JPH11507519A - トロンビンレセプターホモログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト肝臓内で発現された新規なトロンビンレセプタホモログ（ＴＲＨ）を同定しコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。本発明は、更に、ＴＲＨをコードするヌクレオチド配列へのアンチセンス分子と、核酸分子をコードするＴＲＨに基づいた診断テストと、精製されたＴＲＨの生成物に対する発現ベクターと、ＴＲＨと結合することのできる抗体と、ＴＲＨコーディング核酸配列の検出のためのハイブリッド形成プローブ若しくはオリゴヌクレオチド、ＴＲＨの発現に対する遺伝子工学的に作られた宿主細胞と、ポリペプチドＴＲＨに結合されたアンタゴニスト、抗体、及びインヒビターとを、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビンレセプターホモログ技術分野 本発明は、分子生物学の分野に属し、より詳しくは、本発明は、トロンビンレ セプターホモログの核酸及びアミノ酸配列に関する。背景技術 トロンビンレセプターは、７回膜貫通型受容体（Ｔ７Ｇ）に結合されたＧタン パク質であり、血小板、内皮細胞、繊維芽細胞、メサンジナル（ｍｅｓａｎｇｉ ａｌ）細胞、神経細胞、及び平滑筋細胞に存在する。この受容体は、トロンビン 若しくはその他のセリンプロテアーゼによるａｒｇ⁴¹とｓｅｒ⁴²との間の細胞外 のアミノ末端配列の不可逆の配列によって活性化される。正常な末端細胞では、 トロンビンレセプターの活性化は、細胞内のＧｑタンパク質仲介ホスホイノシチ ド代謝及びＧｉタンパク質仲介アデニル酸シククラーゼ阻害をシミュレート（ｓ ｉｍｕｌａｔｅ）する。更に、末端細胞は、血管内皮由来拡張因子（ＥＤＲＦ） を分泌する。その結果、ＥＤＲＦは、可溶性のグアニル酸シクラーゼ遊離をシミ ュレートし、その次に平滑筋の弛緩及びサイクリックＧＭＰの形成が続く。ＥＤ ＲＦのもう１つの働きは、血小板の付着を禁止すること、及び凝集の禁止であり 、これは血液の流れにおいて有益である。 Ｗｉｌｃｏｘらは（１９９４年、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ７５：１０２９−３８） 、ラットの大動脈の平滑筋において、トロンビンレセプターの発現が、血管の創 傷のすぐ後に増加し、ネオ内膜内での細胞の増殖の引き金となることを表してい る。トロンビンレセプターの開裂部位が抗体と結びつくことを阻止することが、 トロンビン有機の細胞の増殖を停止する。開裂及び活性化の後に、トロンビンレ セプターは、脱感作で、再循環のために細胞内に取り込まれる。レセプターの再 循環と交換とが、 トロンビンに由来する現象の周期を限定する。 トロンビンレセプターは、少なくとも４個の起こり得るＮ−グリコシル化部位 、即ち、Ａｓｎ³⁵、Ａｓｎ⁶²、Ａｓｎ⁷⁵、及びＡｓｎ²⁵⁹を有する。炭水化物の 存在によって、トロンビンレセプターに対して報告された寸法と予測された質量 とが大きく異なるといった影響を受ける。更に、グリコシル化は、それらのレセ プターの質量のおよそ３０％の原因となり、明らかにそれらの分布を決定する（ Ｂｒａｓｓ ＬＦらによる（１９９２年） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７： １３７９５−８）。 トロンビンレセプターは、ノンニユーロキニンＴ７Ｇレセプターによって分類 され、このレセプターは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（Ｆ ＦＨ）に対するもののような多くのタンパク質ホルモンを含む。それらは、非常 に長いＮ末端を有し、共通のリガンドの構造的なモチーフを、低い親和力によっ て結合し、レセプターを活性化し、Ｎ末端及び細胞外のループに応じて、高い親 和力と特異性とを与える（Ｂｏｌａｎｄｅｒ ＦＦ（１９９４年） Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）。 トロンビンレセプターは、プラズマ膜を広げ且つ複数の逆平行の螺旋を形成す る７個の疎水性領域によって他のＴ７Ｇに関連付けられる。これらのトランスメ ンブランセグメント（ＴＭＳ）は、Ｉ−ＶＩＩと、そのレセプタの構造及び機能 的特徴の根拠によって指定される。多くの場合、逆平行が、結合ポケットを形成 するが、結合部位が、より多くの分子を受け入れなければならない場合には、細 胞外Ｎ末端セグメント若しくは１つまたは複数の３個の細胞外ループが、結合（ Ｗａｔｓｏｎ Ｓａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ Ｓ（１９９４）Ｔｈｅ Ｇ− Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）と、レセプ タの細胞内の部分での配座の変更の誘導と、に関連する。次に、活性化されたレ セプターが、細胞内のＧタンパク複合体と相互作用し、この複合体が更に細胞内 のシグナリング能力を、一般に、サイクリックＡＮＢ（ｃＡＭＰ）、ホスホリパ ーゼＣ、イノシトールトリホスフェート、またはイオンチャンネルタンパク質な どの第２のメッセンジャーの精製に対して仲介する。 トロンビンレセプターホモログは、以下に詳細に説明される肝臓などの組織内 で発現される。 ヒトの肝臓の基本的な機能的ユニットは、肝小葉であり、各肝小葉は、中心の 静脈を取り囲む肝細胞プレートからなる。胆汁の小さな官（胆管）は、このプレ ードを二分し、肝小葉の間の隔膜内に見いだされた管を空にする。隔膜と関連し た肝シヌソイドは、内皮細胞及びクッパー細胞と並べられる。バクテリア及び有 機体は、クッパー細胞によって門脈の血液から取り除かれ、このクッパー細胞は 、また、高いレベルのクラスＩＩの主な組織適合性複合性タンパク質を発現し、 一酸化窒素、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、及びＴＮＦを放出する 。 肝細胞は、通常、成人内で赤血球を生み出さず、若しくは分割せず、基本的に 胎児性である。肝臓の一部が破壊若しくは除去された時、残りの柔組織は、全体 の組織を再生することができる。肝細胞は、その代謝性の、貯蔵性の、エンドサ イトーシス性の、及びエキソサイトーシス性の働きと一貫性のある多量の小包体 によって特徴付けられている。肝臓は、３つの主な機能を有する、即ち、（１） 血液の貯蔵及び濾過のための血管、（２）グルコースの調節、及びグリコーゲン と脂肪の貯蔵のための代謝、及び（３）ホルモンの調節及び毒性物質の分解のた めの分泌／排出。 正常な肝臓の血液の量は４５０ｍｌであり、肝臓を流れる平均の血液の流量は 、１４５０ｍｌ／分である。肝臓は、外傷を負った後に、直接的に血液を供給す ることができ、若しくは余分の５００ｍｌから１０００ｍｌの血液を蓄えること ができる。体内で生み出されたリンパ液の内の半分は、ディッセ腔（肝細胞の下 に配置された）を通って排出されて肝臓からもたらされる。肝臓内の高い血圧は 、浮腫若しくは腹水の重要な要因である。 肝細胞は、非常に高い代謝率を有し、炭水化物と、脂肪と、タンパク質とを同 時に処理、合成、及び分解する。炭水化物の代謝は、グリコーゲンの貯蔵、フル クトース及びガラクトースのグルコースへの変換、及び糖新生からなる。肝臓は 、ホルモンに応じて血液中のグルコースの量を調節する。 肝細胞は、特別な脂肪代謝機能と、脂肪酸の酸化と、リポタンパク質、リン脂 質、及びコレステロールの生成とを有する。リポタンパク質は、リン脂質及びコ レステロールを、細胞膜及びその他の細胞の機能で重要な物質を形成するために リン糖質及びコレステロールが用いられるその他の領域へ運ぶ。炭水化物及びタ ンパク質の脂肪への変換の多くは、肝臓内で行われるが、貯蔵は、生体内のいた るところにある脂肪組織内でも行われる。肝臓は、また、脂溶性ビタミン及び鉄 分をも貯蔵する。 肝臓は、血漿タンパク質の９０％を、特にアルブミンと様々なグロブリンとを 、１５ｇ／日から５０ｇ／日の速度で形成する。肝臓は、また、サイトカインに 応答して、ハプトグロビン、セルロプラスミン、及びトランスフェリンを製造す る。肝臓は、非必須アミノ酸を製造し、ビタミンＫが存在する場合、促進グロブ リン、エリトロポイエチン、及び凝固因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＩＸ、及びＸ を合成する。 脂肪を溶かす薬剤は、通常、肝臓内での解毒に用いられる。相Ｉ反応 は、酸化、還元、ヒドロキシル化、スルホキシド化、脱アミノ、脱アルキル、若 しくはメチル化による薬剤の分子の反応性のグループの酵素の修飾を含む。その ような修飾は、バルビツール剤及びベンゾジアゼピンを不活性化し、コルチゾン 若しくはプレドニゾンを活性化する。相Ｉ反応に関連する酵素は、エタノール及 びバルビツール剤から誘導され、クロラムフェニコール、シメチヂン、及びエタ ノールによって阻害される。 相ＩＩ反応は、酵素による、その物質の酸若しくは塩誘導体への、例えば、グ ルクロニド、グリシン、若しくは硫酸鉛への、変換過程を含む。肝臓が損傷を受 けた時、肝臓が、抗痙攣薬（フェノバビタール）、抗炎症剤（アセタミノフェン 若しくは糖質コルチコリド）、トランキライザー（リドカイン、プロプラノール ）、若しくは抗生物質（クロラムフェニコール、トテラサイクリン、若しくはリ ファンピシン）を処理する速度が遅くなる。加えて、肝臓が、脱アミノ、タンパ ク質分解、若しくは脱ヨウ素によって、内生的なホルモンを不活性にする。糖質 コルチコイド及びアルドステロンは、還元されて、それらのテトラヒドロ誘導体 となり、グルクロン酸に対して共役とされる。テストステロン及びエストロゲン は、ケトステロイドに変換されて、硫酸若しくはグルクロン酸と共役にされる。 肝臓の異常な生理学的条件及び病理学的条件には、脂肪肝、これは疾病に対応 して肝細胞内に過剰に脂肪が蓄積されるもの、黄痘、これはビリルビンが大量に 細胞外の液体内に存在するもの、肝炎、これはヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎ ａｖｉｒｕｓ）により（その主な病理学的は宿主細胞の免疫反応により）もたら されるウイルス感染であり、肝臓の柔組織が不可逆的に慢性的に傷付けられて起 こり繊維症となるもの、肉芽腫及びアミロイド症などの浸潤性疾病、及び腺腫（ アデノマー）と癌腫、が含まれる。 臨床医は、現在、ビリルビンとウロビリノーゲンとのレベルを測定して、溶血 性の肝臓疾患を診断し、ガン胎児性抗原のレベルを検定して、転移する腫瘍を診 断する。その機能に応じて、トロンビンレセプターホモログに対する検定が、過 剰な繊維症及びその結果の肝臓の損傷の診断ツールとなる。トロンビンレセプタ ーホモログが、機械的若しくは化学的な傷に応答して発現された時、若しくは不 必要な凝固反応または進行性の繊維症において含まれている時、トロンビンレセ プターホモログは、また、肝臓内の炎症性のプロセスを制御するためのアクセス 可能な治療上のターゲットをも表す。 肝臓についての解剖学、生理学、疾病が研究され、とりわけ、Ｇｕｙｔｏｎ， ＡＣ（１９９１年）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ｏｇｙ， ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｐ Ａ： Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｌ， ＫＪ らによる（１９９４年）Ｈａｒｒｉｓ ｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｉｃｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ：及びＴｈｅ Ｍｅ ｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｈｙ （１９９２年）Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒａｈ ｗａｙ ＮＪに開示されている。 本出願で開示された新規なトロンビンレセプターホモログの特定は、そのよう な７回膜貫通型受容体が発現された若しくは活性状態で含まれている炎症若しく は疾病に関連するシグナル伝達の発生の診断若しくは仲介の機会を提供する。 本発明は、新規なヒトトロンビンレセプターホモログ（ＴＲＨ）をコードする 独自のヌクレオチド配列を提供する。