ES2908239T3

ES2908239T3 - Uso de anticuerpos contra timp-2 para la mejora de la función renal

Info

Publication number: ES2908239T3
Application number: ES17865610T
Authority: ES
Inventors: Paul Mcpherson; John Kellum
Original assignee: University of Pittsburgh; Astute Medical Inc
Current assignee: University of Pittsburgh; Astute Medical Inc
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2022-04-28
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: EP3532101B1; WO2018081578A1; AU2017348365A1; EP3532101A4; JP2019533695A; US20190263926A1; EP3532101A1; JP7100030B2; CN110352073A

Abstract

Anticuerpo que se une específicamente al inhibidor de metaloproteinasa 2 (TIMP-2) para su uso en el tratamiento de lesión renal aguda (LRA) en un sujeto que tiene o se identifica que tiene un mayor riesgo de dicha lesión renal aguda.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de anticuerpos contra timp-2 para la mejora de la función renal

ANTECEDENTES

[0001] El inhibidor de la metaloproteinasa 2 (precursor humano Swiss-Prot P16035, también conocido como «inhibidor tisular de las metaloproteinasas 2» y «TIMP2») es una proteína secretada que forma complejos con las metaloproteinasas y las inactiva irreversiblemente al unirse a su cofactor de zinc catalítico. Se sabe que TIMP2 actúa sobre MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16 y MMP-19. TIMP2 supuestamente suprime la proliferación de células endoteliales. Como resultado, se ha sugerido que la proteína codificada juega un papel en el mantenimiento de la homeostasis tisular al suprimir la proliferación de tejidos inactivos en respuesta a factores angiogénicos e inhibir la actividad de la proteasa en los tejidos sometidos a remodelación.

[0002] Además, los documentos WO2010/048346 y WO2011/075744 describen el uso de TIMP2 para evaluar el estado renal de un sujeto tanto individualmente como en paneles de multimarcadores. En particular, se ha demostrado que los niveles de TIMP2 medidos mediante inmunoensayo se correlacionan con la estratificación del riesgo, el diagnóstico, la estadificación, el pronóstico, la clasificación y la monitorización del estado renal.

[0003] La lesión renal aguda (LRA) se debe a una variedad de afecciones y tiene graves consecuencias. La LRA se define como cualquiera de los siguientes:

Aumento de SCr en >0,3 mg/dl (>26,5 mmol/l) dentro de las 48 horas; o

Aumento de SCr a >1,5 veces el valor inicial, lo que se sabe o se presume que ocurrió dentro de los 7 días anteriores; o

Volumen de orina <0,5 ml/kg/h durante 6 horas.

[0004] La LRA se clasifica por gravedad de acuerdo con los siguientes criterios:

Etapa Creatinina sérica Producción de orina

<0,5 ml/kg/h durante 6-12 1 1,5-1,9 veces el valor inicial; o aumento > 0,3 mg/dl (> 26,5 mmol/l) horas

<0,5 ml/kg/h durante >12 2 2,0-2,9 veces el valor inicial horas

<0,5 ml/kg/h durante >12 3,0 veces el valor inicial; o el inicio de la terapia de reemplazo renal; o aumento horas; o anuria durante > 12 3 de la creatinina sérica a > 4,0 mg/dl (> 353,6 mmol/l); o en pacientes <18 años, horas

disminución de la eGFR a <35 ml/min por 1,73 m2

[0005] Es importante destacar que, al definir el síndrome de cambios agudos en la función renal de manera más amplia, los criterios de la RIFLE van más allá de la IRA. El concepto de LRA, según lo definido por los criterios de la RIFLE, incluye otras afecciones menos severas. Bellomo y col., Crit Care. 8(4):R204-12, 2004, describe los criterios de la RIFLE:

«Riesgo»: la creatinina sérica aumentó 1,5 veces desde el valor inicial O producción de orina de <0,5 ml/kg de peso corporal/h durante 6 horas;

«Lesión»: la creatinina sérica aumentó 2,0 veces desde el valor inicial O producción de orina <0,5 ml/kg/h durante 12 h;

«Falla (failure)»: la creatinina sérica aumentó 3,0 veces desde el valor inicial O creatinina >355 pmol/l (con un aumento de >44) o una producción de orina por debajo de 0,3 ml/kg/h durante 24 h o anuria durante al menos 12 horas;

«Pérdida»: necesidad persistente de terapia de reemplazo renal durante más de cuatro semanas.

«IRT»: enfermedad renal en etapa terminal: la necesidad de diálisis durante más de 3 meses.

[0006] Como se analiza en Kellum, Crit. Care Med. 36: S141-45, 2008 y Ricci y col., Kidney Int. 73, 538-546, 2008, los criterios RIFLE proporcionan una definición uniforme de LRA que ha sido validada en numerosos estudios.

[0007] Se reconoce ampliamente que la LRA conduce a una alta morbilidad y mortalidad en pacientes hospitalizados, y existe una necesidad urgente de un tratamiento eficaz. A excepción de unos pocos estudios aislados, la gran mayoría de los estudios clínicos y en animales aún no han demostrado de manera concluyente el beneficio de un tratamiento farmacológico de LRA. Jo y col., Clin J Am Soc Nephrol 2: 356-365, 2007.

RESUMEN

[0008] Es un objeto de la descripción los procedimientos para el tratamiento de sujetos que tienen, o que corren riesgo de tener, lesiones renales. Específicamente, la administración de anticuerpos dirigidos al inhibidor de metaloproteinasa 2 (TIMP-2) se muestra en esta solicitud para mejorar las puntuaciones histológicas renales en un modelo de LRA inducido por septicemia.

[0009] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al inhibidor de metaloproteinasa 2 (TIMP-2) para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene lesión renal aguda o que se identifica que tiene un mayor riesgo de lesión renal aguda, el uso comprende la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo al sujeto.

[0010] En determinadas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-TIMP-2 se realiza opcionalmente en asociación con uno o más agentes terapéuticos adicionales o procedimientos terapéuticos indicados para la mejora de la función renal, en una cantidad suficiente para mejorar la función renal. A continuación, se describen en detalle las realizaciones de tratamiento adicionales adecuadas.

[0011] En determinadas realizaciones, un sujeto que lo necesita es un sujeto que tiene enfermedad renal crónica (ERC) o que presenta uno o más síntomas de ERC. En otras realizaciones, un sujeto que lo necesita es un sujeto que tiene una lesión renal aguda (LRA) o que presenta uno o más síntomas de LRA.

[0012] En aun otras realizaciones, un sujeto que lo necesita es un sujeto identificado como con mayor riesgo de LRA. A modo de ejemplo, se puede identificar que tal sujeto tiene un mayor riesgo en función de un diagnóstico existente de una o más de insuficiencia cardíaca congestiva, preeclampsia, eclampsia, diabetes mellitus, hipertensión, enfermedad arterial coronaria, proteinuria, insuficiencia renal, filtración glomerular por debajo del intervalo normal, cirrosis, creatinina sérica por encima del intervalo normal, septicemia, lesión de la función renal o función renal reducida. En determinadas realizaciones, el sujeto se caracteriza por tener nefropatía diabética (ND) o presentar uno o más síntomas de ND.

[0013] Alternativamente, o además, tal sujeto puede identificarse como con un mayor riesgo en función del sujeto que se somete o se ha sometido a una cirugía vascular mayor, derivación de la arteria coronaria u otra cirugía cardíaca, y/o ha recibido uno o más de AINE, ciclosporinas, tacrolimus, aminoglucósidos, foscarnet, etilenglicol, hemoglobina, mioglobina, ifosfamida, metales pesados, metotrexato, agentes de contraste radiopacos o estreptozotocina.

[0014] En determinadas realizaciones, se puede identificar que tal sujeto tiene un mayor riesgo en función de un resultado de biomarcador. Preferentemente, el resultado de biomarcador comprende una o más de una concentración de TIMP-2 medida en orina y una concentración de proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 (IGFBP7) medida en orina, y lo más preferentemente un resultado combinado calculado a partir de una concentración de TIMP-2 medida en orina y una concentración de IGFBP7 medida en orina, tal como un resultado de [TIMP-2]x[IGFBP7].

[0015] En determinadas realizaciones, el sujeto se caracteriza como en la etapa AKIN 1 o por debajo de esta; el sujeto se caracteriza como en la etapa AKIN 2 o por debajo de esta, o el sujeto se caracteriza como en la etapa AKIN 3 o por debajo de esta.

[0016] En diversas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-TIMP-2, solo o con las realizaciones de tratamiento opcionales, da como resultado una mejora en la velocidad de filtración glomerular estimada (Egfr, por sus siglas en inglés) del sujeto.

[0017] En diversas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-TIMP-2, solo o con las realizaciones de tratamiento opcionales, reduce el nivel de creatinina sérica en el sujeto.

[0018] En diversas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-TIMP-2 es parenteral, tal como intravenosa, intraarterial o subcutánea.

[0019] En diversas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-TIMP-2 es una IgG, un fragmento Fab, un F(ab')2, o un scFv. Esta lista no pretende ser limitante. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-TIMP-2 es humanizado o completamente humano.

[0020] En ciertas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos adicionales o procedimientos terapéuticos indicados para la mejora de la función renal comprenden uno o más tratamientos seleccionados del grupo que consiste en terapia de reemplazo renal, manejo de sobrecarga de fluido, administración de un inhibidor de caspasa, administración de minociclina, administración de un inhibidor de poli ADP-ribosa polimerasa, administración de un quelante de hierro, administración de un tratamiento para septicemia en un sujeto que lo necesita, administración de insulina, administración de eritropoyetina, y administración de un vasodilatador.

[0021] Los detalles de una o más realizaciones de la descripción se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la descripción serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0022] Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones de la descripción y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

La figura 1 muestra la lesión del tejido renal medida por histología en un modelo con septicemia de ligadura y punción cecal de ratón después del tratamiento con anti-TIMP2 en comparación con animales con septicemia no tratados.

