JPH11503904A - セルブレビン・ホモログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なセルブレビン（ｃｂ）を同定し、コードするヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。本発明には、ｃｂをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＣＢの産生のための発現ベクター、ＣＢと特異的に結合し得る抗体、ヌクレオチド配列をコードするＣＢの誘発を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、ＣＢの発現のための生物工学的処理をなされた宿主細胞、及びＣＢをコードする核酸分子及びＣＢに特異的に結合し得る抗体に基づいた、活性化した炎症または疾病細胞及び／または組織の診断テスト方法が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 セルブレビン・ホモログ技術分野 本発明は分子生物学の分野に属し、特に、本発明では、３つの新規なセルブレ ビン相同体の核酸配列及びアミノ酸配列について記述している。背景技術 セルブレビン（cellubrevin）は、シナプトブレビン、即ちシナプス小胞随伴 膜タンパク質（ＶＡＭＰ）のホモログである。シナプトブレビンは、初めにラッ トの脳（Ｂａｕｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｅｍｂｏ Ｊ ８：３７ ９−８４）で発見され、初めのうちはニューロン細胞にのみ存在すると考えられ ていた。セルブレビンは、一つの細胞の原形質膜から、シナプスを横切って受容 性ニューロンの原形質膜に至る小胞の移動に関与する１８ｋＤＡの一体型膜タン パク質（Ｒａｌｓｔｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ ｅｍ ２６９：１５４０３−６）である。調節された小胞輸送経路とエンドサイ トティックプロセスは、シナプトブレビン分子の分割による神経伝達物質放出を 阻害するクロストリジウム属の神経毒素の高度に特異的な作用によりブロックさ れ得る。現在シナプトブレビンは、多くの非神経細胞タイプのレセプタ媒介エン ドサイトティック−エキソサイトティック経路に関与する恒常的小胞経路におい て発生し、機能を発揮することが知られている。 セルブレビンは、初めにラットの細胞及び組織で発見され研究された１６ｋＤ ａのタンパク質である（ＭｃＭａｈｏｎ ＨＴ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｎ ａｔｕｒｅ ３６４：３４６−９）。様々な細胞膜の Ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究（Ｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｊ Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ １２５：１０１５−２４； Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ （１９９３ ） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１８４２３−６）により、セルブレビン を含むＶＡＭＰが広く分布しており、膜輸送に重要な役目を果たしていることが 分かった。セルブレビンは、発生時のエキソサイトーシスを介する軸策延長、神 経伝達物質や修飾的ペプチドの放出、及びエンドサイトーシスに関与しているよ うである。エンドサイトティック小胞輸送には、核膜、小胞体、ゴルジ体、及び ペルオキシソームやリソゾームのような様々な封入体の融着と分割のような細胞 内現象が含まれる。 エンドサイトティックプロセスは、酵母菌、セロラブディティスエレガンス、 ショウジョウバエ、及びヒト等の多様な真核細胞に普遍的に存在する。これらの 器官の内部及び器官の間での小胞の移動を支配するこの相同タンパク質は、進化 論的保存領域を含んでいる。一般に、ＶＡＭＰは３つのドメイン組織を有してい る。これらのドメインは、２８個のアミノ酸からなる可変プロリンリッチＮ末端 配列、６９個のアミノ酸からなる高度に保存的な中心の親水性コア部分、及び膜 アンカーと推定される２３個のアミノ酸からなる疎水性配列を含む。 シナプトブレビンに関連して上に説明したように、セルブレビンは、破傷風毒 素の軽鎖を含む亜鉛エンドプロテアーゼのような金属エンドプロテアーゼによる 選択的なタンパク質加水分解に感受性を有する。実験の結果、エンドソーム融合 体は、ＮＳＦ（N-ethylmaleimide-sensitive fusion proteins）やＳＮＡＰ（sm all，soluble attachment proteins）に関与する融合プロセス及び温度−及びＡ ＴＰ依存性ドッキングプロセスによる特異的なセルブレビンの分割の後にも継続 的に存在し得ることが分かった。 組織分布及びＶＡＭＰは、初めに考えられていたよりずっと多数でまた広く存 在していたため、発現における差や細胞下の局在化についての研究で、疾病や疾 病の症状の完全や調節に役立つ最も有益な領域の一つがわかる可能性がある。 セルブレビンは、特定の細胞型に関連し、細胞内経路及び細胞外経路の双方に 関与し、それらの存在量及び特異性は様々なようである。この新規なセルブレビ ン（及び関連するＶＡＭＰ）と、原形質膜のＳＮＡＰ及びシンタキシン、若しく はＮＳＦやシナプトタグミン（synaptotagmin）のようなコア融合タンパク質と の相互作用を解明することにより、通常の状態、及び急性または慢性の疾病状態 での小胞輸送の調節のための手段が得られる。発明の開示 本発明は、新規なヒト・セルブレビンを一義的にコードするヌクレオチド配列 を提供するものである。ここに開示するｃＤＮＡは、（１）インサイト社クロー ンＮｏ．８０１８４内で発見された、ポリペプチドＣＢ−１（配列番号：２）を コードするｃｂ−１（配列番号：１）、（２）インサイト社クローンＮｏ．１２ ２８２６内で発見された、ポリペプチドＣＢ−２（配列番号：４）をコードする ｃｂ−２（配列番号：３）、（３）インサイト社クローンＮｏ．３１１５３７を 元に延長させて同定された、ポリペプチドＣＢ−３（配列番号：６）をコードす るｃｂ−３（配列番号：５）、（４）インサイト社クローンＮｏ．６７４７１９ 内で発見された、ポリペプチドＣＢ−４（配列番号：６）をコードするｃｂ−４ （配列番号：７）である。 また、本発明には、これらのＣＢまたはその変異体を用いて、生理学的または 病理学的な損傷に関与する状態に介入する方法も含んでおり、この方法では、ｃ ｂ核酸、またはそのフラグメントやオリゴマーを用い て、試料または抽出物をテストする。本発明の他の側面として、該核酸配列のア ンチセンス、該核酸配列を含むクローニングベクターや発現ベクター、これたの 発現ベクターで形質転換された宿主細胞または宿主生物、宿主細胞からの精製Ｃ Ｂの産生と回収方法、及び活性化または炎症細胞及び／または組織の診断または 治療のための抗体を産生するのに用いることができる精製タンパク質がある。図面の簡単な説明 第１図は、ＣＢ−１（インサイト社クローンＮｏ．８０８１４）のヌクレオチ ド配列（配列番号：１）及びアミノ酸配列（配列番号：２）を示した図である。 第２図は、ＣＢ−２（インサイト社クローンＮｏ．１２２８２６）のヌクレオ チド配列（配列番号：３）及びアミノ酸配列（配列番号：４）を示した図である 。 第３図は、ＣＢ−３（インサイト社クローンＮｏ．３１１５３７）のヌクレオ チド配列（配列番号：５）及びアミノ酸配列（配列番号：６）を示した図である 。 第４図は、ＣＢ−４（インサイト社クローンＮｏ．６７４７１９）のヌクレオ チド配列（配列番号：７）及びアミノ酸配列（配列番号：８）を示した図である 。 第５図に示すのは、新規なセルブレビン及びその既知の最も近縁なホモログ、 ラットのシナプトブレビン（配列番号：９；ＧＩ３８８４８３）、ウシのシナプ トブレビン（配列番号：１０；ＧＩ４３３０７５）、アフリカツメガエルのシナ プトブレビン（配列番号：１１；ＧＩ６０６９７８）の間のアミノ酸アライメン トを示した図である。ここに示すアライメントは、ＤＮＡＳＴＡＲ ｓｏｆｔｗ ａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のｍｕｌｔｉｓｅ ｑｕｅｎｃｅ ａ ｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍを用いて作成されたものであり、残基の一致 は枠で囲って示されている。これら複数の分子は、ＧＩ３８８４８３に記載され ているＫ３９ＶＬＥＲ４２モチーフ、Ｗ７６Ｗ７７モチーフを有しており、全て が突出したＣ末端のイソロイシン及びバリン残基を有しており、これらの残基の 存在により膜内部の小胞の局在化が可能となる。発明の実施の形態 三種の新規なセルブレビン・ホモログは、異なる三つのインサイト社ｃＤＮＡ ライブラリーの部分的ヌクレオチド配列から発見された。インサイト社クローン Ｎｏ．１２２８２６は、肺ライブラリー（ＬＵＮＧＮＯＴ０１）のｃＤＮＡから 発見され、インサイト社クローンＮｏ．３１１５３７は、肺ライブラリー（ＬＵ ＮＧＮＯＴ０１）のｃＤＮＡから見出され、インサイト社クローンＮｏ．６７４ ７１９は、小脳ライブラリー（ＣＲＢＬＮＯ０１）のｃＤＮＡから見出された。 本明細書において、ＣＢ（上位の場合）なる用語は、セルブレビン・ポリペプ チド、自然発生ＣＢ及びその活性断片を意味し、これらはｃＤＮＡまたはｃｂ（ 下位の場合）から転写されたｍＲＮＡによりコードされる。 本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＣＢの生物学的及び／また は免疫学的活性を保持しているＣＢの形態を意味する。 本明細書において、“自然発生ＣＢ”なる用語は、生物工学的処理を受けてい ない細胞により生成されたＣＢを意味し、より具体的には、アセチル化、カルボ キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）及びアシル化を含む 翻訳後修飾されたポリペプチドから生成される様々なＣＢの形態を表現する用語 である。 本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリン グ（例えば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾されたＣＢ、若し くは例えばオルニチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないア ミノ酸の化学合成によって得られる挿入体、置換体のＣＢを意味する。 本明細書において、“組換え変異体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて 生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＣＢとは異 なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。細胞輸送のような、興味の対 象となる活性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミノ酸残基を決 定するためには、特定のＣＢの配列と相同なペプチドの配列とを比較し、相同性 の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。 アミノ酸の“置換”では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの 置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換 、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的 特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸 の“挿入”または“除去”は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換 えＤＮＡ技術を用いてＣＢのアミノ酸の挿入、除去、または置換を体系的に行い 、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異体が実験 的に決定され得る。 必要ならば、ＣＢポリペプチドを細胞膜を通して移動せしめる“シグナル配列 またはリーダー配列”を含むようにすることができる。このような配列は、本発 明のポリペプチド上に自然に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により異種 タンパク質源から得られる。 本明細書において、ポリペプチド“フラグメント（断片）”、“部分 ”、または“セグメント”なる用語は、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくと も約７個のアミノ酸、または少なくとも約８〜１３個のアミノ酸からなり、別の 実施例では約１７個またはそれ以上のアミノ酸をからなるアミノ酸残基の伸展（ ストレッチ）を意味する。活性であるためには、ＣＢポリペプチドは、生物学的 及び／または免疫学的活性を示すに十分な長さを有している必要がある。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグ メント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、同一の、若しくは近縁 関係にあるｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子を同定、若しくは増幅するためのポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成法にお けるプライマーとして使用するのに十分な長さを有するｃｂヌクレオチド残基の 任意のストレッチを意味する。 本発明には、化学合成されたもの、或いは天然または組換えポリペプチド源か ら得られた精製ＣＢポリペプチドが含まれる。 本発明はまた、ＣＢをコードする組換え核酸分子で形質転換された細胞にも関連 する。ＣＢポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の周知となって いる。例えば、このようなポリペプチドの精製のために、本発明の提供する抗体 を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。