JPH11505412A - ホスホリパーゼｃホモログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なホスホリパーゼＣホモログを同定し、コードするヌクレオチド（ｐｌｃｈ）及びアミノ酸配列（ＰＬＣＨ）を提供する。本発明には、ｐｌｃｈヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＰＬＣＨの産生のための発現ベクター、ＰＬＣＨと特異的に結合し得る抗体、過剰なヌクレオチド配列をコードするＰＬＣＨを検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、ＰＬＣＨの発現のための生物工学的処理をなされた宿主細胞、及びＰＬＣＨをコードする核酸分子及びＰＬＣＨに特異的に結合し得る抗体に基づいた、活性化した炎症または疾病状態の、ヒドロキシ尿素耐性細胞及び／または組織の診断テスト方法が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスホリパーゼＣホモログ 技術分野 本発明は分子生物学の分野に属し、特に、本発明では、マスト細胞ライブラリ ーに由来する新規なホスホリパーゼＣホモログの核酸及びアミノ酸配列について 記述している。 背景技術 ホスホリパーゼＣ ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、酵素の一種で、ジスルフィド異性化酵素とし ても知られており、膜貫通シグナル伝達において非常に重要な役目を果たす。ホ ルモン、増殖因子、神経伝達物質、及び免疫グロブリンを含む多くの細胞外シグ ナリング分子は、それぞれの細胞表面受容体に結合し、ＰＬＣ群を活性化する。 活性化ＰＬＣの役割は、ホスファチジルイノシトール ４，５−ビスリン酸（Ｐ ＩＰ２）、形質膜の微量成分の加水分解を触媒し、ジアシルグリセロール及びイ ノシトール １，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）を作り出すことである。 これらの各生化学的経路において、ＩＰ３及びジアシルグリセロールは、二次 メッセンジャーとしての役目を果たし、一連の細胞内反応のトリガーとなる。Ｉ Ｐ３は細胞内貯蔵部位からのＣａ⁺⁺の放出を誘導し、ジアシルグリセロールは、 プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。両経路は、分泌、神経活動、代 謝、及び増殖を含む細胞内プロセスを調節する膜貫通シグナル伝達機構の一部分 である。例えば、ヒトの単 球におけるインターロイキン４受容体シグナリングは、ＰＬＣの活性化を伴う（ Ｈｏ， ＪＬ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｅｘｐｅｒ Ｍｅｄ １８０ ：１４５７−６９）。 ＰＬＣのアイソフォームは数種類が同定されており、ＰＬＣ−β、ＰＬＣ−γ 、ＰＬＣ−δの３つに分けられる。更に、そのサブタイプは、例えばＰＬＣ−β −１のようにギリシャ文字の後にアラビア数字を付して示さる。ＰＬＣは、試料 が６２〜６８ｋＤａで、そのアミノ酸配列には２つの有意な類似性の領域が存在 する。Ｘで表される第１領域は約１７０アミノ酸からなり、第２領域またはＹ領 域は約２６０アミノ酸を含む。Ｇタンパク質依存性膜貫通シグナリングの機構 特定のＰＬＣの活性化は、グアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（Ｇタン パク質）または細胞表面受容体の固有チロシンキナーゼ活性によって媒介される 。ホルモン受容体を含む多くの形質膜結合性受容体は、細胞のＧタンパク質を活 性化する。各Ｇタンパタ質はアデニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホ スホリパーゼＣのような１または２以上の膜結合型エフェクタをオン状態にする 分子スイッチとしての役目を果たしうる。 Ｇタンパク質はα、β、及びγサブユニットを有するヘテロ三量体である。不 活性Ｇタンパク質はそのαサブユニットに密接に結合したグアニン二リン酸（Ｇ ＤＰ）分子を有する。受容体に結合したＧタンパク質がホルモンのような細胞外 リガンドに結合するとき、ホルモン−受容体複合体が、ＧＤＰのαサブユニット からの解離を起こさしめる。その直後に、ＧＴＰ分子がその部位を埋め、αサブ ユニットの固有ＡＴＰアーゼの作用により、Ｇタンパク質のホルモン−受容体複 合体からの解離を生じさせる。同時に、ＧＴＰ結合は、α−、β−、及びγ−サ ブユニッ ト間のアフィニティを減らし、β−γ複合体を取り除く。系によっては、β−γ 複合体が、次にＰＬＣβ−２を活性化する（Ｋａｔｚ Ａ ｅｔ ａｌ （１９ ９２） Ｎａｔｕｒｅ ３６０：６８６−９）。ホスホリパーゼアイソフォーム及びその細胞活性 ３つのＰＬＣのアイソフォームの触媒活性はＣａ⁺⁺に依存している。ＰＬＣに おけるＣａ⁺⁺の結合サイトは、２つの保存領域の１つであるＹ領域に存在するこ とが示唆されている。共通にイノシトールを含有するリン脂質、即ちホスファチ ジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール ４−リン酸（ＰＩＰ ）、及びホスファチジルイノシトール ４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）の任意 のアイソフォームによる加水分解によって、環式及び非環式イノシトールリン酸 が作り出される。多数のホルモン及び関連分子が、ホスホリパーゼを活性化する ことが知られている。ＰＬＣ−βアイソフォーム ＰＬＣのβ−１及びβ−２アイソフォームの両者は、Ｇタンパク質の何れかの サブタイプにより活性化され、細胞表面受容体からＰＬＣへのシグナル伝達の際 にＧタンパク質αサブユニットに関与する。Ｇタンパク質には２つの異なるタイ プがあり得、１つは百日咳毒素感受性のもの、もう１つは百日咳毒素非感受性の ものであって、これらはβ−１アイソフォームを活性化する。Ｋａｔｚ Ａ ｅ ｔ ａｌ（上述）は、Ｇタンパク質のβサブユニットもＰＬＣβ−１活性化しう ることを示唆している。ＰＬＣの活性化はサイトゾルにおけるＣａ⁺⁺のＰＬＣの 必要量を減らすより、むしろその固有活性を高めることによって達成される。ＰＬＣ−γアイソフォーム ＰＬＣγ−１アイソフォームは、主としてチロシンキナーゼファミリーに属す る増殖因子受容体によりリン酸化され活性化される。更に、こ の増殖因子受容体は、チロシンのリン酸化が起こる前に、γ−１アイソフォーム に結合する。上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及び 神経成長因子（ＮＧＦ）に対する受容体によるチロシンリン酸化の主なサイトは 、ＰＬＣアミノ酸配列の中のＴｙｒ−７７１、Ｔｙｒ−７８３、及びＴｙｒ−１ ２５４に現れる。受容体結合型チロシンキナーゼによるγ−１アイソフォームに おけるＴｙｒ−７８３のリン酸化は、γ−１アイソフォームの活性化に必要不可 欠である。 他の証拠が示唆していることは、非受容体型チロシンキナーゼも、白血球にお ける細胞表面受容体に応じてγ−１アイソフォームをリン酸化し、活性化するこ とができるということである。例えば、Ｔ細胞抗原受容体複合体は、抗原を認識 し、形質膜前後でシグナルを伝達することができる。同様に、非受容体型プロテ インチロシンキナーゼは、γ−２アイソフォームの活性化も行うことができるよ うである。 別の証拠が示唆しているのは、γ−２アイソフォームの活性化が、血小板由来 増殖因子によるホスホリパーゼＤの刺激に対して必要であるということである（ Ｙｅｏ Ｅ−Ｊ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９ （４５）：２７８２３−２７８２６）。他の証拠が示唆していることは、Ｂ細胞 表面抗原ＣＤ２０は、チロシン及びセリンキナーゼと結合し、チロシンのリン酸 化及びγ−１及びγ−２アイソフォームの活性化に関与しているということであ る（Ｄｅａｎｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５ １ （９）：４４９４−４５０４）。 ＰＬＣの増殖因子誘発活性化は、Ｇタンパク質の仲介とは独立しているようで ある。しかし、Ｍａｒｒｅｒｏ ＭＢ ｅｔ ａｌ（１９９４， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１０９３５−３９）の報告によれば、ラットの大動脈脈管 平滑筋細胞においては、ＰＬＣ−γ−１がＧタ ンパク質結合受容体により活性化されているという例外が存在する。ＰＬＣ−δ ＰＬＣ−δアイソフォームの受容体もトランスデューサも同定されていない。プロテインキナーゼによるＰＬＣの阻害 証拠が示唆していることは、ある種の細胞においては、プロテインキナーゼの 活性化がネガティブフィードバックシグナルの役目を果たし、大きさ及び持続時 間を含む受容体結合ＰＬＣ活性を減弱することである。例えば、プロテインキナ ーゼによる、ＥＧＦ受容体におけるＴｈｒ−６５４のリン酸化は、受容体チロシ ンキナーゼがγ−１アイソフォームをリン酸化する能力を低減することによりγ −１アイソフォームの活性化を防ぐ。更に、ｃＡＭＰ及びホルボール １２−ミ リステート １３−アセテート（ＰＭＡ）のようなＰＫＣ活性化因子は、Ｔ細胞 抗原受容体により誘導されたＰＩＰ２の加水分解を減弱する。同様に、ＰＬＣの β−１アイソフォームはある種の細胞においてＰＫＣにより調節されているよう である。二次メッセンジャー及びカルシウムイオンの効果：イノシトールトリスリン酸及 びジアシルグリセロール ひとたび活性化されると、ＰＬＣはホスファチジルイノシトール−４，５−ビ スリン酸（ＰＩＰ２）の加水分解を触媒して、ジアシルグリセロール及びイノシ トール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）を作りだし、これらの全てが二次メ ッセンジャーとしての役目を果たす。イノシトールトリスリン酸は、細胞内格納 部位からＣａ⁺⁺を放出し、細胞外液からのＣａ⁺⁺の流入を増加させる。Ｃａ⁺⁺は 、目標の酵素を直接調節し、二次メッセンジャーとしての機能を果たし、トロポ ニンＣ及びカルモジュリンのようなＣａ⁺⁺結合タンパク質と相互作用することに よって他の酵 素に間接的に作用する。 イノシトールトリスリン酸の経路の非活性化は、Ｃａ⁺⁺の細胞への能動輸送及 び形質膜結合型Ｃａ⁺⁺ＡＴＰアーゼによるイオンの排出によって達成される。同 様に、一連のリン酸化によりイノシトールトリスリン酸を分解する。 ＰＬＣの加水分解により生成されるジアシルグリセロールは、プロテインキナ ーゼＣを活性化することにより二次メッセンジャーとしての役目を果たす。プロ テインキナーゼＣがジアシルグリセロールに結合した後、プロテインキナーゼＣ によるＣａ⁺⁺の必要量は、サイトゾルにおいて遊離したＣａ⁺⁺が生み出されるレ ベルまで低下する。活性化プロテインキナーゼＣは、多数の細胞内タンパク質を リン酸化する。ジアシルグリセロールの効果は酵素リサイクリングにより止めら れて、ホスファチジルイノシトールが形成される。別の形態として、ジアシルグ リセロールリパーゼがジアシルグリセロールを破壊する。ＰＬＣ及び疾病 証拠が示すことは、原発性ヒト乳ガンの高いパーセンテージのものが、受容体 ＥＧＦ及びＰＬＣ−γ−１のレベルの上昇を伴うことである。