CN110352073A

CN110352073A - 针对timp-2的抗体用于改善肾功能的用途

Info

Publication number: CN110352073A
Application number: CN201780076765.5A
Authority: CN
Inventors: P·麦克菲森; J·A·科勒姆
Original assignee: Smart Pharmaceutical Co Ltd; University of Pittsburgh
Current assignee: Smart Pharmaceutical Co Ltd; University of Pittsburgh
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-10-18
Also published as: EP3532101B1; JP7100030B2; JP2019533695A; EP3532101A1; WO2018081578A1; AU2017348365A1; EP3532101A4; US20190263926A1; ES2908239T3

Abstract

本发明提供了使用特异性结合金属蛋白酶抑制剂2(TIMP‑2)的抗体治疗患有肾损伤或有患肾损伤风险的受试者的方法。具体而言，该方法能够用于治疗患有慢性肾病(CKD)、急性肾损伤(AKI)的受试者，或已经诊断为充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉疾病、蛋白尿、低于正常范围的肾小球滤过、肝硬化、高于正常范围的血清肌酐、败血症或急性肾功能衰竭(ARP)中的一种或多种的受试者。

Description

针对TIMP-2的抗体用于改善肾功能的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月28日提交的美国临时专利申请62/414,479的权益，其全部内容包括所有表格、附图和权利要求书通过引用并入本文。

背景

以下对本发明背景的讨论仅提供用于帮助读者理解本发明，并且不承认其描述或构成本发明的现有技术。

金属蛋白酶抑制剂2(人前体Swiss-Prot P16035，也称为“金属蛋白酶组织抑制剂2”和“TIMP2”)是一种分泌蛋白，其与金属蛋白酶复合并通过与其催化锌辅因子结合而不可逆地使它们失活。已知TIMP2作用于MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16和MMP-19。据报道，TIMP2抑制内皮细胞的增殖。因此，已经提出编码的蛋白质通过抑制响应于血管生成因子的静息组织的增殖，以及通过抑制经历重塑的组织中的蛋白酶活性而在维持组织稳态中起作用。

另外，WO2010/048346和WO2011/075744(其每一个的全部内容包括所有表格、附图和权利要求书通过引用并入本文)描述了TIMP2用于单独地和在多标记物组中评估受试者的肾状态的用途。特别地，通过免疫测定测量的TIMP2水平显示与肾状态的风险分层、诊断、分期、预后、分类和监测相关。

急性肾损伤(AKI)是由于各种病况引起的并且具有严重后果。AKI定义为以下任何一种：

在48小时内SCr增加≥0.3mg/dl(≥26.5μmol/l)；或

将SCr增加至≥1.5倍基线，已知或假定在过去7天内发生；或

尿量<0.5ml/kg/h，持续6小时。

根据以下标准对AKI进行严重性分期：

重要的是，通过更广泛地定义肾功能急性变化的综合征，RIFLE标准超越了ARF。根据RIFLE标准定义的，AKI的概念包括其他不太严重的病况。Bellomo等人(Crit Care.8(4):R204-12,2004)描述了RIFLE标准：

“风险”：血清肌酐从基线增加1.5倍，或尿液产量<0.5ml/kg体重/小时，持续6小时；

“损伤”：血清肌酐从基线增加2.0倍，或尿液产量<0.5ml/kg/hr，持续12h；

“衰竭”：血清肌酐从基线增加3.0倍或肌酐>355μmol/l(升高>44)或尿排出量低于0.3ml/kg/hr持续24小时或无尿持续至少12小时；

“损失”：持续需要肾脏替代疗法持续超过四周。

“ESRD”：终末期肾病-需要透析持续超过3个月。

如在Kellum,Crit.Care Med.36:S141-45,2008和Ricci等人,Kidney Int.73,538-546,2008(各自通过引用整体并入本文)中所讨论的，RIFLE标准提供了AKI的统一定义，其已在许多研究中得到验证。

普遍认为，AKI导致住院患者的高发病率和死亡率，并且迫切需要有效的治疗。除了一些孤立的研究外，绝大多数动物和临床研究尚未最终证明AKI药物治疗的益处。Jo等人,Clin J Am Soc Nephrol 2:356–365,2007。

概述

本发明的一个目的是用于治疗患有肾损伤或处于肾损伤的风险的受试者的方法。具体地，本文显示针对金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的抗体的施用改善败血症诱导的AKI模型中的肾组织学评分。

在第一方面，本发明提供了用于改善有此需要的受试者、最优选人受试者的肾功能的方法，其包括：向受试者施用特异性结合金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的抗体。

在某些实施方案中，抗TIMP-2抗体的施用任选地与足以改善肾功能的量的用于改善肾功能的一种或多种其他治疗剂或治疗方法联合进行。在下文中详细描述了合适的另外的治疗方式。

在某些实施方案中，有此需要的受试者是患有慢性肾病(CKD)或表现出一种或多种CKD症状的受试者。在其他实施方案中，有此需要的受试者是患有急性肾损伤(AKI)或表现出AKI的一种或多种症状的受试者。

在其他实施方案中，有此需要的受试者是被鉴定为具有增加的AKI风险的受试者。举例来说，基于以下的一种或多种疾病的存在诊断，可以将这样的受试者鉴定为具有增加的风险：充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉疾病、蛋白尿、肾功能不全、低于正常范围的肾小球滤过、肝硬化、高于正常范围的血清肌酐、败血症、肾功能损伤或肾功能减退。在某些实施方案中，受试者的特征在于患有糖尿病肾病(DN)或表现出DN的一种或多种症状。

可替代地或另外地，基于受试者正在经历或已经经历大血管手术、冠状动脉搭桥或其他心脏手术，和/或已经接受以下的一种或多种：NSAID、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线的造影剂或链脲霉素，可以将这样的受试者鉴定为具有增加的风险。

在某些实施方案中，基于生物标记物结果，可以将这样的受试者鉴定为具有增加的风险。优选地，生物标记物结果包括测量的尿TIMP-2浓度和测量的尿胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)浓度中的一种或多种，并且最优选地从测量的尿TIMP-2浓度和测量的尿IGFBP7浓度计算的组合结果，例如[TIMP-2]×[IGFBP7]结果。

在某些实施方案中，受试者的特征在于处于AKIN阶段1或低于AKIN阶段1；受试者的特征在于处于AKIN阶段2或低于AKIN阶段2，或者所述受试者的特征在于处于AKIN阶段3或低于AKIN阶段3。

在各种实施方案中，单独或与任选的治疗方式一起施用抗TIMP-2抗体导致受试者的估计的肾小球滤过率(eGFR)的改善。

在各种实施方案中，单独或与任选的治疗方式一起施用抗TIMP-2抗体降低了受试者中血清肌酐的水平。

在各种实施方案中，抗TIMP-2抗体的施用是肠胃外的，例如静脉内、动脉内或皮下。

在各种实施方案中，抗TIMP-2抗体的施用是IgG、Fab片段、F(ab’)2或scFv。该列表并不意味着限制。在某些实施方案中，抗TIMP-2抗体是人源化的或完全人源化的。