La figura 2 muestra la función renal medida por la creatinina sérica en un modelo con septicemia de punción y ligadura cecal de ratón después del tratamiento con anti-TIMP2 en comparación con animales con septicemia no tratados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

[0023] Como se usa en esta invención, la expresión «inhibidor 2 de metaloproteinasa» y «TIMP-2» se refieren a uno o más polipéptidos presentes en una muestra biológica que se derivan del precursor de inhibidor 2 de metaloproteinasa (precursor humano: Swiss-Prot P16035 (SEQ ID NO: 10)).

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

M G A A A R T L R L A L G L L L L A T L L R P A D A C S C S P V H P Q Q A F C N A D W I R A K A V S E K E V D S G N D

7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0

I Y G N P I K R I Q Y E I K Q I K M F K G P E K D I E F I Y T A P S S A V C G V S L D V G G K K E Y L I A G K A E G D G

1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0

K M H I T L C D F I V P W D T L S T T Q K K S L N H R Y Q M G C E C K I T R C P M I P C Y I S S P D E C L W M D W V T E

[0024] Se han identificado los siguientes dominios en el inhibidor 2 de metaloproteinasa:

Residuos Longitud ID del dominio

1 ± -26 26 Péptido señal

27 ± - 194 Inhibidor 2 de metaloproteinasa

220

[0025] A menos que se indique específicamente lo contrario en esta solicitud, las definiciones de los términos utilizados son definiciones estándar utilizadas en la técnica de las ciencias farmacéuticas. Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular «un», «una» y «el/la» incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a «un vehículo farmacéutico» incluye mezclas de dos o más de dichos portadores y similares.

[0026] El término «sujeto», como se usa en esta invención, se refiere a un organismo humano o no humano. Por lo tanto, los procedimientos y composiciones que se describen en esta invención son aplicables tanto a enfermedades humanas como veterinarias. Además, aunque un sujeto es preferentemente un organismo vivo, la invención descrita en esta solicitud también puede usarse en análisis post-mortem. Los sujetos preferidos son seres humanos, y mucho más preferentemente «pacientes» que, como se usa en esta invención, se refiere a seres humanos vivos que están recibiendo atención médica por una enfermedad o afección. Esto incluye a personas sin una enfermedad definida que estén siendo investigadas para determinar signos de patología.

[0027] El término «diagnóstico», como se usa en esta invención, se refiere a procedimientos mediante los cuales el experto en la técnica puede estimar y/o determinar la posibilidad ("una probabilidad") de si un paciente padece una enfermedad o afección determinada. En el caso de la presente invención, «diagnóstico» incluye el uso de los resultados de un ensayo, con la máxima preferencia un inmunoensayo, para un marcador de lesión renal de la presente descripción, opcionalmente junto con otras características clínicas, para llegar a un diagnóstico (es decir, la manifestación o no manifestación) de una lesión renal aguda o IRA, para el sujeto del que se obtuvo y se analizó una muestra. El hecho de que tal diagnóstico se «determine» no significa que el diagnóstico sea 100 % exacto. Muchos biomarcadores son indicativos de múltiples afecciones. El médico experto no utiliza los resultados de los biomarcadores en un vacío informativo, sino que los resultados de ensayo se utilizan junto con otras indicaciones clínicas para llegar a un diagnóstico. Por lo tanto, un nivel de biomarcador medido en un lado de un umbral de diagnóstico predeterminado indica una mayor probabilidad de aparición de enfermedad en el sujeto en relación con un nivel medido en el otro lado del umbral de diagnóstico predeterminado.

[0028] De manera similar, un riesgo de pronóstico indica una posibilidad ("una probabilidad") de que tenga lugar un curso o resultado dado. Se hace referencia a un nivel o un cambio en el nivel de un indicador de pronóstico, que a su vez se asocia con una mayor probabilidad de morbilidad (por ejemplo, empeoramiento de la función renal, IRA futura, o muerte) como "indicativo de una mayor probabilidad" de un resultado adverso en un paciente.

[0029] El término "anticuerpo", como se usa en esta invención, se refiere a un péptido o polipéptido derivado, modelado después o sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse específicamente a un antígeno o epítopo. Véase, p. ej., Fundamental Immunology, 3.a edición, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994; J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. El término anticuerpo incluye porciones de unión a antígeno, es decir, «sitios de unión a antígeno», (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias, regiones determinantes de complementariedad (CDR)) que conservan la capacidad de unirse al antígeno, incluido (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (RDC) aislada. Los anticuerpos monocatenarios también se incluyen como referencia en el término «anticuerpo».

[0030] Determinados anticuerpos terapéuticos son anticuerpos IgG. El término «IgG», tal como se usa en esta solicitud, se refiere a un polipéptido que pertenece a la clase de anticuerpos que están sustancialmente codificados por un gen de inmunoglobulina gamma reconocido. En humanos, esta clase comprende IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, esta clase comprende IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Los dominios Ig conocidos en la clase IgG de anticuerpos son VH, C^y1, C^y2, C^y3, VL y CL. La IgG es la clase preferida de anticuerpos terapéuticos por varias razones prácticas. Los anticuerpos IgG son estables, se purifican fácilmente y se pueden almacenar en condiciones que son prácticas para las cadenas de suministro farmacéuticas. In vivo tienen una larga vida media biológica que no es solo una función de su tamaño, sino que también es el resultado de su interacción con el llamado receptor Fc (o FcRn). Este receptor parece proteger la IgG del catabolismo dentro de las células y la recicla de vuelta al plasma.

[0031] Los anticuerpos son proteínas inmunológicas que se unen a un antígeno específico. En la mayoría de los mamíferos, incluidos los humanos y los ratones, los anticuerpos se construyen a partir de cadenas polipeptídicas pesadas y ligeras pareadas. Las regiones variables de cadena ligera y pesada muestran una diversidad de secuencia significativa entre anticuerpos y son responsables de unirse al antígeno diana. Cada cadena está formada por dominios de inmunoglobulina (Ig) individuales y, por lo tanto, se utiliza el término genérico inmunoglobulina para dichas proteínas.

[0032] La presente descripción incluye fragmentos de unión al antígeno anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. Como se usa en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, «fragmento de anticuerpo» o «fragmento de unión al antígeno» se refiere a fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, es decir, fragmentos de anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno unido por el anticuerpo de longitud completa, p. ej., fragmentos que retienen una o más regiones RDC. Los ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen, de modo no taxativo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')²y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple, p. ej., sc-Fv; nanocuerpos; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, etc.).

[0033] La presente descripción incluye fragmentos Fab anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. Un «fragmento Fab» está compuesto por una cadena ligera y las regiones C^h1 y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un «fragmento Fab» puede ser el producto de la escisión de papaína de un anticuerpo.

[0034] La presente descripción incluye anticuerpos anti-TIMP-2 y fragmentos de unión al antígeno de estos que comprenden una región Fc y procedimientos de uso de estos. Una región «Fc» contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

[0035] La presente descripción incluye fragmentos Fab'anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. Un «fragmento Fab» contiene una cadena ligera y una porción o fragmento de una cadena pesada que contiene el dominio V^hy el dominio C^h1 y también la región entre los dominios C^h1 y C^h2, de modo que se pueda formar un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')².

[0036] La presente descripción incluye fragmentos anti-TIMP-2 F(ab')2 y procedimientos de uso de estos. Un «fragmento F(ab')²» contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios C^h1 y C^h2, de modo que se forme un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. Por lo tanto, un fragmento F(ab')²está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Un «fragmento F(ab')²» puede ser el producto de la escisión de pepsina de un anticuerpo.

[0037] La presente descripción incluye fragmentos Fv anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. La «región Fv» comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes.

[0038] La presente descripción incluye fragmentos scFv anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. La expresión anticuerpo «Fv de cadena simple» o «scFv» se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios V^hy V^lde un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido simple. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios V^hy V^lque permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una reseña de scFv, véase Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburgy Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269 a 315. Véase también la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 88/01649 y las patentes de EE. UU. N.° 4.946, 778 y 5.260.203.

[0039] La presente descripción incluye anticuerpos de dominio anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. Un «anticuerpo de dominio» es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones V^hse unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones V^hde un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse a los mismos antígenos o a antígenos diferentes.

[0040] La presente descripción incluye anticuerpos bivalentes anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión al antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (ver más adelante).

[0041] La presente descripción incluye anticuerpos de dominio simple camelizados anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de esta solicitud también incluyen anticuerpos de dominio simple camelizados. Véase, p. ej., Muyldermans y col. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann y col. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; la patente de EE. UU. N.° 6.005.079). En un aspecto, la presente descripción proporciona anticuerpos de dominio simple que comprenden dos dominios V^hcon modificaciones de modo que se formen anticuerpos de dominio simple.

[0042] La presente descripción incluye diacuerpos anti-TIMP-2 y procedimientos de uso de estos. Como se usa en esta solicitud, el término «diacuerpos» se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptídica (V^h-V^lo V^l-V^h).

Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Se describen los diacuerpos

más completamente en, p. ej., el documento EP 404,097; WO 93/11161; y Holliger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una reseña de las variantes de anticuerpos modificados genéricamente, véase Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

[0043] La expresión «se une específicamente» no pretende indicar que un anticuerpo se une exclusivamente a su diana prevista ya que, como se ha indicado anteriormente, un anticuerpo se une a cualquier polipéptido que presente el epítopo o epítopos a los que se une el anticuerpo. Por el contrario, un anticuerpo «se une específicamente» si su afinidad por su diana prevista es aproximadamente 5 veces mayor en comparación con su afinidad por una molécula no diana que no muestra el epítopo o epítopos apropiados. Preferentemente, la afinidad del anticuerpo será al menos aproximadamente 5 veces, preferentemente 10 veces, más preferentemente 25 veces, incluso más preferentemente 50 veces, y mucho más preferentemente 100 veces o más, mayor para una molécula diana que su afinidad por una molécula no diana. En realizaciones preferidas, los anticuerpos preferidos se unen con afinidades de al menos aproximadamente10⁷M^-1, y preferentemente entre aproximadamente 10⁸M^{' 1}a aproximadamente 10⁹M^-1, aproximadamente 10⁹M^_1a aproximadamente 10^1°M^-1, o aproximadamente 10^1°M^_1a aproximadamente 10¹²M^-1.