同様に、自然発症 の高血圧ラットについての研究は、高血圧の主な理由の１つが、ＰＬＣアミノ酸 配列のＸ領域及びＹ領域における点突然変異から生じたＰＬＣ−δ−１の異常な 活性化であることを示唆している。 ＰＬＣの生物学は、特にＩｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ｅｔ ａｌ． （１ ９９４） Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎ ａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ Ｙ； Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ Ａ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎ １５１：６３７−６４８； ａｎｄ Ｒｈｅｅ ＳＧ ａｎｄ Ｃｈｏｉ ＫＤ （１９９４） Ｊ Ｂｉｏ ｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１２３９３−１２３９６に記されている。 発明の開示 本発明は、新規なヒト・ホスホリパーゼＣホモログ（ＰＬＣＨ）を一義的にコ ードするヌクレオチド配列を提供するものである。ｐｌｃｈなる符号を付して示 したｃＤＮＡは、初めにヒト・マスト細胞ライブラリーに由来するインサイト社 クローンＮｏ．９１１８内で発見された。 また、本発明には、これらのＰＬＣＨまたはその変異体を用いて、生理学的ま たは病理学的な損傷に関与する状態に介入する方法も含んでおり、この方法では 、ｐｌｃｈ核酸、またはそのフラグメントやオリゴマーを用いて試料または抽出 物をテストする。本発明の他の側面として、ｐｌｃｈのアンチセンスＤＮＡ、ｐ ｌｃｈを含むクローニングベクターや発現ベクター、ｐｌｃｈを含む発現ベクタ ーで形質転換された宿主細胞または宿主生物、宿主細胞からの精製ＰＬＣＨの産 生と回収方法、活性化または炎症細胞及び／または組織の診断または治療のため の抗体を産生するのに用いることができる精製ＰＬＣＨ、及びヒドロキシ尿素が 適切な治療となるような腫瘍から得られた生物学的試料に対して用いられる診断 テスト方法がある。 図面の簡単な説明 第１Ａ図及び第１Ｂ図は、ヒト・マスト細胞ｃＤＮＡライブラリーから得られ たホスホリパーゼＣホモログ（ＰＬＣＨ）のヌクレオチド配列（配列番号：１） 及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号：２）を、そ れぞれ示した図である。核酸配列及びアミノ酸配列のアライメントは、ＭａｃＤ ＮＡｓｉｓ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いて生成された。 第２図は、ハムスターのタンパク質ジスルフィド異性化酵素／フォーム１ホス ホイノシチド特異的ホスホリパーゼファミリーＣ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ＭＭ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２８１：６４５−５０）のＭ ＡＰ５ＰＲＯＭＲとコンセンサスＰＬＣＨ（配列番号：２、上側）のアミノ酸配 列アライメントを示した図である。 第３図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＰＬＣＨ疎水性の分析の結果を 示した図である。 第４図は、配列番号：１に示す本発明のＰＬＣＨに対するコンセンサス配列を 構築するのに用いられたＤＮＡ配列を示した図である。このＤＮＡ配列は、ＩＮ ＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅ ｍを用いて構築され、配列番号：３から配列番号：１３として示されている。 発明の実施の形態 定義 本明細書において、ＰＬＣＨ（上位の場合）なる用語は、ホスホリパーゼＣホ モログ、自然発生ＰＬＣＨ及びその活性断片を意味し、これらはｃＤＮＡまたは ｐｌｃｈ（下位の場合）から転写されたｍＲＮＡによりコードされる。 本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＰＬＣＨの生物学的及び／ または免疫学的活性を保持しているＰＬＣＨの形態を意味する。 本明細書において、“自然発生ＰＬＣ”なる用語は、生物工学的処理 を受けていない細胞により生成されたＰＬＣを意味し、より具体的には、アセチ ル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）及びア シル化を含む翻訳後修飾されたポリペプチドから生成される様々なＰＬＣの形態 を表現する用語である。 本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリング（例え ば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチ レングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾されたＰＬＣ、若しくは例 えばオルニチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸 の化学合成によって得られる挿入体、置換体のＰＬＣを意味する。 本明細書において、“組換え変異体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて 生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＰＬＣとは 異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。通常のシグナル伝達のよう な、興味の対象となる活性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミ ノ酸残基を決定するためには、特定のＰＬＣＨの配列と相同なペプチドの配列と を比較し、相同性の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。 アミノ酸の“置換”では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの 置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換 、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的 特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸 の“挿入”または“除去”は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換 えＤＮＡ技術を用いてＰＬＣＨ分子のアミノ酸の挿入、除去、または置換を体系 的に行い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異 体が実験的に決定され得る。 必要ならば、ＰＬＣＨポリペプチドを細胞膜を通して移動せしめる“シグナル 配列またはリーダー配列”を含むようにすることができる。このような配列は、 本発明のポリペプチド上に自然に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により 異種タンパク質源から得られる。 本明細書において、ポリペプチド“フラグメント（断片）”、“部分”、また は“セグメント”なる用語は、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個 のアミノ酸、または少なくとも約８〜１３個のアミノ酸からなり、別の実施例で は約１７個またはそれ以上のアミノ酸をからなるアミノ酸残基の伸展（ストレッ チ）を意味する。活性であるためには、ＰＬＣＨポリペプチドは、生物学的及び ／または免疫学的活性を示すに十分な長さを有している必要がある。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグ メント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、同一の、若しくは近縁 関係にあるｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子を増幅、または単に明らかにするためのポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成 法におけるプライマーとして使用するのに十分な長さを有するｐｌｃｈヌクレオ チド残基の任意のストレッチを意味する。 本発明には、天然または組換えポリペプチド源から得られた精製ＰＬＣＨポリ ペプチド、ＰＬＣＨをコードする組換え核酸分子で形質転換された細胞を含む。 ＰＬＣＨポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の周知となってい る。例えば、このようなポリペプチドの精製のために、本発明の提供する抗体を 用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。タンパ ク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ （１ ９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８２， Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”及び“Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ （１９ ８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ”に記載されており、これらの文献を本明細書と共に参照された い。 本明細書において、“組換え体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製 される、ＰＬＣＨをコードするポリヌクレオチドも意味する。ＰＬＣＨをコード するＤＮＡも対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み 得る。 “核酸プローブ”は、ＰＬＣＨをコードする本発明のｃＤＮＡ配列に基づいて 調製される。オリゴヌクレオチドは、そのＤＮＡ配列の部分を含み、少なくとも 約１５個のヌクレオチドからなるが、通常は約２０ヌクレオチドからなる。核酸 プローブは、約６ｋｂより少ない、通常は約１ｋｂ未満の塩基対数の配列の部分 からなる。偽の陽性を排除するための試験の後、これらのプローブを用いて、細 胞または組織内にＰＬＣＨをコードするｍＲＮＡが存在するか否かを判定したり 、または“Ｗａｌｓｈ ＰＳ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １：２４１−２５０”に記載のように染色体ＤＮＡから類似した 核酸配列を分離することができる。 