在某些实施方案中，用于改善肾功能的一种或多种其他治疗剂或治疗方法包括选自以下的一种或多种治疗：肾替代疗法、流体超负荷管理、施用胱天蛋白酶抑制剂、施用米诺环素、施用聚ADP-核糖聚合酶抑制剂、施用铁螯合剂、在有此需要的受试者中施用针对败血症的治疗、施用胰岛素、施用促红细胞生成素和施用血管扩张剂。

在附图和以下描述中阐述了本公开内容的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求书，本公开内容的其他特征、目的和优点将是显而易见的。

附图的简要说明

包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图示出了本发明的若干实施方案，并与本说明书一起用于解释本发明的原理。

图1显示了与未处理的败血症动物相比，用抗TIMP2处理后在小鼠盲肠结扎和穿刺败血症模型中通过组织学测量的肾组织损伤。

图2显示了与未处理的败血症动物相比，用抗TIMP2处理后在小鼠盲肠结扎和穿刺败血症模型中通过血清肌酐测量的肾功能。

详述

定义

如本文所用，术语“金属蛋白酶抑制剂2”和“TIMP-2”是指存在于生物样品中的一种或多种多肽，其衍生自金属蛋白酶抑制剂2前体(人前体：Swiss-Prot P16035(SEQ IDNO:10))。

已在金属蛋白酶抑制剂2中鉴定了以下结构域：

残基长度结构域ID

1-26 26 信号肽

27-220 194 金属蛋白酶抑制剂2

除非本文另有明确说明，否则所用术语的定义是制药科学领域中使用的标准定义。如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“药物载体”包括两个或更多个(两种或更多种)这样的载体的混合物等。

如本文所用的术语“受试者”是指人或非人生物体。因此，本文描述的方法和组合物适用于人和兽医疾病。此外，虽然受试者优选是活生物体，但是本文描述的发明也可以用于死后分析。优选的受试者是人，并且最优选“患者”，如本文所用，其是指接受针对疾病或病况的医疗护理的活着的人类。这包括正在接受病理学体征检查的没有明确疾病的人。

如本文所用的术语“诊断”是指技术人员能够通过其估计和/或确定患者是否患有给定疾病或病况的概率(“可能性”)的方法。在本发明的情况下，“诊断”包括使用针对本发明的肾损伤标记物的测定(最优选免疫测定)结果(任选地与其他临床特征一起)，以达到从其获得和测定样品的受试者的急性肾损伤或ARF的诊断(即，存在或不存在)。这样的诊断被“确定”并不意味着诊断是100％准确的。许多生物标记物指示多种病况。熟练的临床医生不在信息真空下使用生物标记物结果，而是将测试结果与其他临床指标一起使用以得出诊断。因此，在预定诊断阈值的一侧上测量的生物标记物水平相对于在预定诊断阈值的另一侧上的测量水平指示在受试者中发生疾病的更大可能性。

类似地，预后风险表示给定的过程或结果将发生的概率(“可能性”)。预后指标的水平或水平的变化(其进而与发病概率增加(例如，肾功能恶化、未来的ARF或死亡)相关)被称为“指示患者的不良结果的增加的可能性”。

如本文所用的术语“抗体”是指衍生自、模拟或基本上由免疫球蛋白基因或其片段编码的肽或多肽，其能够特异性结合抗原或表位。参见，例如，Fundamental Immunology,3rd Edition,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993)；Wilson(1994；J.Immunol.Methods175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97。术语抗体包括保留结合抗原的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包括在术语“抗体”中作为参考。

某些治疗性抗体是IgG抗体。如本文所用的术语“IgG”是指属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人中，该类别包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG类别抗体中的已知Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。出于若干实际原因，IgG是治疗性抗体的优选类别。IgG抗体稳定，易于纯化，并且能够在对于药物供应链实用的条件下储存。在体内，它们具有长的生物半衰期，其不仅是它们的大小的函数，而且还是它们与所谓的Fc受体(或FcRn)相互作用的结果。这种受体似乎保护IgG免受细胞内的分解代谢，并将其再循环回血浆。

抗体是结合特定抗原的免疫蛋白质。在大多数哺乳动物(包括人和小鼠)中，抗体由成对的重链和轻链多肽链构建。轻链和重链可变区在抗体之间显示出显著的序列多样性，并负责结合靶抗原。每条链由单个免疫球蛋白(Ig)结构域组成，因此通用术语免疫球蛋白用于此类蛋白质。

本发明包括抗TIMP-2抗原结合片段及其使用方法。除非另有说明，否则本文所用的“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；纳米抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体等)。

本发明包括抗TIMP-2Fab片段及其使用方法。“Fab片段”包含一条轻链和一条重链的C_H1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是抗体的木瓜蛋白酶切割的产物。

本发明包括抗TIMP-2抗体及其包含Fc区的抗原结合片段及其使用方法。“Fc”区含有两个重链片段，其包含抗体的CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。

本发明包括抗TIMP-2Fab'片段及其使用方法。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的含有V_H结构域和C_H1结构域以及C_H1和C_H2结构域之间的区域的部分或片段，从而能够在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')₂分子。

本发明包括抗TIMP-2F(ab’)₂片段及其使用方法。“F(ab')₂片段”含有两条轻链和两条重链，其含有C_H1和C_H2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')₂片段由两个Fab'片段组成，这两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。“F(ab')₂片段”可以是抗体的胃蛋白酶切割的产物。

本发明包括抗TIMP-2Fv片段及其使用方法。“Fv区”包括来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。

本发明包括抗TIMP-2scFv片段及其使用方法。术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun(1994)The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,New York,pp.269-315。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203。

本发明包括抗TIMP-2结构域抗体及其使用方法。“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个V_H区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个V_H区可以靶向相同或不同的抗原。

本发明包括抗TIMP-2二价抗体及其使用方法。“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。

本发明包括抗TIMP-2骆驼化单结构域抗体及其使用方法。在某些实施方案中，本文的抗体还包括骆驼化的单结构域抗体。参见，例如Muyldermans等人(2001)TrendsBiochem.Sci.26:230；Reichmann等人(1999)J.Immunol.Methods 231:25；WO 94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。在一个实施方案中，本发明提供单结构域抗体，其包含两个具有修饰的V_H结构域，从而形成单结构域抗体。

本发明包括抗TIMP-2双抗体及其使用方法。如本文所用，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链中的轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)(V_H-V_L或V_L-V_H)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO93/11161；和Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。关于工程化抗体变体的综述，一般参见Holligerand Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。

术语“特异性结合”并不意味着抗体唯一地与其预期靶标结合，因为如上所述，抗体与展示抗体所结合的表位的任何多肽结合。相反，如果抗体对其预期靶标的亲和力与其对不显示适当表位的非靶分子的亲和力相比大约高5倍，则抗体“特异性结合”。优选地，对于靶分子，抗体的亲和力比其对非靶分子的亲和力高至少约5倍，优选10倍，更优选25倍，甚至更优选50倍，和最优选100倍或更多。在优选的实施方案中，优选的抗体以至少约10⁷M^-1和优选约10⁸M^-1至约10⁹M^-1、约10⁹M^-1至约10¹⁰M^-1、或约10¹⁰M^-1至约10¹²M^-1的亲和力结合。