タン パク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ （ １９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”及び“Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ （１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎ ｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ”に記載されており、これらの 文献を本明細書と共に参照されたい。 本明細書において、“組換え体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製 されるＣＢをコードするポリヌクレオチドも意味する。ＣＢをコードするＤＮＡ も対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み得る。 “オリゴヌクレオチド”または“核酸プローブ”は、ＣＢをコードする本発明 のｃＤＮＡ配列に基づいて調製される。オリゴヌクレオチドは、ｃｂのＤＮＡ配 列の部分を含み、少なくとも約１５個のヌクレオチドからなるが、通常は約２０ ヌクレオチドからなる。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない、通常は約１ｋｂ 未満の塩基対数の配列の部分からなる。偽の陽性を排除するための試験の後、こ れらのプローブを用いて、細胞または組織内にＣＢをコードするｍＲＮＡが存在 するか否かを判定したり、または“Ｗａｌｓｈ ＰＳ ｅｔ ａｌ（１９９２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １：２４１−２５０”に記載のように染 色体ＤＮＡから類似した核酸配列を分離することができる。 本発明の核酸プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸に由 来するものであるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニ ックトランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分 野において周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標 識する方法は、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”または“Ａｕ ｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ”に詳しく述べられており、これ らの文献を本明細書と共に参照されたい。 本明細書において、“活性化”細胞とは、通常の若しくは疾病状態のプロセス の一部としての神経分泌物質分子または酵素分子の搬出を含む細胞外または細胞 内膜輸送に関与する細胞を意味する。 別の形態として、本発明のポリペプチド、またはそれと近縁関係にあるポリペ プチドをコードする組換え変異体は、当業者に周知の技術を用いて、遺伝暗号の “重複性”を利用することにより合成、または同定され得る。様々な切断部位を 作り出すサイレント変化のような、様々なコドン置換を導入することで、プラス ミドやウィルスベクターへのクロニング、または特定の原核細胞系または真核細 胞系における発現を最適化することができる。また、ｃｂ配列に突然変異を導入 することによって、それがＣＢポリペプチドまたはＣＢポリペプチドに付加され た他のペプチドのドメインにおいて反映され得ることになり、ポリペプチドの特 質を修正したり、リガンド結合親和力、鎖間親和力、または変性／ターンオーバ ー速度のような特性を変えることもできる。発明の詳細な説明 本発明は、新規なヒト・セルブレビンを一義的に同定するヌクレオチド配列を 提供する。ＣＢは活性細胞、多くの場合保護細胞において特異的に発現すること から、本発明の核酸（ｃｂ）、ポリペプチド（ＣＢ）、及びＣＢに対する抗体は 、生理学的または病理学的プロセスの調査やインターベンションにおいて有用で ある。ＣＢに支配されるエキソサイトーシスは、細胞内部の膜輸送を管理し、ケ モカインの放出に影響を与え得る。ここでケモカインは、炎症性分子、または内 皮細胞、繊維芽細胞、またはリンパ球の活性に特異的な他の分子において活性な プロテアーゼや細胞の遊走に関与する物質である。 本出願人のｃｂ−１（配列番号：１）は、リウマチ用滑膜ライブラリ から単離され、ラットのシナプトブレビンＩＩ（GI 388483; McMahon，HT et al ．(1993)Nature 364:346-9）と最も近縁関係を有する。ｃｂ−１配列に正確に一 致若しくは重複する転写物（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：１２−３３）は、疾病の影 響を受けた、及び／または全身性防衛（systemic protection）に関与する細胞 及び組織を反映する１４個の異なるライブラリから電気的に同定された。転写物 は、好酸球（ＥＯＳＩＨＥＴ０２）、リンパ球（ＴＭＬＲ３ＤＴ０２）及びマク ロファージ（ＭＰＨＧＮＯＴ０２；ＭＭＬＲ２ＤＴ０１）から作られたライブラ リにおいて見いだされ、また２つのリンパ組織、即ち胸腺（ＴＨＹＭＮＯＴ０２ ）及び扁桃腺（ＴＯＮＳＮＯＴ０１）から作られたライブラリにおいても見いだ され、また全身性防衛が定期的に発生する組織、例えば肺（ＬＵＮＧＮＯＴ０２ ）、小腸（ＳＩＮＴＮＯＴ０１）、及び腎臓（ＫＩＤＮＮＯＴ０２）から作られ たライブラリにおいて見いだされ、また疾病状態にある炎症組織、例えばリウマ チ用滑液（ＳＹＮＯＲＡＢ０１、ＳＹＮＯＲＡＴ０１、及びＳＹＮＯＲＡＴ０４ ）、７８歳の男性から除去された前立腺（ＰＲＯＳＮＯＴ０１）、及び前立腺（ ＰＲＯＳＴＵＴ０３）及び乳の腫瘍（ＢＲＳＴＴＵＴ０１）から作られたライブ ラリにおいて見いだされる。ｃｂ−１配列は、慢性関節リウマチ、乳腫瘍及び前 立腺腫瘍の診断や、全身性防衛における免疫系の活性化を確認する診断において 有用である。 本出願のｃｂ−２（配列番号：３）は、肺ライブラリ（ＬＵＮＧＮＯＴ０１） から単離され、アフリカツメガエルのシナプトブレビンＩＩ（GI 606978; Knech t AK（1988）Proc Nat Acad Sci 8086-90）と最も強い近縁関係を有する。ｃｂ −２配列に正確に一致または重複する転写物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．３４−４ ０）は、外胚葉神経性または腫瘍オリジンの細胞及び組織を反映する異なる５つ のライブラリから電気的に 同定された。ｃｂ−２転写物は、年間約１００箱のたばこを吸ってきており肺ガ ンを患っていた７９歳の男性の非腫瘍肺組織から作られたライブラリ（ＬＵＮＧ ＮＯＴ０１及びＬＵＮＧＮＯＴ０３）において見いだされ、また心臓（ＬＡＴＲ ＮＯＴ０１及びＬＶＥＮＮＯＴ０２）から作られたライブラリ、脳腫瘍（ＢＲＡ ＩＴＵＴ０１）から作られたライブラリ、クローン病を患っている４０歳の白人 男性から取った結腸（ＣＯＬＮＮＯＴ０５）、及び３４歳の白人女性から除去し た子宮（ＵＴＲＳＮＯＴ０２）から作られたライブラリにおいて見いだされる。 ｃｂ−２配列は、外胚葉及び神経組織における細胞増殖の診断、特にクローン病 、肺ガン、または脳腫瘍の診断において有用である。 本出願のｃｂ−３（配列番号：５）はクモ膜下出血で死亡した４７歳の白人男 性から除去された肺組織（ＬＵＮＧＮＯＴ０２）に由来するｃＤＮＡから同定さ れた。この配列を用いて作られた完全長ｃＤＮＡは、後に、ウシのシナプトブレ ビン（GI 433075; Sudhof TC et al．（1989）Neuron 2:1475-81）と最も近縁関 係を有することが分かった。ｃｂ−３配列に正確に一致または重複する転写物（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．４１−４９）は、９つの異なるライブラリから電気的に 同定された。この細胞及び組織は、活性内皮細胞及び／または全身性防衛におけ る機能を共有する４つの組織源を代表している。この４つの細胞及び組織は、培 養されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＮＯＢ０１）、肺（前述のＬＵＮＧＮＯ Ｔ０１）、心房（ＲＡＴＲＮＯＴ０１及びＬＡＴＲＮＯＴ０１）、及び小胞（Ｓ ＩＮＴＮＯＴ０２）である。このｃｂ−３配列は、特に感染状態や炎症状態の診 断、及び内皮、特に心臓血管の内皮に影響を与える他のストレスの診断に有用で ある。 本出願のｃｂ−４（配列番号：７）は、慢性閉塞性肺疾患で死亡した６９才の 白人男性から除去された小脳組織（ＣＲＢＬＮＯＴ０１）から 単離された。ｃｂ−４配列は、上述していない新たなクラスのセルブレビン分子 を表わしている。この配列は、ここに開示する他の分子との共通部分が限定され たものである。ｃｄ−３配列は、無酸素症のような小脳を損なう状態の診断や、 多発性硬化症や結節硬化症やウイルソン病のような小脳変性疾患、マラリア、百 日咳、流行性耳腺炎、脳炎、ポリオ、梅毒、または結核等を含む、ウイルス、細 菌、菌類、または寄生生物によって引き起こされる感染症、若しくは星状細胞腫 、延髄芽細胞腫、上衣細胞腫、及びヒト遺伝子の発現を誘発する血管芽細胞腫の ような中枢神経系の腫瘍の診断に有用である。 各セルブレビンを用いた、特定のＣＢの上方制御された発現に対する診断テス トは、ウイルス等の感染症、外傷性の組織損傷、関節炎や喘息のような遺伝病、 浸潤癌、白血病、及びリンパ腫を原因とする状態、または、処置を行わなければ 生ずる異常な膜輸送に関連する他の生理学的／病理学的問題の診断や適切な治療 を行うのに役立つ。 ＣＢをコードするヌクレオチド配列（またはその相補配列）は、分子生物学の 分野における当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これらの技 術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマーと しての使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＣＢの組換え体産生に おける使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの化学的類 似体等の産生における使用が含まれる。更に、未だ開発されていない分子生物学 的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互 作用のような既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技術である限り、ここ に開示するヌクレオチド配列を、その分子生物学的技術において使用することが できる。 遺伝暗号の同義性（degeneracy）の結果、その一部に既知のヌクレオ チド配列及び自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を有す るヌクレオチド配列を有するようなＣＢをコードする多種のヌクレオチド配列が 産生され得る、ということは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的に は可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することにより作られ得る全ての可 能なヌクレオチド配列をその範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生Ｃ Ｂのヌクレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号 に基づいて形成される。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示 されたものと考えられたい。 ＣＢ及び／またはＣＢ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格な条件の 下で自然発生ｃｂのヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なものであるのが 好ましいが、実質的に異なるコドン使用頻度をプロセシングするＣＢまたはＣＢ 誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン の選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主におけるペプチドの発現速 度を高めるように選択することができ、このときこの発現速度は、その宿主にお ける特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明のＣＢ及び／またはＣＢ 誘導体をコードするヌクレオチド配列を、このコードされたアミノ酸配列を変え ることなく実質的に変化させる他の理由は、より望ましい特性、例えば自然発生 ヌクレオチド配列から産生されたものより長い半減期を有するＲＮＡ転写物を作 り出すためである。 ＣＢをコードするヌクレオチド配列は、完全に確立された組換えＤＮＡ技術（ “Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”参照）により様々な他のヌ クレオチド配列と結合してもよい。 ｃｂに結合するのに有用なヌクレオチド配列には、例えば従来より周知のプラス ミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等のクローニングベクターの 組合せが含まれる。興味の対象となるベクターには、発現ベクター、複製ベクタ ー、プローブ産生ベクター、及びシークエンシングベクター等が含まれる。一般 に、興味の対象となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能 を発揮する便利な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選 択可能なマーカーを含み得る。 本発明の別の実施例では、ＣＢをコードする自然発生ヌクレオチド配列とハイ ブリッド形成可能なｃｂ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが提供され る。このようなプローブは、近縁関係にあるセルブレビンをコードする配列を検 出するのにも用いることができ、好ましくは、これらのＣＢをコードする任意の 配列のヌクレオチドの少なくとも５０％を含む。本発明のハイブリダイゼーショ ンプローブは、配列番号：１、３、５、または７のヌクレオチド配列、または自 然発生ｃｂのプロモータ、エンハンサー要素、及びイントロンを含むゲノムの配 列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なリポ ーターグループにより標識され得るが、このリポーターグループには、³²Ｐまた は³⁵Ｓのような放射性核種、若しくはアルカリホスファターゼのような酵素標識 が含まれ、これらはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合する。