本発明のプローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸に由来す るものであるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニック トランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野に おいて周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識す る方法は、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”または“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅ ｔ ａｌ （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ ｏｎｓ”に詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい 。 本明細書において、“活性化”細胞とは、通常の若しくは疾病状態のプロセス の一部としての神経分泌物質分子または酵素分子の搬出を含む細胞外または細胞 内膜輸送に関与する細胞を意味する。 別の形態として、本発明のポリペプチド、またはそれと近縁関係にあるポリペ プチドをコードする組換え変異体は、当業者に周知の技術を用いて、遺伝暗号の “重複性”を利用することにより合成、または選択され得る。様々な切断部位を 作り出すサイレント変化のような、様々なコドン置換を導入することで、プラス ミドやウィルスベクターへのクローニング、または特定の原核細胞系または真核 細胞系における発現を最適化することができる。また、突然変異を導入すること によって、それがＰＬＣＨポリペプチドまたはＰＬＣＨポリペプチドに付加され た他のペプチドのドメインにおいて反映され得ることになり、ポリペプチドの特 質を修正したり、リガンド結合親和力、鎖間親和力、または変性／ターンオーバ ー速度のような特性を変えることもできる。発明の詳細な説明 本発明は、初めにヒトのマスト細胞で同定された新規なヒト・ホスホリパーゼ Ｃホモログを一義的に同定するヌクレオチド配列を提供する。この初めに同定さ れた配列は、配列番号：３に示されている。これは、ハムスターのＰ５タンパク 質（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ＭＭ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２８１：６４５−５０）に対して相同であることが分かっており、該ハムス ターＰ５タンパク質はヒド ロキシ尿素、抗新生物剤に対する耐性を高めた細胞系において初めに同定された 。従って、ＰＬＣＨの発現は診断のために利用すると極めて有用である。ＰＬＣ Ｈは免疫活性細胞において特異的に発現することから、本発明の核酸（ｐｌｃｈ ）、ポリペプチド（ＰＬＣＨ）、及びＰＬＣＨに対する抗体は、免疫においてマ スト細胞が果たす役割を含む生理学的または病理学的プロセスの調査やインター ベンションにおいて有用である。従って、各ホスホリパーゼＣを用いた、特定の ＰＬＣＨの上方制御された発現に対する診断テストは、全身性または局所的な感 染症、外傷性の組織損傷、全身性または局所的な感染症、外傷性の組織損傷、高 血圧を伴う遺伝病や環境病、癌腫、その他シグナル伝達の異常を伴う他の生理学 的／病理学的な問題の診断や適切な治療を行うのに役立つ。 ＰＬＣＨをコードするヌクレオチド配列（またはその相補配列）は、分子生物 学の分野における当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これら の技術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマ ーとしての使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＰＬＣＨの組換え 体産生における使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの 化学的類似体等の生成における使用等が含まれる。更に、未だ開発されていない 分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的な 塩基対相互作用のような既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技術である 限り、ここに開示するヌクレオチド配列を、その分子生物学的技術において使用 することができる。 遺伝暗号の同義性（degeneracy）の結果、その一部に既知のヌクレオチド配列 及び自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を有するヌクレ オチド配列を有するようなＰＬＣＨをコードする多種のヌクレオチド配列が生成 され得る、ということは当業者には理解され よう。本発明は、より具体的には可能なコドン選択に基づいて組合せを選択する ことにより作られ得る全ての可能なヌクレオチド配列をその範囲に含んでいる。 これらの組合せは、自然発生ＰＬＣＨのヌクレオチド配列に対して適用されるよ うな標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて形成される。また、このような全 ての変異体は、具体的にここで開示されたものと考えられたい。 ＰＬＣＨ及び／またはＰＬＣＨ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格 な条件の下で自然発生ＰＬＣＨ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可 能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用をプロセシングした ＰＬＣＨ誘導体またはＰＬＣＨをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは 有益であり得る。コドン選択では、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主に おけるペプチドの発現速度を高めるように選択することができ、このときこの発 現速度は、その宿主における特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明 のＰＬＣＨ及び／またはＰＬＣＨ誘導体をコードするヌクレオチド配列を、この コードされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変える他の理由は、より望 ましい特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から形成されるものより長い半減 期を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 ＰＬＣＨをコードするヌクレオチド配列を、完全に確立された組換えＤＮＡ技 術（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅ ｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”参照）を用いて、様々 な他のヌクレオチド配列と結合してもよい。ｐｌｃｈを結合するのに有用なヌク レオチド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、コスミド、λファージ誘 導体、ファージミド等の各種クローニングベクターが含まれる。興味の対象とな るベクタ ーには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエン シングベクター等が含まれる。一般に、興味の対象となるベクターは、少なくと も１つの生物において複製起点機能を発揮する便利な制限エンドヌクレアーゼ検 知サイト、及び宿主細胞用の選択可能なマーカーを含み得る。 本発明の別の実施例では、ＰＬＣＨをコードする自然発生ヌクレオチド配列と ハイブリッド形成可能なｐｌｃｈ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが 提供される。このようなプローブは、ホスホリパーゼＣ受容体をコードする配列 を検出するのにも用いることができ、好ましくは、このｐｌｃｈをコードする任 意の配列のヌクレオチドの少なくとも５０％を含む。本発明のハイブリダイゼー ションプローブは、配列番号：１のヌクレオチド配列、または自然発生ｐｌｃｈ のプロモータ、エンハンサー要素、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来す るものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なリポーター群に より標識され得るが、このリポーター群には、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核 種、若しくはアルカリホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビ ジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合する。この他当業者に周知の技術 を用いてプローブを標識することができる。 米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，９６５，１８８号明細書に記載さ れているようなＰＣＲ法の実施において、ＰＬＣＨをコードするヌクレオチド配 列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法がある。このようなＰＣＲで使用 されるプローブは、組換えにより得られたものであるか、化学的に合成されたも のであるか、若しくは両者の混合であり得、また、診断的な使用に供される個別 のヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノム配列の同定に用いられる可能な縮重 配列のプール（degenerate pool）を含み得る。 ｐｌｃｈＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを作り出す ための他の方法には、ｍＲＮＡプローブの形成のためのベクターへの、ＰＬＣＨ 及びＰＬＣＨ誘導体をコードする核酸配列のクローニングが含まれる。このよう なベクターは従来より周知であって市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性標識を なされたヌクレオチドを添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブ を合成するのに使用することができる。 現在は、完全に化学合成によりＰＬＣＨ及びＰＬＣＨ誘導体をコードするＤＮ Ａ配列、またはその一部分を生成することが可能であり、その後、従来より周知 の試薬、ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入するこ とができる。更に、化学合成を用いて、ｐｌｃｈポリヌクレオチド配列若しくは その一部分に突然変異を起こさせることも可能である。 