[0044] La afinidad se calcula como K^d= k^disociación/k^asociación(k^disociaciónes la constante de velocidad de disociación, k^asociaciónes la constante de velocidad de asociación, y K^des la constante de equilibrio). La afinidad se puede determinar en equilibrio midiendo la fracción unida (r) del ligando marcado a diversas concentraciones (c). Los datos se representan gráficamente utilizando la ecuación de Scatchard: r/c = K(n-r): donde r = moles de ligando unido/mol de receptor en equilibrio; c = concentración de ligando libre en equilibrio; K = constante de asociación en equilibrio; y n = número de sitios de unión a ligando por molécula receptora. Mediante un análisis gráfico, r/c se representa en el eje Y frente a r en el eje X, produciendo así un gráfico de Scatchard. La medición de la afinidad del anticuerpo mediante análisis de Scatchard se conoce bien en la técnica. Véase, p. ej., van Erp y col., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson y Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988.

[0045] Los anticuerpos de la descripción se pueden caracterizar adicionalmente por mapeo de epítopos, de modo que se pueden seleccionar anticuerpos y epítopos que tengan la mayor utilidad clínica en los inmunoensayos descritos en esta solicitud. El término «epítopo» se refiere a un determinante antigénico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Preferentemente, se dirige un epítopo que está presente en la molécula diana, pero está parcial o totalmente ausente en moléculas no diana.

[0046] En algunas realizaciones, el cóntigo de anticuerpo puede ser una mezcla de secuencias de diferentes especies. Como tal, si el anticuerpo es un anticuerpo, tal anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los «anticuerpos quiméricos» como los «anticuerpos humanizados» se refieren a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie.

Por ejemplo, los «anticuerpos quiméricos» tradicionalmente comprenden una o más regiones variables de un ratón (o rata, en algunos casos) y la o las regiones constantes de un ser humano. «Anticuerpos humanizados» generalmente se refieren a anticuerpos no humanos que han tenido las regiones de estructura de dominio variable intercambiadas por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto las RDC, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a tal anticuerpo excepto dentro de sus RDC. Las RDC, algunas o todas las cuales están codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en el marco de lámina beta de una región variable de anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad se determina mediante las RDC injertadas. La creación de dichos anticuerpos se describe, p. ej., en el documento WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen y col., 1988, Science 239:1534-1536. A menudo se requiere la «retromutación» de los residuos de marco aceptor seleccionados a los residuos donantes correspondientes para recuperar la afinidad que se pierde en la construcción injertada inicial (patente de EE. UU. N.° 5.530.101; la patente de EE. UU. N.° 5.585.089; la patente de EE. UU. N.° 5.693.761; la patente de EE. UU. N.° 5.693.762; la patente de EE. UU. N.° 6.180.370; la patente de EE. UU. N.° 5.859.205; la patente de EE. UU. N.° 5.821.337; la patente de EE. UU. N.° 6.054.297; la patente de EE. UU. N.° 6.407.213). El anticuerpo humanizado comprenderá también de manera óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, por lo general la de una inmunoglobulina humana, y por lo tanto comprenderá por lo general una región Fc humana. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar usando ratones con un sistema inmunitario modificado genéticamente. Roque y col., 2004, Biotecnol. Prog. 20:639-654. Una variedad de técnicas y procedimientos para humanizar y remodelar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica (véase Tsurushita y Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EUA), y referencias citadas en esta). Los procedimientos de humanización incluyen, de modo no taxativo, los procedimientos descritos en Jones y col., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann y col., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen y col., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen y col., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He y col., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter y col., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta y col., 1997, Cancer Res.57(20):4593-9; Gorman y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor y col., 1998, Protein Eng 11:321-8. La humanización u otros procedimientos para reducir la inmunogenicidad de las regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir procedimientos de rechapado, tal como se describe, p. ej., en Roguska y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973. En una realización, el anticuerpo original ha madurado por afinidad, como se conoce en la técnica. Los procedimientos basados en la estructura se pueden emplear para la humanización y maduración por afinidad, por ejemplo, como se describe en el documento Us Ser. N.° 11/004.590. Los procedimientos basados en la selección se pueden emplear para humanizar y/o madurar por afinidad regiones variables de anticuerpos maduros que incluyen, de modo no taxativo, los procedimientos descritos en Wu y col., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca y col., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok y col., 1996, J. Biol. Chem.

271(37): 22611-22618; Rader y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss y col., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759. Otros procedimientos de humanización pueden implicar el injerto de solo partes de las RDC que incluyen, de modo no taxativo, procedimientos descritos en la patente de los EE. UU. N.° 09/810.502. Tan y col., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis y col., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084.

[0047] En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano. «Anticuerpo completamente humano» o «anticuerpo humano completo» se refiere a un anticuerpo humano que tiene la secuencia génica de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano. Se pueden obtener anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, usando ratones transgénicos (Bruggemann y col., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) o bibliotecas de anticuerpos humanos acopladas con procedimientos de selección (Griffiths y col., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108).

Producción de anticuerpos

[0048] Las preparaciones de anticuerpos monoclonales se pueden producir usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinante y despliegue bacteriófago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma que incluyen las conocidas en la técnica y las que se enseñan, por ejemplo, en Harlow y col., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling, y col., en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS, págs. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981).

[0049] La expresión «anticuerpo monoclonal», tal como se usa en esta solicitud, no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. La expresión «anticuerpo monoclonal» se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o de fagos, y no el procedimiento mediante el cual se produce.

[0050] Los anticuerpos monoclonales derivados de animales distintos de ratas y ratones ofrecen ventajas únicas. Muchas dianas de proteínas pertinentes para la transducción de señales y la enfermedad se conservan altamente entre ratones, ratas y humanos, y por lo tanto son reconocidas como autoantígenos por un hospedador de ratón o rata, lo que las hace menos inmunogénicas. Este problema puede evitarse cuando se utiliza el conejo como animal hospedador. Véase, p. ej., Rossi y col., Am. J. Clin. Pathol., 124, 295-302, 2005.

[0051] Los procedimientos para producir y analizar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no taxativo, los ratones se pueden inmunizar con un antígeno de interés o una célula que expresa tal antígeno. Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, p. ej., se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero de ratón, se extrae el bazo de ratón y se aíslan los esplenocitos. Los esplenocitos a continuación se fusionan mediante técnicas bien conocidas a cualquier célula de mieloma adecuada. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitante. Los clones de hibridoma a continuación se analizan mediante procedimientos conocidos en la técnica para detectar células que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno. El fluido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, se puede generar inoculando ratones intraperitonealmente con clones de hibridoma positivos.

[0052] Los adyuvantes que se pueden utilizar en los procedimientos de generación de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de proteínas; adyuvantes bacterianos, p. ej., bacterias enteras (BCG, Corynebacterium parvum, Salmonella minnesota) y componentes bacterianos que incluyen el esqueleto de la pared celular, dimeticol de trehalosa, monofosforil lípido A, residuo extraíble en metanol (MER) de bacilo de tubérculo, adyuvante de Freund completo o incompleto; adyuvantes virales; adyuvantes químicos, p. ej., hidróxido de aluminio, yodoacetato y hemuccinato de colesterilo; o adyuvantes de ADN desnudos. Otros adyuvantes que se pueden usar en los procedimientos de la descripción incluyen toxina de cólera, proteínas paropox, MF-59 (Chiron Corporation; Véase también Bieg y col. (1999) «^gA^d65 and Insulin B Chain Peptide (9-23) Are Not Primary Autoantigens In The Type 1 Diabetes Syndrome Of The BB Rat», Autoimmunity, 31(1):15-24, MPL® (Corixa Corporation; Véase también Lodmell y col. (2000) «DNA Vaccination Of Mice Against Rabies Virus: Effects Of The Route Of Vaccination And The Adjuvant Monophosphoryl Lipid A (MPL)», Vaccine, 18: 1059-1066; Johnson y col. (1999) «3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives: Synthesis And Immunoestimulant Activities», Journal of Medicinal Chemistry, 42: 4640-4649; Baldridge y col. (1999) «Monophosphoryl Lipid A (MPL) Formulations For The Next Generation Of Vaccines», Methods, 19: 103 107,

Adyuvante RC-529 (Corixa Corporation; the lead compound from Corixa's aminoalkyl glucosaminide 4-phosphate (AGP) chemical library, véase también www.corixa.com), y adyuvante DETOX™ (Corixa Corporation; DETOX™ adjuvant includes MPL® adjuvant (monophosphoryl lipid A) and mycobacterial cell wall skeleton; Véase también Eton y col. (1998) «Active Immunotherapy With Ultraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX In Patients With Metastatic Melanoma», Clin. Cancer Res. 4(3):619-627; y Gupta y col. (1995) «Adjuvants For Human Vaccines-Current Status, Problems And Future Prospects», Vaccine, 13(14): 1263-1276).

[0053] Numerosas publicaciones analizan el uso de la tecnología de presentación de fagos para producir y cribar bibliotecas de polipéptidos para la unión a un analito seleccionado. Véase, p. ej., Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin y col., Science 249, 404-6, 1990, Scott y Smith, Science 249, 386-88, 1990; y Ladner y col., Pat. de EE.UU. N.° 5.571.698. Un concepto básico de los procedimientos de presentación de fagos es el establecimiento de una asociación física entre el ADN que codifica un polipéptido que se va a cribar y el polipéptido. Esta asociación física se proporciona por la partícula del fago, que muestra un polipéptido como parte de una cápside que encierra el genoma del fago que codifica el polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre polipéptidos y su material genético permite el cribado masivo simultáneo de un gran número de fagos que portan diferentes polipéptidos. Los fagos que presentan un polipéptido con afinidad por una diana se unen a la diana, y estos fagos se enriquecen mediante el cribado de afinidad por la diana. La identidad de los polipéptidos presentados a partir de estos fagos se puede determinar a partir de sus respectivos genomas. Usando estos procedimientos, un polipéptido identificado por tener una afinidad de unión por una diana deseada, se puede sintetizar a continuación en masa por medios convencionales. Véase, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 6.057.098.