ｃＤＮＡ、ここでは、ｔ番目（ｔｒｈ）と して指定され、インサイト社クローン第８６７００を 用いて、肝臓ｃＤＮＡライブラリーから同定されクローニングされた。 本発明は、また、活性化された若しくは炎症を起こした細胞及び／またはその 発現に関連した組織の診断及び治療に、ＴＲＨのヌクレオチド及びアミノ酸配列 若しくはその変異体を用いることに関する。本発明の側面は、ｔｒｈのアンチセ ンスＤＮＡと、ｔｒｈを含むクローニング若しくは発現ベクターと、ｔｒｈを含 む発現ベクターと共に形質転換された宿主細胞若しくは組織と、宿主細胞からの 精製されたＤＮＡの生成及び回収の方法と、治療上の用途でレセプターのアンタ ゴニスト、抗体、若しくはインヒビタを同定するために用いることのできる精製 されたタンパク質ＴＲＨとを含む。図面の簡単な説明 第１Ａ図及び第１Ｂ図は、ＴＲＨに対する共通配列のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の並びを表している 。ヌクレオチド配列を拡張して全長の配列を得るために用いられるオリゴマーは 、ＸＬＲ＝ＴＧＣＣＴＴＣＣＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＧＡＣＣＧ、及びＸＬＦ＝ ＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＧである。 第２図は、四角で囲まれた以外の部分は同じであるヒトトロンビンレセプター ＨＵＭＴＨＲＲを伴ったヒトＴＲＨの並びを表している。発明を実施するための最良の形態 本明細書で用いられているように、上側ケースのＴＲＨは、自然発生した、若 しくは合成されたもの、及びそれらの活性なフラグメントであるトロンビンレセ プターホモログを意味し、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によって表されるアミ ノ酸配列を有する。或る実施例では、ポリペプチドＴＲＨが、ＦＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１のｃＤＮＡ（下側ケースのｔｒｈ）から転写されたｎＲＮＡによってコー ドされる。 本出願が目的とする新規なトロンビンレセプターホモログ（ｔｒｈ）は、肝臓 ライブラリーに由来する部分的なｃＤＮＡから同定された。インサイトクローン ８６７００は、ヒトトロンビンレセプター（Ｄｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＰＭ ａｎ ｄ ＭＣ Ｂｅｒｎｄｔ １９９４）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２１：３４９−５８）であるＨＵＭＴＨＲＲと殆ど等しい。更 に、インサイト８６７００は、残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）９４−１５５である血小 板活性化因子と等しいアミノ酸配列を表す。これらの残基は、上述された７回膜 貫通型受容体の、ＴＭＳ ＩＩＩ、第２の細胞内ループ、及びＴＭＳ ＩＶの殆 どを、カバーする。 「活性な」は、任意の自然発生したＴＲＨの生物学的及び／または免疫学的な 活性を保持したＴＲＨの形態を意味する。 「自然発生したＲＴＨ」は、遺伝子工学的に作られたものではないヒトの細胞 によって生み出されたＴＲＨを意味し、例えば、限定を意図するものではないが 、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、糖質化、アシル化等 を含む、ポリペプチドの翻訳語修飾から生ずる様々なＴＲＨが予期される。 「由来の」は、通常はヒトのタンパク質内では起こることのない、ユビキチン 化、標識化（例えば、放射性核種、様々な酵素等による）、ペギレーション（ｐ ｅｇｙｌａｔｉｏｎ）（ポリエチレングリコールにより誘導体化（ｄｅｒｉｖａ ｔｉｚａｔｉｏｎ））、及びオルニチン等のアミノ酸の化学的な合成によるによ る挿入若しくは置換、等の技術によって化学的に修飾されたＴＲＨを意味する。 「組換ポリペプチド変異体」は、ＴＲＨポリペプチドの活性を有し且つ組換Ｄ ＮＡ技術を用いて行われたアミノ酸の挿入、削除、置換によって生じた自然発生 したＴＲＨとは異なる任意のポリペプチドを意味する。 通常のシグナル導入等の、対象とされている活性を失わずに、何れのアミノ酸残 基が、置換され、加えられ、若しくは削除されるかを決めるガイダンスは、特定 のＴＲＨの配列を、同相ペプチドの配列と比較して、高度に維持された領域内で 起きたアミノ酸配列の変化の数を最小とすることにより見いだされてもよい。 好ましくは、アミノ酸の「置換」は、１つのアミノ酸を、同じ構造及び／また は化学的な特性を有する他のアミノ酸に置き換えた結果、例えば、ロイシンを、 イソロイシン若しくはバリンと、アスパルターゼを、グルタミン酸塩と、または トレオニンを、セリンと、即ち、保存的な置き換えの結果、もたらされるもので ある。「挿入」若しくは「削除」は、通常、およそ１個から５個のアミノ酸の範 囲内にある。可能な変異体は、組換ＤＮＡ技術を用いてｔｒｈの分子内のヌクレ オチドの挿入、削除、または置換を、ペプチド合成によって、または系統的に行 い、発現された組換変異体の活性を定量することによって実験的に求められる。 ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」、若しくは「セグメント」は、少 なくとも５個のアミノ酸の、及び多くとも約２０個のアミノ酸の、好ましくは約 ９個から１３個のアミノ酸の、アミノ酸残基のストレッチからなる。活性である ためには、任意のｔｒｈフラグメントは、単独で、若しくは抗体生成のための鍵 穴吸着ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ） 等のキメラを表す分子若しくは活性を評価するためのプリン受容体から殆どの場 合に構成されたキメラをテストする分子の一部として、生物学的及び／または免 疫学的な活性を表すのに十分な長さを有していなければならない。 必要に応じて、「シグナル若しくはリーダ配列」は、ポリペプチドが細胞膜を 貫通するようにする。そのような配列は、本発明のポリペプチドにおいて自然発 生していても、組み合わせＤＮＡ技術によって非相同 のソースから供給されてもよい。 「プローブ」は、相補的配列を検出するための分子増殖若しくはハイブリダイ ゼーションに用いる十分な長さのＮＡ若しくはＤＮＡである。 「オリゴヌクレオチド」若しくは「オリゴマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）におけるプライマー若しくはプローブとして用いられる十分な個数のベ ースを有するヌクレオチド残基のストレッチである。そのようなオリゴヌクレオ チドは、配列リストにおいて見いだされるｃＤＮＡ配列に基づいて調製される。 反応条件を確率し且つ誤った評価を取り除くために適した試験の後に、オリゴヌ クレオチドが、或る特定の細胞若しくは組織内の同一または同相のＤＮＡ若しく はその転写されたＲＮＡの存在を、増殖、提示、若しくは確認するために、用い られる。オリゴヌクレオチド若しくはオリゴマーは、少なくとも１０個のヌクレ オチド及び多くても約３５個のヌクレオチド、好ましくは約２５個のヌクレオチ ドを有するＤＮＡ配列の一部をなす。 「縮重オリゴヌクレオチドプローブ」は、遺伝子コードの縮重に基づく少数の 置換（１つ以上のコドンが、同じアミノ酸を特定してもよい）が行われたプロー ブである。このプローブは、Ｗａｌｓｈ ＰＳらによって（１９９２、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ １：２４１−５０）開示されたように、染色体ＤＮ Ａから同じ天然の核酸配列を増殖するのに特に便利である。 ポリヌクレオチド若しくは核酸の「部分」若しくは「フラグメント」は、約６ ｋｂより少ないヌクレオチド、好ましくは約１ｋｂより少ない、プローブとして 標識化されて用いられる、ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列の全体若しく は或る部分を有する。プローブは、放射性の要素、酵素、若しくは色素生産性の マーカまたはフッ素生産性のマーカーで標識化されてもよい。反応条件を獲得し 且つ誤った評価を取り除くた めの適切な試験の後に、核酸プローブが、サザン、ノーザン、またはｉｎ ｓｉ ｔｕハイブリダイゼーションにおいて用いられて、特定のＴ７Ｇ若しくはＴ７Ｇ ホモログをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡが特定の細胞、組織または生体内に 存在するか否かが判定される。 核酸プローブに対する配列は、自然発生した、組換技術による、若しくはコン ピュータによる共通配列から由来されるが、物理的プローブは、全体が若しくは 一部が化学的に合成され、ニックトランスレーション、クレノウ充填反応（Ｋｌ ｅｎｏｗ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＰＣＲ、若しくはその他の当 業者に知られた方法によって標識化される。本発明のプローブは、その調製及び ／若しくは標識化が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊらによる（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ、若しくはＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭらによる（１９８ ９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉ ｔｙに詳しく記載されており、この２つの文献は言及することによって本出願の 一部とされる。 Ｔ７Ｇをコードする「組換ヌクレオチド変異体」は、遺伝子コード内の「冗長 性」を用いて合成若しくは選択される。様々なコドンの置換が、例えば特定の制 限部位を産生する無症状の変化等が、プラスミド若しくはウイルスベクター内へ のクローン化を最適化するために、若しくは特定の原核システムまたは真核シス テム内での発現を増加するために、導入されてもよい。また、コドン使用特定変 異（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が導入さ れて、若しくは関連するペプチドのドメインを含むキメラが加えられて、ポリペ プチドの任 意の部分の特性を試験若しくは変更し、特に、リガンド結合親和力、鎖間親和力 、若しくは分解／代謝速度を変更してもよい。 新規なヒトトロンビンレセプターホモログを同定する独自のヌクレオチド配列 を提供する。このｔｒｈに対する配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１において示さ れており、ＧｅｎＢａｎｋ配列のＨＵＭＴＨＲＲと同相ではあるが、かなり異な る。ＴＲＨは、外傷若しくは感染症に対する細胞内で発現されるので、核酸（ｔ ｒｈ）、ポリペプチド（ＴＲＨ）、及びＴＲＨに対する抗体が、細胞のシグナリ ング、免疫、回復、などを制御する正常な及び異常な生理学上の及び病理学上の プロセスにおいて調査及び仲介を行うのに適している。従って、ＴＲＨのアップ レギュレートされた（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現に対する検査が、全身の感 染症、局部的な感染症、外傷による若しくはその他の組織の損傷、遺伝的な若し くは環境的な疾病（高血圧症、癌腫、及びその他の病理学的な問題に関連する） によって引き起こされた異常なシグナル伝達によって生じた状態の診断及び適切 な治療を促進することができる。 ＴＲＨ（またはその相補体）をコーディングするヌクレオチド配列は、分子生 物学の当業者に知られた他の様々の分野での用途がある。これらの分野には、サ ザン若しくはノーザンハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション プローブとしての用途、ＴＣＲのためのオリゴマーとしての用途、染色マッピン グ及び遺伝子マッピングのための用途、ＴＲＨの組換産生のための用途、アンチ センスＤＮＡ若しくはＲＮＡ（若しくはそれらの化学的な類自体など）の発生に おける用途、ドメイン特定治療分子（ｄｏｍａｉｎ−ｓｐｅｃｉｓｉｃ ｔｈｅ ｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）の設計のためのアンタゴニスト、イン ヒビタ、若しくはアゴニストの選択のためのキメラ分子の生成の用途、が含まれ る。