亲和力计算为K_d＝k_off/k_on(k_off是解离速率常数，k_on是结合速率常数，K_d是平衡常数)。通过测量不同浓度(c)的标记配体的结合部分(r)，能够确定平衡时的亲和力。使用Scatchard方程绘制数据：r/c＝K(n-r)：其中r＝平衡时结合配体的摩尔数/受体的摩尔数；c＝平衡时游离配体浓度；K＝平衡结合常数；和n＝每个受体分子的配体结合位点数。通过图形分析，在Y轴上绘制r/c，相对地，在X轴上绘制r，从而产生Scatchard图。通过Scatchard分析进行的抗体亲和力测量是本领域众所周知的。参见，例如，van Erp等人,J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson and Griswold,Comput.Methods ProgramsBiomed.27:65-8,1988。

本发明的抗体可以进一步通过表位作图来表征，从而可以选择在本文所述的免疫测定中具有最大临床效用的抗体和表位。术语“表位”是指能够特异性结合抗体的抗原决定簇。表位通常由分子的化学活性表面群组组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者而非与后者的结合丧失。优选地，靶向在靶分子上存在但在非靶分子上部分存在或完全不存在的表位。

在一些实施方案中，抗体支架可以是来自不同物种的序列的混合物。因此，如果抗体是抗体，则此类抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”均指组合来自多于一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在某些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常是指非人抗体，其已将可变结构域框架区交换为人抗体中发现的序列。通常，在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人源多核苷酸编码或除了在其CDR内以外与这种抗体相同。CDR(部分或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-片层框架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR确定。这种抗体的产生描述于例如WO 92/11018，Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构建体中丧失的亲和力(美国专利号5,530,101；美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；美国专利号6,180,370；美国专利号5,859,205；美国专利号5,821,337；美国专利号6,054,297；美国专利号6,407,213)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，因此通常包含人Fc区。使用具有基因工程免疫系统的小鼠也能够产生人源化抗体。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。用于人源化和重塑非人抗体的多种技术和方法是本领域众所周知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)，和其中引用的参考文献)。人源化方法包括但不限于Jones等人,1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人,1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA86:10029-33；He等人,1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA89:4285-9,Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4181-4185；O'Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8中描述的方法。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其他方法可包括表面重修方法，如例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973中所述的。在一个实施方案中，如本领域已知的，已经亲和力成熟亲本抗体。基于结构的方法可用于人源化和亲和力成熟，例如如美国专利申请系列号11/004,590中描述的。基于选择的方法可用于人源化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,Protein Engineering 16(10):753-759中描述的方法。其他人源化方法可以包括仅移植部分CDR，包括但不限于美国专利申请系列号09/810,502；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中描述的方法。

在一个实施方案中，抗体是完全人抗体。“完全人抗体”或“完整人抗体”是指具有衍生自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。可以例如使用转基因小鼠(Bruggemann等人,1997,Curr Opin Biotechnol 8:455-458)或人抗体文库结合选择方法(Griffiths等人,1998,Curr Opin Biotechnol 9:102-108)获得完全人抗体。

抗体的产生

可以使用本领域已知的各种各样的技术产生单克隆抗体制剂，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括本领域已知的那些，并且例如在Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold SpringHarbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等人,in:MONOCLONAL ANTIBODIESAND T-CELL HYBRIDOMAS,pp.563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(两者均通过引用整体并入)中教导。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不限于产生它的方法)的抗体。

来源于除大鼠和小鼠之外的动物的单克隆抗体提供了独特的优势。与信号转导和疾病相关的许多蛋白质靶标在小鼠、大鼠和人之间高度保守，因此可被小鼠或大鼠宿主识别为自身抗原，使其不太具有免疫原性。当使用兔子作为宿主动物时，可以避免这个问题。参见，例如，Rossi等人,Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。

使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规和众所周知的。在非限制性实例中，能够用目的抗原或表达这种抗原的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合抗原的抗体的细胞。通常通过用阳性杂交瘤克隆腹膜内接种小鼠来产生通常含有高水平抗体的腹水。

能够用于抗体产生方法的佐剂包括但不限于蛋白质佐剂；细菌佐剂，例如完整细菌(BCG、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota))和包括细胞壁骨架的细菌组分、海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰脂质A、结核杆菌的甲醇可提取残基(MER)、完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂；病毒佐剂；化学佐剂，例如氢氧化铝、碘乙酸盐和胆甾醇基半琥珀酰胺；裸DNA佐剂。能够用于本发明方法的其他佐剂包括霍乱毒素、paropox蛋白、MF-59(Chiron Corporation；也参见Bieg等人(1999)“GAD65AndInsulin B Chain Peptide(9-23)Are Not Primary Autoantigens In The Type1Diabetes Syndrome Of The BB Rat,”Autoimmunity,31(1):15-24，其通过引用并入本文)、(Corixa Corporation；也参见Lodmell等人(2000)“DNA Vaccination OfMice Against Rabies Virus:Effects Of The Route Of Vaccination And TheAdjuvant Monophosphoryl Lipid A(MPL),”Vaccine,18:1059-1066；Johnson等人(1999)“3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives:Synthesis And ImmunostimulantActivities,”Journal of Medicinal Chemistry,42:4640-4649；Baldridge等人(1999)“Monophosphoryl Lipid A(MPL)Formulations For The Next Generation OfVaccines,”Methods,19:103-107，其均通过引用并入本文)、RC-529佐剂(CorixaCorporation；来自Corixa氨基烷基氨基葡萄糖胺4-磷酸(AGP)化学文库的先导化合物，也参见www.corixa.com)和DETOX^TM佐剂(Corixa Corporation；DETOX^TM佐剂包括佐剂(单磷酰脂质A)和分枝杆菌细胞壁骨架；也参见Eton等人(1998)“Active ImmunotherapyWith Ultraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX InPatients With Metastatic Melanoma,”Clin.Cancer Res.4(3):619-627；和Gupta等人(1995)“Adjuvants For Human Vaccines—Current Status,Problems And FutureProspects,”Vaccine,13(14):1263-1276，两者均通过引用并入本文)。

许多出版物讨论了使用噬菌体展示技术来产生和筛选多肽文库用于结合选定的分析物。参见，例如，Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等人,Science 249,404-6,1990,Scott and Smith,Science 249,386-88,1990；和Ladner等人,美国专利号5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是在编码待筛选多肽的DNA与该多肽之间建立物理结合。这种物理结合由噬菌体颗粒提供，其展示多肽作为包围编码多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。多肽与其遗传物质之间的物理结合的建立允许同时大量筛选携带不同多肽的大量噬菌体。展示对靶标具有亲和力的多肽的噬菌体与靶标结合，并且通过对靶标的亲和力筛选富集这些噬菌体。从这些噬菌体展示的多肽的身份可以从它们各自的基因组确定。通过使用这些方法，然后可以通过常规方法大量合成鉴定为对所需靶标具有结合亲和力的多肽。参见，例如，美国专利号6,057,098，其全部内容包括所有表格、附图和权利要求书并入本文。