このヌクレオチド配列を用いて、炎症及びＰＬＣＨの異常なレベルの発現を伴 う疾病、炎症や活性化の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌ クレオチド配列は、従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件 の下で患者の体液または組織の試料に加えられ得る。インキュベーション時間の 経過後、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（ま たは他の展開剤を必要とする標識）を含有する適合性の液体で試料が洗浄される 。この適合性の液体を洗い流した後、染料を定量して標準値と比較する。染料の 量が著しく多い場合には、このヌクレオチド配列は試料とハイブリッド形成した ことになり、このアッセイにより炎症及び／または疾病の存在が確認される。 ｐｌｃｈのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのた めのハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示する ヌクレオチド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺 伝子及び／または染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような 技術には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対 するリンケージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラリまたはフローソ ートされた染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含 まれる。染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ ゼーション技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９ ８８） Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂ ａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ”に記載されている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染 色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと相関関係を有し得る。遺伝 子地図データの例としては、“１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）”がある。物理的染色体地図上でのｐｌｃ ｈをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因） との間の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するため の助けとなる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者と、キャリアまたは 発症者との相違を検出することができる。 ＰＬＣＨをコードするヌクレオチド配列を用い、周知の組換えＤＮＡ技術を利 用して精製ＰＬＣＨを作り出すことができる。遺伝子を単離した後その遺伝子を 発現させる方法を記載した文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅｄｄ ｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ”がある。ＰＬＣＨは、原核細胞または真核細胞の何れかの様 々な宿主細胞内において発現され得る。宿主細胞は、ｐｌｃｈヌクレオチド配列 が単離される種と同一の種、あるいは異なる種の何れからでも得ることができる 。組換えＤＮＡ技術によってＰＬＣＨを作り出すことの利点には、精製用として 十分な量のタンパク質が得られること、及び精製のための簡単な手順が利用でき るようになることがある。 ＰＬＣＨをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ホスホリパーゼ Ｃの発現及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る 。組換え細胞により産生されたＰＬＣＨは、使用される特定の遺伝子構造に応じ て、分泌されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質 は、分泌される形態で調製するのがより便利である。精製の工程は、使用される 産生プロセスの性質及び産生される特定のタンパク質の性質に基づいて決まる。 組換え体産生に加えて、固相技術（solid-phase technique）を用いた直接の ペプチド合成によりＰＬＣＨフラグメントを生成することもできる。（“Ｓｔｅ ｗａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄ ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ． Ｓａｎ Ｆｒａｎ ｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ （１９６３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４”参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合 成は、手作業で、あるいは機械により自動的に行うことができる。自動的な合成 は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ）を製造業者の指示に従って用いることにより行うことができる。 ＰＬＣＨの様々なフラグメントを個別に化学合成し、化学的な方法により結合す ることによってＰＬＣＨの完全長分子を生成することもできる。 抗体の誘導のために使用するＰＬＣＨは、免疫活性を有していなければならな い。ＰＬＣＨ特異的抗体の誘発のために使用するペプチドは、少なくとも５個、 好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。このペプ チドは、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部分をまねており、ＰＬＣＨに類似 した小さい自然発生分子の一部分の全アミノ酸配列を含み得る。ＰＬＣＨのアミ ノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬＨ）やキメラ分子 に対して産生される抗体のような他のタンパク質のストレッチと融合され得る。 特定のＰＬＣＨ配列に対して特異的な抗体は、適当な動物に該ポリペプチドま たは抗体フラグメントを接種することにより産生され得る。抗体が、ポリペプチ ドのエピトープに対して産生され、自然発生または組換えタンパク質の全体また は一部分に結合するならば、その抗体は特定のＰＬＣＨに対して特異的である。 抗体の産生は、動物への注射により生ずる免疫反応の刺激作用によるもののみな らず、合成抗体、または組換え免疫グロブリンライブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：３８３３−３８３７またはＨｕｓ ｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１ ”参照）のスクリーニングや、ｉｎ ｖｉｔｒｏのリンパ球集団の刺激のような 他の特異的結合分子の産生の類似した工程によってもなされる。現在の技術（“ Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４ ９：２９３−２９９”）では、抗体形成の原理に基づき、高度に特異的に結合す る多数の試薬を提供することができる。このような技術を、ＰＬＣＨに特異的に 結合し得る分子の産生に適用することができる。 本発明の他の実施例では、ＰＬＣＨ特異的抗体、受容体等を生理活性薬剤とし て用いて、全身性または局所的な感染症、外傷性の組織損傷、高血圧を伴う遺伝 病や環境病、癌腫、その他シグナル伝達の異常を伴う生理学的／病理学的な問題 を治療する。 ＰＬＣＨのアゴニスト、アンタゴニスト、及び受容体を含む生理活性組成物は 、最大許容投与量を決定するための哺乳類種に対する臨床研究と、安全な投与量 を決定するための人体に対する臨床研究をと含む、幾つかの方法論によって決定 された適切な治療のための投与量だけ投与され得る。更に、生理活性薬剤は、安 定度や半減期のような生薬学的な特性を高める、十分に確立された化合物や組成 物と合成され得る。治療的な生理活性組成物の投与は、血流への静脈注射による 方法、若しくは治療に利用可能なその他の効果的な手段によって行われることが 企図されている。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供されている。これらの実施例は 、例示を意図するものであり、本発明の限定を意図するものではない。 工業的応用性 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築 コンセンサス・ホスホリパーゼＣ配列の多くは、ヒト・マスト細胞ライブラリ ーを含む配列群のなかのインサイト社クローンＮｏ．８１１８において同定され た。配列番号：４〜１３の配列は、多くの異なるライブラリーに由来するインサ イト社のデータベースから見出された。これらの配列を用いて、当業者が完全長 ｃＤＮＡを構築し、それを用いてＰＬＣＨを生成するだけの十分な情報を得るこ とができる。 ヒト・マスト細胞ライブラリーを調製するのに用いられる細胞は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃの癌患者から得た。ヒト・マスト細胞ｃＤＮＡライブラリーは、ポ リＡ＋ｍＲＮＡを精製し、酵素学的に二本鎖相補的ＤＮＡを合成することにより 調製された。合成アダプタはｃＤＮＡの平滑末端に結合され、次いでｃＤＮＡは ファージλ由来のＵＮＩ−ＺＡＰ（商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌ ａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）に結合され、さらにこれがＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞株ＸＬ １−ＢＬＵＥ（商標登録）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に感染させられた。ｃＤＮ Ａライブラリの品質は、ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングされ、次いでｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標登録）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が、 ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセスにおいて切り取られた。