本明細書で開示されているＴＲＨをエンコーディングするヌクレオ チドの用途は、公知の技術の例示であり、それらの用途を当業者に知られた如何 なる技術に対しても限定することを意図するものではない。更に、本明細書で開 示されたヌクレオチド配列は、未だに開発が終了していない分子生物学の分野、 例えば現在知られている三重項遺伝子コード、特定のベース対合相互作用等であ るヌクレオチド配列の特性に基づく新たな技術、でも用いられる。 当業者には、遺伝子コードの縮重の結果として、任意の公知の及び自然発生し た遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小の相同性を有する、複数のＴＲＨエン コーディングヌクレオチド配列が、産生されることがわかる。本発明は、起こり 得るコドンの選択に基づいた組み合わせの選択によってもたらされるヌクレオチ ド配列に関して詳しく説明された各配列及び可能な起こり得る変異体を有する。 これらの組み合わせは、自然発生するＴＲＨのヌクレオチド配列に適応される時 に標準的な三重項遺伝子コードに基づいて行われ、そのような全ての変異体は、 本明細書の開示に含まれると考えられる。 ＴＲＨをコードするヌクレオチド配列とその変異体とは、好ましくは、緊縮条 件のもとで自然発生したＴＲＮ遺伝子のヌクレオチド配列へハイブリダイゼーシ ョンできるが、ヌクレオチド配列エンコーディングＴＲＨ及びその誘導体（実質 的に異なるコドンの利用をすることのできる）を産生することが有益である。コ ドンは、その特定のコドンが宿主細胞によって用いられる頻度に基づいて特定の 原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞内でペプチドの生ずる発現速度を増加するよ うに選択できる。コードされたアミノ酸配列を変えることなくＴＲＨをエンコー ディングするヌクレオチド配列とその誘導体とを実質的に変えることのその他の 理由には、自然発生した配列から産生された転写物に比べ、例えばより長い半減 期などのより好ましい特性を有するＲＮＡの転写が産生されるこ とである。 ＴＲＨをコードするヌクレオチド配列は、十分に確立された組換ＤＮＡ技術（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊらによる上述された）を用いて、他の様々なヌクレオチド 配列のと結合される。ｔｒｈと結合するための便利なヌクレオチド配列は、寸法 、有用性、忠実性などの特性に対する選択を行うことができる、当業者に知られ た、プラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミド（ｐｈａｇｅ ｍｉｄ）、及び収容することのできるインサート、及びそれらの類似体、などの クローニングベクターの組み合わせを含む。対象とされているその他のベクター は、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シーケンシングベク ター、ＹＡＣ及びＢＡＣマッピングベクター、などを含む。一般的には、これら のベクターは、少なくとも１つの組織内の複製機能のソースと、有用な制限エン ドヌクレアーゼ感知部位と、宿主細胞に対する選択可能なマーカーとを含む。 本発明の他の側面は、自然発生したＴＲＨをコードするヌクレオチド配列に対 してハイブリダイゼーションを行うことのできるｔｒｈ特定核酸ハイブリダイゼ ーションプローブを提供する。そのようなプローブが、ＴＲＨをコードする配列 を検出するためにも用いられ、好ましくは、このｔｒｈエンコーディング配列か らの対象とされている特定のドメインからの少なくとも５０％のヌクレオチドを 含んでいるべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列から由来されるか、対応する自然発生したｔ ｒｈのプロモータ、エンハンサ要素、及びイントロンを含む遺伝子配列から由来 する。ハイブリダイゼーションプローブは、³²Ｐ若しくは³⁵Ｓ等の放射性ヌクレ オチド若しくはアビジン／ビオジン結合システムを介してプローブに結合された アルカリホスファターゼなどの酵素ラベル、及びその他 を含む様々なリポータグループによって標識化されてよい。 ＴＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号及び４，９６５，１８８号で開示 されているように、ｔｒｈをコードするオリゴヌクレオチドに対する用途を、更 に、提供する。ＴＣＲで用いられるそのようなプローブは、組換によるもの、化 学的に合成されるもの、若しくはそれらの両方の混合であり、診断の用途に用い るための離散的なヌクレオチド配列若しくは緊密に関連したＴ７Ｇ配列を同定す るための起こり得る配列の縮重プールを有する。 全長の遺伝子が、米国特許出願第０８／４８７、１１２（１９９５年６月７日 に出願された）で開示されているような新たな方法を用いて既知の配列からクロ ーンされ、この特許出願はここで言及したことによって本出願の一部とされ、こ の方法では、ＸＬ−ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ ｙ，ＣＡ）を、ＤＮＡの長いピースを増殖するために用いられている。この方法 は、一人の研究者が同時に複数の遺伝子（２０個若しくはそれ以上の）を処理し 、６日から１０日の間に拡張された（全長のものも可能である）配列を得ること ができるように開発された。この方法は、ライブラリーをスクリーンするために 標識化されたプローブを用い、一人の研究者によって１４日から４０日間の間に わずか約３個から５個の遺伝子を処理することのできる現在の方法にとって変わ るものである。 第１のステップは、約２日間に亘って、既知の部分的な配列に基づいてプライ マーが設計され合成される。第２のステップでは、約６時間から８時間に亘って 、選択されたライブラリーのＴＣＲ増殖によって、配列が拡張される。ステップ ３及びステップ４では、約１日間に亘って、増殖されたｃＤＡＮの精製とその適 切なベクターへの連結反応が行われる。ステップ５では、約１日間に亘って、形 質転換と宿主細胞の成長が 行われる。ステップ６では、約５時間に亘って、ＰＣＲが用いられて配列を拡張 するめにバクテリアクローンのスクリーニングが行われる。 最後のステップでは、約１日間に亘って、選択されたクローンの調製及びシー ケンシングが行われる。全長のｃＤＮＡが得られなかった場合、全体の手順が、 オリジナルのライブラリー若しくは他の好ましいライブラリーの何れかを用いて 繰り返される。好ましいライブラリは、より長いｃＤＮＡを含むようにその寸法 が選択されたものであるか、またはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ ｒｇ ＭＤ）からの肺、肝臓、心臓、及び脳などの商業的に入手可能なライブラ リーの１つまたは組み合わせたものであってよい。ｃＤＮＡライブラリーは、オ リゴｄ（Ｔ）またはランダムなプライマーと共に調製されたものであってよい。 ランダムなプライマーのライブラリーを用いることの利点は、遺伝子の５’末端 を含むより多くの配列を有するということである。ランダムなプライマーのライ ブラリーは、特に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全な遺伝子を得ることがな い場合に有効である。明らかに、タンパク質の長さが長くなるほど、完全な遺伝 子が１つのプラスミド内において見いだされる可能性が低下する。 Ｔ７Ｇ ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブを生み出すための他 の手段には、ＴＲＨ若しくはその誘導体をコードする核酸配列を、ｎＲＮＡプロ ーブを産生するためのベクターへクローニングすることがある。そのようなベク ターは、当業者には知られており、且つ商業的に入手可能であり、Ｔ７としての 適切なＲＮＡポリメラーゼ若しくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼと、適切な標識 化されたヌクレオチドとを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプロ ーブを合成するために用いられる。 こうして、ＴＲＨ及び／若しくはその誘導体をコードするＤＮＡ若し くはその一部を、完全に、合成化学によって産生することができる。そのような 分子は、試薬、及び本出願の出願時における当業者に知られた方法によって、多 くの入手可能なベクターへ挿入される。更に、合成化学は、突然変異を、ｔｒｈ 配列若しくはその任意の部分へ導入するために用いることもできる。 ヌクレオチド配列は、異常なレベルのＴＲＨの発現に関連する、活性、感染症 、若しくは疾病を、検出するための検定法を開発するために用いることができる 。ヌクレオチド配列は、当業者に知られた方法によって標識化され、患者からの 液体若しくは組織の標本に加えられる。ハイブリダイゼーションを行うための十 分な時間の温置の後に、標本が、可視マーカを、例えばヌクレオチドが酵素によ って標識化されていた場合には染料若しくはその他の適切な分子を、含む相溶性 の流体によって洗浄される。相溶性の流体がすすぎ落とされた後、染料が計量測 定され、基準値と比較される。染料の量が非常に多い場合（若しくは非常に少な い場合）、ヌクレオチド配列は、標本によってハイブリダイゼーションされ、且 つその検定によって、感染症若しくは疾病などの異常な状態が示される。 ｔｒｈに対するヌクレオチド配列は、遺伝子マッピングのためのハイブリダイ ゼーションプローブを構築するために用いることができる。本明細書で開示され たヌクレオチド配列は、公知の遺伝子及び／若しくは染色体マッピング技術を用 いて、染色体及び染色体の特定の領域へマッピングされる。これらの技術には、 ｉｎ ｓｉｔｕのハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカに対する結合分 析、ライブラリーを用いたハイブリダイゼーションスクリーニング、既知の染色 体に対する特定の流動蓄積染色体調製（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏ ｓｏｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）などが含まれる。染色体の核酸のｉｎ ｓｉ ｔｕの蛍光ハイブリダイゼーション技術が、Ｖｅｒｍａらによる（１９８８）Ｈ ｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃ ｉｔｙに説明されている。 遺伝子調製のｉｎ ｓｉｔｕの蛍光ハイブリダイゼーション及び他の物理的な 染色体マッピング技術が、さらなる遺伝子マッピングデータと関連付けられても よい。遺伝子マッピングデータの例は、１９９４年のＧｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）に見いだすことができる。物理 的な染色体マップ上のｔｒｈの位置と、特定の疾病（若しくは特定の疾病に対す る要因）との間の関係は、その遺伝子の疾病に関連するＤＮＡの領域の範囲を限 定する手助けとなる。本発明のヌクレオチド配列は、正常な個体と、キャリア若 しくは病気に冒された個体との間の遺伝子配列の相違を検出するために用いるこ とができる。 ＴＲＨをコードするヌクレオチド配列は、よく知られた組換ＤＮＡ技術を用い て、精製されたＴＲＨを産生するために用いられる。遺伝子が分離された後に遺 伝子の発現のための方法を開示した多くの刊行物の中で、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９ ９０）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｐｇｙ， Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １８５， Ａｃａｄｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡがある。ＴＲＨは、原核細胞若しくは 真核細胞などの宿主細胞内で発現される。宿主細胞は、ヌクレオチド配列が内在 性である同じ種から、若しくは異なる種からのものである。