[0054] Los anticuerpos que se generan mediante estos procedimientos pueden seleccionarse entonces cribando primero la afinidad y especificidad con el polipéptido purificado de interés y, si es necesario, comparando los resultados con respecto a la afinidad y especificidad de los anticuerpos con polipéptidos que se desean excluir de la vinculación. El procedimiento de cribado puede implicar la inmovilización de los polipéptidos purificados en pocillos separados de placas de microtitulación. La solución que contiene un anticuerpo potencial o grupos de anticuerpos se coloca a continuación en los respectivos pocillos de microtitulación y se incuba durante aproximadamente 30 min a 2 h. A continuación, los pocillos de microtitulación se lavan y se añade a los pocillos un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina si los anticuerpos producidos son anticuerpos de ratón), se incuba durante aproximadamente 30 min y después se lava. Se añade el sustrato a los pocillos y aparecerá una reacción de color en la que el anticuerpo contra el polipéptido o polipéptidos inmovilizados está presente.

[0055] Los anticuerpos así identificados pueden analizarse a continuación adicionalmente para determinar su afinidad y especificidad en el diseño de ensayo seleccionado. En el desarrollo de inmunoensayos para una proteína diana, la proteína diana purificada actúa como un estándar con el que juzgar la sensibilidad y especificidad del inmunoensayo utilizando los anticuerpos que se han seleccionado. Debido a que la afinidad de unión de diversos anticuerpos puede diferir; ciertos pares de anticuerpos (p. ej., en ensayos de tipo sándwich) pueden interferir entre sí de forma estérica, etc., el rendimiento del ensayo de un anticuerpo puede ser una medida más importante que la afinidad absoluta y la especificidad de un anticuerpo.

[0056] Los anticuerpos también se pueden producir usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos del gen de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana se pueden introducir de forma aleatoria o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. De manera alternativa, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad se pueden introducir en células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región JH evita la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se crían para producir descendencia homocigótica que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan usando metodologías convencionales con un antígeno seleccionado, p. ej., todo o una porción de un polipéptido de la descripción. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener de los ratones inmunizados, transgénicos usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de linfocitos B y posteriormente se someten a cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una descripción general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y col. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol. 13:65-93.

[0057] Para una descripción detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, p. ej., las publicaciones internacionales N.° WO 98/24893, WO 96/34096 y WO 96/33735; y las patentes de EE. UU. N.° 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 y 5.939.598.

[0058] Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) y Medarex (Princeton, N.J.) pueden participar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.

Expresión recombinante de anticuerpos

[0059] Una vez que se ha obtenido una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la descripción, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Se pueden usar procedimientos que son conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control transcripcionales y traduccionales apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. (Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col., 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel y col. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY).

[0060] Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo se puede transferir a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposómica y precipitación de fosfato de calcio) y las células transfectadas a continuación se cultivan mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo de la descripción. En casos específicos, la expresión del anticuerpo está regulada por un promotor específico constitutivo, inducible o de tejido.

[0061] Las células hospedadoras eucariotas y procariotas, que incluyen células de mamífero como hospedadoras para la expresión de los anticuerpos o fragmentos o cadenas de inmunoglobulina descritos en esta solicitud son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas que se pueden obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NS0, células SP2, células HeLa, células renales de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y una cantidad de otras líneas celulares. Las células hospedadoras de mamíferos incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, de bovino, de caballo y de hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan mediante la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que se pueden usar son líneas celulares de insectos, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Las células fúngicas incluyen células de levadura y hongos filamentosos, incluso, por ejemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens y Neurospora crassa. Pichia sp., cualquier Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, cualquier Kluyveromyces sp., Candida albicans, cualquier Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, cualquier Fusarium sp., Yarrowia lipolytica y Neurospora crassa. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican la cadena pesada o la parte de unión al antígeno o fragmento de esta, la cadena ligera y/o el fragmento de unión al antígeno de esta se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células hospedadoras durante un período de tiempo suficiente como para permitir la expresión del anticuerpo o fragmento o cadena en las células hospedadoras o la secreción en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras.

[0062] Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión de hospedador para expresar los anticuerpos de la descripción. Tales sistemas de expresión en el huésped representan vehículos a través de los cuales se pueden producir las secuencias codificantes de los anticuerpos y posteriormente purificarlas, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, pueden expresar los anticuerpos de la descripción in situ. Estos incluyen, de modo no taxativo, microorganismos como bacterias (p. ej., E. coli y B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN plásmido o ADN cósmido que contienen secuencias codificantes de inmunoglobulina; levadura (p. ej., Saccharomyces pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias de codificación de inmunoglobulina; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias codificantes de inmunoglobulina; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión del virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformados con vectores de expresión del plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de inmunoglobulina; o sistemas de células de mamífero (p. ej., COS, Cho, BHK, 293, 293T, células 3T3, células linfáticas (véase la patente de EE. UU. N.° 5.807.715), células Per C.6 (células retinianas de rata desarrolladas por Crucell) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (p. ej., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la vacuna de la viruela).

[0063] En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión en función del uso previsto para la molécula que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una cantidad grande de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de niveles altos de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, de modo no taxativo, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther y col. 1983) «Easy Identification of cDNA Clones», EMBO J. 2:1791-1794), en el que la secuencia codificante de anticuerpos se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificante lac Z de manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye y col. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke y col. (1989) «Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli», J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos externos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a microesferas de glutatión-agarosa de la matriz seguida de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir puntos de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de manera que el producto génico diana clonado se pueda liberar del resto de GST.

[0064] En un sistema de insecto, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se puede usar como un vector para expresar genes externos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de anticuerpos se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (p. ej., el gen de poliedrina) del virus y colocar bajo el control de un promotor de AcNPV (p. ej., el promotor de poliedrina).

[0065] En células hospedadoras de mamífero, se puede utilizar una cantidad de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de anticuerpos se puede ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula en hospedadores infectados (véase, p. ej., Logan y col. (1984) «Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659). También se pueden requerir señales de inicio específicas para la traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Asimismo, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de toda la inserción. Estas señales de control traduccional y codones de iniciación exógenos pueden ser de un abanico de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase, p. ej., Bittner y col., (1987) «Expression And Secretion Vectors For Yeast,» Methods in Enzymol. 153:516-544).

[0066] Además, se puede elegir una cepa de células hospedadoras que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto genético de la manera específica deseada. Tales modificaciones (p. ej., glucosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos genéticos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores adecuados para garantizar la modificación y procesamiento correctos de la proteína externa expresada. Con este fin, se pueden usar células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento correcto de la transcripción primaria, glucosilación y fosforilación del producto genético. Tales células hospedadoras de mamíferos incluyen, de modo no taxativo, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.

[0067] Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable un anticuerpo de la descripción pueden modificarse genéticamente. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedadoras se pueden transformar con ADN controlado por elementos para el control de la expresión apropiados (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, puntos de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN externo, se puede permitir que las células genomanipuladas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en estirpes celulares. Este procedimiento se puede usar ventajosamente para genomanipular estirpes celulares que expresan los anticuerpos de la descripción. Tales estirpes celulares genomanipuladas pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con los anticuerpos de la descripción.

[0068] Se puede utilizar una cantidad de sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan al virus del herpes simplex timidina cinasa (Wigler y col. (1977) «Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells», Cell 11:223-232), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y col. (1962) «Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034) y los genes de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y col. (1980) «Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene», Cell 22:817-823) pueden emplearse en las células tk-, hgprt- o aprt- cells, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos se puede usar como base para la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col. Natl. (1980) «Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare y col. (1981) «Transformation Of Mouse Fibroblasts To Metotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y col. (1981) «Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Tachibana y col. (1991) «Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene», Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) «Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions», Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.

32:573-596; Mulligan (1993) «The Basic Science Of Gene Therapy», Science 260:926-932; y Morgan y col. (1993) «Human gene therapy», Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). Los procedimientos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADn recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel y col. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin y col. (1981) «A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells», J. Mol. Biol. 150:1-14; e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., (1984) «Expression of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells», Gene 30:147-156).

[0069] Los niveles de expresión de un anticuerpo de la descripción se pueden aumentar mediante amplificación de vector (para una reseña, véase Bebbington y Hentschel, «The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells» en DNA CLONING, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vectorial que expresa un anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará la cantidad de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse y col. (1983) «Expression and Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes», Mol. Cell. Biol. 3:257-266).

[0070] La célula hospedadora se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la descripción, el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadenas pesada y ligera. Alternativamente, se puede usar un único vector que codifica polipéptidos tanto de cadenas pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot (1986) «Expression and Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes», Nature 322:562-565; Kohler (1980) «Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

[0071] En general, las glucoproteínas producidas en una línea celular particular o animal transgénica tendrán un patrón de glucosilación que es característico para las glucoproteínas producidas en la línea celular o animal transgénico. Por lo tanto, el patrón de glucosilación particular de un anticuerpo dependerá de la línea celular particular o animal transgénico utilizado para producir el anticuerpo. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en esta solicitud, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en esta solicitud, comprenden la presente descripción, independientemente del patrón de glucosilación que puedan tener los anticuerpos. De manera similar, en realizaciones particulares, los anticuerpos con un patrón de glucosilación que comprende solo N-glicanos no fucosilados pueden ser ventajosos, porque se ha demostrado que estos anticuerpos presentan por lo general una eficacia más potente que sus contrapartes fucosiladas tanto in vitro como in vivo (véase, p. ejemplo, Shinkawa y col., J. Biol. Chem. 278:3466-3473 (2003)); patentes de EE. UU. N.° 6.946.292 y 7.214.775). No es probable que estos anticuerpos con W-glicanos no fucosilados sean inmunogénicos porque sus estructuras de carbohidratos son un componente normal de la población que existe en la IgG en suero humano.