こ の他当業者に周知の技術を用いてプローブを標識することができる。 米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，９６５，１８８号明細書に記載さ れているようなＰＣＲ法の実施において、ＣＢをコードするヌクレオチド配列に 基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法がある。このようなＰＣＲ法で使用さ れるプローブは、組換えにより得られたもの であるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の混合であり得、ま た、診断的な使用に供される分散したヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノム 配列の同定に用いられる可能な縮重配列のプール（degenerate pool）を含み得 る。 ｃｂ特異的ハイブリダイゼーションプローブを作り出すための他の方法には、 ｍＲＮＡプローブの形成のためのベクターへの、ＣＢ及びＣＢ誘導体をコードす る核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは従来より周知であ って市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適 当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性の標識をなされたヌクレオチドを添加 することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに使用すること ができる。 現在は、完全に化学合成によりＣＢ及びＣＢ誘導体をコードするＤＮＡ配列、 またはその部分を産生することが可能であり、その後、従来より周知の試薬、ベ クター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することができる 。更に、化学合成を用いて、ｃｂポリヌクレオチド配列若しくはその部分に突然 変異を起こさせることも可能である。 このヌクレオチド配列を用いて、炎症及び疾病を原因とするｃｂの活性化や誘 発の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配列は、 従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件の下で患者の体液ま たは組織の試料に添加することができる。インキュベーション時間の経過後、ヌ クレオチドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（または他の展 開剤を必要とする標識）を含有する適合性の液体で試料が洗浄される。この適合 性の液体を洗い流した後、染料を定量して標準値と比較する。染料の量が著しく 多い場合には、このヌクレオチド配列は試料とハイブリッド形成したことになり 、このアッセイにより炎症及び／または疾病の存在が確認されたことにな る。 ｃｂのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのためのハイブリ ダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌクレオチド 配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺伝子及び／ま たは染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような技術には、ｉ ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対するリンケー ジ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラリまたはフローソートされた染 色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含まれる。染色 体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技 術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｈｕ ｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ”に記載されている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染 色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと相関性を有し得る。遺伝子 地図データの例としては、“１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃ ｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）”がある。物理的染色体地図上でのｃｂをコ ードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因）との間 の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するための助け となる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者と、キャリアまたは発症者 との相違を検出することができる。 ＣＢをコードするヌクレオチド配列を用い、周知の組換えＤＮＡ技術を利用し て精製ＣＢを作り出すことができる。遺伝子を単離した後、その遺伝子を発現さ せる方法を記載した文献は数多くあるが、その例とし ては、“Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ｖ ｏｌ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”があ る。ＣＢは、原核細胞または真核細胞の何れかの様々な宿主細胞内において発現 され得る。宿主細胞は、ｃｂヌクレオチド配列が単離される種と同一の種、ある いは異なる種の何れからでも得ることができる。組換えＤＮＡ技術によってＣＢ を作り出すことの利点には、精製用として十分な量のタンパク質が得られること 、及び精製のための簡単な手順が利用できるようになることがある。 ＣＢをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＣＢの発現及び細胞 培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る。組換え細胞によ り産生されたＣＢは、使用される特定の遺伝子構造に応じて、分泌されるか、あ るいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質は、分泌される形態で 準備しておくのがより便利である。精製の工程は、使用される産生プロセスの性 質及び産生される特定のＣＢの性質に基づいて決まる。 組換えによる産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＣＢ フラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ （１ ９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ Ｒ （１９６３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９− ２１５４”参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機械 により自動的に行うことができる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆ ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に 従って用いることにより行うことができる。ＣＢの様々なフラグメントを個別に 化学合成し、化学的な方法により結合することによってＣＢの完全長分子を産生 することもできる。 抗体の誘発において使用するためのＣＢは、免疫活性を有していなければなら ない。ＣＢ特異的抗体の誘発において使用するためのペプチドは、少なくとも５ 個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。この ペプチドは、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部分をまねており、ＣＢに類似 した小さい自然発生分子の一部分の全アミノ酸配列を含み得る。ＣＢのアミノ酸 配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬＨ）やキメラ分子に対 して産生される抗体のような他のタンパク質のストレッチと融合され得る。 特定のＣＢ配列に対して特異的な抗体は、適当な動物に該ポリペプチドまたは 抗体フラグメントを接種することにより産生され得る。抗体が、ポリペプチドの エピトープに対して産生され、自然発生または組換えタンパク質の全体または一 部分に結合するならば、その抗体は特定のＣＢに対して特異的であると言える。 抗体の産生は、動物への注射により生ずる免疫反応の刺激作用によるもののみな らず、合成抗体、または組換え免疫グロブリンライブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：３８３３−３８３７またはＨｕｓ ｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１ ”参照）のスクリーニングや、ｉｎ ｖｉｔｒｏのリンパ球集団の刺激のような 他の特異的結合分子の産生の類似した工程によってもなされる。現在の技術（“ Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４ ９：２９３−２９９”）では、抗体形成の原理に基づき、高度に特異的に結合す る多数の試薬を提供することができる。このような技術を、ＣＢに特異的に結合 し得る分子の産生に適用す ることができる。 本発明の他の実施例では、ＣＢ特異的抗体を生理活性薬剤として用いて、ウィ ルス若しくはその他の感染症、外傷性の組織損傷、関節炎や多発性硬化症のよう な遺伝病、浸潤癌、白血病やリンパ種を治療し、その他ＣＢの誘発及び異常な膜 輸送に関連する生理学的／病理学的な問題を解決する。 ＣＢのアゴニストやアンタゴニストを含む生理活性組成物は、最大許容投与量 を求めるための哺乳類種に対する臨床研究と、安全な投与量を求めるための人体 に対する臨床研究をと含む幾つかの方法論によって決定された適切な治療のため の投与量だけ投与され得る。更に、生理活性薬剤が、安定度若しくは半減期など の生薬学的な性質を高める十分に確立された化合物や組成物と合成され得る。治 療的な生理活性組成物の投与は、血液内への静脈注射による方法、若しくは治療 に利用可能なその他の効果的な手段によって投与されることが企図されている。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供されている。これらの実施例は 、例示を意図するものであり、本発明の限定を意図するものではない。工業的応用性 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築 第１のセルブレビン配列ＣＢ−１は、リウマチ様滑膜ライブラリ（ＳＹＮＯＲ ＡＢ０１）を含むｃＤＮＡ群（インサイト社クローンＮｏ．８０１８４）におい て同定された。リウマチ様間接組織は、慢性間接リウマチを患っており、股関節 置換外科手術を受けた６８才の白人男性から得られた。冷凍された組織は、乳鉢 及び乳棒でかき混ぜられ、すぐにグアニジウムイソチオシアネートを含む緩衝液 に溶解された。溶解の後、 数回のフェノール−クロロフォルム抽出を行い、エタノール沈殿処理を行った。 ポリＡ⁺ｍＲＮＡは、ビオチン標識されたオリゴｄ（Ｔ）及び常磁性粒子に結合 されたストレプトアビジン（Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔｒａｃｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて単離された。 このポリＡ⁺ｍＲＮＡを用いて、カスタムｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇ ｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）で構築した。 個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス によって得られたが、このプロセスにおいてはＸＬ１−ＢＬＵＥ（登録商標）細 胞がｆ１ヘルパーファージに共感染され（co-infected）た。フλ及びヘルパー ファージの双方に由来するタンパク質は、λＤＮＡ上で定義された配列から新た なＤＮＡ合成を開始し、より小さい一本鎖の環式ファージミド分子を生成した。 この分子は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）及びｃＤＮＡ挿入体の全てのＤＮＡ配列を含む。ファージミドＤＮＡは 細胞から放出され精製されて、新鮮なＳＯＬＲ（登録商標）細胞（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）に再感染させるのに使用され、その細胞で二本鎖ファージミドＤＮＡ が生成された。このファージミドはβラクタマーゼ遺伝子を有しているため、新 たに形質転換された細菌はアンピシリン含有培地上で選択された。ファージミド ＤＮＡの精製には、ＱＩＡＷＥＬＬ−８（登録商標） Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＱＩＡＧＥＮ ｉｎｃ． Ｃｈａｔｓｗ ｏｒｔｈ ＣＡ）が使用された。 第２のセルブレビン配列ＣＢ−２は、ヒト肺ライブラリ（ＬＵＮＧＮＯＴ０１ ）を含むｃＤＮＡ群（インサイト社クローン Ｎｏ．１２２８２６）において同 定された。肺組織は７２歳の男性から肺ガンの外科手 術の際に除去された。ＬＵＮＧＮＯＴ０１に使用された組織には腫瘍組織は含ま れていないが、この患者は年間約１００箱のタバコを吸ってきた患者である。ｃ ＤＮＡライブラリはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入された（カタログ番号ＳＴ Ｒ９３７２１０）。 第３のセルブレビンｃＤＮＡ配列ＣＢ−３は、ヒト肺ライブラリ（ＬＵＮＧＮ ＯＴ０２）を含むｃＤＮＡ群（インサイト社クローン Ｎｏ．３１１５３７）に おいて同定された。この肺組織は、クモ膜下出血で死亡した４７歳の白人男性（ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａ ｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｅｘｔｏｎ ＰＡ社ロット番号Ｈ ＥＶ０８２）から得られた。