組換ＤＮＡ技術によ ってＴＲＨを産生することの利点は、精製のための適切な量のタンパク質を得る ことができ、且つ単純化された精製手順を用いることができるということである 。 ＴＲＨをコードするＤＮＡのタンパク質と共に形質転換された細胞は、ＴＲＨ の発現と細胞の培地からのタンパク質の回収とに適した条件のもとで培養される 。組換え細胞によさて産生されたＴＲＨは、用いられた特定の遺伝子構造に応じ て、分泌されるか、または細胞内に含まれる。一般的に、組換タンパク質を調製 することがより便利である。精製ステップは、産生プロセスに応じて及び産生さ れた特定のタンパク質に応じて変化する。 ＴＲＨを分離するための様々な方法が、当業者に知られた手順によって行われ る。例えば、ポリペプチドは、本発明によって提供される抗体を用いることによ って、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。タンパク質の精製の ための当業者に知られた他の様々な方法が、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ（１９９０ ）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １８２，Ａｃａｄ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，及びＳｃｏｐｅｓ Ｒ （１ ９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ Ｃｉｔｙで開示された方法を含み、これらの出版物は言及したことによっ て本出願の一部とされる。組換産生に加えて、ＴＲＨのフラグメントが、固相技 術（Ｓｔｅｗａｒｔらによる（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉ ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ， Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ ＣＡ：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ（１９６３）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅ ｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４）を用いた、直接ペプチド合成によって 産生される。ｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質合成が、手作業による若しくは自動 化された方法によって行われてもよい。自動化された合成は、例えば、Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） を用いて、製造業者によって提供されたインストラクションに従って、達成する ことができる。ＴＲＨの様々なフラグメントが、別個に化学的に合成されて、全 長のポリペプチドを産生する化学的な方法を用いて組み合わされてもよい。 抗体に対するＴＲＨの誘導は、生物学的活性を必要としないが、タンパク質は 抗原性でなければならない。全体のアミノ酸配列を含むＴＲＨのアミノ酸の短い ストレッチは、鍵穴吸着ヘモシアニン等の他のタンパク質のストレッチと融合さ れてもよく、融合タンパク質に対して産生された抗体のストレッチと融合されて もよい。 ＴＲＨに対して特異的な抗体が、適切な動物に、ポリペプチド若しくは抗原フ ラグメントを接種することによって産生される。抗体は、抗体がポリペプチドの 抗原エピトープに対して特異的であり自然発生した若しくは組換技術によるタン パク質の少なくとも一部に結合する場合、ＴＲＨに対して特異的である。抗体の 産生は、動物への注入による免疫反応の刺激だけでなく、合成抗体、若しくは組 換免疫ブロブリンライブラリー（Ｏｒｌａｎｄｙ Ｒらによる（１９８９）ＰＮ ＡＳ ８６：３８３３−３７，又は Ｈｕｓｅ ＷＤらによる（１９８９）Ｓｃ ｉｅｎｅｃ ２５６：１２７５−８１）のスクリーニング若しくはｉｎ ｖｉｔ ｒｏのリンパ細胞の数の刺激などの他の特定の結合分子の産生における類似のス テップをも含む。現在の技術（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−９９）は、抗体の形成の原理に 基づく多数のコードに特異的な結合試薬を提供する。これらの技術は、ＴＲＨの 特異的に特定の領域と結合する分子を産生するように適合される。 本発明の更に他の実施例は、全身の若しくは局部的な感染症、外傷、 及び他の組織の損傷、高血圧症、癌腫、及び他の病理学的な問題に関連する遺伝 的なまたは環境的な疾病、を原因とする異常なシグナル伝達を治療するための生 体に作用する薬剤などまたはＴＲＨ特異抗体の使用に関する。 アゴニスト、アンタゴニスト、またはＴＲＨのインヒビタを有する生体に作用 する組成物は、最大許容投与量を決定するためのほ乳類に対する臨床的な研究と 、安全な投与量を決定するための正常なヒトに対する臨床的な研究とを含む任意 の様々な原理体系によって決定された適切な治療のための投与量で投与される。 加えて、生体に作用する薬剤は、半減期等の薬理学的な特性若しくは安定性を強 化する十分に確立された様々な化合物若しくは組成物と錯化されてもよい。治療 上の生体に作用する化合物が、血液への静脈注射やその他の治療に用いることの できる有効な手段によって、投与される。 以下の具体例が、本発明を説明するために提供されている。これらの具体例は 、例示を意図するものであって、本発明の限定を意図するものではない。産業上の利用可能性 Ｉ ｎＲＮＡの分離と、ｃＤＮＡライブラリの構築 本発明のＴＲＨ配列は、最初に、ヒト腎臓ライブラリーを有する配列の内から インサイトクローンＮｏ８６７００として同定された。このライブラリに用いら れるヒトの細胞は、４９歳の男性（カタログ番号９３７２２４：薄相遺伝子（ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）から採取された。ｃＤＮＡライ ブラリーに対するｃＤＮＡ合成は、オリゴｄ（Ｔ）から開始され、合成アダプタ オリゴヌクレオチドは、そのＵｎｉ−ＺＡＰ（商標）ベクターシステム（薄相遺 伝子）内への挿入を可能にするｃＤＮＡ末端と結合された。これにより、高い効 率の一方 向（センス方向）のラムダライブラリーの構築がなされ、クローンのｃＤＮＡへ の挿入を行わせるための青／白色選択を伴ったプラスミドシステムを用いること が可能となった。 ｃＤＮＡライブラリは、ＤＮＡプローブ若しくは抗体プローブによってスクリ ーニングされ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ファージミド（薄相遺伝子 ）が、ｉｎ ｖｉｖｏで急速に試験される。このファージミドによって、容易な 挿入特性、シーケンシング、部位特異的突然変異誘発、融合ポリペプチドの一方 向欠失の発生及び発現に対するプラスミドシステムを用いることができる。カス タム構築されたライブラリーのファージ粒子は、大腸菌宿主株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ （登録商標）（薄相遺伝子）へ感染させられ、高い形質転換効率を有し、ｃＤＮ Ａライブラリ内の生の不十分に表示されたクローンを得る確率を増加させる。代 わりの一方向のベクターは、限定するものではないが、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）及びｐＳＨｌｏｘ−１（Ｎｏｖａｇ ｅｎ、Ｍａｅｉｓｏｎ ＷＩ）を含む。ＩＩ ｃＤＮＡクローンの分離 個々のｃＤＮＡのファージミド形態は、ｉｎ ｖｉｖｏの除去プロセスによっ て得られ、宿主バクテリア株は、ライブラリファージとｆ１ヘルパーファージと の両方に感染させられた。ポリペプチド、または、ファージを含むライブラリと ヘルパーファージでニックされた(ｎｉｃｋ)ＤＮＡての両方から由来する酵素が 、目的のＤＮＡに定義された配列からの新たなＤＮＡ合成を開始し、ｔＢＬＵＥ ＳＣＲＩＰＴ（登録商標）プラスミドの全てのＤＮＡ配列とｃＤＮＡインサート とを含んだより小型の一本鎖環状プラスミドＤＮＡ分子を形成する。ファージミ ドＤＮＡは、細胞から分泌され、精製され、次に新鮮な宿主細胞に再び感染させ られるために用いられ、宿主細胞で二本鎖ファージミドＤＮＡが産生さ れる。ファージミドは、β−ラクトマーゼ（ｌａｃｔａｍａｓｅ）を運ぶので、 新たに形質転換されたバクテリアが、アンピリシン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を 含む培地の上で選択された。 ファージミドＤＮＡが、ＭＡＧＩＣ ＭＩＮＩＰＲＥＰＳ（商標）ＤＮＡ精製 システムを用いて精製される（カタログ番号Ａ７１００：Ｄｒｏｍｅｇａ Ｃｏ ｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。この小型のプロセスは、登録されたＤＮＡ結合 樹脂を用いたバクテリア細胞の分離及び精製されたファージミドＤＮＡを急速に 分離するための、簡単且つ信頼性の高い方法を提供する。ファージミドＤＮＡは 、また、ＱＩＡＷＥＬＬ−８２プラスミド精製システム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ ， Ｃｈａｄｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を用いて精製される。この産生ラインは、Ｑ ＩＡＧＥＮアニオン交換樹脂粒子を用いたバクテリア細胞の分離及びコードに精 製されたファージミドＤＮＡの分離をするための便利な且つ迅速な高いスループ ットの方法を提供する。これらのいずれかの方法の実行の後に、シーケンシング 及びその他の分析的な処理のために、ＤＮＡが抽出され、且つ調製される。ＩＩＩ ｃＤＮＡクローンのシーケンシング 肝臓ライブラリーのランダムな分離からのｃＤＮＡインサートが、部分的に配 列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）された。ＤＮＡシーケンシングの方法は、当業者には よく知られている。通常の酵素方法は、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメン トであるＳＥＱＵＥＮＡＳＥ(登録商標)(ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ｒｐ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ)、またはＴａｑポリメラーゼを用いて、対 象とされているＤＮＡテンプレートヘアリーリングされたオリゴヌクレオチドプ ライマーからＤＮＡ鎖を拡張する。一本鎖及び二本鎖のテンプレートの両方に用 いるための方法が開発されてきた。読み終わり反応生成物が、尿素アクリルアミ ドゲ ルの上で電気泳動され、オートラジオグラフィー（放射性ヌクレオチドで標識化 されたプレカーサに対して）若しくは蛍光検出法（蛍光でラベル標識化されたプ レカーサに対して）の何れかによって検出された。蛍光検出法を用いた機械化さ れた反応調製、シーケンシング、及び分析における最近の改良点は、Ｃａｔａｌ ｙｓｔ８００及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７若しくは３７ ３ＤＮＡシーケンサ等の機械を用いて、一日で複数の配列内の拡張が可能とされ たということである。ＩＶ ｃＤＮＡクローン及び導き出されたタンパク質の相同サーチ このようにして得られた各配列が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに よって開発され、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列分析システムに組み込まれ たＧｅｎＢａｎｋサーチアルゴリズムを用いてＧｅｎＢａｎｋの配列と比較され た。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌ ａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷ Ｉｎｃ.,Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡで開発された ）が用いられて、同相の領域が求められた。