然后可以通过首先用纯化的目标多肽筛选亲和力和特异性并且如果需要将结果与抗体与需要被排除结合的多肽的亲和力和特异性进行比较来选择通过这些方法产生的抗体。筛选程序可包括将纯化的多肽固定在微量滴定板的不同孔中。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液置于各自的微量滴定孔中并孵育约30分钟至2小时。然后洗涤微量滴定孔，并向孔中加入标记的第二抗体(例如，如果产生的抗体是小鼠抗体则标记的第二抗体是与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)并孵育约30分钟然后洗涤。将底物加入孔中，并且在存在针对固定化多肽的抗体时出现颜色反应。

然后可以在所选择的测定设计中进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在开发针对靶蛋白的免疫测定中，纯化的靶蛋白作为标准品，用于使用所选抗体判断免疫测定的灵敏度和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能不同；某些抗体对(例如，在夹心测定中)可以在空间上相互干扰等，抗体的测定性能可能是比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。

还能够使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生抗体。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座而单独或同时变得无功能。具体而言，JH区域的纯合缺失阻止了内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。使用常规方法用选择的抗原(例如本发明多肽的全部或部分)免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于产生人抗体的该技术的概述，参见Lonberg等人(1995)“Human Antibodies FromTransgenic Mice,”Int.Rev.Immunol.13:65-93，其全部内容通过引用并入本文。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论以及用于产生这种抗体的方案，参见例如国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；和美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425,5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，它们通过引用整体并入本文。此外，可以约定公司例如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)来使用与上述类似的技术提供针对所选抗原的人抗体。

抗体的重组表达

一旦获得了编码本发明抗体的核酸序列，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体的载体。可以使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。(参见，例如，Sambrook等人,1990,MOLECULARCLONING,A LABORATORY MANUAL,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.和Ausubel等人eds.,1998,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,JohnWiley&Sons,NY中描述的技术)。

可以通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的抗体。在具体的实施方案中，抗体的表达受组成型、诱导型或组织特异性启动子的调节。

用于表达本文公开的抗体或片段或免疫球蛋白链的真核和原核宿主细胞(包括作为宿主的哺乳动物细胞)是本领域众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。这些特别地包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌属的种(Saccharomyces sp.)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属的种(Kluyveromyces sp.)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属的种(Fusarium sp.)、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。毕赤酵母属的种(Pichia sp.)、任意酵母菌属的种、多形汉森酵母、克鲁维酵母属的种、白色念珠菌、任意曲霉属的种(Aspergillus sp.)、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、任意镰刀菌属的种、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙链孢霉。当编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许在宿主细胞中表达抗体或片段或链或将其分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间来产生抗体。

可利用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体。此类宿主表达系统代表可以产生和随后纯化抗体的编码序列的媒介物，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体的细胞。这些包括但不限于用含有免疫球蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属、毕赤酵母属)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有免疫球蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有来源于哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利号5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的大鼠视网膜细胞))。

在细菌系统中，可以根据所表达的抗体的预期用途有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白质时，为了产生抗体的药物组合物，可能期望指导高水平的易于纯化的融合蛋白产物的表达的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones,”EMBO J.2:1791-1794)，其中抗体编码序列可以与lac Z编码区在读框内地单独连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等人(1985)“Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichiacoli,”Nucleic Acids Res.13:3101-3110；Van Heeke等人(1989)“Expression Of HumanAsparagine Synthetase In Escherichia coli,”J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。pGEX载体也可用于表达外源多肽作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合基质谷胱甘肽-琼脂糖珠然后在游离的谷胱甘肽-硫酮存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物能够从GST部分释放。

在昆虫系统中，将苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将目的抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)将产生重组病毒，其是活的并且能够在受感染的宿主中表达免疫球蛋白分子。(参见例如，参见Logan等人(1984)“AdenovirusTripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late AfterInfection,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81:3655-3659)。插入的抗体编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子能够具有多种来源(天然和合成的)。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可以增强表达效率(参见Bitter等人(1987)“Expression And SecretionVectors For Yeast,”Methods in Enzymol.153:516-544)。

另外，可以选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。

对于重组蛋白的长期高产量生产，优选稳定表达。例如，可以改造稳定表达本发明的抗体的细胞系。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标记转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到它们的染色体中并生长形成病灶，其进而可以被克隆并扩增到细胞系中。该方法可有利地用于改造表达本发明的抗体的细胞系。此类改造细胞系可特别用于筛选和评估与本发明的抗体直接或间接相互作用的化合物。

可以使用许多选择系统，包括但不限于能够分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)“Transfer Of Purified Herpes VirusThymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells,”Cell 11:223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等人(1962)“Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48:2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人(1980)“Isolation OfTransforming DNA:Cloning The Hamster Aprt Gene,”Cell 22:817-823)基因。而且，抗代谢物抗性能够用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-ActingGene,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:3567-3570；O'Hare等人(1981)“TransformationOf Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant PlasmidExpressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:1527-1531)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等人(1981)“Selection ForAnimal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:2072-2076)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Tachibana等人(1991)“Altered Reactivity OfImmunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene,”Cytotechnology 6(3):219-226；Tolstoshev(1993)“Gene Therapy,Concepts,Current Trials And Future Directions,”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy,”Science 260:926-932；和Morgan等人(1993)“Human gene therapy,”Ann.Rev.Biochem.62:191-217)。可以使用的重组DNA技术领域中通常知晓的方法描述于Ausubel等人(eds.),1993,CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,NY；Kriegler,1990,GENE TRANSFER ANDEXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,Stockton Press,NY中；以及Dracopoli等人(eds),1994,CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS,John Wiley & Sons,NY.的第12和13章中；Colbere-Garapin等人(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker For HigherEukaryotic Cells,”J.Mol.Biol.150:1-14；以及hygro，其赋予对潮霉素抗性(Santerre等人(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418ResistanceAs Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells,”Gene 30:147-156)。

通过载体扩增能够增加本发明抗体的表达水平(综述参见Bebbington andHentschel,“The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The ExpressionOf Cloned Genes In Mammaian Cells,”于DNA CLONING,Vol.3.(Academic Press,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，抗体的产生也将增加(Crouse等人(1983)“Expression And Amplification OfEngineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Mol.Cell.Biol.3:257-266)。

可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可含有相同的选择性标记，其使得能够实现重链和轻链多肽的相等表达。或者，可以使用编码重链和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，轻链应置于重链之前，以避免过量的无毒重链(Proudfoot(1986)“Expression AndAmplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Nature322:562-565；Kohler(1980)“Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。

通常，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有糖基化模式，该糖基化模式是细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白的特征。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体包含本发明而不依赖于抗体可能具有的糖基化模式。类似地，在特定实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为已显示这些抗体在体外和体内通常表现出比其岩藻糖基化对应物更强的功效(参见例如，Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。这些具有非岩藻糖基化N-聚糖的抗体不太可能具有免疫原性，因为它们的碳水化合物结构是存在于人血清IgG中的群体的正常组分。

一旦重组表达了本发明的抗体，就可以通过本领域已知的用于纯化抗体的任何方法纯化它，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、特别是通过在蛋白A后对特定抗原的亲和力的亲和色谱以及分级柱色谱)、离心、差异溶解度或通过任何其他标准技术纯化蛋白质。