この組織は、ＧｕＳＣＮを含む緩衝液に溶解され、 溶解産物は．７Ｍ ＣｓＣｌクッション上で、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−７０Ｍ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ） のＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ロータを用いて常温で１８時間２５０００ｒｐｍで 遠心分離された。ＲＮＡはフェノール・クロロホルムｐＨ８．０によって抽出さ れ、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５ｖｏｌのエタノールを用いて沈殿され、 水に再懸濁されて、３７℃で１５分間のＤナーゼ処理をなされた。ＲＮＡは、Ｑ ｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離され、ｃ ＤＮＡライブラリを構築するのに用いられた。 第１の鎖ｃＤＮＡ合成は、Ｘｈｏｌ制限サイトを含むオリゴｄ（Ｔ）プライマ ／リンカを用いて達成された。第２の鎖合成はＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏ ｌｉリガーゼ、及びＲナーゼＨの組合せを用いて達成され、更にＥｃｏＲＩを平 滑末端を有するｃＤＮＡに添加した。ＥｃｏＲＩアダプタを添加した２鎖のｃＤ ＮＡは、次いでＸｈｏｌ制限酵素によって消化され、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４ ０００を用いて分画化され て、サイズが１０００塩基対数を越える配列を得た。サイズを選択されたｃＤＮ Ａは、ＵｎｉＺａｐ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）に挿入され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）を含むこのベクタは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞、鎖ＸＬ１−Ｂｌｕ ｅＭＲＦ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換のために入れられた。 ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンは、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス により得られた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、共感染されたｆ１ヘルパーファー ジのニックトランスレーションで標識されたＤＮＡとの双方に由来する酵素が、 新たなＤＮＡ合成を開始し、ｃＤＮＡ挿入体を含む、より小さい、１本鎖の環状 ファージミドＤＮＡ分子が作り出された。放出されたファージミドＤＮＡは精製 されて、ＳＯＬＲ（商標）宿主細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に再感染するのに 用いられた。βラクタマーゼを保有するファージミドの存在により、アンピシリ ンを含有する培地上で新たに形質転換された細菌が成長可能となった。 ２つの肺ライブラリは、肺において見いだされた多様な細胞タイプのｃＤＮＡ を反映している。この細胞タイプには、肺マクロファージ、リンパ球及び白血球 、上皮細胞及び内皮細胞、肺ゴブレット細胞、及びサーファクタント関連タンパ ク質の原因である他の細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。 第４のセルブレビンｃＤＮＡ配列ＣＢ−４は、ヒト小脳ライブラリ（ＣＲＢＬ ＮＯＴ０１）を含むｃＤＮＡ（インサイト社クローンＮｏ．６７４７１９）にお いて同定された。ＣＲＢＬＮＯＴ０１ｃＤＮＡライブラリは、６９歳の白人男性 から取り出された通常の小脳組織（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｅｘｔｏｎ ＰＡ社ロ ット番号ＲＴ９５−０５−０３０１）から構築された。冷凍組織は時間をおかず に均質化され、細胞はグアニジウムイソチオシアネート溶液に、Ｂｒｉｎｋｍａ ｎｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ−３０００ （Ｂｒｉ ｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ ）を用いて溶解された。次いで溶解産物は５．７Ｍ ＣｓＣｌクッションに負荷 されて、ＳＷ２８ｓｗｉｎｇｉｎｇ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒにおいて室温で １８時間２５，０００ｒｐｍで超遠心処理された。ＲＮＡは、ｐＨ４．０の産生 フェノールで１度に抽出され、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５ｖｏｌのエ タノールと共に沈殿され、ＤＥＰＣ処理された水に再懸濁されて、２５分間３７ ℃でＤナーゼ処理された。切断は、上述のものと同量のｐＨ８．０のフェノール 及びＲＮＡによってストップされた。ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離され、これを用いてｃＤＮＡライブラリ を構築した。 ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉ ｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（カタログ番号１８２４８−０１ ３；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）における推奨されたプロトコールに従って取り扱われ た。ｃＤＮＡはＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂカラム（カタログ番号２７５１０ ５， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分画化され、４００ｂｐを越えるｃＤＮＡは、ｐ Ｓｐｏｒｔ Ｉに結合された。プラスミドｐＳｐｏｒｔ Ｉは、次いで、ＤＨ５ ａ（商標）競合的細胞（カタログ番号１８２５８−０１２， Ｇｉｂｃｏ／ＢＲ Ｌ）に形質転換のため入れられた。 ２．ｃＤＮＡクローンの配列決定 こられの胃ライブラリからランダム単離されたｃＤＮＡ挿入体は、Ｓａｎｇｅ ｒ Ｆ及びＡＲ Ｃｏｕｌｓｏｎ（１９７５；Ｊ Ｍｏｌ Ｂ ｉｏｌ ９４：４４１ｆ）の方法により配列決定された。ＤＮＡ配列決定の方法 は、当分野において周知である。従来の酵素を用いた方法では、ＤＮＡポリメラ ーゼクレノウフラグメントＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）またはＴａｑポリメ ラーゼのような酵素を使用して、目的のＤＮＡ鋳型にアニールされたオリゴヌク レオチドプライマーからＤＮＡ鎖を延させる。このような方法は一鎖若しくは二 鎖の鋳型の双方を使用するために開発されてきた。鎖終結反応生成物は、電気泳 動及び尿素アクリルアミドゲルを用いて分離され、オートラジオグラフ法（放射 性咳種で標識された前駆物質用）、若しくは蛍光剤（蛍光剤で標識された前駆物 質用）の何れかによって検出される。反応調製、配列決定、及び蛍光検出法を用 いた分析において、最近の機械化により、１日に決定される配列の数を増やすこ とが出来るようになった（ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｔ ８００、またはＨａｍｉ ｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ Ｎ Ｖ）、を４台のＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００ ； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びｔｈｅ Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７及び３７３ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎ ｃｅｒｓを用いる）。 ３．ｃＤＮＡクローン及び推論されたタンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡの配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の検索アル ゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標） ６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙ ｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用いて、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比較した。 このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎ ｇｕａｇｅ （ＴＲＷ Ｉｎｃ．， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡ）を用いて 、相同性領域を決定した。 配列比較をどのように行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、 ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組 合せを用いて、興味の対象である配列に対して相同性を有する領域を含む配列を 、ＤＮＡデータベースから検索し、適当な配列に対して初期値と共にスコアが付 けられた。続いて、これらの相同領域を、ドットマトリタス相同性プロット法を 用いて検定し、偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表 示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメント用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＤＮＡ配列の相同 性の検査に類似した方法で確認された。Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域を含 むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコアを 付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、 有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。 別の方法として、ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的アライメント検索ツール）（ Basic Local Alignment Search Tool）を用いて、局部的な配列のアライメント を検索した。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ （１９９０ ） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０参照）ＢＬＡＳＴは、ヌクレ オチド及びアミノ酸配列双方のアライメントを検出して、これにより配列の類似 性を決定する。アライメントが局部的であるために、ＢＬＡＳＴは、ギャップを 含まないアライメントを求めるのに有用なものである。ＢＬＡＳＴアルゴリズム 出力の基本単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉ ｒ（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメ ントスコアがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコア以上である ような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、興味 の対象となる配列と、データベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統 計的有意性を評価し、ユーザが選択した有意性の閾値を超える一致のみを知るこ とができる。パラメータＥは、データベース配列との一致で報告されるものを選 択するための、統計的有意性の閾値を設定するパラメータである。Ｅは、データ ベース検索全体のコンテキストの中で、ＨＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の 一致の予定頻度の上限と解釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラ ムの出力において報告される。 更に、ＢＬＡＳＴ分析を用いて、ＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベース内での 近縁関係にある分子の検索を行った。このプロセス、“エレクトロニックノーザ ン”分析は、ノーザンブロット法に類似したものであり、一回に一つのセルブレ ビン配列を用いて、設定された厳密さで一致する、或いは相同性を有する分子を 検索する。エレクトロニックノーザンの厳密さは、“プロダクトスコア”に基づ いたものである。このプロダクトスコアは、｛ＢＬＡＳＴでの問合わせ配列と参 照配列との間のヌクレオチドまたはアミノ酸の一致度（％）｝×｛（問合わせ配 列及び参照配列の長さに基づく）ＢＬＡＳＴスコアの可能な最大値（％）｝／１ ００、として定義される。プロダクトスコア４０では、一致度は１〜２％以内で あるが、７０では完全に一致する。相同性を有する、若しくは近縁関係にある分 子は、約１５〜３０のプロダクトスコアを示すものを選択することによって同定 され得る。 ４．ＣＢの同定、完全長配列決定、及び翻訳 リウマチ様滑膜ライブラリからランダムにつり上げられ配列決定されたクロー ンの分析により、インサイト社クローンＮｏ．８０１８４におけるセルブレビン 配列が、ラットのセルブレビン（ＭｃＭａｈｏｎ ＨＴ ｅｔ ａｌ （１９９ ３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３４６−９）のホモログとして同定された。イン サイト８０１８４を含むｃＤＮＡ挿入体は、上述と同様の方法により完全に配列 決定された。同定された挿入体のコーディング領域（ＡＴＧ→ＴＧＡ）は、配列 番号：１として示した。