どのようにして配列の比較が行われ たかを求める２つのパラメータは、ウインドウサイズ、ウインドウオフセット、 及びエラートレランスである。これら３つのパラメータの組み合わせを用いるこ とによって、ＤＮＡデータベースが、問題となっている配列と相同の領域を含む 配列に対するサーチが行われ、適切な配列に初期の値が割り当てられる。従って 、これらの同相の領域は、ドットマトリクス同相性プロットを用いて試験され、 同相の領域を偶然に一致したものから区別する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ 整合が用いられて、同相性サーチの結果が表示される。 ペプチド及びタンパク質配列の同相性がＤＮＡ配列の同相性で用いられたのと 同様な方法で、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列分析装置を 用いて確かめられる。Ｐａｔｔｅｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕ ａｇｅ、及びパラメータウインドウが用いられて、最初の値が割り付けられた同 相性の領域を含む配列に対してタンパク質データベースのサーチが行われる。ド ットマトリクス同相性プロットが、偶然一致した領域から、高い同相性を有する 領域を区別するために試験された。 代わりに、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔ ｏｏｌｉ基づくＢＬＡＳＴが用いられて、局部的な配列のアラインメントのサー チが行われる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３ ６：２９０−３００;Ａｌｔｓｃｈｕｌ． ＳＦらによる（１９９０）Ｊ Ｍｏ ｌ Ｂｉｏｌ ２５１：４０３−１０）。ＢＬＡＳＴは、配列の類似性を求める ために、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の両方に対するアラインメントを生 み出す。アラインメントの局所的な特性のために、ＢＬＡＳＴは、正確な一致を 求めるために、若しくは同相性を同定するために、特に有効である。ギャップを 含まない一致に対しては理想的であるが、モチーフとなるスタイルのサーチを行 うためには適していない。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの出力の原理的なユニットは 、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは、２個の任意の配列のフラグメントを有し、その長さは等しく、それ らのアラインメントは、局部的に最大であり、そのアラインメントスコアは、利 用者によって設定された遮断スコア若しくは閾値と同じであるかそれを上回るも のである。ＢＬＡＳＴアプローチは、疑問とされている配列とデータベースの配 列との間でＨＳＰを探し、見いだされた任意の一致の統計上の重要性を評価し、 利用者に選択された重要度の閾値を満足する一致のみを報告する。データベース の配列整合を報告するための、統計学的な重要な閾値を開発したパラメータＥは 、データ ベス配列整合を報告するために、統計学的に重要な閾値を生み出した。パラメー タＥは、データベースの配列の一致を報告するための統計学的に重要な閾値を生 み出す。Ｅは、全体のコンテクスト内での１つの又は複数のＨＳＰの生ずる機会 の期待される頻度の情報バンドとして翻訳される。その一致がＥを満足する任意 のデータベース配列が、プログラム出力で報告される。Ｖ 同定、全長クローニング、シーケンシング、及び翻訳 肝臓ライブラリーからのクローンのランダムに抽出された配列された部分から のＩＮＨＥＲＩＴ（商標）の分析の結果が、インサイト８６７００を、トロンビ ンレセプターホモログであるＨＵＭＴＨＲＲとして同定した。ｃＤＮＡインサー ト（インサイト８６７００を有する）が、十分に配列され、全長のｃＤＮＡをク ローニングするためのベースとして用いられた。 インサイトクローン８６７００のｃＤＮＡは、１９９５年６月７日に出願され た（Ｇｕｅｇｌｅらによる）米国特許出願第０８／４８７、１１２号（言及した ことによって本出願の一部とされる）に開示されているように変形されたＸＬ− ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）手順を用いて全長まで拡張された。プライ マーは、公知の設計された配列のベースであり、１つのプライマーは、アンチセ ンス方向での拡張を開始するように合成され（ＸＬＲ＝ＴＧＣＣＴＴＣＣＧＴＴ ＧＣＴＧＴＡＴＡＧＡＣＣＧ）、もう１つのプライマーはセンス方向に拡張する ように合成された（ＸＬＦ＝ＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧ ＴＧ）。このプライマによって、対象とされている遺伝子に対する新たな未知の ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを形成するように、配列が「外向きに」拡 張できるようになった。プライマーは、Ｏｌｏｇｏ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． Ｐｌｙｍ ｏｕｔｈ ＭＮ）を用いて、長さが２０から３０個のヌクレオチドとなるように 、５０％以上のＧＣコンテンツを有するように、設計された約６８℃から７２℃ の温度で目標の配列にアニールされた。ヘアピン構造及びプライマーとプライマ ーの２量体化をもたらすヌクレオチドのストレッチが回避された。 肝臓ｃＤＮＡライブラリがテンプレートとして用いられ、ＸＬＲ及びＸＬＦプ ライマーが、８６７００配列を拡張し増殖するために用いられた。ＸＬ−ＰＣＲ キットの命令に従って、且つ酵素と反応物の混合物をゆっくりと混ぜ合わせるこ とにより、高い忠実性の増殖が達成された。２５ｐＭｏｌの各プライマーと、ピ ットのその他の構成要素の推奨された濃度とから始め、ＴＣＲが、ＭＪ温度循環 装置ＴＰＣ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｍ ＭＡ）を 用いて、以下のパラメータで実行された。 ステップ１ ６０秒間の９４℃（最初の変性化） ステップ２ １５秒間の９４℃ ステップ３ １分間の６５℃ ステップ４ ７分間の６８℃ ステップ５ 更に１５回、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １５秒間の９４℃ ステップ７ １分間の６５℃ ステップ８ （７分＋１５秒）／サイクルの６８℃ ステップ９ 更に１１回、ステップ６からステップ８を繰り返す ステップ１０ ８分間の７２℃ ステップ１１ ４℃（一定に保つ） ２８サイクルの終了時に、５０μｌの反応混合物が取り除かれ、残りの反応混 合物が、以下のように更に１０サイクルに亘って放置された。 ステップ１ １５秒間の９４℃ ステップ２ １分間の６５℃ ステップ３ （１０分＋１５秒）／サイクルの６８℃ ステップ４ 更に９回、ステップ１からステップ３を繰り返す ステップ５ １０分間の７２℃ 反応混合物の５μｌから１０μｌのアリコットが、低濃度の（約０．６から０ ．８％の）アガロースミニゲル上で電気泳動によって分析され、何れの反応が配 列の拡張で上手く行われたかが求められた。全ての拡張が可能性として全長の遺 伝子を含むが、最も大きい生成物若しくはバンドの幾つかが、選択され、ゲルか ら切断された。ＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ， Ｃｈａｔ ｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）などの市販されたゲル抽出方法を用いて、更に精製が行わ れた。ＤＮＡが回収された後、クレノウ酵素が用いられて、配位結合及びクロー ニングを容易にする平滑断端を生み出す一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをト リム（ｔｒｉｍ）するために用いられた。 エタノールでの沈殿の後に、生成物が１３μｌの連鎖反応緩衝液内で再び溶解 された。次に、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）と１μｌのＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼとが加えられ、混合物が室温で２時間から３時間に亘 って、若しくは１６℃で一晩に亘って、インキュベートされた。コンポーネント 大腸菌細胞（４０μｌの適切な媒体）が、３μｌの連鎖反応混合物と共に形質転 換され、８０μｌのＳＯＣ媒体（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊらによる、上述されたさ れた）のなかで培養された。１時間に亘る３７℃での培養の後に、全体の形質転 換混合物が、２５ｍｇ／Ｌのカーベニシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ （ＬＢ）アガー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊらによる、上述された）に塗布された。 翌日、１２個のコロニーがランダムに各プレートからピックアップ されて、適切な市販されている無菌の９６ウェルマイクロチタープレートの各々 のウェル内に配置された１５０μｌの液体ＬＢ／カーベニシリン媒体内で培養さ れた。翌日、５μｌの各々の一晩を経た培養が非無菌の９６ウェルプレートへ転 移され、水を用いた１：１０の希釈の後に、５μｌの各々のサンプルがＴＣＲア レイ内に移された。 ＰＣＲ増殖のために、０．７５ユニットのＴａｑポリメラーゼと、ベクタープ ライマーと、拡張反応のために用いられる１つ若しくは両方の遺伝子特定プライ マーとを含む、５μｌの濃縮されたＰＣＲ反応混合物（１３３Ｘ）が、各ウェル に加えられた。以下の条件に基づいて増殖が行われた。 ステップ１ ６０秒間の９４℃ ステップ２ ２０秒間の９４℃ ステップ３ ３０秒間の５５℃ ステップ４ ９０秒間の７２℃ ステップ５ 更に２９回、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １８０秒間の７２℃ ステップ７ ４℃（保持） ＰＣＲ反応物のアリコットが、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で放置 された。ＰＣＲ生成物の寸法が、初めの部分的なｃＤＮＡと比較され、適切なク ローンが選択され、プラスミドと連鎖反応し、シーケンスされた。 ヒトＴＲＨに対する、ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びアミノ酸（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）配列が、第１図に例示されている。ＴＲＨの３つの可能 な翻訳が、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＰＩＲなどのタンパク質データベースに対し てサーチされ、正確な一致は発見されなかった。第２図は、ｔｒｈとＨＵＭＴＨ ＲＲ配列との比較を表している。ＶＩ アンチセンス分析 正しい完全なｃＤＮＡ配列（ＴＲＨ）の知識によって、その配列を遺伝子機能 の調査でのアンチセンス技術のためのツールとして用いることができる。オリゴ ヌクレオチド、ｃＤＮＡ、または遺伝子フラグメント（ｔｒｈのアンチセンスス トランド（ｓｔｒａｎｄ）を有する）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉ ｖｏの何れかで用いられて、ｍＲＮＡの発現を抑制する。そのような技術は当業 者にはよく知られており、アンチセンス分子は、ヌクレオチド配列に沿った様々 な位置で設計される。細胞若しくは試験用の動物の全体をそのようなアンチセン ス配列で治療することにより、対象とされている遺伝子が効果的に産生される。 しばしば、遺伝子の機能が、細胞内で、細胞で、組織で、若しくは生物体のレベ ル（例えば、致死量、分化機能の損失、組織の変化など）での振る舞いを観察す ることによってその実否が確かめられる。 構築された配列を特定の開いたリーディングフレームの転写を妨害することに 用いるのに加え、遺伝子の発現の修飾が、イントロン領域、プロモータ／エンハ ンサ要素若しくはトランス作用性調節遺伝子に対してアンチセンス配列を設計す ることによって得られる。