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔは、プラスミド及びｃＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列の必要なもの全てを含む、 より小型の一本鎖環状ＤＮＡ分子である。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離 このファージミドＤＮＡは、細胞から放出され、精製されて、更に新鮮な細菌 性宿主細胞（ＳＯＬＲ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に再感染するのに 使用されて、この宿主細胞で二本鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファー ジミドがβ−ラクタマーゼに対する遺伝子を保有していることから、新たに形質 転換された細菌が、アンピシリン含有培地で選択された。 ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＷＥＬＬ（登録商標）−８ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、またはＱＩＡＧＥＮ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ． ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ ９１３１１）を用いて精製された。このシ ステムは、細菌細胞を溶解し高度に精製されたファージミドＤＮＡを単離するた めの、高速で信頼性が高く 高スループットの方法である。精製樹脂から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配 列決定及び他の分析的操作に用いるのに適したものであった。 ３．ｃＤＮＡクローンの配列決定 これらのマスト細胞ライブラリからランダム単離されたｃＤＮＡ挿入体は、部 分的に配列決定された。従来の酵素を用いた方法では、ＤＮＡポリメラーゼクレ ノウフラグメントＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）またはＴａｑポリメラーゼの ような酵素を使用して、目的のＤＮＡ鋳型にアニールされたオリゴヌクレオチド プライマーからＤＮＡ鎖を伸展させる。このような方法は一鎖若しくは二鎖の鋳 型の双方を使用するために開発されてきた。鎖終結反応生成物は、電気泳動及び 尿素アクリルアミドゲルを用いて分離され、オートラジオグラフ法（放射性核種 で標識された前駆物質を用いる場合）、若しくは蛍光剤（蛍光剤で標識された前 駆物質を用る場合）の何れかによって検出される。反応調製、配列決定、及び蛍 光検出法を用いた分析において、最近の機械化により、１日に決定される配列の 数を増やすことが出来るようになった（ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｔ ８００、ま たはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、を４台のＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及び ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７及び３７３ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓを用いる）。 ４．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索 このようにして得られた各配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 製の検索アルゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標） ６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用い て、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比較された。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒ ｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ （ＴＲＷ Ｉｎｃ．， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡ）を用いて、相同性領域を決定した。配列比較を どのように行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウ オフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用い て、興味の対象である配列に対して相同性を有する領域を含む配列を、ＤＮＡデ ータベースから検索し、適当な配列に対して初期値と共にスコアが付けられた。 続いて、これらの相同領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定 し、偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するため にＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＤＮＡ配列の相同 性の検査に類似した方法で確認された。Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域を含 むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコアを 付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、 有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。 別の形態として、ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“Ｂａｓ ｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （Ａｌｔｓ ｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ ｌ ２１５：４０３−１０）”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した 。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列双方のアライメントを検出して 、配列の類似性 を決定する。アライメントが局部的であることから、ＢＬＡＳＴは、正確な一致 の決定、または相同性検索に特に有用である。一致はギャップを含まないのが理 想であるが、モチーフスタイルの検索は適切ではない。ＢＬＡＳＴアルゴリズム 出力の基本単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（Ｈ ＳＰ）である。 ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメ ントスコアがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコア以上である ような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、興味 の対象となる配列と、データベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統 計的優位性を評価し、ユーザが選択した優位性の閾値を超える一致のみを知るこ とができる。パラメータＥは、データベース配列との一致で報告されるものを選 択するための、統計的優位性の閾値を設定するパラメータである。Ｅは、データ ベース検索全体の文脈の中で、ＨＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の一致の予 定頻度の上限と解釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラムの出力 において報告される。 ５．遺伝子の同定、完全長配列決定、及び翻訳 インサイト社クローンＮｏ．９１１８で同定されたマスト細胞ライブラリーか らランダムにピックアップし配列決定することによって得られたＩＮＨＥＲＩＴ （商標）の分析の結果、ハムスターのＰ５遺伝子、またはタンパク質ジスルフィ ド異性化酵素（上述のＣｈａｕｄｈｕｒｉ ＭＭ ｅｔ ａｌ）のホモログが得 られる。インサイト社クローンＮｏ．９１１８を含むｃＤＮＡ挿入断片は、上述 の方法を用いて完全に配列決定される。この挿入断片は、全て、ヌクレオチドの 概ね１３０番目から９５０番目（データは示されていない）に対応する開放読み 枠からなる。クローンＮｏ．９１１８から得られた該挿入断片、インサイト社の クロ ーンのデータベース（配列番号：４〜１３参照）、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）及び ハムスターの配列をガイドとして用いることによって、第１図に示すコンセンサ ス配列を構築した。第１図に示す翻訳（配列番号：２）に対して、ＳｗｉｓｓＰ ｒｏｔ及びＰＩＲのようなタンパク質データベースを検索したが、完全に一致す るものは見つけられなかった。第２図に示すのは、ＰＬＣＨコンセンサス配列と ハムスターＰ５タンパク質の配列との比較である。第３図に示すのは、ＰＬＣＨ に対する疎水性プロットである。第４図は、配列番号：３〜１３の集合の比例代 表図（proportional representation）である。 ６．アンチセンス分析 ＰＬＣＨの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査に おけるアンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。オリゴヌクレオ チド、即ちｐｌｃｈのアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメ ントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、ｍＲＮＡの発現を阻害 することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の様々な部 位に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動物の全体をこ のようなアンチセンス配列で処理することより、ｐｌｃｈ遺伝子の機能を効果的 に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若しくは生物 体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の変化等） を観察することにより、ｐｌｃｈ遺伝子の機能を確認することができる。