急性肾功能衰竭的诊断

本发明部分涉及向诊断患有AKI的患者施用抗TIMP-2抗体。如上所述，本文所用的术语“急性肾(或肾脏)损伤”和“急性肾(或肾脏)衰竭”部分地根据血清肌酐从基线值的变化来定义。ARF的大多数定义都有常见的要素，包括使用血清肌酐和常用的尿排出量。患者可能出现肾功能不全而没有可用于该比较的基线肾功能测量值。在这种情况下，可以通过假设患者最初具有正常GFR来估计基线血清肌酐值。肾小球滤过率(GFR)是每单位时间从肾(肾脏)的肾小球毛细血管过滤到鲍氏囊中的流体体积。肾小球滤过率(GFR)可以通过测量血液中具有稳定水平并且可以自由过滤但不会被肾脏再吸收或分泌的任何化学物质来计算。GFR通常以ml/min为单位表示：

通过将GFR归一化至体表面积，可以假设GFR为约75-100ml/min/1.73m²。因此测得的速率是尿液中源自可计算的血液量的物质的量。

有几种不同的技术用于计算或估计肾小球滤过率(GFR或eGFR)。然而，在临床实践中，肌酐清除率用于测量GFR。肌酐是由身体自然产生的(肌酐是肌酸的代谢产物，肌肉中存在肌酸)。它由肾小球自由过滤，但也由肾小管以非常少的量主动分泌，使得肌酐清除率将实际的GFR高估10-20％。考虑到测量肌酐清除率的容易程度，这个误差范围是可以接受的。

如果肌酐尿浓度(U_Cr)、尿流速(V)和肌酐血浆浓度(P_Cr)的值是已知的，则能够计算肌酐清除率(CCr)。由于尿浓度和尿流速的乘积得到肌酐的排泄率，肌酐清除率也被认为是其排泄率(U_Cr×V)除以其血浆浓度。这在数学上通常表示为：

通常进行24小时尿液收集，从一天早晨的空膀胱到第二天早晨的膀胱内容物，然后进行比较血液测试：

为了比较不同大小的人之间的结果，通常针对体表面积(BSA)校正CCr，并且与平均大小的人相比表示为ml/min/1.73m²。虽然大多数成年人的BSA接近1.7(1.6-1.9)，但极度肥胖或苗条的患者应针对其实际BSA校正CCr：

肌酐清除率测量的准确性(即使在收集完成时)也是有限的，因为随着肾小球滤过率(GFR)降低，肌酐分泌增加，因此血清肌酐的升高更少。因此，肌酐排泄远大于过滤负荷，导致GFR的潜在大幅高估(多达两倍的差异)。然而，出于临床目的，重要的是确定肾功能是稳定的还是变得更糟或更好。这通常通过单独监测血清肌酐来确定。与肌酐清除率一样，血清肌酐在ARF的非稳态条件下不能准确反映GFR。尽管如此，血清肌酐从基线变化的程度将反映GFR的变化。血清肌酐易于测量，并且其对于肾功能而言是特异的。

为了就mL/kg/hr基础的尿排出量确定尿排出量，每小时的尿液收集和测量是足够的。例如，在仅有累积24小时的排出量且没有提供患者体重的情况下，已经描述了RIFLE尿排出量标准的微小修改。例如，Bagshaw等人,Nephrol.Dial.Transplant.23:1203–1210,2008，假设平均患者体重为70kg，并且患者根据以下标准分配RIFLE分类：<35mL/h(风险)、<21mL/h(损伤)或<4mL/h(衰竭)。

风险评估

因为AKI与显著的发病率和死亡率相关，并且因为没有可用于逆转AKI的特定治疗，所以早期识别和管理是最重要的。实际上，识别具有AKI风险的患者，或具有可能的AKI但在临床表现之前的患者，可能比仅治疗已建立的AKI产生更好的结果。因此，本发明部分涉及向处于即将发生(在72小时内，更优选在48、24、18或12小时内)AKI的高风险的患者施用抗TIMP-2抗体。

高风险患者包括具有急性肾损伤(AKI)的风险因素但具有正常GFR的患者。例如，他们可能包括患有糖尿病和高血压或正在服用药物例如非甾体类抗炎药或血管紧张素转换酶抑制剂的患者。这些个体代表需要被鉴定以在可能的情况下修改风险因素并在指示时(例如，对比研究)启动预防策略的群体。患有肾前性AKI的患者是具有肾前尿指数和自动调节机制失效(其导致GFR降低(例如，脱水))的患者。这些个体有可能迅速逆转他们的肾前状况。在此期间，可能存在对近端小管细胞刷状缘的损伤但不可检测。然而，使用新型生物标记物，可以识别早期损伤和治疗。AKI患者可能代表从严重肾前性AKI的延伸。或者，在某些情况下，AKI可能不会在肾前状态之前(例如，败血症、暴露于肾毒素)。血清肌酐是晚期标记物，并且在存在实质性损伤后将检测AKI。此时，干预可能为时已晚。

KDIGO急性肾损伤临床实践指南(Kidney Intl.2(Suppl 1)，2012，其全部内容包括所有附录通过引用并入)提供了对AKI的风险评估的描述，特别是在第2.2章和附录D中。风险因素包括水合状态，低蛋白血症，高龄，女性，黑人种族，CKD、糖尿病、心脏病、败血症或肺病的存在，暴露于某些药物以及肾毒性的造影剂，心脏手术等。

生物标记物的使用

血清肌酐测量(SCr)是肾功能的金标准标记物。然而，SCr浓度在检测肾功能的突然下降时可能是不准确的，因为剩余健康肾单位的功能储备阻止了SCr的显著升高，直到50％的肾单位丢失。因此，因为SCr是肾损伤的“晚期”标记物，即使基于SCr的肾功能估计是“正常的”，肾损伤也可能已经开始。已用于评估AKI的其他生物标记物包括血清和尿胱抑素C，血清和尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，尿肾损伤分子1，白细胞介素-18，肝型脂肪酸结合蛋白和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶。

2014年，美国食品和药物管理局批准了基于金属蛋白酶组织抑制剂2和胰岛素样生长因子结合蛋白7的尿浓度的组合([TIMP-2]×[IGFBP7])的测试的上市以鉴定患者处于发展未来AKI的风险。在一项研究中，ICU入院后不久单次测量尿TIMP2·IGFBP7，发现12小时内发生中度至重度AKI的AUC-ROC为0.84。使用0.3的截止值，测试显示灵敏度和特异性分别为89％(77-97％)和49％(43-54％)；在截止值为2.0时，测试显示灵敏度和特异性为40％(23-57％)和94％(92-96％)。Gunnerson等人,J.Trauma Acute Care Surg.80:243–49,2016。这些测试提供了用于根据本发明的方法鉴定高风险患者进行治疗的理想方法。

药物组合物和施用

为了制备本发明的抗TIMP-2抗体和抗原结合片段的药物或无菌组合物，将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)。

治疗和诊断剂的制剂可以通过与例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液形式的可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见，例如，Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(eds.)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weinerand Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。

单独施用或与另一种治疗剂组合施用的本发明抗体的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定，例如，用于测定LD₅₀(对50％人群致死的剂量)和ED₅₀(50％人群中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。这些化合物的剂量优选在包括毒性很小或没有毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和施用途径。