同様に、抑制が、「三重螺旋」塩基対として知られて もいる、ホゲムーン（Ｈｏｇｅｂｏｏｍ）塩基対原理体系を用いて達成される。ＶＩＩ ＴＲＨの発現 ｔｒｈの発現は、適切な発現ベクター内へのｃＤＮＡのサブクローニングと、 類似の発現宿主へのベクターの転写とによって行われる。この特別な場合では、 ＤＮＡライブラリー、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの形成のために以前に用いられた クローニングベクターもまた、大腸菌内でのｔｒｈ配列の直接的な発現を提供す る。クローニング部位の上流側で、このベクターは、β−トラクトシアーゼに対 するプロモータを含み、そ の次に、アミノ末端Ｍｅｔ及びそれに続く７個のβ−ガラクトシアーゼの残基と が続く。この８個の残基のすぐ次には、人工的な開始及び転写に用いられる人工 的なバクテリオファージプロモータが続き、クローニングのためのＥｃｏ ＲＩ を含む複数の独自な制限部位が続く。 標準的な方法を用いたＩＰＴＧを伴った分離され移入されたバクテリアの株の 誘発が、最初のβ−ガラクトシダーゼの７個の残基と、約１５個の「リンカ」の 残基と、ｃＤＮＡ内にコードされたペプチドとに応ずる融合タンパク質を産生す る。ｃＤＮＡクローンの挿入が、基本的にランダムなプロセスによって生ずるの で、誘発されたｃＤＮＡが適切な翻訳に対する正しいフレーム内に存在すること が３回に１度の割合で生ずる。ｃＤＮＡが適切なリーディングフレーム内にない 場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発、エクソネクレアーゼＩＩＩまたはヤエ ナリヌクレアーゼの何れかを加水分解によって、若しくは適切な長さのオリゴヌ タレオチドリンカの封入体を含む公知の方法によって、適切な数のベースの削除 若しくは挿入によって得られる。 代わりに、ｔｒｈのｃＤＮＡが、特定の宿主内のタンパク質の発現のために有 効に用いられることが知られている他のベクター内にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ ｄ）される。クローニング部位と、目標とされるｃＤＮＡの両方の末端部位での ストレッチのためのハイブリダイゼーションを行うのに十分なＤＮＡのセグメン ト（約２５ベース）とを含むオリゴヌクレオチドプライマーが、標準的な方法に よって化学的に合成される。次に、これらのプライマーが、ＰＣＲによって所望 の遺伝子セグメントを増殖するために用いられる。その結果得られた遺伝子セグ メントは、標準的な条件の下で適切な制限酵素によって加水分解され、ゲル電気 泳動法によって分離される。交互に、同様の遺伝子セグメントが、ｃＤＮＡを適 切な制限酵素によって加水分解することで、産生される。適切な プライマーを用いるとき、２つ以上の遺伝子からのコード配列のセグメントが、 連鎖反応し、適切なベクター内でクローン化される。そのようなキメラ配列の構 築によって発現を最適化することができる。 適切な発現宿主には、限定を意図するものではないが、中国産のハムスターの 卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞などのほ乳類の細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫 の細胞、サッカロミセスセレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母菌細胞 、大腸菌などのバクテリアが含まれる。これらの細胞システムの各々に対して便 利な発現ベクターは、バクテリア内での増殖を可能にする複製のオリジンと、バ クテリア内でのプラスミドの選択を可能にするβラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝 子などの選択可能なマーカーとを含む。更に、ベクターは、移入された真核宿主 細胞内での選択を可能にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子など の第２の選択可能なマーカーを含む。真核発現宿主における使用のためのベクタ ーは、しばしば、対象とされているｃＤＮＡの一部ではないときに、３′ポリア デニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列のＲＮＡ処理エレメントを必 要とする。 更に、ベクターは、遺伝子の発現を増加するプロモータ若しくはエンハンサー を含む。そのようなプロモータは、ＣＨＯ細胞に対するＭＭＴＶ、ＳＶ４０及び メタロチオネインプロモータと、バクテリア宿主細胞に対するｔｒｐ、ｌａｃ、 ｔａｃ、及びＴ７プロモータと、酵母菌細胞に対するα因子、アルコール酸化酵 素、及びＰＧＨプロモータとを含む。ラウス肉腫ウィルスエンハンサーなどの移 入エンハンサーが、ほ乳類の宿主細胞内で用いられる。組み換え技術による細胞 の均一な培地が、標準的な培養方法によって得られると、大量の組み換え技術に よって産生されたＴＲＨが、純化培地から回収され、当業者に知られたクロマト グラフィー法によって分析される。ＶＩＩＩ 組み換えＴＲＨの分離 ＴＲＨは、タンパク質の精製を容易にするために加えられた１つ若しくは複数 の追加的なポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現される。 そのような精製を容易にするドメインは、限定を意図するものではないが、固定 化金属での精製を可能にするヒスチジントリプトファン、固定化免疫グロブリン での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ拡張／親和力精製 システムで用いられるドメインなどの金属キレート化ペプチドを含む（Ｉｍｍｕ ｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）。精製ドメインとｔｒｈ配列との間 のＦａｃｔｏｒ ＸＡ若しくはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）などの切断可能なリンカの配列を含むことが、ＴＲＨ の発現を容易にする上で有益である。ＩＸ キメラＴ７Ｇのテスト 機能的なキメラＴ７Ｇが、新たなイソフォームの細胞外受容配列を、既知のイ ソフォームのトランスメンブランセグメント及び細胞内セグメントと結合するこ とによって構築される。そのようなキメラ分子は、テストを行うのに便利である 。この発想は、Ｋｏｂｉｌｋａらによって（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ ０：１３１０−１３１６で発表され、この発表者らは、大量のα２−ＡＲトラン スメンブラン配列をβ２−ＡＲへ段階的に挿入することによって、一連のキメラ α２−β２アドレナリンレセプタ（ＡＲ）を作り出した。既知のアゴニストの結 合能力は、分子がβ２配座よりも多くのα２配座を有するようにシフトしたとき に、変化し、中間の構造が、混合された特異性を表した。しかしながら、アンタ ゴニストを結合するための特異性は、ドメインＶＩＩのソースと関連付けられて いる。配位子の認識のためのＴ７ＧドメインＶＩＩＩの重要さは、２個の酵母菌 のα因子レセプタを用いるキメラ内で見いだされ、 酵母菌レセプタが様々なレセプタとして分類されるので重要である。即ち、ある 特定のドメインの機能的な役割は、カテゴリーに関わらずＴ７Ｇファミリーを通 して保存されることが明らかである。 同時平行的に、ある特定のイソフォームからの内部のセグメント若しくは細胞 質ドメインが、既知のＴ７Ｇの類似のドメインと交換され、レセプタを三量体の Ｇタンパク質（Ｄｏｈｌｍａｎらによる（１９９１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏ ｃｈｅｍ ６０：６５３−８８）に結合するための構造的な決定基を同定するた めに用いられる。ドメインＶ、ＶＩ、及びβ２−ＡＲからの細胞内結合ループが α２−ＡＲに置換されるキメラレセプタが、配位子をα２−ＡＲの特異性と結合 されるが、β２−ＡＲと同様にアデニルシクラーゼを刺激することが表される。 このことは、アドレナリン型のレセプタに対して、Ｇタンパク質の認識が、ドメ インＶ及びＶＩと、その結合ループの中に存在するということを表している。α １−ＡＲからのＶ−＞ＶＩループが、β２−ＡＲの対応するドメインと置き換え られたキメラでは、逆の状況が予測され、結果としてもたらされたレセプタがβ ２−ＡＲ特異性を備えた配位子に結合し、α１−ＡＲと同様にＧタンパク質によ って仲介されたホスファチジルイノシトールの代謝を活性化させた。最終的に、 ムスカリン性レセプタから構築されたキメラもまた、Ｖ−＞ＶＩループがＧタン パク質の活性の特異性に対する主要な決定基であることを明らかにした（Ｂｏｌ ａｎｄｅｒ，上述されたように）。 キメラの若しくは修飾されたＴ７Ｇ（細胞外の及びトランフメンブラン領域の 気管を含む）が、レセプタ決定配位子結合特異性の両方の部分を示した。例えば 、２個のＳｅｒ残基が全てのアドレナリン型の及びＤカテコールアミンレセプタ ーのドメインＶ内で保存され、強いアゴニストの活性のために必要とされた。こ れらのセリンは、Ｔ７Ｇ結合部位内 に存在すると考えられており、かつアゴニストのカテコールの半分との水素結合 を形成すると考えられている。同様に、生物起源のアミンを結合する全てのＴ７ ＧのドメインＩＩＩ内に存在するＡｓ残基は、Ｔ７Ｇの結合部位内に存在して生 物起源のアミンのグループとのイオン対合を形成すると考えられてる。 機能的なクローンされたＴ７Ｇが異種構造の発現システム内で発現され、それ らの生物学的活性が査定される（Ｍａｒｕｌｌらによる(１９８８)Ｐｒｏｃ Ｎ ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：７５５１−５５；Ｋｉｎｇらによる（１９９ ０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１２１−２３）。１つの異種構造のシステムが、 酵母菌細胞へのほ乳類のＴ７Ｄ及びほ乳類のＧタンパク質に対する遺伝子を導い た。Ｔ７Ｇは、適切な配位子の特異性と親和力とを有し、酵母菌細胞の成長阻害 及び形態の変化といった適切な生物学的活性化の引き金となることが表された。Ｘ Ｄｒｈ特異的抗体の産生 Ｄｒｈに対する抗体を産生するために２つのアプローチが用いられ、各々のア プローチは、ポリクロナール抗体若しくはモノクロナール抗体の何れかを産生す るために便利である。一方のアプローチでは、逆相のＨｐｃｌ分離からの変性さ れたタンパク質が７５ｍｇまでの量で得られる。この変性されたタンパク質は、 標準的な手順を用いて、マウス若しくはラビットを免疫化するために用いられ、 約１００μｇがマウスの免疫化に適しており、一方、１ｍｇまでがラビットの免 疫化に適している。マウスのハイブリドマーを同定するためには、変性されたタ ンパク質が¹²⁵Ｉで標識され、抗体が産生される起こりうるマウスのＢ細胞のハ イブリドマーをスクリーンするために用いられる。この手順は、ごくわずかな量 のタンパク質を必要とし、２０ｍｇのタンパク質が、数千のクローンの標識化及 びスクリーニングに対して充分な量である。 第２のアプローチでは、適切なＴＲＨドメインのアミノ酸配列は、ｃＤＮＡの 転移から由来するように、高い免疫性の領域を決定するために分析される。第３ 図に例示されているように、適切な親水性領域を有するオリゴペプチドは、合成 されて、抗体を産生するべく、適切な免疫化プロトコルで用いられる。適切なエ ピトープを選択するための分析が、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭらによって（上述され た）説明されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列が、ペプチドのＣ末端 、Ｎ末端、及びそれらの介在する親水性の領域とに存在する。 通常、長さ約１５残基の選択されたペプチドが、ｆｍｏｃケミストリーを用い て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−雄性イミドベンゾイル −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エ ステル（ＭＢＳ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭらによる、上述された）との反応によっ て、鍵穴吸着フェモカイン（ＫＬＨ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）と 結合される。