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節 遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾 することかできる。同様に、“三重らせん体 （トリプルヘリックス）”塩基対として知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用い ても阻害が達成される。 ７．ＰＬＣＨの発現 ｐｌｃｈの発現は、ｐｌｃｈを適当な発現ベクターにサブクローニングし、そ のベクターを適当な発現宿主に導入させることにより達成される。特にこの場合 には、以前に組織ライブラリの生成のために使用されたクローニングベクターも Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐｌｃｈ配列を直接発現させる。例えば、クローニングサ イトの上流において、このベクターはβガラクトシダーゼのプロモータを有し、 それに続けてアミノ末端Ｍｅｔ及び次に続くβガラクトシダーゼの７つの残基を 含む配列を含む。これらの８つの残基のすぐ後に、人為的プライミング及び転写 に役立つ工学的処理をなされたバクテリオファージプロモータ、及びクローニン グのための、Ｅｃｏ ＲＩを含む多数の独特な制限サイトを有する。 標準的方法を用いて、単離された、ＩＰＴＧのトランスフェクションをなされ た菌種の誘発により、βガラクトシダーゼの始めの７つの残基とリンカーの約１ ５個の残基に対応する融合タンパク質、及びｃＤＮＡにコードされたペプチドが 生成される。ｃＤＮＡクローン挿入断片は必ずランダムプロセスによって生成さ れることから、入れられたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠内に存在 する機会は３つに１つだけである。ｃＤＮＡが適当な読み枠内にない場合には、 それは周知の方法で適切な数の塩基の削除若しくは挿入を行うことによって得ら れる。このような方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘導、エキソヌクレ アーゼＩＩＩ若しくは大豆ヌクレアーゼによる消化、若しくはオリゴヌクレオチ ドリンカー混入などがある。 ｐｌｃｈのｃＤＮＡは、特異的宿主におけるタンパク質の発現のために有用で あると知られている他のベクター内にシャトルされる。標的ｃ ＤＮＡ（２５個の塩基）の両端のストレッチに対してハイブリッド形成するのに 十分なＤＮＡのセグメントとクローニングサイトを含むオリゴヌクレオチドアン プリマーは、標準的方法によって化学的に合成され得る。次いでこれらのプライ マーを用いて、ＰＣＲにより所望の遺伝子セグメントが増幅される。得られた新 たな遺伝子セグメントは、標準状態のもとで適当な制限酵素で消化され、ゲル電 気泳動法によって単離される。これとは別の方法では、類似する遺伝子セグメン トを、ｃＤＮＡを適当な制限酵素と共に消化し、欠失した遺伝子セグメントを化 学的に合成されたオリゴヌクレオチドで埋めることによって生成する。１以上の 遺伝子からのコーディング配列のセグメントを互いに連結し、適切なベクターに クローニングすることにより、組換え配列の発現が最適化される。 このようなキメラ分子のための適切な発現宿主にはチャイニーズハムスターの 卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞のようなほ乳類の細胞や、Ｓｆ９細胞のよう な昆虫の細胞や、サッカロミセスセレビシエのような酵母菌細胞や、Ｅ．ｃｏｌ ｉのような細菌があるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系 のそれぞれに対して有用な発現ベクターは、バクテリア内での増殖を可能にする 複製起点、及び細菌内での選択を可能にするβラクタマーゼ抗生物質抵抗性遺伝 子のような選択可能なマーカーを含んでいる。更に、このベクターは、真核生物 の宿主細胞へのトランスフェクションに役立つネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを含む。真核生物の発現宿主に おいて使用するために、ベクターは、それが目的のｃＤＮＡの一部分でない場合 には、３’ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシング要素を必要とするこ とがある。 更にこのベクターは、遺伝子発現を増加させるエンハンサまたはプロ モータを含む。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＣＨＯ細胞に対し てはＭＭＴＶ、ＳＶ４０、及びメタロチオネインプロモータ、細菌宿主に対して はｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモータ、また酵母菌に対してはα因子 、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨプロモータ等がある。ラウス肉腫ウィル ス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサは、ほ乳類宿主細胞において使 用される。標準的な培養方法により、組換え細胞の均質な培養物がひとたび得ら れたならば、組換えにより生成された大量のＰＬＣＨが条件培地から回収され、 周知のクロマトグラフィー法を用いて分析される。 ８．組換えＰＬＣＨの単離 任意のＰＬＣＨは、タンパク質精製を促進するべく添加された１または２以上 の付加的ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現される。こ のような精製促進ドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定免疫グロブリン 上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸展／アフィニ ティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ． Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）にお いて使用されるドメインなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。 精製ドメインとｐｌｃｈ配列との間のＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖ ｔｒｏｇｅｎ）のような切断可能なリンカー配列を含むことが、ＰＬＣＨの発現 を促進するのに役立っている。 ９．ＰＬＣＨ特異的抗体の生成 ＰＬＣＨに対する抗体を生成するのに２つの方法が用いられる。それぞれの方 法はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れかを生成するために有用 なものである。その方法の１つでは、逆相ＨＰＬＣ分離により、変性タンパク質 が最大７５ｍｇ得られる。変性タンパク質は 標準的なプロトコルを用いてマウス若しくはウサギを免疫化するのに用いられる 。即ちマウスの免疫化に対しては約１００μｇが適切であり、ウサギの免疫化に は最大１ｍｇが用いられ得る。マウスハイブリドーマの同定のためには、変性タ ンパク質が放射性沃素で標識して、抗体を産生し得るネズミのＢ細胞ハイブリド ーマのスクリーニングを行うのに用いる。この手順で必要となるタンパク質はご く少量で、即ち数千のクローンの標識付け及びスクリーニングのためには２０ｍ ｇで十分である。 第２の方法においては、ｃＤＮＡの転写から演繹されるＰＬＣＨのアミノ酸配 列が分析されて、免疫抗原性の高い領域が決定される。適当な親水性領域を含む オリゴペプチドが合成され、抗体を生成するための適切な免疫化プロトコルにお いて使用される。適当なエピトープを選択するための分析は、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ等（ｓｕｐｒａ）によって説明されている。免疫化のための最適なアミノ酸 配列が通常存在するのは、Ｃ末端、Ｎ末端、及びそれらの間に挟まれた、タンパ ク質がその自然な配座にあるとき外部環境にさらされることの多いポリペプチド の親水性領域である。 典型的には、約１５個の残基を有する長さの選択されたペプチドは、ｆｍｏｃ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐ ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、 Ｍ−メイルイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）と反応（ＭＢＳ； Ａｕｓｕｂｅ ｌ ＦＭ 等， ｓｕｐｒａ）させることによってキーホールリンペットヘモシ アニン（ＫＬＨ、Ｓｉｇｍａ）に結合される。必要ならば、ＫＬＨと結合できる ようにするため、システインがペプチドのＮ末端に挿入される。ウサギは、フロ イント完全アジュバントのペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫化される。 得られた抗血清は、ペプチドとプラスチックを結合し、１％のウシの血清アルブ ミンでブロックし、抗血清と反応させ、洗浄し、かつ（放射性またはけい光剤に より）標識されたアフィニティ精製された特異的ヤギ抗ウサギｌｇＧと反応させ ることによって抗ペプチド活性がテストされる。 ハイブリドーマは標準的な技術を用いて調製されスクリーニングされる。目的 のハイブリドーマは、標識されたＰＬＣＨと共にスクリーニングを行うことによ って検出され、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する融合体が同 定される。典型的なプロトコルにおいては、プレートの穴（ＦＡＳＴ； Ｂｅｃ ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）が、１０ｍｇ／ ｍｌの、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗−種ｌ ｇ）抗体によってコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡで ブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマからの上澄みに曝される。インキュ ベーションの後、穴は１ｍｇ／ｍｌの標識されたＰＬＣＨに曝される。抗体を産 生するクローンは、上述のバックグラウンドにおいて検出され得る量の標識され たＰＬＣＨと結合する。このようなクローンはが拡大され、限界希釈（１細胞／ ３穴）で２サイクルのクローニングを受ける。クローン化されたハイブリドーマ はプリスタン処理されたマウスに注射されて、それが腹水を生成し、プロテイン Ａ上のアフィニティクロマトグラフィーによってマウスの腹水からモノクローナ ル抗体が生成される。少なくとも１０⁸／Ｍ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰またはそ れ以上の親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的には、Ｈａｒｌｏｗ ａ ｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ及びＧｏｄｉｎｇ（１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉ ｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙに記載されているような標準的 な手順によって生成される。