[0072] Una vez que el anticuerpo de la descripción se ha expresado de forma recombinante, se puede purificar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

Diagnóstico de insuficiencia renal aguda

[0073] La presente invención se refiere en parte a la administración de anticuerpos anti-TIMP-2 a pacientes a quienes se les diagnosticó LRA. Como se ha indicado anteriormente, los términos «lesión renal (o de riñón) aguda» e «insuficiencia renal (o de riñón) aguda», como se usan en esta invención, se definen en parte en términos de cambios en la creatinina sérica desde un valor inicial. La mayoría de las definiciones de IRA tienen elementos comunes, incluido el uso de creatinina sérica y, a menudo, la producción de orina. Los pacientes pueden presentar disfunción renal sin una medida inicial disponible de la función renal para su uso en esta comparación. En tal caso, se puede estimar un valor de creatinina sérica inicial asumiendo que el paciente inicialmente tenía una GFR normal. La velocidad de filtración glomerular (GFR) es el volumen de líquido filtrado desde los capilares glomerulares renales (del riñón) hacia la cápsula de Bowman por unidad de tiempo. La velocidad de filtración glomerular (GFR) se puede calcular midiendo cualquier sustancia química que tenga un nivel estable en la sangre, y que se filtre libremente, pero que los riñones no la reabsorban ni secreten. La GFR se expresa típicamente en unidades de ml/min:

C F R Concentración de orina x Flujo de orina

Concentración plasmática

[0074] Al normalizar la GFR con respecto al área de la superficie corporal, se puede suponer una GFR de aproximadamente 75-100 ml/min por 1,73 m2. Por lo tanto, la tasa medida es la cantidad de sustancia en la orina que se originó a partir de un volumen calculable de sangre.

[0075] Se utilizan varias técnicas diferentes para calcular o estimar la velocidad de filtración glomerular (GFR o eGFR). En la práctica clínica, sin embargo, el aclaramiento de creatinina se utiliza para medir la GFR. La creatinina se produce de forma natural por el cuerpo (la creatinina es un metabolito de la creatinina, que se encuentra en el músculo). Se filtra libremente por el glomérulo, pero también se secreta activamente por los túbulos renales en cantidades muy pequeñas, de modo que el aclaramiento de creatinina sobreestima la GFR real en un 10-20 %. Este margen de error es aceptable considerando la facilidad con la que se mide el aclaramiento de creatinina.

[0076] El aclaramiento de creatinina (CCr) se puede calcular si se conocen los valores de la concentración de creatinina en orina (U^{o r}), el caudal de orina (V), y la concentración de creatinina plasmática (P^{o r}). Dado que el producto de la concentración de orina y el caudal de orina produce la tasa de excreción de creatinina, también se dice que el aclaramiento de creatinina es su tasa de excreción (U^{o r}3V) dividida por su concentración plasmática. Esto se representa comúnmente matemáticamente como:

[0077] Comúnmente se realiza una recogida de orina de 24 horas, desde una mañana con la vejiga vacía hasta el contenido de la vejiga a la mañana siguiente, y a continuación se realiza un análisis de sangre comparativo:

f/'/> ^X24-Volumen en horas

Vt PG^t x 24 x 60min

[0078] Para permitir la comparación de resultados entre personas de diferentes tamaños, la CCr a menudo se corrige para el área de superficie corporal (BSA) y se expresa en comparación con un hombre de tamaño medio como ml/min/1,73 m2 Si bien la mayoría de los adultos tienen un BSA que se acerca a 1,7 (1,6-1,9), los pacientes extremadamente obesos o delgados deben tener su CCr corregido para su BSA real:

[0079] La precisión de una medición del aclaramiento de creatinina (incluso cuando la recogida está completa) es limitada porque, a medida que disminuye la velocidad de filtración glomerular (GFR), aumenta la secreción de creatinina y, por lo tanto, el aumento de la creatinina sérica es menor. Por lo tanto, la excreción de creatinina es mucho mayor que la carga filtrada, lo que da como resultado una sobreestimación potencialmente grande de la GFR (hasta dos veces la diferencia). Sin embargo, para fines clínicos, es importante determinar si la función renal es estable o está empeorando o mejorando. Esto a menudo se determina monitorizando la creatinina sérica en solitario. Al igual que el aclaramiento de creatinina, la creatinina sérica no será un reflejo exacto de la GFR en la condición de estado no estable de la IRA. No obstante, el grado en el que la creatinina sérica cambia con respecto al valor inicial reflejará el cambio en la GFR. La creatinina sérica se mide rápida y fácilmente y es específica para la función renal.

[0080] Con el propósito de determinar la producción de orina en una producción de orina en una base de ml/kg/h, es adecuada la recogida y medición de orina por hora. En el caso en el que, por ejemplo, solo se dispuso de una producción acumulada de 24 horas y no se proporcionó el peso de los pacientes, se han descrito modificaciones menores de los criterios de producción de orina RIFLE. Por ejemplo, Bagshaw y col., Nephrol. Dial. Transplant. 23: 1203-1210, 2008, asumen un peso promedio del paciente de 70 kg, y a los pacientes se les asigna una clasificación RIFLE basada en lo siguiente:<35 mL/h (Riesgo), <21 mL/h (Lesión) o <4 mL/h (Falla).

Evaluación de riesgos

[0081] Debido a que la LRA se asocia con una morbilidad y mortalidad significativas, y debido a que no hay un tratamiento específico disponible para revertir la LRA, el reconocimiento y el manejo tempranos son primordiales. De hecho, es probable que el reconocimiento de los pacientes en riesgo de LRA, o con una posible LRA, pero antes de las manifestaciones clínicas, produzca mejores resultados que tratar solo la LRA establecida. Por lo tanto, la presente invención se refiere en parte a la administración de anticuerpos anti-TIMP-2 a pacientes con alto riesgo de LRA inminente (dentro de 72 horas, y más preferentemente 48, 24, 18 o 12 horas).

[0082] Los pacientes de alto riesgo incluyen aquellos con factores de riesgo de lesión renal aguda (LRA) pero que tienen una GFR normal. Por ejemplo, pueden incluir pacientes que tienen diabetes e hipertensión o están tomando medicamentos tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos o inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. Estos individuos representan una población que necesita ser identificada para modificar los factores de riesgo si es posible e iniciar estrategias preventivas cuando se indica (por ejemplo, estudios de contraste). Los pacientes con LRA prerrenal son aquellos con índices urinarios prerrenales y falla de los mecanismos autorreguladores que conducen a una disminución de la GFR (por ejemplo, deshidratación). Estos individuos tienen el potencial de revertir rápidamente su afección prerrenal. Durante este período, la lesión en el borde ciliado de las células del túbulo proximal puede estar presente pero no ser detectable. Sin embargo, con los nuevos biomarcadores, la identificación de lesiones tempranas y el tratamiento es posible. Los pacientes con LRA pueden representar una extensión de LRA prerrenal grave. Como alternativa, en algunas afecciones, la LRA puede no estar precedida de un estado prerrenal (por ejemplo, septicemia, exposición a nefrotoxinas). La creatinina sérica es un marcador tardío y detectará LRA después de que se presente una lesión sustancial. En este punto, la intervención puede ser demasiado tarde.

[0083] La Guía de práctica clínica de KDIGO para la lesión renal aguda (Kidney Intl. 2 (Suppl 1), 2012 proporciona una descripción de la evaluación de riesgo para la LRA, particularmente en el Capítulo 2.2 y el Apéndice D. Los factores de riesgo incluyen estado de hidratación, hipoalbuminemia, edad avanzada, sexo femenino, raza negra, presencia de ERC, diabetes, enfermedad cardíaca, septicemia o enfermedad pulmonar, exposición a ciertos medicamentos y agentes de contraste que son nefrotóxicos, cirugía cardíaca, etc.

Uso de biomarcadores

[0084] La medición de creatinina sérica (SCr) es el marcador estándar de oro para la función renal. Sin embargo, las concentraciones de SCr pueden ser inexactas en la detección de una disminución abrupta en la función renal, ya que la reserva funcional de las nefronas sanas restantes evita un aumento significativo en SCr hasta que se pierde el 50% de las nefronas. Por lo tanto, debido a que SCr es un marcador «tardío» de lesión renal, incluso si la estimación basada en SCr de la función renal es «normal», es posible que la lesión renal ya haya comenzado. Otros biomarcadores que se han utilizado para evaluar la LRA incluyen cistatina C en suero y orina, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos en suero y orina, molécula 1 de lesión renal en orina, interleucina-18, proteína de unión a ácidos grasos de tipo hepático y N-acetil- p-D-glucosaminidasa.

[0085] En 2014, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos aprobó la comercialización de una prueba basada en la combinación de concentraciones en orina de inhibidor tisular de metaloproteinasa 2 y proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 ([TIMP-2] 3 [IGFBP7]) para identificar a los pacientes que están en riesgo de desarrollar LRA en el futuro. En un estudio, una sola medición de TIMP2- IGFBP7 urinario poco después del ingreso en la UCI y se encontró una AUC-ROC de 0,84 para el desarrollo de LRA de moderada a grave dentro de las 12 horas. Usando un valor de corte de 0,3, la prueba mostró una sensibilidad y especificidad de 89% (77-97%) y 49% (43-54%), respectivamente; a un valor de corte de 2,0, la prueba mostró una sensibilidad y especificidad de 40% (23-57%) y 94% (92-96%). Gunnerson y col., J. Trauma Acute Care Surg. 80: 243-49, 2016. Tales pruebas proporcionan un procedimiento ideal para identificar pacientes de alto riesgo para el tratamiento según la presente invención.