必要な場合、サイトカインがペプチドのＮ末端に導入されて、ＫＬ Ｈとの結合を可能にする。ラビットが完全なフロイントアジュバント内でペプチ ド−ＫＬＨ複合体と免疫化とされる。結果として得られたアンティセラ（ａｎｔ ｉｓｅｒａ）がプラスチックとペプチドを結合させ、１％の牛の血清アルブミン と共に阻止し、アンティセラを反応させ、洗浄し、かつ親和性の生成された、標 識化された、放射性若しくは蛍光の特定の羊の抗ラビットＩｇＧと反応させるこ とによって、抗ペプチドの活性がテストされた。 ハイブリドーマが、調製されて、標準的な技術を用いてスクリーニングされる 。対象とされているハイブリドーマは、所望の特異性を備えたモノクローナルの 抗体を産生するそれらの融合を同定するべく標識化さ れたＴＲＨによってスクリーニングされて検出される。通常の手順では、プレー トのウェル（ＦＡＳＴ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌ ｔｏ ＣＡ）が、親和性の精製された特定のラビット抗マウス（または適切な抗 種ＩＧ）の抗体（１０ｍｇ／ｍｌの）によってインキュベーションの間にコーテ ィングされる。このコートされたウェルは、１％のＢＳＡで阻止され、洗浄され 、ハイブリドーマからの上澄みによってインキュベートされる。洗浄の後に、ウ ェルは１ｍｇ／ｍｌの標識化されたＴＲＨでインキュベートされる。特定の抗体 を伴った上澄みは、バックグラウンドにおけるよりもより多くの標識化されたＴ ＲＨを結合している。次に、特定の抗体を産生するクローンが、拡張され、限定 された希釈における２サイクルのクローニングが施される。クローニングされた ハイブリドーマは、腹水を作るようにプリスタン処理された（ｐｒｉｓｔａｎｅ −ｔｒｅａｔｅｄ）マウスに注入され、モノクローナルな抗体がマウスの腹水か ら、タンパク質Ａ上の親和性クロマトグラフィーによって精製される。少なくと も１０⁸Ｍ^-1、好ましくは１０⁹から１０¹⁰若しくはそれ以上の親和力を有するモ ノクローナルな抗体が、標準的な手順によって産生され、この標準的な手順は、 Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＮＹ，及びＧｏ ｄｉｎｇ（１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒ ｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹに開示されており、これらは言及したことによって 本出願の一部とされる。ＸＹ ＴＲＨ特異抗体を用いた診断テスト 特定のＴＲＨ抗体は、信号の形質導入の評価、及びＴＲＨの量の相違 若しくはばらつき、または活性なシグナリングカスケードの下流側の産生物によ って特徴付けられる感染性のまたは遺伝性の状態を診断するのに有効に用いられ る。ＴＲＨは、ヒトの肝臓ライブラリーから見いだされたので、免疫保護若しく は免疫防衛に主に含まれるタイプの細胞内でアップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕ ｌａｔｅｄ）されることがわかる。 ＴＲＨの診断テストは、抗体及びラベルを、ヒトの体液、細胞膜、細胞、組織 、若しくはそれらの抽出物内のＴＲＨを検出するために用いる方法を含む。ポリ ペプチド及び本発明の抗体は、修飾なしに若しくは修飾されて用いられる。しば しば、ポリペプチド及び抗体は、電子を共有してあるいは電子を共有せずに、検 出できる信号に対する物質と結合されることによって標識化される。様々なラベ ル及び接合技術が科学的な文献及び特許文献の両方に非常に多く報告されており 、かつよく知られている。適切なラベルには、放射性ヌクレオチド、酵素、基質 、補助因子、インヒビター、蛍光剤、化学発光剤、磁気的粒子などが含まれてい る。そのようなラベルの使用方法を開示する特許は、米国特許第３，８１７，８ ３７号、３，８５０，７５２号、３，９３９，３５０号、３，９９６，３４５号 、４，２７７，４３７号，４，２７５，１４９号及び４，３６６，２４１号が含 まれている。更に、組換免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に 例示されているように産生され、この文献はここで言及したことによって本出願 の一部とされる。 タンパク質に対して特異的なポリクローナル若しくはモノクローナルの抗体の 遊離化を用いて、可溶性のまたはメンブランに結合されたＴＲＨを測定するため の様々な手順が当業者には知られている。その例として、酵素結合された免疫吸 着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）と、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）と、蛍光活性細胞ソ ーティング法（ＦＡＣＳ）がある。ＴＲＨの２個の非妨害エピトープに対して反 応するモノクローナルな抗 体を用いる２部位モノクローナルベースの免疫検定法が好ましいが、競合する結 合検定法が用いられてもよい。これらの検定法は、Ｍａｄｄｏｘ，ＤＥらによる （１９８３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１ｆに説明されている。ＸＩＩ 特異的抗体を用いた天然のＴＲＨの精製 天然の若しくは組み換え技術によるＴＲＨは、ＴＲＨに対して特異的な抗体を 用いて免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性 のカラムは、抗ＴＲＨ抗体を活性化されたクロマトグラフィー樹脂に電子対を共 有するように結合することで構成されている。 ポリクローナルな免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムによる沈殿、または固 定化されたタンパク質Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｅｍｏ ｌｏｇｙ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）の何れかによって免疫血清から調 製される。同様に、モノクローナルな抗体は、硫酸アンモニウムによる沈殿、若 しくは固定化されたタンパク質Ａでのクロマトグラフィーによって、マウスの腹 水から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ活性化セフ ァローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）のようなク ロマトグラフィーの樹脂と電子対を共有するように結合されている。抗体が樹脂 に結合され、樹脂が阻止され、誘導体の樹脂が、製造業者の指示に基づいて洗浄 される。 そのような免疫親和性カラムは、可溶性の形態でＴＲＨを含む細胞からフラク ションを調製することによって、ＴＲＨを精製するときに用いられる。この調製 は、全体の細胞の可溶化、または分画遠心分離によって得られた細胞のフラクシ ョンの可溶化（界面活性剤を加える場合と加えない場合とを含む）、若しくは当 業者に知られた他の方法によって行われる。代わりに、シグナル配列を含む可溶 性のＴＲＨが、利用できる 量で、細胞が成長した培地へスクリーニングされる。 可溶性のＴＲＨを含む調製は、免疫親和性カラムで行われ、このカラムが、Ｔ ＲＨの選択的な光学濃度を可能とする条件の下で洗浄される（例えば、界面活性 剤が存在する状態での高いイオン強度緩衝液）。次に、このカラムが抗体／ＴＲ Ｈの結合を分裂させる条件の下で希釈される（例えば、ｐＡ２−３の緩衝液、ま たは高い濃度の尿素イオン若しくはチオシアネートイオンなどのカオトロープ（ ｃｈａｏｔｒｏｐｅ））、ＴＲＨが採集される。ＸＩＩＩ 薬剤のスクリーニング 本発明は、特に、ＴＲＨまたはその結合フラグメントを、様々な薬剤スクリー ニング技術で用いることによって、治療上の化合物をスクリーニングするために 便利である。そのようなテストで用いられるポリペプチド若しくはフラグメント は、液体の形状、固体の支持物に取り付けられた形状、細胞の表面に取り付けら れた形状、若しくは細胞内に配置された形状である。薬剤のスクリーニングの１ つの方法は、上述されたようにポリペプチド、フラグメント、若しくはキメラを 発現する組み換え技術による核酸と共に安定して形質転換された真核宿主細胞若 しくは原核宿主細胞を用いる。薬剤は、競合する結合検定法において、それらの 形質転換された細胞に対してスクリーニングされる。そのようなセルは、生存可 能な形態若しくは減少する形態の何れかで、標準的な結合検定法に対して用いら れる。ＴＲＨと試験されている薬剤との間の複合体の形成が測定される。代わり に、テストされている薬剤によって引き起こされたＴＲＨとレセプターとの間の 複合体の形成の減少が試験される。 即ち、本発明は、シグナル伝達に影響を及ぼす薬剤若しくは他の薬品に対する スクリーニングを行う方法を提供する。これらの方法は、当業者にはよく知られ ており、その薬剤を、ＴＲＨポリペプチド若しくはそ のフラグメントと接触させ、（１）この薬剤と、ＴＲＨポリペプチド若しくはフ ラグメントとの間の複合体の存在を検定する過程と、（２）ＴＲＨポリペプチド 若しくはフラグメントと、細胞との間の複合体の存在を検定する過程とを有する 。それらの競合する結合検定法では、ＴＲＨポリペプチド若しくはフラグメント が、通常、標識化されている。適切なインキュベーションの後に、自由なＴＲＨ ポリペプチド若しくはフラグメントが、結合された形態のものから分離され、自 由な若しくは錯化されていない標識の量が、特定の薬剤のＴＲＨへの結合する能 力、若しくはＴＲＨと薬剤の複合体との形成を妨げる能力の目安となる。 薬剤をスクリーニングするための他の方法は、ＴＲＨポリペプチドに対する適 切な結合親和性を備えた化合物に対するスクリーニングのスループットを向上さ せ、この方法は、１９８４年９月１３日に公開された欧州特許出願８４／０３５ ６４号に説明されており、この欧州特許出願は言及したことによって本出願の一 部とされる。概略を述べると、複数の異なる小型のペプチド試験化合物が、個体 の基質（プラスチックピン若しくはその他の表面）の上で合成される。このペプ チド試験化合物が、ＴＲＨポリペプチドと反応して、洗浄される。次に、結合Ｔ ＲＨポリペプチドが、当業者に知られた方法によって検出される。代わりに、精 製されたＴＲＨが、上述された薬剤スクリーニング方法で用いるために直接プレ ートの上にコーティングされる。更に、中和されていない抗体が、ペプチドを捕 獲し個体の支持物にペプチドを固定化するために用いられる。 本発明は更に、ＴＲＨと特異的に結合することのできる抗体を中和することが 、ＴＲＨポリペプチド若しくはそのフラグメントと結合するためのテスト化合物 に匹敵する、共合する薬剤スクリーニング検定法の使用法をもたらす。このよう にして、抗体は、１つ若しくは複数の抗原決 定基（ＴＲＨを伴って）を占有する任意のペプチドの存在を検出するために用い ることができる。ＸＩＶ 合理的な薬剤の設計 合理的な薬剤の設計の目的は、対象とされている生物学的に活性なポリペプチ ドの、若しくはポリペプチドが相互作用をする小さい分子、例えばアゴニスト、 アンタゴニスト、若しくはインヒビターの、構造的な類似性を生み出すことであ る。それらの例の任意のものは、ポリペプチドのより活性的な若しくはより安定 な形状であり、若しくはｉｎ ｖｉｖｏのポリペプチドの機能を強めるか機能を 抑制する、薬剤を形成するために用いることができる（Ｈｏｄｇｓｏｎ Ｊ（１ ９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１、ここで言及したこ とによって本出願の一部とされる）。 １つのアプローチでは、対象とされているタンパク質の三次元構造、若しくは タンパク質インヒビター複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶学によって、若しくは コンピュータのモデリングによって、または最も多くの場合、この２つの方法の 組み合わせによって、決定される。ポリペプチドの形及び電荷が、構造を解明し 、かつ分子の活性部位を求めるために確かめられなければならない。