ヒトｃｂ−１の配列を、ＰａｔｅｎｔＩＮリリース１． ３０（米国特許庁ソフトウェアパッケージ）を用いて、配列の規則に従って翻訳 し、配列番号：２に示した。翻訳物ＣＢ−１の配列を、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔやＰ ＩＲのようなタンパク質データベースで検索したが、完全に一致するものは見出 されなかった。第１図〜第４図に示すのは、ここに開示するＣＢのヌクレオチド 配列及びアミノ酸配列である。第５図に示すのは、ＣＢ分子とそれに最も近縁な ホモログとの配列アライメントである。 肺ライブラリ（ＬＵＮＧＮＯＴ０１）からランダムにつり上げられ配列決定さ れたクローンの分析により、インサイト社クローンＮｏ．１２２８２６における セルブレビン配列が、アフリカツメガエルのセルブレビン（ＧＩ ６０６９７８ ； Ｋｎｅｃｈｔ， Ａ．Ｋ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａ ｄ． Ｓｃｉ． ８０８６−９０）のホモログとして同定された。インサイト１ ２２８２６を含むｃＤＮＡ挿入体は完全に配列決定された。同定された挿入体の コーディング領域（ＡＴＧ→ＴＧＡ）は、配列番号：３として示した。ヒトｃｂ −２の配列をＭａｃＤＮＡｓｉｓ（商標）ソフトウェア（日立ソフトウェアエン ジニアリング社）を用いて翻訳し、配列番号：４に示した。翻訳物ＣＢ−２の配 列を、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔやＰＩＲのようなタンパク質デ ータベースで検索したが、完全に一致するものは見出されなかった。 肺ライブラリ（ＬＵＮＧＮＯＴ０２）からランダムにつり上げられ配列決定さ れたクローンの分析により、インサイト社クローンＮｏ．３１１５３７における セルブレビン配列が、ウシのセルブレビン（ＧＩ ４３３０７５； Ｓｕｄｈｏ ｆ ＴＣ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｅｕｒｏｎ ２：１４７５−１４８ １）のホモログとして同定された。インサイト３１１５３７を含むｃＤＮＡ挿入 体は、以下に説明する方法に従って完全に延長された。同定された挿入体のコー ディング領域（ＡＴＧ→ＴＧＡ）は、配列番号：５として示した。ヒトｃｂ−３ の配列をＭａｃＤＮＡｓｉｓ（商標）ソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニ アリング社）を用いて翻訳し、配列番号：６に示した。翻訳物ＣＢ−３の配列を 、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔやＰＩＲのようなタンパク質データベースで検索したが、 完全に一致するものは見出されなかった。 小脳ライブラリ（ＣＲＢＬＮＯＴ０１）からランダムにつり上げられ配列決定 されたクローンの分析により、インサイト社クローンＮｏ．６７４７１９におけ るセルブレビン配列が、独特で唯一のセルブレビン配列として同定された。イン サイト６７４７１９を含むｃＤＮＡ挿入体は完全に配列決定された。同定された 挿入体のコーディング領域（ＡＴＧ→ＴＧＡ）は、配列番号：７として示した。 ヒトｃｂ−４の配列をＭａｃＤＮＡｓｉｓ（商標）ソフトウェア（日立ソフトウ ェアエンジニアリング社）を用いて翻訳し、配列番号：８に示した。翻訳物ＣＢ −４の配列を、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔやＰＩＲのようなタンパク質データベースで 検索したが、完全に一致するものは見出されなかった。 ５．３１１５３７のｃＤＮＡの完全長への延長 インサイト３１１５３７のｃＤＮＡは、ｃＤＮＡの完全長への延長のためのオ リゴヌクレオチドプライマーをデザインするのに用いられた。 プライマーは既知の配列に基づいて設計された。プライマーの１つはアンチセン ス方向（ＸＬＲ）への延長を開始するべく合成され、他方はセンス方向（ＸＬＦ ）に配列を延長するためのものであった。このプライマーにより、配列を“外向 きに”延長させ、目的の遺伝子に対する、新たな未知のヌクレオチド配列を含む 単位複製配列を生成した。このプライマーはオリゴ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）を用いて２２〜 ３０のヌクレオチドからなる長さを有し、５０％以上のＧＣコンテントを有し、 約６８〜７２℃の温度でターゲット配列にアニールするように設計され得る。ヘ アピン構造で、プライマー−プライマー二量体形成を引き起こすような任意のヌ クレオチドのストレッチの生成は回避される。 ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）製の肺（カタログ番 号１０４２４−０１８）及び心臓（カタログ番号１０４１９−０１８）ｃＤＮＡ ライブラリを組み合わせたものを、ＸＬＲ＝ＴＧＴＧＴＴＡＧＧＣＡＧＴＡＧＴ ＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧ及びＸＬＦ＝ＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧ ＧＣＴＧＴＧＣプライマーと共に用いて、インサイト社クローンＮｏ．３１１５ ３７を延長し、増幅して、完全長セルブレビン配列を得た。 ＸＬ−ＰＣＲキットの指示に従い、酵素及び反応混合物を徹底的に混合するこ とによって、忠実度の高い増幅が達成される。４０ｐｍｏｌの各プライマーを初 め、推奨された濃度のキットの他の成分を用いることによって、ＰＣＲは、Ｐｅ ｌｔｉｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）を用いて以下のパラメータで実 行された。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６を更に１５回反復 ステップ８ ９４℃で５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を更に１２回反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（この温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲル上で電気泳動を行うことによって分析し、配列の延長において どの反応が成功したかを決定した。どの延長反応生成物も完全長遺伝子を含んで いる可能性があるが、最も大きい生成物もしくはバンドが選択されゲルから切り 取られる。ＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）のような市販 のゲル抽出法を用いて更なる精製が行われた。ＤＮＡの回収の後、クレノウ（Kl enow）酵素を用いて、一鎖ヌクレオチドの張り出し（overhangs）をトリムし、 再連結及びクローニングが容易な平滑末端を生成した。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結反応緩衝液に再び溶解した。つ いで、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼを添加し、その混合物は、室温で２〜３時間、または１６℃で一 晩インキュベーションされた。競合的（competent）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（４０μ ｌの適当な媒質）を、３μｌの連結反 応混合物で形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等， ｓｕｐｒａ）において培養された。３７℃で１時間のインキュベーションの後、 形質転換混合物の全てを２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｅ ｒｔａｎｉ（ＬＢ）−ａｇａｒ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等， ｓｕｐｒａ（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等， ｓｕｐｒａ）にプレートした（plated）。後日、 各プレートから１２個のコロニーをランダムに取り出し、適当な市販の無菌９６ 穴マイクロタイタープレートの各穴において１５０μｌの液体ＬＢ／カルベニシ リン媒質で培養した。後日一晩培養された各５μｌを非無菌型９６穴プレートに 移し、水で１：１０に希釈した後、５μｌの各試料をＰＣＲアレイに移した。 ＰＣＲ法による増幅のため、０．７５単位のＤａｑポリメラーゼベクタープラ イマー、及び延長反応に使用される遺伝子特異的プライマーの１つもしくは複数 を含む濃縮ＰＣＲ反応混合物（１．３３Ｘ）の１５μｌを、各穴に添加した。増 幅は以下のような条件のもとで実行された。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４を更に２９回反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（その温度を保持） ＰＣＲ反応のアリコットは、アガロースゲルの上で分子量マーカーとともに反 応させた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分ｃＤＮＡと比較し、適当なクローン を選択してプラスミドに連結し、配列決定を行った。 ６．アンチセンス分析 ＣＢの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査におけ るアンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。オリゴヌクレオチド 、即ちｃｂのアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはＣＤＮＡのフラグメントをｉ ｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、ｃｂのｍＲＮＡの発現を阻害す ることができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の様々な部位 に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動物の全体をこの ようなアンチセンス配列で処理することより、ｃｂ遺伝子の機能を効果的に遮断 することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若しくは生物体全体 のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の変化等）を観察 することにより、ｃｂ遺伝子の機能を確認することができる。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節 遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾 することかできる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリックス）”塩基対と して知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成することができる。 ７．ＣＢの発現 ｃｂの発現は、ｃｂを適当な発現ベクターにサブクローニングし、そのベクタ ーを適当な発現宿主に導入させることにより達成される。以前に組織ライブラリ の生成のために使用されたクローニングベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまた はｐＳｐｏｒｔ ＩもＥ．ｃｏｌｉにおけるｃｂ配列の直接的発現をなさしめる 。例えば、クローニングサイトの上流において、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはβガ ラクトシダーゼのプロモータを有し、それに続けてアミノ末端Ｍｅｔ及び次に続 くβガラクトシダ ーゼの７つの残基を含む配列を含む。これらの８つの残基のすぐ後に、人為的プ ライミング及び転写に役立つ工学的処理をなされたバクテリオファージプロモー タ、及びクローニングのための、Ｅｃｏ ＲＩを含む多数の独特な制限サイトを 有する。 標準的方法を用いて、単離された、ＩＰＴＧのトランスフェクションをなされ た菌種の誘発により、βガラクトシダーゼの始めの７つの残基とリンカーの約１ ５個の残基に対応する融合タンパク質、及びｃＤＮＡにコードされたペプチドが 生成される。ｃＤＮＡクローン挿入体は必ずランダムプロセスによって生成され ることから、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠内に存在する 機会は３つに１つだけである。ｃＤＮＡが適当な読み枠内にない場合には、それ は周知の方法で適切な数の塩基の削除若しくは挿入を行うことによって得られる 。このような方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、エキソヌクレアー ゼＩＩＩ若しくは大豆ヌクレアーゼによる消化、若しくはオリゴヌクレオチドリ ンカー混入などがある。 ｃｂのｃＤＮＡは、特異的宿主におけるタンパク質の発現のために有用である と知られている他のベクター内にシャトルされる。標的ｃＤＮＡ（２５個の塩基 ）のス両端のトレッチに対してハイブリッド形成するのに十分なＤＮＡのセグメ ントとクローニングサイトを含むオリゴヌクレオチドアンプリマーは、標準的方 法によって化学的に合成され得る。次いでこれらのプライマーを用いて、ＰＣＲ により所望の遺伝子セグメントが増幅される。得られた新たな遺伝子セグメント は、標準状態のもとで適当な制限酵素で消化され、ゲル電気泳動法によって単離 される。これとは別の方法では、類似する遺伝子セグメントを、ｃＤＮＡを適当 な制限酵素と共に消化し、欠失した遺伝子セグメントを化学的に合成されたオリ ゴヌクレオチドで埋めることによって生成する。１以上の遺伝 子からのコーディング配列のセグメントを互いに連結し、適切なベクターにクロ ーニングすることにより、組換え配列の発現が最適化される。 このようなキメラ分子のための適切な発現宿主にはチャイニーズハムスターの 卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞のようなほ乳類の細胞や、Ｓｆ９細胞のよう な昆虫の細胞や、サッカロミセスセレビシエのような酵母菌細胞や、Ｅ．ｃｏｌ ｉのような細菌があるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系 のそれぞれに対して有用な発現ベクターは、バクテリア内での増殖を可能にする 複製起点、及び細菌内での選択を可能にするβラクタマーゼ抗生物質抵抗性遺伝 子のような選択可能なマーカーを含んでいる。