Composiciones farmacéuticas y administración

[0086] Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles de los anticuerpos anti-TIMP-2 y fragmentos de unión al antígeno de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences y U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

[0087] Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar al mezclar con vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables en forma de, p. ej., polvos liofilizados, suspensiones, soluciones acuosas o suspensiones (véase, p. ej., Hardman, y col. (2001) Goodman y Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, NY; Avis, y col. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y col. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y col. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

[0088] La toxicidad y la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la descripción, administrados solos o en combinación con otro agente terapéutico, pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., para determinar la LD⁵⁰(la dosis letal para el 50% de la población) y la ED⁵⁰(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (LD⁵⁰/ ED⁵⁰). Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración.

[0089] En una realización adicional, un agente terapéutico adicional se administra a un sujeto en asociación con un anticuerpo anti-TIMP-2 o fragmento de unión al antígeno de este de la descripción de acuerdo con la Physicians 'Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57.a edición (1 de noviembre de 2002)).

[0090] El modo de administración puede variar. Las vías de administración incluyen oral, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica o intraarterial.

[0091] En realizaciones particulares, los anticuerpos anti-TIMP-2 o fragmentos de unión al antígeno de estos de la descripción se pueden administrar por una vía invasiva tal como mediante inyección. En realizaciones adicionales de la invención, un anticuerpo anti-TIMP-2 o fragmento de unión al antígeno del mismo, o composición farmacéutica del mismo, se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial, o por inhalación, administración de aerosol. La administración por vías no invasivas (por ejemplo, oralmente; por ejemplo, en una píldora, cápsula o comprimido) también se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

[0092] La presente descripción proporciona un recipiente (p. ej., un vial de plástico o vidrio, p. ej., con una tapa o una columna de cromatografía, aguja hueca o un cilindro de jeringa) que comprende cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la descripción o una composición farmacéutica de estos. La presente descripción también proporciona un dispositivo de inyección que comprende cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la descripción o una composición farmacéutica de esta. Un dispositivo de inyección es un dispositivo que introduce una sustancia en el cuerpo de un paciente a través de una vía parenteral, p. ej., intramuscular, subcutánea o intravenosa. Por ejemplo, un dispositivo de inyección puede ser una jeringa (p. ej., precargada con la composición farmacéutica, tal como un autoinyector) que, por ejemplo, incluye un cilindro o cuerpo para retener el fluido que se va a inyectar (p. ej., anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo), una aguja para perforar la piel y/o los vasos sanguíneos para la inyección del fluido; y un émbolo para empujar el fluido fuera del cilindro y a través del orificio de la aguja. En un aspecto de la descripción, un dispositivo de inyección que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este de la presente descripción o una composición farmacéutica de este es un dispositivo de inyección intravenosa (IV). Tal dispositivo incluye el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en una cánula o trocar/aguja que se puede unir a un tubo que se puede unir a una bolsa o depósito para retener fluido (por ejemplo, solución salina; o solución de anillo lactato que comprende NaCl, lactato de sodio, KCl, CaCh y opcionalmente que incluye glucosa) introducida en el cuerpo del paciente a través de la cánula o trocar/aguja. El anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica de este puede, en un caso de la descripción, introducirse en el dispositivo una vez que el trocar y la cánula se insertan en la vena de un sujeto y el trocar se retira de la cánula insertada. El dispositivo IV puede, p. ej., insertarse en una vena periférica (p. ej., en la mano o el brazo); la vena cava superior o la vena cava inferior, o dentro de la aurícula derecha del corazón (p. ej., una vía IV central); o en una vena subclavia, yugular interna o femoral y, p. ej., avanzar hacia el corazón hasta llegar a la vena cava superior o la aurícula derecha (p. ej., una vía venosa central). En un aspecto de la descripción, un dispositivo de inyección es un autoinyector; un inyector de chorro o una bomba de infusión externa. Un inyector de chorro utiliza un chorro estrecho de líquido de alta presión que penetra la epidermis para introducir el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de un paciente. Las bombas de infusión externas son dispositivos médicos que administran el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de un paciente en cantidades controladas. Las bombas de infusión externas pueden alimentarse eléctrica o mecánicamente. Las diferentes bombas funcionan de diferentes maneras, p. ej., una bomba de jeringa mantiene el fluido en el depósito de una jeringa, y un pistón móvil controla el suministro de fluido, una bomba elastomérica mantiene el fluido en un depósito de globo estirable y la presión de las paredes elásticas del globo impulsa el suministro de fluido. En una bomba peristáltica, un conjunto de rodillos pellizca un trozo de tubería flexible, empujando el fluido hacia adelante. En una bomba multicanal, los fluidos se pueden suministrar desde múltiples depósitos a múltiples velocidades.

[0093] Las composiciones farmacéuticas descritas en esta solicitud también se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja; tales como los dispositivos descritos en las patentes de EE. UU. n.° 6.620.135; 6.096.002; 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 o 4.596.556. Tales dispositivos sin aguja que comprenden la composición farmacéutica también forman parte de la presente descripción. Las composiciones farmacéuticas descritas en esta solicitud también se pueden administrar mediante infusión. Los ejemplos de implantes y módulos conocidos para administrar las composiciones farmacéuticas incluyen los descritos en: patente de EE.u U. N.° 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la patente de EE.UU. N.° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para administrar la medicación a una velocidad de infusión precisa; la patente de EE.UU. N.° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para administración continua de fármacos; la patente de EE. UU. N.° 4.439.196, que describe un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de múltiples cámaras. Muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos son bien conocidos por los expertos en la técnica y los que comprenden las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se encuentran dentro del alcance de la presente descripción.

[0094] El régimen de administración depende de varios factores, incluida la velocidad de recambio de suero o tejido del anticuerpo terapéutico o fragmento de unión al antígeno, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, el régimen de administración administra suficiente anticuerpo o fragmento terapéutico para efectuar una mejora en el estado de la enfermedad objetivo, mientras que simultáneamente minimiza los efectos secundarios no deseados. Por consiguiente, la cantidad de agente biológico administrado depende en parte del anticuerpo terapéutico particular y la gravedad de la afección que se está tratando. Se dispone de orientación para seleccionar dosis adecuadas de anticuerpos o fragmentos terapéuticos (véase, p. ej., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert, y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom y col. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon y col. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz y col. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky y col. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

[0095] El médico realiza la determinación de la dosis adecuada, p. ej., utilizando parámetros o factores conocidos o sospechados en la técnica para afectar el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y se incrementa en pequeños incrementos a partir de entonces hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnósticas importantes incluyen aquellas de síntomas de, p. ej., la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas. En general, es deseable que un producto biológico que se usará derive de la misma especie que el animal al que se dirige el tratamiento, minimizando así cualquier respuesta inmunitaria al reactivo. En el caso de sujetos humanos, por ejemplo, pueden ser deseables anticuerpos humanizados y completamente humanos.

[0096] Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de estos descritos en esta solicitud pueden proporcionarse por infusión continua o por dosis administradas, p. ej., diariamente, 1-7 veces por semana, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, bimensualmente, trimestralmente, semestralmente, anualmente, etc. Se pueden proporcionar dosis, p. ej., por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, intraespinal o por inhalación. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 mg/kg de peso corporal, más generalmente de al menos 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más (véase, p. ej., Yang, y col. (2003) New Engl. J. Med.

349:427-434; Herold, y col. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, y col. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych.

67:451-456; Portielji, y col. (20003) Cancer Immunol. Immunother.52:151-144). También se pueden proporcionar dosis para lograr una concentración diana predeterminada de anticuerpo anti-TIMP-2 en el suero del sujeto, tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 mg/ml o más. En otras realizaciones, se administra un anticuerpo anti-TIMP-2 de la presente invención, p. ej., por vía subcutánea o intravenosa, semanalmente, quincenalmente, «cada 4 semanas», mensualmente, cada dos meses o trimestralmente a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 o 2500 mg/sujeto.

[0097] Tal como se usa en esta solicitud, el término «cantidad eficaz» se refiere a una cantidad de un anti-TIMP-2 o fragmento de unión a antígeno de este de la invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto, es eficaz para provocar una mejora medible en uno o más síntomas de la enfermedad, por ejemplo, el cáncer o la progresión del cáncer. Una dosis eficaz se refiere además a esa cantidad del anticuerpo o fragmento suficiente para dar como resultado al menos una mejora parcial de los síntomas, p. ej., una función renal o histología mejorada. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, una dosis eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis eficaz se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que producen el efecto terapéutico, ya sea administrable en combinación, en serie o simultáneamente. Una cantidad eficaz de un agente terapéutico producirá una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico en al menos un 10%; por lo general en al menos un 20%; preferentemente al menos aproximadamente un 30%; más preferentemente al menos un 40%, y con la máxima preferencia al menos un 50%. Una cantidad eficaz también puede producir una mejora en una medida subjetiva en los casos en los que se utilizan medidas subjetivas para evaluar la gravedad de la enfermedad.

Modalidades de tratamiento adicionales

[0098] Una vez que se obtiene un diagnóstico o se identifica a un paciente como «de alto riesgo», el médico puede seleccionar fácilmente un régimen de tratamiento que sea compatible con el diagnóstico, tal como iniciar la terapia de reemplazo renal, retirar la administración de compuestos que se sabe que son dañinos para el riñón, trasplante de riñón, retrasar o evitar procedimientos que se sabe que son dañinos para el riñón, modificar la administración de diuréticos, iniciar una terapia dirigida a dianas, etc. El experto en la técnica conoce los tratamientos apropiados para numerosas enfermedades analizadas en relación con los procedimientos de diagnóstico descritos en esta solicitud. Véase, p. ej., Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.a Ed. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, NJ, 1999. Estos tratamientos se pueden utilizar junto con la administración de anticuerpos anti-TIMP-2 según la presente invención.