ここではこの２つの資料を参照されたい。 １０．ＰＬＣＨ特異的抗体を用いる診断テスト 特定のＰＬＣＨ抗体は、ＰＬＣＨの量若しくは分布の差によって特徴付けられ る高血圧、シグナル伝達に対して耐性を有する腫瘍の調査や、感染状態や遺伝状 態の診断に役立つ。ＰＬＣＨはヒトのマスト細胞ライブラリーにおいて見出され たことから、主として免疫保護または防御に関与する細胞の型においてアップレ ギュレートされていると思われる。 ＰＬＣＨに対する診断テスト方法には、人体の体液、膜、細胞、組織、若しく はそのような組織の抽出物における特定のＰＬＣＨを検出するべく抗体及び標識 を使用する方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して使用され るか、または修飾することなく使用される。このポリペプチド及び抗体は、多く の場合、検出可能なシグナルを伝達する物質と共有結合、若しくは非共有結合の 何れかで結合することによって標識される。さまざまな標識及びその関連技術が 知られており、科学文書及び特許明細書の双方において広く報告されてきた。適 切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、共同因子（cofactors）、阻害剤 、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識の使用方法 は、米国特許出願第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９ ３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２ ７５，１４９号、及び第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。また組 換え免疫グロブリンは、米国特許出願第４，８１６，５６７号明細書に記載の方 法により生成することができる。こ れらの明細書を本明細書とともに参照されたい。 該タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、若しくはモノクローナル 抗体の何れかを用いる、可溶性ＰＬＣＨまたは膜結合ＰＬＣＨの測定のためのプ ロトコルは、様々なものが周知となっている。この例を挙げると、酵素結合イム ノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍 光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）等がある。好適なのは、ＰＬＣＨ上の２つの非 干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二点（two sites ）モノクローナル免疫アッセイであるが、競合的結合アッセイを用いてもよい。 これらのアッセイは例えばＭａｄｄｏｘ， ＤＥ 等（１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）のような他の文書に記載されている。 １１．特異的抗体を用いた未変性ＰＬＣＨの精製 未変性（nitive）ＰＬＣＨまたは組替えＰＬＣＨは、ＰＬＣＨに対して特異的 な抗体を用いる免疫性アフィニティクロマトグラフィーによって精製される。一 般に、免疫アフィニティカラムは、抗ＰＬＣ抗体と活性化クラマトグラフィー樹 脂とを共有結合することによって構成される。 ポリクローナル免疫グロプリンは、硫酸アンモニウムとともに沈殿させるか、 固定プロテインＡ上で精製させることによって免疫血清から調製される（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿か固定プロテイ ンＡ上でのクロマトグラフィーによって、マウスの腹水から調製される。部分的 に精製された免疫グロプリンは、ＣｎＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフ ィー樹脂に共有結合される。製造者の指示に従った処理により、抗体は樹脂に結 合し、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂が洗浄される。 このような免疫アフィニティカラムは、ＰＬＣＨを含む細胞の分画を調製する ことによってＰＬＣＨの精製を行うときに使用される。この調製は、全ての細胞 の可溶化を行い、（洗剤を添加して行われる、または洗剤無添加での）分画遠心 分離を用いて得られる小細胞分画の単離を行う方法か、若しくは周知の他の方法 によって誘導される。別の方法では、シグナル配列を含む可溶性ＰＬＣＨが、細 胞が成長する媒質に有用な量だけ分泌される。 沈殿物を含む分画のＰＬＣＨは免疫アフィニティカラムを通され、このカラム がＰＬＣＨの優先吸収が可能な条件（即ち、洗剤が存在する高イオン強度の緩衝 液を使用）のもとで洗浄される。次いで、このカラムは抗体／ＰＬＣＨ結合を切 断するような条件（即ち、尿素またはチオシアネートイオンのような高濃度のカ オトロープまたはｐＨ２〜３の緩衝液を使用）の下で溶離され、ＰＬＣＨが回収 される。 １２．薬物スクリーニング 本発明のＰＬＣＨ若しくはその結合フラグメントを、様々な薬物スクリーニン グ技術で治療的な組成物をスクリーニングするのに利用することができる。この ようなテストにおいて用いられるＰＬＣＨポリペプチドまたはフラグメントは、 溶液の中に遊離している形態のものか、固体の支持体に付着している形態のもの か、細胞の表面に支持されている形態のものか、あるいは細胞内に存在する形態 のものの何れかである。薬物スクリーニングの一方法では、宿主細胞として、Ｐ ＬＣＨポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組換え核酸で安定的に形 質転換される真核細胞または原核細胞を利用する。薬物は、競合的結合実験にお いて形質転換された細胞からスクリーニングされる。このような細胞は、生存型 であれ固定型であれ標準的な結合実験に使用することができる。これを用いて、 例えばＰＬＣＨと試験される薬剤との複合体形成を測定 したり、あるいは試験される薬剤によって生じた、ＰＬＣＨと受容体との複合体 の減少を検査することができる。 従って、本発明は、シグナル伝達に影響を及ぼす薬剤または他の薬物のスクリ ーニング方法を提供するものである。これらの方法は、本発明のＰＬＣＨポリペ プチド、若しくはそのフラグメントをこのような薬剤に接触させる過程と、（ｉ ）ＰＬＣＨポリペプチド若しくはそのフラグメントとその薬剤との複合体の存在 、若しくは（ｉｉ）ＰＬＣＨポリペプチドまたはそのフラグメントと細胞との複 合体の存在を、周知の方法により検定（アッセイ）する過程とを含む。このよう な競合的結合検定法においては、ＰＬＣＨポリペプチドまたはそのフラグメント は通常標識される。適当なインキュベーションの後、遊離したＰＬＣＨポリペプ チドまたはそのフラグメントが、結合した形態で存在するものから分離されるが 、遊離した複合体を形成していない標識の量が、特定の薬剤がＰＬＣＨに結合す る能力、またはＰＬＣＨ／細胞複合体に干渉する能力の尺度となる。 薬物スクリーニングのための他の技術では、本発明のＰＬＣＨポリペプチドに 対する適切な結合親和性を有する複合体を高スループットでスクリーニングする ことができ、その技術の詳細は１９８４年９月１３日公開の欧州特許出願第８４ ／０３５６４号明細書に記載されており、本明細書と共にこれを参照されたい。 この方法を簡単に述べると、たくさんの異なる小さなペプチドのテスト化合物が 、例えばプラスチックピンまたは他の物質でできた固体基板の表面上で合成され る。ペプチドテスト化合物は、ＰＬＣＨポリペプチドと反応させられたた上で、 洗浄される。次いで、結合ＰＬＣＨポリペプチドが、周知の方法により検出され る。上述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＰＬＣＨをプ レート上に直接コーティングすることもできる。更に、非中和 性抗体を用いて、固体支持体上にペプチドを捕捉若しくは固定化することができ る。 ＰＬＣＨポリペプチド若しくはそのフラグメントに結合するテスト化合物と、 ＰＬＣＨに結合できる中和性抗体とが特異的に競合する競合的薬物スクリーニン グアッセイの利用も本発明の企図するところである。このようにして、この抗体 を用いて、ＰＬＣＨと１または２以上の抗原決定基が共通な任意のペプチドの存 在を検出することができる。 １３．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目標は、興味の対象の生物学的に活性のポリペプチド、 若しくは、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤のような、その ポリペプチドが相互作用する小分子の構造的な類似体を作り出すことである。こ こに例として挙げたものは何れも、より活性の高いまたは安定な形態のポリペプ チドである薬剤、またはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を強化、または阻 害する薬剤を作り出すのに用いることができる（“Ｈｏｄｇｓｏｎ Ｊ （１９ ９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１”を本明細書とともに 参照されたい）。 １つの方法では、ＰＬＣＨまたはＰＬＣＨ−阻害剤複合体の三次元構造の決定 を、Ｘ線結晶解析、コンピュータによるモデル化、若しくは最も典型的にはこの ２つの手段を組合せて行う。構造を解明し、分子の活性部位を決定するために、 ポリペプチドの形状及び電荷を確認しなければならない。ポリペプチドの構造に 関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得られ ることもある。何れの場合においても、対象物の構造の情報を用いて、効果的な 阻害剤がデザインされる。有用な合理的薬物デザインの例としては、Ｂｒａｘｔ ｏｎ Ｓ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６−７８０１）により提示されたような、活性または安定性が改善 された分子、若しくは、Ａｔｈａｕｄａ ＳＢ等（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅ ｍ １１３：７４２−７４６）によって提示された未変性ＰＬＣＨの阻害剤、ア ゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子があり、ここでは上述の両文 献を参照されたい。 上述のように、機能検定により選択された標的特異的抗体を単離し、次いでそ の結晶構造を解明することも可能である。通常この方法により、続けて行われる 薬物デザインにおける基礎となり得るファーマコア（pharmacore）が得られる。 機能的な、薬理学的に活性の抗体に対する抗イデオタイプの抗体（抗ｉｄ）を生 成することにより、タンパク質の結晶解析を略すことが可能である。