更に、このベクターは、真核生物 の宿主細胞へのトランスフェクションに役立つネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを含む。真核生物の発現宿主に おいて使用するために、ベクターは、それが目的のｃＤＮＡの一部分でない場合 には、３’ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシング要素を必要とするこ とがある。 更にこのベクターは、遺伝子発現を増加させるエンハンサまたはプロモータを 含む。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＣＨＯ細胞に対してはＭＭ ＴＶ、ＳＶ４０、及びメタロチオネインプロモータ、細菌宿主に対してはｔｒｐ 、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモータ、また酵母菌に対してはα因子、アルコ ールオキシダーゼ、及びＰＧＨプロモータ等がある。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ Ｖ）エンハンサのような転写エンハンサは、ほ乳類宿主細胞において使用される 。標準的な培養方法により、組換え細胞の均質な培養物がひとたび得られたなら ば、組換えにより生成された大量のＣＢが条件培地から回収され、周知のクロマ トグラフィー法を用いて分析される。 ８．組換えＣＢの単離 任意のＣＢは、タンパク質精製を促進するべく添加された１または２以上の付 加的ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現される。このよ うな精製促進ドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリ プトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定免疫グロブリン上で の精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ 精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ． Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）において 使用されるドメインなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製 ドメインとｃｂ配列との間のＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｔｒｏｇ ｅｎ）のような切断可能なリンカー配列を含むことが、融合タンパク質からの精 製を促進するのに役立っている。 ９．ＣＢ特異的抗体の生成 ＣＢに対する抗体を生成するのに２つの方法が用いられる。それぞれの方法は ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れかを生成するために有用なも のである。その方法の１つでは、逆相ＨＰＬＣ分離により、変性タンパク質が最 大７５ｍｇ得られる。変性タンパク質は標準的なプロトコルを用いてマウス若し くはウサギを免疫化するのに用いられる。即ちマウスの免疫化に対しては約１０ ０μｇが適切であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇが用いられ得る。マウスハ イブリドーマの同定のためには、変性タンパク質が放射性沃素で標識して、抗体 を産生し得るネズミのＢ細胞ハイブリドーマのスクリーニングを行うのに用いる 。この手順で必要となるタンパク質はごく少量で、即ち数千のクローンの標識付 け及びスクリーニングのためには２０ｍｇで十分である。 第２の方法においては、ｃＤＮＡの転写から演繹されるＣＢのアミノ酸配列が 分析されて、免疫抗原性の高い領域が決定される。適当な親水性領域を含むオリ ゴペプチドが合成され、抗体を産生するための適切な 免疫化プロトコルにおいて使用される。適当なエピトープを選択するための分析 は、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ等（ｓｕｐｒａ）によって説明されている。免疫化の ための最適なアミノ酸配列が通常存在するのは、Ｃ末端、Ｎ末端、及びそれらの 間に挟まれた、タンパク質がその自然な配座にあるとき外部環境にさらされるこ との多いポリペプチドの親水性領域である。 典型的には、約１５個の残基を有する長さの選択されたペプチドは、ｆｍｏｃ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐ ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、 Ｍ−メイルイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）と反応（ＭＢＳ； Ａｕｓｕｂｅ ｌ ＦＭ 等， ｓｕｐｒａ）させることによってキーホールリンペットヘモシ アニン（ＫＬＨ、Ｓｉｇｍａ）に結合される。必要ならば、ＫＬＨと結合できる ようにするため、システインがペプチドのＮ末端に挿入される。ウサギは、フロ イント完全アジュバントのペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫化される。得られ た抗血清は、ペプチドとプラスチックを結合し、１％のウシの血清アルブミンで ブロックし、抗血清と反応させ、洗浄し、かつ（放射性またはけい光剤により） 標識されたアフィニティ精製された特異的ヤギ抗ウサギｌｇＧと反応させること によって抗ペプチド活性がテストされる。 ハイブリドーマは標準的な技術を用いて調製されスクリーニングされる。目的 のハイブリドーマは、標識されたＣＢと共にスクリーニングを行うことによって 検出され、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する融合体が同定さ れる。典型的なプロトコルにおいては、プレートの穴（ＦＡＳＴ； Ｂｅｃｔｏ ｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌ ｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）が、１０ｍｇ／ｍｌの、アフィニティ精製された特異的 ウサギ抗マウス（または適当な抗−種１ｇ）抗体によってコーティングされる。 コーティングされた穴は１％のＢＳＡでブロックされ、洗浄されて、ハイブリド ーマからの上澄みに曝される。インキュベーションの後、穴は１ｍｇ／ｍｌの標 識されたＣＢに曝される。抗体を産生するクローンは、上述のバックグラウンド において検出され得る量の標識されたＣＢと結合する。このようなクローンはが 拡大され、限界希釈（１細胞／３穴）で２サイクルのクローニングを受ける。ク ローン化されたハイブリドーマはプリスタン処理されたマウスに注射されて、そ れが腹水を生成し、タンパタ質Ａ上のアフィニティクロマトグラフィーによって マウスの腹水からモノクローナル抗体が生成される。少なくとも１０⁸／Ｍ、好 ましくは１０⁹〜１０¹⁰またはそれ以上の親和性を有するモノクローナル抗体は 、典型的には、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ， ＮＹ及びＧｏｄｉｎｇ（１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃ ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙに記載されているよ うな標準的な手順によって生成される。ここではこの２つの資料を参照されたい 。 １０．ＣＢ特異的抗体を用いる診断テスト 特定のＣＢ抗体は、ＣＢの量若しくは分布の差によって特徴付けられる小胞輸 送の調査や、感染状態や遺伝状態の診断に役立つ。特定のＣＢが特定のヒトｃＤ ＮＡライブラリで見出されたことから、全身性防衛のような機能を共通にする細 胞や組織において発現が引き起こされると思 われる。 ＣＢに対する診断テスト方法には、人体の体液、膜、細胞、組織、若しくはそ のような組織の抽出物における特定のＣＢを検出するべく抗体及び標識を使用す る方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して使用されるか、ま たは修飾することなく使用される。このポリペプチド及び抗体は、多くの場合、 検出可能なシグナルを伝達する物質と共有結合、若しくは非共有結合の何れかで 結合することによって標識される。さまざまな標識及びその関連技術が知られて おり、科学文書及び特許明細書の双方において広く報告されてきた。適切な標識 としては、放射性核種、酵素、基質、共同因子（cofactors）、阻害剤、蛍光剤 、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識の使用方法は、米国 特許出願第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３ ５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１ ４９号、及び第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。また組換え免疫 グロブリンは、米国特許出願第４，８１６，５６７号明細書に記載の方法により 生成することができる。これらの明細書を本明細書とともに参照されたい。 該タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、若しくはモノクローナル 抗体の何れかを用いた可溶性ＣＢまたは膜結合ＣＢの測定のためのプロトコルは 、様々なものが周知となっている。この例を挙げると、酵素結合イムノソルベン トアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細 胞選別法（ＦＡＣＳ）等がある。好適なのは、ＣＢ上の２つの非干渉エピトープ に対して反応するモノクローナル抗体を用いる二点（two sites）モノクローナ ル免疫アッセイであるが、競合的結合アッセイを用いてもよいる。これらのアッ セイは例えばＭａｄｄｏｘ， ＤＥ 等（１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １ ５８ ：１２１１）のような他の文書に記載されている。 １１．特異的抗体を用いた天然ＣＢの精製 天然ＣＢまたは組替えＣＢは、ＣＢに対して特異的な抗体を用いる免疫性アフ ィニティクロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫アフィニティカ ラムは、抗ＣＢ抗体と活性化クラマトグラフィー樹脂とを共有結合することによ って構成される。 ポリクローナル免疫グロプリンは、硫酸アンモニウムとともに沈殿させるか、 固定タンパク質Ａ上で精製させることによって免疫血清から調製される（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿か固定タンパク 質Ａ上でのクロマトグラフィーによって、マウスの腹水から調製される。部分的 に精製された免疫グロプリンは、ＣｎＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフ ィー樹脂に共有結合される。製造者の指示に従った処理により、抗体は樹脂に結 合し、この樹脂はブロックされた上で、誘導体樹脂が洗浄される。 このような免疫アフィニティカラムは、ＣＢを含む細胞の分画を調製すること によってＣＢの精製を行うときに使用される。この調製は、全ての細胞の可溶化 を行い、異なる遠心分離法を用いて得られるサブ細胞分画の単離を行う方法か、 若しくは周知の他の方法によって誘導される。別の方法では、シグナル配列を含 む可溶性ＣＢが、細胞が成長する媒質に有用な量だけ分泌される。 沈殿物を含む分画のＣＢは免疫アフィニティカラムを通され、このカラムがＣ Ｂの優先吸収が可能な条件（即ち、洗剤が存在する高イオン強度の緩衝液を使用 ）のもとで洗浄される。次いで、このカラムは抗体／ＣＢ結合を切断するような 条件（即ち、尿素またはチオシアネートイオ ンのような高濃度のカオトロープまたはｐＨ２〜３の緩衝液を使用）の下で溶離 され、ＣＢが回収される。 １２．薬物スクリーニング 本明細書において開示されるセレブレビンは、治療効果を有する化合物のスク リーニングに役立つ。様々な薬物スクリーニング技術において、ＣＢまたはその 結合フラグメントが役立つのである。このようなテストで使用されるポリペプチ ドまたはフラグメントは、溶質に遊離しているか、個体の担体に固着しているか 、細胞の表面や細胞内に存在している。薬物スクリーニングの方法の１つでは、 ＣＢを発現する組換え核酸またはそのフラグメントで安定に形質転換された真核 生物もしくは原核生物の宿主細胞を用いる。薬物は、競合的結合アッセイにおい て、このような形質転換された細胞に対してスクリーニングされる。このような 細胞は、生細胞であっても固定された細胞であっても、標準的な結合アッセイ用 として用いられる。例えば、ＣＢとテストされる作動薬との複合体の形成が測定 される。別の例では、テストする薬物が、ＣＢと受容体との複合体形成に与える 影響を検定することもできる。 従って、本発明は、薬物または小胞輸送に影響を及ぼす他の薬剤のスクリーニ ング方法を提供するものである。この方法は、このような薬物をＣＢポリペプチ ドまたはそのフラグメントに接触させる過程と、 （ｉ）薬物とＣＢポリペプチドまたはフラグメントとの複合体の存在、もしくは （ｉｉ）ＣＢポリペプチドまたはフラグメントと細胞との複合体の存在を周知の 方法を用いて検定する過程とを含む。このような競合的結合アッセイにおいては 、ＣＢポリペプチドまたはフラグメントは通常標識される。適当なインキュベー ションの後、遊離ＣＢポリペプチドまたはフラグメントは結合された形態にある ものから分離されて、遊離もしくは非複合化標識の量が、特定の薬物がＣＢと結 合する能力や、Ｃ Ｂ及び作動薬複合体に干渉する能力の測定基準となる。 薬物スクーリニングのための他の技術で、ＣＢポリペプチドに対する適切な結 合アフィニティを有する化合物のスクリーニングの高スループットが得られるが 、これについては１９８４年９月１３日に公開されたヨーロッパ特許第８４／０ ３５６４号に詳細に記載されており、ここではこれを参照されたい。簡単に説明 すると、多数の異なる小さなペプチドテスト化合物が、プラスチックピンまたは 他の表面のような固体基質上で合成される。このペプチドテスト化合物は、ＣＢ ポリペプチドと反応させられた上で洗浄される。結合されたＣＢポリペプチドは 、ついで周知の方法を用いて検出される。精製されたＣＢが、上述の薬物スクリ ーニング技術において使用するべくプレート上に直接コーティングされてもよい 。更に、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体の担体上に固定化す ることもできる。 