在进一步的实施方案中，根据Physicians'Desk Reference 2003(ThomsonHealthcare；57th edition(November 1,2002))将其他治疗剂与本发明的抗TIMP-2抗体或其抗原结合片段一起施用于受试者。

施用方式可以变化。施用途径包括口服，直肠，经粘膜，肠道，肠胃外；肌肉内，皮下，皮内，髓内，鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内，眼内，吸入，吹入，局部，经皮，透皮或动脉内。

在具体的实施方案中，可以通过侵入途径例如通过注射施用本发明的抗TIMP-2抗体或其抗原结合片段。在本发明的其他实施方案中，通过静脉内、皮下、肌肉内、动脉内或通过吸入、气溶胶递送施用抗TIMP-2抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。通过非侵入性途径(例如，口服；例如，在丸剂、胶囊或片剂中)施用也在本发明的范围内。

本发明提供包含本发明的任何抗体或抗原结合片段或其药物组合物的容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有帽或色谱柱、中空针或注射器筒)。本发明还提供了包含本发明的任何抗体或抗原结合片段或其药物组合物的注射装置。注射装置是通过肠胃外途径(例如肌肉内、皮下或静脉内)将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，例如自动注射器)，其例如包括用于容纳待注射的流体(例如，抗体或片段或其药物组合物)的圆筒或桶、用于刺穿(piecing)皮肤和/或血管用于注射流体的针；以及用于将流体推出圆筒并穿过针孔的柱塞。在本发明的实施方案中，包含本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。这样的装置包括在套管或套管针/针中的抗体或片段或其药物组合物，其可以附接到管，所述管可以附接到用于容纳通过套管或套管针/针引入到患者体内的流体(例如，盐水；或包含NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl₂和任选地包括葡萄糖的乳酸林格溶液)的袋或贮存器)。在本发明的实施方案中，一旦将套管针和套管插入受试者的静脉并从插入的套管中取出套管针，就可将抗体或其片段或其药物组合物引入装置中。IV装置可以例如插入外周静脉(例如，手或手臂中)；上腔静脉或下腔静脉，或在心脏的右心房内(例如，中央IV)；或者进入锁骨下动脉、颈内静脉或股静脉，并且例如向心脏前进直至其到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉线)。在本发明的实施方案中，注射装置是自动注射器；喷射注射器或外部输液泵。喷射注射器使用液体的高压窄射流，其穿透表皮以将抗体或其片段或药物组合物引入患者体内。外部输注泵是以受控量将抗体或其片段或其药物组合物递送到患者体内的医疗装置。外部输液泵可以电力或机械力供电。不同的泵以不同的方式操作，例如，注射泵将流体保持在注射器的储存器中，并且可移动的活塞控制流体输送，弹性泵将流体保持在可伸展的球囊储存器中，并且来自球囊的弹性壁的压力驱动流体输送。在蠕动泵中，一组滚子向下夹在一段柔性管上，向前推动流体。在多通道泵中，流体可以以多个速率从多个储存器输送。

本文公开的药物组合物还可以使用无针皮下注射装置施用；例如美国专利号6,620,135；6096002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。包含药物组合物的这种无针装置也是本发明的一部分。本文公开的药物组合物还可以通过输注施用。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块的实例包括在以下专利中公开的那些：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物输送的可变流量可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员公知的，并且包含本发明的药物组合物的那些也在本发明的范围内。

施用方案取决于若干因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体或片段以实现靶标疾病状态的改善，同时最小化不希望的副作用。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重程度。可以获得选择合适剂量的治疗性抗体或片段的指导(参见，例如，Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。

合适的剂量由临床医生确定，例如，使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素。通常，剂量以略小于最佳剂量的量开始，并且此后其以小的增量增加，直到相对于任何负面副作用达到所需或最佳效果。重要的诊断测量包括例如炎症的症状的那些或产生的炎性细胞因子的水平。通常，期望所使用的生物制剂来源于与靶向治疗的动物相同的物种，从而最小化对试剂的任何免疫应答。例如，在人受试者的情况下，人源化和完全人抗体可以是期望的。

本文公开的抗体或其抗原结合片段可通过连续输注或通过例如每日、每周1-7次、每周、每两周、每月、每两个月、每季度、每半年、每年施用的剂量来提供。可以例如静脉内、皮下、局部、口服、鼻腔、直肠、肌肉内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg,0.5μg/kg,1μg/kg,10μg/kg,100μg/kg,0.25mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/ml,10mg/kg,25mg/kg,50mg/kg或更多(参见，例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144)。还可以提供剂量以在受试者的血清中实现抗TIMP-2抗体的预定的靶浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其他实施方案中，本发明的抗TIMP-2抗体每周、每两周、“每4周”、每月、每两个月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者例如皮下或静脉内施用。

如本文所用，术语“有效量”是指本发明的抗TIMP-2或其抗原结合片段的量，当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，其有效地引起疾病的一种或多种症状(例如癌症或癌症的进展)的可测量的改善。有效剂量还指足以导致症状至少部分改善的抗体或片段的量，例如改善的肾功能或组织学。当应用于单独施用的个体活性成分时，有效剂量仅指该成分。当应用于组合时，有效剂量是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合、连续或同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断测量或参数改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观测量来评估疾病严重性的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。

其他治疗方式

一旦获得诊断或患者被鉴定为“高风险”，临床医生能够容易地选择与诊断相容的治疗方案，例如开始肾替代疗法，撤回已知损害肾脏的化合物的递送，肾移植，延迟或避免已知对肾脏有害的程序，改变利尿剂施用，开始目标导向治疗等。本领域技术人员知道与本文描述的诊断方法相关讨论的许多疾病的适当治疗。参见，例如，Merck Manual ofDiagnosis and Therapy,17th Ed.Merck Research Laboratories,Whitehouse Station,NJ,1999。这些治疗可以与根据本发明的抗TIMP-2抗体的施用一起使用。

AKI的管理和治疗选择是多因素的，并且最终必须针对每种特定情况和患者进行定制。如前所述，RRT(无论是连续的还是间歇的)是一种替代肾功能的血液净化系统。然而，如上所述，RRT与风险和并发症相关，并且证据表明RRT可能是导致更差结果的独立危险因素。从风险-效益的角度来看，RRT应该保留给那些被认为最有可能患有持续性AKI和/或最有可能无法恢复的患者。在这种二分法构建中，保守治疗经常代表许多常见临床情况(包括临床证据、床边评估和客观数据表明从AKI恢复和/或AKI的非持久性的高可能性的情况)的首选临床选择。

保守治疗被定义为在不使用RRT的情况下解决AKI的危险和危及生命的表现的医疗干预和方法。这些管理策略包括但不限于关键的生理和病理生理紊乱，例如血容量过多和体液不平衡，酸中毒和酸碱失调，电解质紊乱(例如高钾血症)，尿毒症和严重的氮质血症。保守的管理策略由以下基本策略组成：