鏡像の鏡像 と同様の意味で、抗ｉｄの結合部位は、もとのレセプタの類似体であることが期 待される。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作られたペプチド のバンク（bank）から、ペプチドを同定し単離することができる。単離されたペ プチドは、ファーマコアとして役立つ。 本発明により、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を行うのに使用できる十分な 量のポリペプチドを作ることができる。更に、ここに開示したＰＬＣＨアミノ酸 配列の知識を、Ｘ線結晶解析の代わり、またはそれと共に用いられるコンピュー タによるモデル化技術に応用することができる。 １４．シグナル伝達複合体の他のメンバーの同定 精製ＰＬＣＨを、相互作用またはシグナル伝達経路タンパク質を同定し、特徴 付け、精製するための研究用ツールとして利用することができる。様々な周知の 方法を用いてＰＬＣＨに放射性標識を組み込むことができ、これを可溶性分子ま たは膜結合分子を補足することに用いることができる。好適実施例では、ＰＬＣ Ｈの主たるアミノ基を、¹²⁵Ｉボルト ンハンター試薬（“Ｂｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ （ １９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １３３：５２９”参照）で標識する。この試 薬は、様々な分子をその生物学的活性を損なうことなく標識するために用いられ てきた（“Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ ｈｅｍ ２６６： １８９８９； ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ （１９９３ ） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５５５”参照）。膜結合分子は 、標識化ＰＬＣＨ分子と共にインキュベートされる。次いで、この細胞は洗浄さ れて非結合分子が除去され、次いでＰＬＣＨ複合体が定量される。異なる濃度の ＰＬＣＨを用いて得られたデータから、ＰＬＣＨ複合体の数、親和性、及び会合 度を表す数値が計算される。 標識化ＰＬＣＨは、ＰＬＣＨが相互作用する分子の精製のための試薬としても 有用である。アフィニティ精製の一実施例では、ＰＬＣＨはクロマトグラフィカ ラムに共有結合で結合される。細胞とその膜が抽出され、ＰＬＣＨが除去され、 様々なＰＬＣＨを含まない小成分がカラムに通される。分子は、そのＰＬＣＨ親 和性のためにカラムに結合する。ＰＬＣＨ複合体はカラムから回収され、Ｎ末端 タンパク質シークエンシングを受ける。得られたアミノ酸配列は、その捕捉され た分子を同定し、適当なｃＤＮＡライブラリーからのその遺伝子のクローニング のための変性オリゴヌクレオチドプローブをデザインするのに使用される。 別の方法では、ＰＬＣＨに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体が産生 され、更にスクリーニングにより、このうち標識化ＰＬＣＨの結合を阻害するも のが同定される。このモノクローナル抗体は、アフィニティ精製または関連分子 の発現クローニングのために用いられる。 他の可溶性結合分子の同定も類似した方法で行われる。標識化ＰＬＣＨを、抽 出物、またはマスト細胞由来及び推定上の標的細胞由来の他の 適切な材料と共にインキュベートする。インキュベーションの後、（精製ＰＬＣ Ｈより大きいサイズの）ＰＬＣＨ複合体を、例えば、サイズ排除クロマトグラフ ィまたは密度勾配遠心分離法のような分子の大きさによって分離するサイジング 技術を用いて同定し、従来より周知の方法で精製する。可溶性結合タンパク質は Ｎ末端シークエンシングを受けて、その可溶性タンパク質が既知である場合には データベースによる同定のため、その可溶性タンパク質が未知である場合にはク ローニングのための十分な情報が得られる。 １５．ＰＬＣＨの抗体、阻害剤、レセプタ、またはアンタゴニストの使用及び投 与 ＰＬＣＨの抗体、阻害剤、レセプタ、またはアンタゴニスト（または他のシグ ナル伝達を制限する処理剤、ＴＳＴ）は、治療的に投与されたときそれぞれ異な る効果を発揮する。ＴＳＴは、非中毒性、不活性、薬学的な許容範囲にある水性 担体媒質で配合される。媒質のｐＨは、好ましくは約５〜８、特に好ましくは６ 〜８である。しかし、このｐＨは配合される抗体、阻害剤、またはアンタゴニス トの特性、及び治療条件によって変化しうる。ＴＳＴの特性には、分子の溶解度 、半減期及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、これらの特性及び他の特性が効果的 な担体を決める助けとなる。ＴＳＴとしては未変性のヒトタンパク質も好適であ るが、薬物スクリーニングによって得られた有機分子または合成分子も、特定の 状況においては同様に効果的である。 ＴＳＴは周知の投与経路で投与される。この投与経路には、局所的クリーム及 びゲル、経粘膜スプレー及びエアロゾル、経皮パッチ及び帯具、注射可能な静脈 の潅注配合物、及び液体及び錠剤の経口薬であって胃酸及び酵素に対して耐性を 有するように配合されたもの等があるが、これらに限定されない。特定の配合、 正しい投与量、及び投与経路は病院所 属医師によって決定されるが、状況に応じて様々に変化し得る。 このような決定は、治療条件、投与されるＴＳＴ、及び特定のＴＳＴの薬動力 学的プロファイルのようなさまざな要素を考慮することによってなされる。考慮 に入れるべき他の因子には、患者の病状（例えば重症であるかどうか）、年齢、 体重、性別、食事、時間、及び投与の頻度、薬物の組合せ、反応感受性及び治療 に対する耐性／反応性などがある。長時間作用するＴＳＴの配合物の投与頻度に は、３〜４日に１回の投与、毎週１回の投与、若しくは２週間に１回の投与程度 であるが、この頻度は特定のＴＳＴの半減期及びクリアランス速度によって決ま る。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの間であり、総投与量の上限は約 １ｇであるが、これは投与経路によって異なる。特定の投与量及び投与方法に関 する手引きは、米国特許出願第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号 または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。当業者は異なるＴＳＴ 群に対しては異なる配合を用いることができるであろう。神経細胞への投与では 血管内皮細胞のような他の細胞の場合とは異なる投与方法が必要となる。 また、マスト細胞の活性をトリガーする状態または疾病が、ＴＳＴ群で治療可 能な障害を誘起させ得ることが考えられる。これらの状態または疾病は上述の診 断テストによって診断されるが、このようなテストは、全身性または局所的な感 染症、外傷性の組織損傷、高血圧を伴う遺伝病や環境病、癌腫、その他シグナル 伝達の異常を伴う生理学的／病理学的な問題が生じたことが疑われる場合に行わ れるべきである。 上述の明細書の記載の中で引用された全ての文献及び特許明細書は、本明細書 と一体に組み込まれる。ここに記載された本発明の方法及びシステムの様々な変 更が、請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなく行われ得ることは当業者 には明らかであろう。本発明の特定の好適実 施例について説明してきたが、これは請求項に記載の本発明を、これらの実施例 のみに限定するものではないことを理解されたい。実際、当業者は、以下の請求 の範囲に記載の本発明の範囲内で、上述の実施例に様々に変更を加えて実施する ことができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9/16 Ｄ 9/16 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するホスホリパーゼＣホモログ（ＰＬ ＣＨ）をコードする精製ポリヌクレオチド。 ２．核酸配列が、配列番号：１の配列若しくはその相補的配列であることを特徴 とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．生物学的試料における、過剰なＰＬＣＨに関連しているような腫瘍、状態ま たは疾病の診断テスト方法であって、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 １に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 検出が、前記腫瘍、状態または疾病の診断となる、該過程とを有することを特徴 とする診断テスト方法。 ４．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。 ５．請求項４に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞 。 ６．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であっ て、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項５に記載の宿主細胞 を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ７．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ８．請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相 補的なアミノ酸配列を含むアンチセンス分子。 ９．請求項８に記載のアンチセンス分子及び薬学的に許容範囲の賦形剤を含む医 薬品組成物。 １０．効果的な量の請求項９に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含む ことを特徴とする過剰なＰＬＣＨに関連しているような腫瘍、状態または疾病を 患う患者の治療方法。 １１．請求項７に記載の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 １２．腫瘍、状態または疾病の診断テスト方法であって、 過剰なＰＬＣＨが、生物学的試料における、ヒドロキシ尿素に対して耐性を有 する細胞を特徴付けていることを特徴とし、 ａ）抗体がＰＬＣＨに結合し、抗体−ＰＬＣＨ複合体を形成するのに適切な条 件の下で、前記生物学的試料と請求項１１に記載の抗体とを結合する過程と、 ｂ）前記抗体−ＰＬＣＨ複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が 、前記腫瘍、状態または疾病の診断となる、該過程とを有することを特徴とする 診断テスト方法。 １３．請求項７に記載の精製ポリペプチドに対して特異的な阻害剤。 １４．請求項１３に記載の阻害剤及び薬学的に許容範囲の賦形剤を含む医薬品組 成物。 １５．効果的な量の請求項１４に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含 むことを特徴とする過剰なＰＬＣＨに関連しているような腫瘍、状態または疾病 を患う患者の治療方法。