本発明は、ＣＢと結合し得る中和抗体がＣＢポリペプチドまたはそのフラグメ ントに結合するテスト化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使 用も包含している。この方法においては、抗体がＣＢと１または２以上の抗原決 定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するために用いられる。 １３．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目的は目的の生物学的に活性のポリペプチドの、もしく はそれらが相互作用する小さい分子、即ち、アゴニスト、アンタゴニスト、もし くは阻害剤の構造的類似体を生成することである。これらの例の何れにおいても 、ポリペプチドの活性及び安定性がより勝っている薬物、もしくはｉｎ ｖｉｖ ｏでポリペプチド機能に干渉する薬物を形成するために用いられる。（Ｈｏｄｇ ｓｏｎ Ｊ（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１参照） １つの方法においては、目的のタンパク質、もしくはタンパク質−阻害剤複合 体の三次元構造が、Ｘ線結晶法、コンピュータによるモデル化、もしくは最も典 型的にはこの二つの方法を組み合わせることによって決定される。ポリペプチド の形状及び電荷は、構造を明瞭にし分子の活性サイトを決定するため、双方とも に確認されなければならない。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同 タンパク質の構造に基づいてモデル化することによって得られることもある。ど ちらの場合においても、得られる構造情報が、効果的な阻害剤をデザインするの に用いられる。合理的薬物デザインの有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ Ｓ ａｎ ｄ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６ −７８０１）によって示されたような活性及び安定性を改善した分子、もしくは Ａｔｈａｕｄａ ＳＢ等（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３：７４２−７ ４６）によって示されたような天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、もしくはア ンタゴニストとして機能する分子があり、ここではこれらの資料を参照されたい 。 上述のような機能的アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、つ いでその結晶構造を解明することも可能である。この方法は、原則として、次の 薬物デザインのベースとなるファーマコア（pharmacore）を形成する。機能的で 、薬理学的に活性な抗体に対する坑イデオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄｓ）を生 成することによってタンパク質結晶分析を飛ばすことも可能である。鏡像の鏡像 という関係で、ａｎｔｉ−ｉｄｓの結合サイトは、もとの受容体の類似体である と予想される。次いでこのａｎｔｉ−ｉｄｓは、化学的に若しくは生物学的に生 成されたペプチドのＢａｎｋからペプチドを同定し単離するのに用いられる。単 離されたペプチドはファーマコアとして機能する。 本発明によって、十分な量の特定のＣＢが形成され、これはＸ線結晶 学のような分析研究を行うのに使用することができる。更に、ここで用いられた ＣＢアミノ酸配列を知ることによって、それをＸ線結晶分析の代わりに用いたり 、更にそれに加えてコンピュータによるモデル化技術を用いる場合の手引きが得 られる。 １４．ＶＡＭＰ／ＳＮＡＰ／ＮＳＦ複合体の他のメンバーの同定 精製されたＣＢは、レセプタ、ドッキング及び融合タンパク質の同定、特性付 け及び精製のための研究用のツールである。放射性標識は周知のさまざまな方法 によってＣＢに組み込まれ、標識されたＣＢは、溶解した若しくは膜に結合した レセプタ分子を同定し捕捉するのに用いられる。好適な方法は、ＣＢにおける第 １アミノ基に¹²⁵Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する過程を含む（ Ｂｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ（１９７３） Ｂｉｏｃ ｈｅｍ Ｊ １３３：５２９）。この試薬は、生物学的活性の随伴性損失を引き 起こすことなくさまざまな分子に標識するのに使用されてきた（Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡ 等 （１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６： １８９８９； ＭｃＣｏｌｌ Ｓ 等（１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０− ４５５５）レセプタ保有膜は、標識されたＣＢ分子と共にインキュベーションさ れ、洗浄されて結合されていない分子が除去され、レセプタ−ＣＢ複合体が定量 される。異なる濃度のＣＢを用いて得られたデータは、レセプタ−ＣＢ複合体の 数、アフィニティ及び会合度（association）の値を計算するのに用いられる。 標識されたＣＢは、ＣＢが相互作用する分子を精製するための試薬としても有 用である。アフィニティ精製の一実施例においては、ＣＢはクロマトグロフィー カラムと共有結合される。細胞及びその細胞膜を抽出して、ＣＢを除去し、さま ざまなＣＢ遊離サブコンポーネントをカラムに通過させる。ＣＢ関連分子はその 生物学的親和性によってカラムに結 合する。ＣＢ複合体は、カラムから回収され、解離されて、回収された分子はＮ 末端タンパク質シクエンシングを受ける。次いでこのアミノ酸配列が、捕捉され た分子の同定、または適当なｃＤＮＡライブラリからその遺伝子をクローニング するための縮重オリゴヌクレオチドプローブのデザインに用いられる。 別の方法では、ＣＢに対する抗体、特にモノクローナル抗体が産生される。こ のモノクローナル抗体をスクリーニングして、標識されたＣＢの結合を阻害する ものを同定する。次いで、これらのモノクローナル抗体は、関連分子の発現クロ ーニングまたはアフィニティ精製において使用される。 他の可溶性結合分子も同様に同定される。標識されたＣＢは、リウマチ様滑膜 、肺、または小脳のような細胞または組織に由来する適当な物質または抽出物と 共にインキュベーションされる。インキュベーションの後、（精製ＣＢ分子より 大きい）ＣＢ複合体は、サイズ除外クロマトグラフィーまたは濃度勾配遠心法の ようなサイジング技術によって同定され、周知の方法によって精製される。可溶 性結合タンパク質は、Ｎ末端シクエンシングを受けて、可溶性タンパク質が既知 の場合にはデータベース上での同定についての十分な情報、可溶性タンパク質が 未知の場合にはクローニングについての十分な情報が得られる。 １５．ＣＢの抗体、阻害剤、レセプタ、またはアンタゴニストの使用及び投与 ＣＢの抗体、阻害剤、レセプタ、またはアンタゴニスト（または他の小胞輸送 を制限する処理剤、ＴＣＢ）は、治療的に投与されたとき異なる効果を発揮する 。ＴＣＢは、非中毒性、不活性、薬学的な許容範囲にある水性担体媒質で配合さ れる。媒質のｐＨは、好ましくは約５〜８、特に好ましくは６〜８である。しか し、このｐＨは配合される抗体、阻 害剤、またはアンタゴニストの特性、及び他の条件によって変化しうる。ＴＣＢ の特性には、分子の溶解度、半減期及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、これらの 特性及び他の特性が効果的な担体を決める助けとなる。ＴＣＢとしては天然のヒ トタンパク質も好適であるが、薬物スクリーニングによって得られた有機分子ま たは合成分子も、特定の状況においては同様に効果的である。 ＴＣＢは周知の投与経路で投与される。この投与経路には、局所的クリーム及 びゲル、経粘膜スプレー及びエアロゾル、経皮パッチ及び帯具、注射可能な静脈 の潅注配合物、及び液体及び錠剤の経口薬であって胃酸及び酵素に対して抵抗性 を有するように配合されたもの等があるが、これらに限定されない。特定の配合 、正しい投与量、及び投与経路は病院所属医師によって決定されるが、状況に応 じて様々に変化し得る。 このような決定は、治療条件、投与されるＴＣＢ、及び特定のＴＣＢの薬動力 学的プロファイルのようなさまざな要素を考慮することによってなされる。考慮 に入れるべき他の因子には、患者の病状（例えば重症であるかどうか）、年齢、 体重、性別、食事、時間、及び投与の頻度、薬物の組合せ、反応感受性及び治療 に対する耐性／反応性などがある。長時間作用するＴＣＢの配合物の投与頻度に は、３〜４日に１回の投与、毎週１回の投与、若しくは２週間に１回の投与程度 であるが、この頻度は特定のＴＣＢの半減期及びクリアランス速度によって決ま る。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの間であり、総投与量の上限は約 １ｇであるが、これは投与経路によって異なる。特定の投与量及び投与方法に関 する手引きは、米国特許出願第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号 または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。当業者は異なるＴＣＢ に対しては異なる配合が効果的であり、神経細胞への投与には血管内皮細胞のよ うな他の細胞の場合とは異なる 投与方法が求められることが予想される。 また、白血球を活性化させる状態または疾病が、ＴＣＢで治療可能な障害を誘 発させ得ることが考えられる。これらの状態または疾病は上述の診断テストによ って診断されるが、このようなテストは、ウイルス感染または他の感染症、外傷 による組織損傷、関節炎や喘息のような遺伝病、侵食性白血病及びリンパ腫、ま たは通常の細胞の挙動に由来する他の生理学的／病理学的問題が生じたことが疑 われる場合に行われるべきである。 １６．治療的分子の供給のための人工小胞 特定のＣＢ及びＣＢが相互作用する細胞内外のレセプタによって支配される小 胞の局在化は、蛍光抗体を用いて検定される。細胞内輸送、細胞外輸送双方にお けるＣＢの数、配置、及び特異性を解明することは非常に有益である。これによ って、関節炎、喘息、及び嚢胞性繊維症のような疾病への介入における小胞プロ セスを破壊することが可能となるのみならず、人工小胞の開発が可能となる。こ れらの小胞はリポソームに最も類似しており、立体的に安定であり得る。内部に 含まれている特定のセルブレビンは、小胞が細胞へ侵入したり、細胞を通過した り、細胞から出るような移動の際の目的地を提示する役割を果たす。セルブレビ ン分子及び小胞の内容物は、共に注意深く選択される。これら人工小胞は特定の サイズ有し、抗体、ヌクレオチド、及びインスリン、Ｄナーゼ、または治療的タ ンパク質のような他の化学療法薬分子を与えることが可能である。この技術は、 局在型の遺伝性または非遺伝性細胞療法に効果的なベクター及び組換えヌクレオ チドを供するのにも役立つ。何れの場合においても、リポソームが、特定の細胞 タイプ、組織、器官、または腫瘍に対してその表面でのＣＢの発現により誘導さ れる。 １７．キメラ治療的ＣＢ 別の実施例においては、人工小胞上のＣＢ分子の小胞内側端がキメラであり、 治療的ペプチドからなる。この治療的ペプチドは、移動の間は小胞内部において 保護されており、融合時には、細胞内原形質膜の一部として露出される。露出さ れたペプチドは、膜にアンカーされたままその機能を発揮するか、または、恒常 的細胞内酵素により所定の配列のところで切断されて細胞内に放出されるかの何 れかである。本発明の好適実施例は、このような短い治療的ペプチドを供給も包 含している。 本明細書に記載した全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に参照され たい。本明細書を参照することにより、当業者は本発明を実行することが十分可 能であるものと考えられる。本発明の実施においては、当業者には明らかな上述 の実施例の様々な変更が、請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなく行わ れることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ Ｇ０１Ｎ 33/566 ＡＢＮ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ ロスアルトス・ラクレスタドライブ 12555 (72)発明者 マリー、リン・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州94028・ ポルトラバレー・ロストランコスロード 1124