[0099] Las opciones de manejo y tratamiento para LRA son multifactoriales y, en última instancia, deben adaptarse a cada situación y paciente específicos. Como se indicó anteriormente, la TRR, ya sea continua o intermitente, es un sistema de purificación de la sangre que sustituye la función renal. Sin embargo, la TRR está asociada a riesgos y complicaciones, como se trató anteriormente, y la prueba sugiere que la TRR puede ser un factor de riesgo independiente para peores resultados. Desde una perspectiva de riesgo-beneficio, la TRR debe reservarse para aquellos pacientes que se considere que tienen más probabilidades de padecer LRA persistente y/o que es más probable que no se recuperen. En esta construcción dicotómica, el manejo conservador representa con frecuencia la opción clínica preferida para muchos escenarios clínicos comunes, incluidas situaciones en las que la prueba clínica, la evaluación de cabecera y los datos objetivos sugieren una alta probabilidad de recuperación y/o no persistencia de LRA.

[0100] El manejo conservador se define como intervenciones y estrategias médicas que abordan las manifestaciones peligrosas y potencialmente mortales de LRA sin el uso de TRR. Estas estrategias de manejo incluyen, de modo no taxativo, las alteraciones fisiológicas y fisiopatológicas claves, como la hipervolemia y los desequilibrios de fluidos, la acidosis y los trastornos ácido-base, las alteraciones electrolíticas (por ejemplo, la hiperpotasemia) y la uremia y azotemia grave. Las estrategias de manejo conservadoras consisten en las siguientes estrategias básicas:

Soporte hemodinámico:

a. Terapia de fluidos, incluido el uso de cristaloides y coloides

b. Administración de vasopresores y agentes vasoactivos (los vasopresores de uso común incluyen los siguientes: norepinefrina, epinefrina, fenilefrina, dopamina, vasopresina)

c. Terapia diurética, incluido el uso de diuréticos del asa y osmóticos

d. Tratamiento de la acidosis y otras anomalías ácido-base

e. Tratamiento del potasio y otras alteraciones y desequilibrios electrolíticos.

f. Control glucémico y tratamiento de la hiperglucemia.

g. Apoyo nutricional.

[0101] La hiperpotasemia, cuando es grave, es una emergencia médica y requiere intervención inmediata. Las estrategias de tratamiento se dividen en tres estrategias principales: 1) Intervenciones que hacen que el potasio se desplace del espacio extracelular al espacio intracelular, 2) Intervenciones que estabilizan las acciones de la membrana del potasio y 3) Intervenciones que mejoran la eliminación del potasio. Estas intervenciones a menudo se realizan simultáneamente.

[0102] Los pacientes con LRA comúnmente desarrollan anomalías ácido-base, más en particular acidosis metabólica, que requiere intervención cuando es clínicamente importante.

[0103] La glucosa elevada debido a la hiperglucemia por estrés se encuentra con frecuencia en LRA y otras enfermedades críticas, y si bien la evidencia sigue siendo controvertida con respecto al control glucémico asociado al beneficio final, los pacientes y las poblaciones que probablemente se beneficien, y los objetivos de glucosa deseados y las estrategias terapéuticas específicas para lograr la normoglucemia (relativa), el consenso y el estándar de atención actual sugieren lo siguiente: uso de terapia de insulina para lograr un nivel de glucosa en suero entre 110 y 149 mg/dL (6,1 - 8,3 mmol/L) y mayor; y monitorización frecuente de la glucosa sérica.

[0104] Más allá del manejo conservador, los médicos pueden determinar que el inicio o mantenimiento de la terapia de reemplazo renal es apropiado. La TRR intermitente incluye hemodiálisis y diálisis sostenida de baja eficiencia, mientras que la TRR continua se refiere a ultrafiltración (UF), hemofiltración venosa continua (CVVH), hemodiálisis venosa continua (CVVHD), hemodiafiltración venosa continua (CVVHDF), hemodiálisis venosa continua de alto flujo y hemofiltración venosa arterial continua (CAVH).

Procedimientos generales

[0105] Se describen procedimientos estándar en biología molecular Sambrook, Fritsch y Maniatis (1982 & 1989 2.a edición, 2001 3.a edición) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Los procedimientos estándar también aparecen en Ausbel, y col. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que describe la clonación en células bacterianas y mutagénesis de ADN (Vol. 1), la clonación en células de mamífero y levadura (Vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3), y bioinformática (Vol.

4).

[0106] Se describen procedimientos para la purificación de proteínas que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización (Coligan, y col. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se describen análisis químicos, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión, glucosilación de proteínas (véase, p. ej., Coligan, y col. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, y col. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5 a 16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; págs. 45-89. Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., págs. 384-391). Se describe la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, y col. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, supra). Hay a disposición técnicas estándar para caracterizar las interacciones ligando/receptor (véase, p. ej., Coligan, y col. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York).

[0107] Se pueden preparar anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados (véase, p. ej., Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nueva York, NY; Kontermann y Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nueva York; Harlow y Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 139-243; Carpenter, y col. (2000) J. Immunol.

165:6205; He, y col. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang y col. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca y col. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia y col. (1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol.

224:487-499; la patente de EE. UU. N.° 6.329.511).

[0108] Una alternativa a la humanización es utilizar bibliotecas de anticuerpos humanos que se muestran en bibliotecas de fagos o de anticuerpos humanos en ratones transgénicos (Vaughan y col. (1996) Nature Biotechnol.

14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez y col. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas y col. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kay y col. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin y col. (1999) Nature Biotechnol.

17:397-399).

[0109] Se describen anticuerpos y diacuerpos de cadena simple (véase, p. ej., Malecki y col. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath y col. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter y col. (2001) J. Biol. Chem.

276:26285-26290;

Hudson y Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; y la patente de EE. UU. N.° 4.946.778). Se proporcionan anticuerpos bifuncionales (véase, p. ej., Mack, y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, y col. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, y col. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, y col. (1985) Science 229:81-83; Raso, y col. (1997) J. Biol. Chem., 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, y col. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; y las patentes de EE. UU. N.° 5.932.448, 5.532.210, y 6.129.914).

[0110] También se proporcionan anticuerpos multiespecíficos (véase, p. ej., Azzoni y col. (1998) J. Immunol.

161:3493; Kita y col. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant y col. (2000) J. Biol. Chem., 74:9115; Pandey y col. (2000) J. Biol. Chem., 275:38633; Zheng y col. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst y col. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875); Labrijn y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U^{s a}110: 5145-50, 2013; de Jong y col., PLOS Biol 14(1): e1002344, 2016 (doi:10.1371/journal.pbio.1002344).

[0111] La purificación del antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales se pueden inmunizar con células que portan el antígeno de interés. Los esplenocitos a continuación se pueden aislar de los animales inmunizados y los esplenocitos se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma (véase, p. ej., Meyaard y col. (1997) Immunity 7:283-290; Wright y col. (2000) Immunity 13:233-242; Preston y col., supra; Kaithamana y col. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

[0112] Los anticuerpos se pueden conjugar, p. ej., con moléculas de fármaco pequeñas, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos son útiles para fines terapéuticos, de diagnóstico, kit u otros, e incluyen anticuerpos acoplados, p. ej., a colorantes, radioisótopos, enzimas o metales, p. ej., oro coloidal (véase, p. ej., Le Doussal y col. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini y col. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts y col. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

[0113] Se encuentran disponibles procedimientos para la citometría de flujo, que incluyen la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (véase, p. ej., Owens, y col. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2.a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Hay disponibilidad de reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, que incluyen cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, p. ej., como reactivos de diagnóstico (Catálogo de sondas moleculares (2003), Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catálogo, St. Louis, MO).

[0114] Se describen procedimientos estándar de histología del sistema inmunitario (véase, p. ej., Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, NY; Hiatt, y col. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, y Wilkins, Phila, PA; Louis, y col. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, N^y).

[0115] Hay disponibilidad de paquetes de software y bases de datos para determinar, p. ej., fragmentos antigénicos, secuencias líderes, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glucosilación y alineaciones de secuencias, (véase, p. ej., GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, y col. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, y col. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, y col. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Desarrollo de anticuerpos monoclonales en conejos

[0116] Las hembras de conejos de Nueva Zelanda son inmunizadas por inyecciones subcutáneas (SC) con emulsiones de antígeno/adyuvante. La inmunización primaria se realiza con el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund se utiliza para todos los refuerzos posteriores. Los conejos se inyectan SC cada tres semanas a 250mg de antígeno proteico por conejo (alternando dos sitios, caderas y escápulas). Se extrae una muestra de sangre de la vena marginal del oído siete días después del segundo refuerzo. Esta muestra de sangre (suero inmunitario) se prueba mediante un ensayo ELISA indirecto para determinar si la respuesta inmunitaria del conejo es adecuada para el desarrollo de anticuerpos monoclonales. El conejo que responde mejor recibe un refuerzo final SC y cuatro días después es sacrificado a través de la exsanguinación. Toda la sangre se recolecta mediante punción cardíaca. Los linfocitos B que producen el anticuerpo de interés se identifican mediante ELISA indirecto en el antígeno diana y se aíslan los genes de inmunoglobulina. Se clonan cadenas pesadas y ligeras en vectores de expresión de mamíferos separados, se transfectan en células HEK (transfección transitoria) y se extraen sobrenadantes de cultivo tisular que contienen anticuerpos monoclonales de conejo.

Ejemplo 2: Desarrollo de anticuerpos monoclonales en ratones

[0117] Los ratones BALB/c hembra (60 días de edad) se inmunizan mediante inyecciones intraperitoneales (IP) con emulsiones de antígeno/adyuvante según el procedimiento operativo estándar. La inmunización primaria se realiza con el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund se utiliza para todos los refuerzos posteriores. A los ratones se les inyectan IP cada 3 semanas 25 mg de antígeno por ratón (volumen total 125mL por ratón). Las hemorragias de prueba se realizan por punción de la vena safena de 7 a 10 días después del segundo refuerzo.