ごく希に、 ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づくモデ リングによって得られる。どちらの場合でも、関連する構造の情報も、十分なイ ンヒビターを設計するために用いられる。合理的な薬剤の設計の有益な例が、Ｂ ｒａｘｔｏｎ Ｓ及びＷｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ３１：７７９６−７８０１）によって示されたように改善された活性若しく は安定性を有する分子、またはＡｔｈａｕｄａ ＳＢらによる（１９９３） Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３：７４２−４６によって示されたようにインヒビター 、アゴニスト、若しくはアンタゴニ ストとして働く分子を含む。 上述されたように機能的な検定法によって選択された目標とされる特異的抗体 を分離して、次にその結晶の構造を解明することも可能である。この方法では、 第１に、それに基づいて次の薬剤が設計されるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏ ｒｅ）が得られる。機能的な薬理学的に活性な抗体に対して抗イデオタイプの抗 体（抗ＩＤＳ）を産生することによって、タンパク質の結晶学的な解析を省略す ることができる。鏡に映った像を更に鏡に映すように、抗ＩＤＳの結合部位は、 もともとのレセプターと類似するということが予測される。次に、抗ＩＤＳが、 化学的に若しくは生物学的に産生されたペプチドのバンクからのペプチドを同定 して分離するために用いられる。分離されたペプチドは、次に、ファーマコアと して働く。 本発明によって、Ｘ線結晶学のような分析的な研究を行うのに十分な量のポリ ペプチドが産生される。更に、本発明によってもたらされたアミノ酸配列（ＴＲ Ｈ）の知識は、Ｘ線結晶学の代わりに若しくはそれに加えてコンピュータのモデ リング技術を用いる場合のガイダンスを提供する。ＸＶ シグナル伝達複合体の他のメンバーの同定 精製されたＴＲＨは、当業者に知られた様々な方法で選択されたＴＲＨドメイ ン内に組み込まれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで相互に作用する分子を捕獲するために用 いられる。好ましい方法には、ＴＲＨ内の一次アミノグループを、¹²⁵Ｉ ビル トンハンター試薬（Ｂｏｌｔｏｎ Ｈｕｎｔｅｒ）で標識化する方法がある（Ｂ ｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ （１９７３）Ｂｉｏｃｈ ｅｍ Ｊ １３３：５２９）。試薬は、付随する生物学的活性の損失なしに様々 な分子を標識化するために用いられてきた（Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡらによる（１９ ９１） Ｊ Ｂ ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１８９８９； ＭｃＣｏｌｌ Ｓらによる（１９９ ３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５５５）。 標識化されたＴＲＨは、相互作用を及ぼす分子の精製のための試薬として有効 に用いられる。親和的な精製のある実施例では、メンブラン結合ＴＲＨは、クロ マトグラフィーのカラムと電子を共有して結合される。ライブラリー若しくはタ ーゲットの細胞から導かれたセルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）の抽出物が、カ ラムを通過し、適切な親和力を有する分子がＴＲＨと結合する。ＴＲＨの複合体 がカラムから回収され、分離され、回収された分子がＮ末端タンパク質のシーケ ンシングを施される。このアミノ酸配列が、次に、捕獲された分子を同定するた めに、若しくは適切なＤＮＡライブラリーからの関連した遺伝子をクローニング するための縮重されたオリゴヌクレオチドプローブを設計するために用いられる 。 他の方法では、抗体がＴＲＨに対して産生され、特に、上述されたようにモノ クローナルの抗体が産生される。このモノクローナルな抗体は、配位子及びＴＲ Ｈの間の結合を抑制する抗体を同定するためにスクリーニングされる。これらの モノクローナルな抗体は、次に、治療上の用途に用いられる。ＸＶＩ 抗体、インヒビター、またはアンタゴニストの利用及び投与 ＴＲＨの抗原、インヒビター、またはアンタゴニスト（若しくはその他の信号 の形質導入を制限する処理、ＬＳＴ）は、治療の用途で投与された場合に、異な る効果をもたらす。ＬＳＴは、好ましくは約５から８のｐＨ濃度でより好ましく は、６から８のｐＨ濃度で、しかしこのｐＨ濃度は、製剤化された抗体、インヒ ビター、若しくはアンタゴニスト及び治療される状態に応じて変わる、非毒性の 不活性な薬理学的に許容される水溶性のキャリア媒体内で製剤化される。ＬＳＴ の特性には、分子 の可溶性、半減期、及び抗原性／抗免疫性が含まれており、これらの及びその他 の特性は、効果的なキャリアを定義する場合の手助けとなる。天然のヒトタンパ ク質が、ＬＳＴとして好ましいが、薬剤のスクリーニングの結果としてもたらさ れた有機的若しくは合成された分子も、特定の状況では同じように有効である。 ＬＳＴは、限定を意図するものではないが、局部的なクリーム及びゲル、粘膜 を介したスプレー及びエーロゾル、皮膚を介したパッチ及びバンデージ、静脈注 射及び洗浄用の製剤、及び経口投与液体、及びピル、特に胃酸及び酵素を押さえ るように製剤された、を含む公知の投与の経路によって導かれる。特定の製剤化 、正確な投与量、及び投与の経路が、専属の治療者によって、及び各々の特定の 状況に応じて決定される。 そのような決定は、治療される状態、投与されるＬＳＴ、特定のＬＳＴの薬物 動態学的なプロファイルなどの様々な要因を考慮して行われる。更に考慮される 要因としては、患者の病状（例えば、つらさ）、年齢、体重、性別、ダイエット 、投与の時間及び頻度、同時に投与されている薬の組み合わせ、薬に対する反応 の感度、治療に対する耐性／応答反応がある。ＬＳＴ製剤が投与される間隔は、 ３日から４日ごと、１週間ごと、２週間ごとに、ＬＳＴの半減期、及び消耗速度 に応じて変えられる。 通常の投与量は、投与の経路に応じて、０．１μｇから１０万μｇまで、全体 で約１ｇの投与量まで、調節される。投与量及び供給方法に関するガイダンスが 文献に提供されている。米国特許第４，６５７，７６０号、５，２０６，３４４ 号、若しくは５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は、異なるＬＳＴに 対して異なる製剤化を用いる。神経細胞などの細胞への投与は、血管内皮細胞な どのその他の細胞に対する方法とは異なる方法で行われる必要がある。 マスト細胞の活性化の引き金となる状況若しくは疾病における異常な 信号の形質導入が、ＬＳＴによって治療できるダメージを引き起こすということ が予測されている。そのような状況は、特に、過敏症若しくは過敏な反応が、上 述されたように治療される。ＬＳＴは、また、その他の全身の感染症若しくは局 部的な感染症、組織の外傷による損傷、遺伝若しくは環境による疾病（アレルギ ー、高血圧症、癌腫に関連する）、及びその他の異常な信号の形質導入に関連す る生理学的な及び病理学的な問題を治療するために用いることもできる。 上述された全ての出版物及び特許は、言及したことによって本出願の一部とさ れる。上述された本発明の方法及びシステムの様々な変形及び変更は、当業者に は、本発明の技術的視点を逸脱せずに可能であることが明らかとなる。本発明は 、ある特定の好ましい実施例に関連して説明されたが、本発明は、そのような特 定の実施例に限定されるものであると理解されるべきではない。もちろん、上述 された本発明を実行するための態様の様々な変更は、分子生物学及び関連する分 野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・ロックストリート 2309 (72)発明者 シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ ロスアルトスヒルズ・ラクレスタ 12555 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリペプチドを、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列でコード する精製されたポリヌクレオチド。 ２．核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはその相補体を有することを特 徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．生物体の標本でのトロンビンレセプタホモログ（ＣＡＬＲ）の発現に関連す る状態若しくは疾病の診断テスト法であって、 （ａ）前記生物体の標本を、ハイブリダイゼーション複合体を形成するのに適 した条件の下で、請求項１の前記ポリヌクレオチド、若しくはそのフラグメント と結合する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、 前記複合体の存在が、前記生物体の標本内での前記請求項１のポリヌクレオチド の発現と関連付けられている、前記検出する過程とを有することを特徴とする診 断テスト方法。 ４．請求項１に記載された前記ポリヌクレオチドからなる、発現ベクター。 ５．請求項４の発現ベクターと共に形質転換された宿主細胞。 ６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に例示された核酸配列を有するポリペプチドを産生 する方法であって、 （ａ）請求項５の前記宿主細胞を、前記ポリペプチドの前記発現に適した条件 の下で培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを有するこ とを特徴とするポリペプチドの産生方法。 ７．請求項１の前記ポリペプチドの少なくとも一部と相補的な核酸配列を有する アンチセンス分子。 ８．請求項７のアンチセンス分子と、薬理学的に許容できる賦形剤とを 有する薬理学的な組成物。 ９．トロンビンレセプターホモログの変化した発現に関連する状態若しくは疾病 を伴った対象物を治療する方法であって、 前記対象物に、請求項８の薬理学的組成物の効果的な量を投与する過程を有す ることを特徴とする方法。 １０．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチド 。 １１．請求項１０の前記ポリペプチドのアゴニスト。 １２．請求項１の前記アゴニストと、薬理学的に許容される賦形剤とを有するこ とを特徴とする薬理学的組成物。 １３．トロンビンレセプターホモログの変化した発現に関連する状態若しくは疾 病を伴った対象物を治療する方法であって、 前記対象物に、請求項１２の前記薬理学的組成物の有効な量を投与する過程を 有することを特徴とする方法。 １４．請求項１０の記載されたポリペプチドのインヒビター。 １５．請求項１４の前記インヒビターと、薬理学的に許容される賦形剤とを有す ることを特徴とする薬理学的組成物。 １６．トロンビンレセプターホモログの変化した発現に関連する状態若しくは疾 病を伴った対象物を治療する方法であって、 前記対象物に、請求項１５の前記薬理学的組成物の有効な量を投与する過程を 有することを特徴とする方法。 １７．請求項１０の精製されたポリペプチドに対して特異的な抗体。 １８．生物体の標本のトロンビンレセプターホモログの発現に関連した状態若し くは疾病に対する診断テスト方法であって、 （ａ）請求項１７の前記抗体を、前記抗体に適した条件の下で、前記生物体の 標本に組み合わせて、前記ポリペプチドを結合し、抗体：ポリ ペプチドの複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が、前記生物体 の標本内の前記ポリペプチドの前記発現に関連付けられている、前記検出する過 程とを有することを特徴とする方法。 １９．請求項１７の前記抗体と、薬理学的に許容される賦形剤とを有することを 特徴とする薬理学的な組成物。 ２０．トロンビンレセプターホモログの変化した発現に関連する状態若しくは疾 病を伴った対象物を治療する方法であって、 前記対象物に、請求項１９の前記薬理学的な組成物の適切な量を投与する過程 を有することを特徴とする方法。