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする精製ポ リヌクレオチド。 ２．核酸配列が、配列番号：１の配列若しくはその相補的配列であることを特徴 とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．活性化Ｔ細胞の存在が、生物学的試料のなかの請求項１に記載のポリヌクレ オチドの発現に関連しているような状態または疾病の診断テスト方法であって、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 １に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 存在が、前記生物学的試料のなかの請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現と 相関性を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ４．前記状態または疾病が、慢性関節リウマチ、乳腫瘍、前立腺腫瘍からなるグ ループから選択されたものであることを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。 ６．請求項５に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞 。 ７．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であっ て、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項６に記載の宿主細胞 を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ８．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ９．配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする精製ポ リヌクレオチド。 １０．核酸配列が、配列番号：３の配列若しくはその相補的配列であることを特 徴とする請求項９に記載のポリヌクレオチド。 １１．活性化Ｔ細胞の存在が、生物学的試料のなかの請求項９に記載のポリヌク レオチドの発現に関連しているような状態または疾病の診断テスト方法であって 、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 ９に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 存在が、前記生物学的試料のなかの請求項９に記載のポリヌクレオチドの発現と 相関性を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 １２．前記状態または疾病が、クローン病、肺癌、脳腫瘍からなるグループから 選択されたものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 １３．請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター 。 １４．請求項１３に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主 細胞。 １５．配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する 方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項１４に記載の宿主細 胞を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 １６．配列番号：４のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 １７．配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする精製 ポリヌクレオチド。 １８．核酸配列が、配列番号：５の配列若しくはその相補的配列であることを特 徴とする請求項１７に記載のポリヌクレオチド。 １９．請求項１７に記載のポリヌクレオチドの発現が、生物学的試料のなかで誘 発されるような状態または疾病の診断テスト方法であって、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 １７に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 存在が、前記生物学的試料のなかの請求項１７に記載のポリヌクレオチドの発現 と相関性を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ２０．前記状態または疾病が、心血管の内皮に影響を及ぼすような感染症、炎症 、またはストレスからなるグループから選択されたものであることを特徴とする 請求項１９に記載の方法。 ２１．請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクタ ー。 ２２．請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴と する宿主細胞。 ２３．配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であ って、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項２２に記載の宿主細 胞を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ２４．配列番号：６のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ２５．配列番号：８に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする精製 ポリヌクレオチド。 ２６．核酸配列が、配列番号：７の配列若しくはその相補的配列であることを特 徴とする請求項２５に記載のポリヌクレオチド。 ２７．請求項２５に記載のポリヌクレオチドの発現が、生物学的試料のなかで誘 発されるような状態または疾病の診断テスト方法であって、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 ２５に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 存在が、前記生物学的試料のなかの請求項２５に記載のポリヌクレオチドの発現 と相関性を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ２８．前記状態または疾病が、小脳変性疾患、または脳腫瘍からなるグループか ら選択されたものであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。 ２９．請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発 現ベクター。 ３０．請求項２９に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主 細胞。 ３１．配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であ って、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項３０に記載の宿主細 胞を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ３２．配列番号：８のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ３３．請求項２６の精製ポリペプチドに対する阻害剤。 ３４．請求項３３の阻害剤及び製薬学的に許容できる賦形剤を含むことを特徴と する医薬品組成物。 ３５．効果的な量の請求項３４に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含 むことを特徴とする第２図に示すポリペプチドの誘発に関連する状態または疾病 を患う患者の治療方法。 ３６．前記状態または疾病が、クローン病、肺癌、脳腫瘍からなるグループから 選択されたものであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ３７．配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする精製 ポリヌクレオチド。 ３８．核酸配列が、配列番号：５の配列若しくはその相補的配列であることを特 徴とする請求項３７に記載のポリヌクレオチド。 ３９．請求項３７に記載のポリヌクレオチドの発現が、生物学的試料のなかで誘 発されるような状態または疾病の診断テスト方法であって、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 ３７に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 存在が、前記生物学的試料のなかの請求項３７に記載のポリヌクレオチドの発現 と相関性を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ４０．前記状態または疾病が、心血管の内皮に影響を及ぼすような感染症、炎症 、またはストレスからなるグループから選択されたものであることを特徴とする 請求項３９に記載の方法。 ４１．請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクタ ー。 ４２．請求項４１に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主 細胞。 ４３．配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であ って、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項４２に記載の宿主細 胞を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ４４．配列番号：６のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ４５．請求項３７のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的な核酸 配列を含むアンチセンス分子。 ４６．請求項４５のアンチセンス分子及び製薬学的に許容できる賦形剤を含むこ とを特徴とする医薬品組成物。 ４７．効果的な量の請求項４６に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含 むことを特徴とする第３図に示すポリペプチドの誘発に関連する状態または疾病 を患う患者の治療方法。 ４８．前記状態または疾病が、心血管の内皮に影響を及ぼすような感染症、炎症 、またはストレスからなるグループから選択されたものであることを特徴とする 請求項４７に記載の方法。 ４９．請求項４４の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 ５０．第３図に示すポリヌクレオチドの誘発が、生物学的試料のなかでの第３図 ポリペプチドの発現に関連するような状態または疾病の診断テスト方法であって 、 ａ）抗体がポリペプチドに結合し、抗体−ポリペプチド複合体を形成するのに 適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項４９に記載の抗体とを結合する過 程と、 ｂ）抗体−ポリペプチド複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が 、前記生物学的試料のなかでの前記ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する、 該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ５１．請求項４４の精製ポリペプチドに対する阻害剤。 ５２．請求項５１の阻害剤及び製薬学的に許容できる賦形剤を含むことを特徴と する医薬品組成物。 ５３．効果的な量の請求項５２に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含 むことを特徴とする第２図に示すポリペプチドの誘発に関連する状態または疾病 を患う患者の治療方法。 ５４．前記状態または疾病が、心血管の内皮に影響を及ぼすような感染症、炎症 、またはストレスからなるグループから選択されたものであることを特徴とする 請求項５３に記載の方法。 ５５．配列番号：８に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード する精製ポリヌクレオチド。 ５６．核酸配列が、配列番号：７の配列若しくはその相補的配列であることを特 徴とする請求項５５に記載のポリヌクレオチド。 ５７．請求項５５に記載のポリヌクレオチドの発現が、生物学的試料のなかで誘 発されるような状態または疾病の診断テスト方法であって、 ａ）ハイブリッド複合体形成に適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項 ５５に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する過程と、 ｂ）ハイブリッド複合体を検出する過程であって、前記ハイブリッド複合体の 存在が、前記生物学的試料のなかの請求項５５に記載のポリヌクレオチドの発現 と相関性を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ５８．前記状態または疾病が、小脳変性疾患、または脳腫瘍からなるグループか ら選択されたものであることを特徴とする請求項５７に記載の方法。 ５９．請求項５５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクタ ー。 ６０．請求項５９に記載の発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主 細胞。 ６１．配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であ って、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項６０に記載の宿主細 胞を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ６２．配列番号：８のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ６３．請求項５５のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的な核酸 配列を含むアンチセンス分子。 ６４．請求項６３のアンチセンス分子及び製薬学的に許容できる賦形剤を含むこ とを特徴とする医薬品組成物。 ６５．効果的な量の請求項６４に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含 むことを特徴とする第４図に示すポリペプチドの誘発に関連する状態または疾病 を患う患者の治療方法。 ６６．前記状態または疾病が、小脳変性疾患、または脳腫瘍からなるグループか ら選択されたものであることを特徴とする請求項６５に記載の方法。 ６７．請求項６２の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 ６８．第４図に示すポリヌクレオチドの誘発が、生物学的試料のなかでの第４図 ポリペプチドの発現に関連するような状態または疾病の診断テスト方法であって 、 ａ）抗体がポリペプチドに結合し、抗体−ポリペプチド複合体を形成するのに 適切な条件の下で、前記生物学的試料と請求項６７に記載の抗体とを結合する過 程と、 ｂ）抗体−ポリペプチド複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が 、前記生物学的試料のなかでの前記ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する、 該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ６９．請求項６２の精製ポリペプチドに対する阻害剤。 ７０．請求項６９の阻害剤及び製薬学的に許容できる賦形剤を含むことを特徴と する医薬品組成物。 ７１．効果的な量の請求項７０に記載の医薬品組成物を患者に投与する過程を含 むことを特徴とする第４図に示すポリペプチドの誘発に関連す る状態または疾病を患う患者の治療方法。 ７２．前記状態または疾病が、小脳変性疾患、または脳脛瘍からなるグループか ら選択されたものであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。