Esta prueba de sangrado (suero inmunitario) se prueba mediante un ensayo ELISA indirecto para determinar si la respuesta inmunitaria de los ratones es adecuada para la fusión. A los 2 ratones que responden mejor se les da un refuerzo intravenoso final de 10 mg de antígeno por ratón en solución salina estéril a través de la vena de la cola lateral. 4 días después del refuerzo IV, los ratones se sacrifican y se extraen los bazos. Los linfocitos aislados del bazo se utilizan en el proceso de fusión para producir hibridomas utilizando el procedimiento de Kohler, G.; Milstein, C. (1975). «Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity». Nature 256 (5517): 495-497. Los hibridomas se generan usando un procedimiento de fusión PEG1500.

Ejemplo 3: Humanización

[0118] Al comparar las secuencias de marco (FR) de región variable (V) murina del monoclonal de ratón con las de anticuerpos humanos en la base de datos de Kabat (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., Oficina de Impresión del Gobierno de los EE. UU., Ishington, D.C.), se encuentra que las secuencias humanas exhiben el mayor grado de homología de secuencia con los FR de los dominios VK y VH del monoclonal de ratón. Por lo tanto, estas secuencias humanas se seleccionan como los marcos humanos en los que se injertan las RDC para el monoclonal de ratón.

Ejemplo 4. Evaluaciones histológicas

[0119] El estándar para la determinación de la lesión renal en un modelo animal es un examen microscópico cuidadoso de la morfología renal realizado por un patólogo capacitado. Véase, p. ej., FDA "Review of Qualification Data for Biomarkers of Nephrotoxicity Submitted by the Predictive Safety Testing Consortium, 2009, página 13 ("La histopatología se utilizó como el estándar de oro que definía la lesión"); véase también, Vaidya y col., Nat. Biotechnol.

28: 478-85, 2010 (debido a la poca sensibilidad y especificidad de SCr y BUN, el daño tubular renal se califica por histopatología). El Grupo de Trabajo de Nefrotoxicidad (NWG, por sus siglas en inglés) del Consorcio de Pruebas de Seguridad Predictiva (PSTC, por sus siglas en inglés) del Critical Path Institute creó un léxico histopatológico y asignó una escala de calificación de gravedad de 0-5 de lesiones patológicas de grado 0 (sin patología observable), 1 (mínima), 2 (leve), 3 (moderada), 4 (marcada) o 5 (grave). Esta escala de clasificación se utilizó para evaluar el efecto del tratamiento con anti-TIMP-2.

[0120] Se adquirieron ratones Balb/c (20-24 semanas de edad, peso 25-30g) de Charles River Laboratories International, Inc. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh (UPMC, por sus siglas en inglés). Después de un período de aclimatación de 1 semana, los ratones se sometieron a una ligadura cecal y cirugía de punción (CLP) para inducir septicemia o laparotomía solamente (Sham) después de la anestesia con isoflurano. Específicamente, el ciego se exteriorizó, se ligó a 1/4 de la parte superior y se perforó 3 veces con una aguja de calibre 21. Se extruyó una gota de heces y el ciego ligado y perforado se reemplazó en el abdomen, y la pared abdominal se cerró. Como tratamiento posquirúrgico estándar, se realizó una administración única de reanimación líquida (solución salina 40 ml/kg) en la nuca del cuello por vía subcutánea, se inyectó buprenorfina (0,05 mg/kg) y se aplicaron antibióticos que incluyen ceftriaxona (25 mg/kg) y metronidazol (12,5 mg/kg) por vía intraperitoneal inmediatamente después de la cirugía y cada 12 horas durante 3 días. Todos los animales fueron monitoreados de cerca y se les permitió el libre acceso a alimentos y agua durante la recuperación. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la cirugía y los tejidos renales se recolectaron y se obtuvieron muestras de sangre para mediciones adicionales.

[0121] Astute Medical, Inc. (San Diego, CA) proporcionó dos isotipos de anticuerpos anti-TIMP2. El anticuerpo T iMp2(NB172-77) es un F(ab')2 monoclonal, y el anticuerpo TIMP2(NB251-47) es una IgG de cabra policlonal. Los animales de CLP se aleatorizaron a tres grupos de ocho horas después de la cirugía de CLP: CLP (tratado con placebo de vehículo), CLP+ inyección intraperitoneal con anticuerpo anti-TIMP2 NB172-77, 5 mg/kg), CLP+ inyección intraperitoneal con anticuerpo anti-TIMP2 NB251-47, 5 mg/kg).

[0122] La lesión renal se calificó por histología en imágenes de tejido histológico de tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Incluyó puntuación de infiltración celular (0-3) y puntuación de lesión del epitelio tubular (0-5). Específicamente, la infiltración celular se determinó mediante la puntuación del número próximo de células (capas) que rodean las paredes tubulares y de los vasos (puntuación: 0 = ninguna, 1 = <10 células (5 capas), 2 = 10 a 20 células (5 a 10 capas de células), 3 = > 30 células (>10 capas de células); La lesión del epitelio tubular se calificó en función de la proporción de túbulos que exhiben necrosis celular, pérdida del borde ciliar, formación de yeso, vacuolización y dilatación del túbulo de la siguiente manera: 0, ninguno; 1, <10%; 2, 11% a 25%; 3, 26% a 45%; 4, 46% a 75%; y 5, >76%. La creatinina sérica (SCr) se midió con el kit de ensayo de creatinina de BioVision (Mountain View, CA).

[0123] La prueba estadística para comparar grupos se analizó utilizando el software SPSS versión 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Los grupos experimentales pareados se compararon usando la prueba t. Las diferencias se consideraron significativas a p <0,05. Los resultados se presentan como la media 6 SEM.

[0124] Como se muestra en la Fig. 1, el tratamiento anti-TIMP2 con TIMP2(NB 172-77) disminuyó significativamente la extensión de las lesiones del tejido renal en comparación con los animales con septicemia no tratados (prueba T de dos colas, valor P 0,046). Como se esperaba, el tratamiento anti-TIMP2 no tiene efecto sobre las funciones renales medidas por la creatinina sérica (Fig. 2). Por lo tanto, TIMP2 facilita el daño del tejido renal durante la septicemia independientemente del nivel de creatinina sérica.

[0125] Los ejemplos proporcionados en esta solicitud son representativos de realizaciones preferidas, son ejemplares y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo que se une específicamente al inhibidor de metaloproteinasa 2 (TIMP-2) para su uso en el tratamiento de lesión renal aguda (LRA) en un sujeto que tiene o se identifica que tiene un mayor riesgo de dicha lesión renal aguda.

2. Anticuerpo para uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto tiene enfermedad renal crónica (ERC) o presenta uno o más síntomas de ERC; o

en el que el sujeto tiene nefropatía diabética (ND) o exhibe uno o más síntomas de ND; o

en el que el sujeto tiene un diagnóstico existente de una o más de insuficiencia cardíaca congestiva, preeclampsia, eclampsia, diabetes mellitus, hipertensión, arteriopatía coronaria, proteinuria, insuficiencia renal, filtración glomerular por debajo del intervalo normal, cirrosis, creatinina sérica por encima del intervalo normal, septicemia, lesión en la función renal o función renal reducida; o

en el que el sujeto que se somete o se ha sometido a una cirugía vascular mayor, derivación de arterias coronarias u otra cirugía cardíaca; o

en el que el sujeto ha recibido uno o más AINE, ciclosporinas, tacrolimus, aminoglucósidos, foscarnet, etilenglicol, hemoglobina, mioglobina, ifosfamida, metales pesados, metotrexato, agentes de contraste radiopacos, o estreptozotocina.

3. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto tiene una lesión renal aguda (LRA), opcionalmente en el que la LRA está en la etapa RIFLE R (Riesgo), I (Lesión) o F (Falla).

4. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-3, en el que el sujeto se caracteriza como en una etapa AKIN 1 o una etapa RIFLE R (Riesgo) o por debajo de estas.

5. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-3, en el que el sujeto se caracteriza como en una etapa AKIN 2 o una etapa RIFLE I (lesión).

6. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-3, en el que el sujeto se caracteriza como en una etapa AKIN 3 o una etapa RIFLE F (falla).

7. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-6, en el que la administración produce una mejora en:

(i) velocidad de filtración glomerular estimada (eGFR) del sujeto;

(ii) función renal en el sujeto, en el que el sujeto es un ser humano; y/o

(iii) histología renal en el sujeto.

8. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-6, en el que la administración reduce el nivel de creatinina sérica en el sujeto.

9. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-6, en el que el sujeto se caracteriza por un mayor riesgo de LRA inminente mediante un resultado de biomarcador, en el que el resultado de biomarcador comprende una o más de una concentración de TIMP-2 medida en orina y una concentración de proteína 7 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP7) medida en orina.

10. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 9, en el que el resultado del biomarcador comprende un resultado combinado calculado a partir de una concentración de TIMP-2 medida en orina y una concentración de IGFBP7 medida en orina.

11. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-10, en el que el anticuerpo se administra por vía parenteral.

12. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo se administra por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea o intraperitoneal.

13. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo es una IgG, un fragmento Fab, un F(ab')2 o un scFv.

14. Anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1-13, en el que el anticuerpo se administra en asociación con uno o más agentes terapéuticos o procedimientos terapéuticos adicionales indicados para la mejora de la función renal.

15. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 14, en el que el uno o más agentes terapéuticos o procedimientos terapéuticos adicionales comprenden uno o más tratamientos seleccionados del grupo que consiste en terapia de reemplazo renal, manejo de sobrecarga de fluido, administración de un inhibidor de caspasa, administración de minociclina, administración de un inhibidor de poli ADP- ribosa polimerasa, administración de un quelante de hierro, administración de un tratamiento para septicemia en un sujeto que lo necesita, administración de insulina, administración de eritropoyetina y administración de un vasodilatador.