血液动力学支持：

a.液体疗法，包括使用类晶体和胶体

b.施用血管加压剂和血管活性剂(常用的血管加压剂包括以下物质：去甲肾上腺素，肾上腺素，去氧肾上腺素，多巴胺，血管加压素)

c.利尿疗法，包括使用循环和渗透性利尿剂

d.治疗酸中毒和其他酸碱异常

e.治疗钾和其他电解质紊乱和不平衡。

f.血糖控制和治疗高血糖。

g.营养支持。

当严重时，高钾血症是医学紧急情况并且需要立即干预。治疗方法分为三种主要方法：1)导致钾从细胞外空间转移到细胞内空间的干预，2)稳定钾的膜作用的干预，和3)增强钾消除的干预。这些干预措施通常同时提供。

患有AKI的患者通常发生酸碱异常，最显著的是代谢性酸中毒，其在临床上显著时需要干预。

在AKI和其他严重疾病中经常遇到由于应激性高血糖引起的升高的葡萄糖，并且关于与血糖控制相关的结果益处、可能受益的患者和群体以及期望的葡萄糖靶标和实现(相对)血糖正常的特定治疗方法的证据仍然存在争议，共识和目前的护理标准建议如下：使用胰岛素治疗以达到110至149mg/dL(6.1-8.3mmol/L)及以上的血糖水平；并经常监测血糖。

除了保守治疗之外，医生可以确定肾替代疗法的开始或维持是适当的。间歇性RRT包括血液透析和持续的低效透析，而连续RRT是指超滤(UF)，连续静脉血液滤过(CVVH)，连续静脉血液透析(CVVHD)，连续静脉血液透析滤过(CVVHDF)，连续静脉高通量血液透析，以及连续动脉静脉血液滤过(CAVH)。

一般方法

分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982 & 19892^nd Edition,2001 3^rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3^rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)。标准方法也出现在Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(Vol.1)，在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(Vol.2)，糖缀合物和蛋白质表达(Vol.3)和生物信息学(Vol.4)。

描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析，化学修饰，翻译后修饰，融合蛋白的产生，蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in MolecularBiology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人(2001)Current Protcols inImmunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlowand Lane,同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见，例如，Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,NewYork)。

可以制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见，例如，Sheperd and Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann andDubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow andLane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165:6205；He等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Footeand Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利号6,329,511)。

人源化的替代方案是使用展示在噬菌体上的人抗体文库或转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom andChames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。

描述了单链抗体和双抗体(参见，例如，Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290；Hudson and Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189；and U.S.Pat.No.4,946,778)。提供了双功能抗体(参见，例如，Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15；Volkel等人(2001)Protein Engineering 14:815-823；Segal等人(2001)J.Immunol.Methods 248:1-6；Brennan等人(1985)Science 229:81-83；Raso等人(1997)J.Biol.Chem.272:27623；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Traunecker等人(1991)EMBO J.10:3655-3659；和美国专利号5,932,448、5,532,210和6,129,914)。

还提供了多特异性抗体(参见，例如，Azzoni等人(1998)J.Immunol.161:3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162:6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74:9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275:38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276:12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165:2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875)；Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:5145-50,2013；de Jong等人,PLOS Biol 14(1):e1002344,2016(doi:10.1371/journal.pbio.1002344)。

抗原的纯化不是产生抗体所必需的。可以用携带目标抗原的细胞免疫动物。然后可以从免疫动物中分离脾细胞，并且脾细胞可以与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如，Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity 13:233-242；Preston等人,同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。

抗体可以缀合至例如药物小分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其他目的，并且包括偶联于例如染料、放射性同位素、酶或金属例如胶体金的抗体(参见，例如，Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing and Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。

用于流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选术(FACS)，是可获得的(参见，例如，Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,2^nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。适用于修饰用作例如诊断试剂的核酸包括核酸引物和探针、多肽和抗体的荧光试剂是可获得的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。

描述了免疫系统的组织学标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)ColorAtlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。

可获得用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库(参见例如GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note16:741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。

实施例

实施例1：兔子中的单克隆抗体开发

通过皮下注射(SQ)用抗原/佐剂乳剂免疫雌性新西兰兔。用完全弗氏佐剂进行初次免疫，并将不完全弗氏佐剂用于所有后续加强免疫。每三周以每只兔子250μg蛋白质抗原SQ注射兔子(两个部位(臀部和肩胛骨)交替)。在第二次加强免疫后7天从边缘耳静脉取出测试出血。通过间接ELISA测定来测试该测试出血(免疫血清)以确定兔的免疫应答是否足以用于单克隆抗体开发。最好响应的兔子被给予最后的SQ加强免疫，并且四天后通过放血被安乐死。通过心脏穿刺收集全血。通过对靶抗原的间接ELISA鉴定产生目的抗体的B细胞，并分离免疫球蛋白基因。将重链和轻链克隆到单独的哺乳动物表达载体中，转染到HEK细胞中(瞬时转染)，并收获含有兔单克隆抗体的组织培养上清液。

实施例2：小鼠中的单克隆抗体发育

按照标准操作程序，通过腹膜内注射(IP)用抗原/佐剂乳剂免疫雌性BALB/c小鼠(60日龄)。用完全弗氏佐剂进行初次免疫，并将不完全弗氏佐剂用于所有后续加强免疫。每3周以每只小鼠25μg抗原(每只小鼠总体积125μL)IP注射小鼠。在第二次加强免疫后7至10天通过隐静脉切开进行测试出血。通过间接ELISA测定法测试该测试出血(免疫血清)以确定小鼠的免疫应答是否足够用于融合。最好响应的2只小鼠通过侧尾静脉给予在无菌盐水中的每只小鼠10μg抗原的最终静脉内加强免疫。IV加强免疫后4天，使小鼠安乐死并收获脾脏。从脾脏分离的淋巴细胞用于融合过程以使用Kohler,G.；Milstein,C.(1975)."Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity".Nature 256(5517):495–497的方法产生杂交瘤。使用PEG1500融合过程产生杂交瘤。

实施例3：人源化

通过比较小鼠单克隆的鼠可变(V)区框架(FR)序列与Kabat数据库中的人抗体的序列(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office,Ishington,D.C.，通过引用并入本文)，发现人序列与小鼠单克隆的VK和VH结构域的FR具有最高程度的序列同源性。因此，选择这些人序列作为其上移植小鼠单克隆的CDR的人框架。

实施例4：组织学评价

用于确定动物模型中的肾损伤的标准是由训练有素的病理学家仔细检查肾脏形态。参见，例如，FDA“Review of Qualification Data for Biomarkers ofNephrotoxicity Submitted by the Predictive Safety Testing Consortium,2009，第13页(“组织病理学被用作定义损伤的金标准”)；另见Vaidya等人,Nat.Biotechnol.28:478-85,2010(由于SCr和BUN的敏感性和特异性差，肾小管损伤由组织病理学评分)。Critical Path Institute’s Predictive Safety Testing Consortium(PSTC)Nephrotoxicity Working Group(NWG)创建了组织病理学词典，并赋予了0-5的严重程度评分分级量表以将病理性病变分级为0(无可观察病理)、1(最小程度)、2(轻微的)、3(中等)、4(显著的)或5(严重)。该分级量表用于评估用抗TIMP-2治疗的效果。

实施例5：

Balb/c小鼠(20-24周龄，体重25-30g)购自Charles River LaboratoriesInternational，Inc。所有程序均由匹兹堡大学医学中心(UPMC)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。在1周的适应期后，在用异氟烷麻醉后对小鼠进行盲肠结扎和穿刺手术(CLP)以诱导败血症或仅进行剖腹手术(假手术)。具体而言，将盲肠外露，从顶部1/4处结扎，并用21号针刺穿3次。挤出一滴粪便，将结扎并刺破的盲肠置换到腹部中，并关闭腹壁。作为标准的手术后治疗，在颈背部皮下进行液体复苏(生理盐水40ml/kg)的一次施用，注射丁丙诺啡(0.05mg/kg)，并在手术后立即并每12小时(持续3天)腹膜内施加包括头孢曲松(25mg/kg)和甲硝唑(12.5mg/kg)的抗生素。密切监测所有动物，并在恢复期间允许自由获取食物和水。手术后48小时处死小鼠并收获肾组织并获得血液样品用于进一步测量。

两种同种型的抗TIMP2抗体由Astute Medical，Inc.(San Diego，CA)提供。抗体TIMP2(NB172-77)是单克隆F(ab’)2，抗体TIMP2(NB251-47)是多克隆山羊IgG。在CLP手术后8小时将CLP动物随机分成三组：CLP(用媒介物安慰剂治疗)、CLP+腹膜内注射抗TIMP2抗体NB172-77，5mg/kg)、CLP+腹膜内注射抗TIMP2抗体NB251-47，5mg/kg)。

通过苏木精和曙红(H&E)染色组织学组织图像中的组织学评分肾脏损伤。它包括细胞浸润评分(0-3)和小管上皮损伤评分(0-5)。具体而言，通过对小管和血管壁周围的细胞(层)的近似数量进行评分来确定细胞浸润(评分：0＝无，1＝<10细胞(5层)，2＝10至20个细胞(5至10个细胞层))，3＝>30个细胞(>10个细胞层)；小管上皮的损伤基于显示细胞坏死、刷状缘丧失、管型形成、空泡化和小管扩张的小管的比例评分如下：0，无；1，<10％；2，11％至25％；3，26％至45％；4，46％至75％；和5，>76％。使用来自BioVision(MountainView,CA)的肌酐测定试剂盒测量血清肌酐(SCr)。

使用SPSS 14.0版软件(SPSS Inc.，Chicago，IL)分析用于比较组的统计学测试。使用t检验比较配对的实验组。p<0.05的差异被认为是显著的。结果表示为平均值±SEM。

如图1所示，与未治疗的败血症动物相比，用TIMP2(NB172-77)的抗TIMP2治疗显著降低了肾组织损伤的程度(双尾T检验，P值0.046)。正如预期的那样，抗TIMP2治疗对血清肌酐测量的肾功能没有影响(图2)。因此，TIMP2在败血症期间促进肾组织损伤，而与血清肌酐水平无关。

尽管已经足够详细地描述和举例说明了本发明以使本领域技术人员制造和使用本发明，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下，各种替换、修改和改进应该是显而易见的。本文提供的实施例是优选实施方案的代表，是示例性的，并不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中的修改和其他用途。这些修改包含在本发明的精神内，并由权利要求的范围限定。

除非另有说明，否则本文中“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是可互换的并且不是限制性的。

应进一步理解，在各种实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定实例中，可替代地使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言描述实施方案

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和试剂可用于实施所公开的方法和组合物，但现在描述了示例性方法和材料。

本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文，用于描述和公开在出版物中描述的方法，其可以与本文的描述结合使用。本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明申请日之前本领域普通技术人员的水平。本文中的任何内容均不应被解释为承认发明人无权凭借在先公开内容而先于此类公开内容。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。

本文举例说明性描述的本发明可适当地在缺少本文未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，任何的术语“包含”、“基本上由......组成”和“由...组成”可以用其他两个术语中的任一个替换。已经使用的术语和表达用作描述性的术语而非限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，而是认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的范围内。

在所附权利要求书中阐述了其他实施方案。

Claims

1.一种改善有此需要的受试者的肾功能的方法，包括给受试者施用特异性结合金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的抗体，其任选地与足以改善肾功能的量的用于改善肾功能的一种或多种其他治疗剂或治疗方法联合使用。

2.权利要求1的方法，其中所述受试者患有慢性肾病(CKD)或表现出CKD的一种或多种症状。

3.权利要求1的方法，其中所述受试者患有急性肾损伤(AKI)或表现出AKI的一种或多种症状。

4.权利要求1的方法，其中所述受试者存在以下的一种或多种疾病的诊断：充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉疾病、蛋白尿、肾功能不全、低于正常范围的肾小球滤过、肝硬化、高于正常范围的血清肌酐、败血症、肾功能损伤、肾功能减退或急性肾功能衰竭(ARF)。

5.权利要求1的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历大血管手术、冠状动脉搭桥或其他心脏手术，和/或已经接受以下的一种或多种：NSAID、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线的造影剂或链脲霉素。

6.权利要求1-5之一的方法，其中所述受试者的特征在于处于AKIN阶段1或低于AKIN阶段1。

7.权利要求1-5之一的方法，其中所述受试者的特征在于处于AKIN阶段2或低于AKIN阶段2。

8.权利要求1-5之一的方法，其中所述受试者的特征在于处于AKIN阶段3或低于AKIN阶段3。

9.权利要求1-8之一的方法，其中所述受试者患有糖尿病肾病(DN)或表现出DN的一种或多种症状。

10.权利要求1-9之一的方法，其中所述施用导致受试者的估计的肾小球滤过率(eGFR)的改善。

11.权利要求1-9之一的方法，其中所述施用降低受试者中血清肌酐的水平。

12.权利要求1-9之一的方法，其中通过生物标记物结果将所述受试者表征为即将发生的AKI的风险增加。

13.权利要求12的方法，其中所述生物标记物结果包括测量的尿TIMP-2浓度和测量的尿胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)浓度中的一种或多种。

14.权利要求1-13之一的方法，其中所述受试者是人。

15.权利要求1-14之一的方法，其中胃肠外施用特异性结合TIMP-2的抗体。

16.权利要求15的方法，其中静脉内施用特异性结合TIMP-2的抗体。

17.权利要求15的方法，其中动脉内施用特异性结合TIMP-2的抗体。

18.权利要求15的方法，其中皮下施用特异性结合TIMP-2的抗体。

19.权利要求15的方法，其中腹膜内施用特异性结合TIMP-2的抗体。

20.权利要求1-19之一的方法，其中特异性结合TIMP-2的抗体是IgG。

21.权利要求1-19之一的方法，其中特异性结合TIMP-2的抗体是Fab片段、F(ab’)2或scFv。

22.权利要求1-21之一的方法，其中所述用于改善肾功能的一种或多种其他治疗剂或治疗方法包括选自以下的一种或多种治疗：肾替代疗法、流体超负荷管理、施用胱天蛋白酶抑制剂、施用米诺环素、施用聚ADP-核糖聚合酶抑制剂、施用铁螯合剂、在有此需要的受试者中施用针对败血症的治疗、施用胰岛素、施用促红细胞生成素和施用血管扩张剂。