BR112020015534A2

BR112020015534A2 - Anticorpos antiglicoproteína spike de sars-cov-2 e fragmentos de ligação a antígeno

Info

Publication number: BR112020015534A2
Application number: BR112020015534-9A
Authority: BR
Inventors: Robert Babb; Andrew Murphy; William Olson; Neil Stahl; George D. Yancopoulos; Alina Baum; Gang Chen; Cindy Gerson; Johanna Hansen; Tammy Huang; Christos Kyratsous; Wen-Yi Lee; Marine Malbec
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2021-10-05
Also published as: MA54405A; PL3889177T3; TW202138004A; KR20210134300A; WO2021045836A1; SG11202103404PA; MY197648A; US20220356230A1; LT3889177T; CA3115553A1; HUE061425T2; EP3889177A1; EP3889177B1; JP2024038003A; US20230348569A1; US11732030B2; SI3889177T1; MA54405B1; EP4209507A1; US10954289B1

Abstract

anticorpos antiglicoproteína spike de sars-cov-2 e fragmentos de ligação a antígeno. a presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a uma proteína spike de coronavírus e métodos de uso de tais anticorpos e fragmentos para o tratamento ou prevenção de infecções virais (por exemplo, infecções pelo coronavírus).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTIGLICOPROTEÍNA SPIKE DE SARS-COV-2 E FRAG- MENTOS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO".

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Uma cópia oficial da listagem de sequências é submetida simultaneamente ao relatório descritivo eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatadas em ASCII com um no- me de arquivo "10753W0O01-Sequence.txt", criado em 25 de junho de 2020 e com um tamanho de 922.462 bytes. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que se aglutinam especificamente a proteínas spike de coronavírus e métodos para tratar ou prevenir infecções por coro- navírus com os ditos anticorpos e fragmentos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Os vírus recentemente identificados, como os coronavírus, podem ser difíceis de tratar porque não são suficientemente caracteri- zados. O surgimento desses vírus recém-identificados destaca a ne- cessidade do desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O coro- navírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) é um coronavírus recém-emergente que causa uma doença respiratória aguda grave, COVID-19. O SARS-CoV-?2 foi identificado pela primeira vez a partir de um surto em Wuhan, China e, em 20 de março de 2020, a Organização Mundial da Saúde registrou 209.839 casos confirmados em 168 países, áreas ou territórios, resultando em 8.778 mortes. As características clínicas do COVID-19 incluem febre, tosse seca e fadi- ga, e a doença pode causar insuficiência respiratória, resultando em morte.

[0004] Até o momento, não houve vacina ou agente terapêutico para prevenir ou tratar a infecção por SARS-CoV-2. Em vista da ame- aça contínua à saúde humana, há uma necessidade urgente de tera- pias antivirais preventivas e terapêuticas para o controle do SARS- CoV-2. Como esse vírus usa sua glicoproteína spike para interação com o receptor celular ACE? e a serina protease TMPRSS?2 para en- trada em uma célula-alvo, essa proteína spike representa um alvo atraente para a terapêutica de anticorpos. Em particular, anticorpos totalmente humanos que se ligam especificamente à proteína Spike de SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) com alta afinidade e que inibem a in- fecciosidade do vírus podem ser importantes na prevenção e trata- mento do COVID-19.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] Existe a necessidade anticorpos terapêuticos antiproteína Spike de SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) neutralizantes e uso dos mesmos no tratamento ou prevenção de infecção viral. A presente descrição aborda essa necessidade, em parte, pelo fornecimento de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S humanos, como os da Tabela 1, e combinações dos mesmos, incluindo, por exemplo, combinações com outros terapêuticos (por exemplo, agentes anti-inflamatórios, agentes antimaláricos, agentes antivirais ou outros anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno) e métodos de uso dos mesmos para o trata- mento de infecções virais.

[0006] A presente descrição fornece proteínas neutralizadoras de ligação a antígeno humano que se ligam especificamente a SARS- CoV-2-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.

[0007] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo recombinante isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma proteína spike de coronavírus

(CoV-S), em que o anticorpo tem uma ou mais das seguintes caracte- rísticas: (a) se liga ao CoV-S com um ECro inferior a cerca de 10º M; (b) demonstra um aumento na sobrevivência de um animal infectado por coronavírus após administração ao dito animal infectado por coro- navírus, em comparação com um animal comparável infectado por co- ronavírus sem a dita administração; e/ou (c) compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) contidas em uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que compreende uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para uma HCVR da Tabela 1; e três CDRs de cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência a uma LCVR da Ta- bela 1.

[0008] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno compreende: (a) uma região variável de cadeia pe- sada de imunoglobulina que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 de um anticorpo da Tabela 1; e/ou (b) uma região variável da ca- deia leve de imunoglobulina que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um anticorpo da Tabela 1.

[0009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno compreende: (a) uma região variável de imunoglobu- lina da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoáci- dos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoá- cidos com uma sequência de HCVR da Tabela 1; e/ou (b) uma região variável de imunoglobulina de cadeia leve que compreende uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de LCVR da Tabela 1.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i-

gação a antígeno compreende o CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um único anticorpo da Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compre- ende uma imunoglobulina que compreende a HCVR e a LCVR de um único anticorpo da Tabela 1.

[0011] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma proteína de ligação a antígeno que compete com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno discutidos acima ou aqui para a ligação ao CovV-S.

[0012] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma proteína de ligação a antígeno que se liga ao mesmo epítopo que, ou a um epí- topo sobreposto em, CoV-S, como qualquer um dos anticorpos ou fra- gmentos de ligação a antígeno discutidos acima ou aqui.

[0013] Em qualquer uma das várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode ser multiespecífico.

[0014] Em qualquer uma das várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode compreender uma ou mais den- tre as seguintes propriedades: a) inibe o crescimento de um coronaví- rus; b) liga-se à superfície de um coronavírus; c) limita a disseminação da infecção por coronavírus das células in vitro; e d) protege camun- dongos geneticamente modificados para expressar a proteína ACE2 ou TMPRSS2 humana da morte e/ou perda de peso causada pela in- fecção por coronavírus.

[0015] Em qualquer uma das várias modalidades, CoV-S é SARS- CovV-2-S.

[0016] Em um aspecto, a presente descrição fornece um complexo que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como discutido acima ou aqui, ligado a um polipeptídeo de CoV-S. Em algumas modalidades, o CoV-S é SARS-CoV-2-S.

[0017] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como discutido acima ou aqui, que compreende: (a) introduzir em uma célula hospedeira um ou mais polinucleotídeos que codificam o dito anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno; (b) cultivar a célula hospedeira em condições favoráveis à expressão de um ou mais polinucleotídeos; e (c) opcionalmente, isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no da célula hospedeira e/ou um meio no qual a célula hospedeira é cultivada. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês.

[0018] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que é um produto do método dis- cutido acima.

[0019] Em um aspecto, a presente descrição fornece um polipeptí- deo que compreende: (a) CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio de HCVR de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR estabelecida na Tabela 1; ou (bj) CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um domínio de LCVR de uma cadeia de imunoglobulina que compreende uma se- quência de aminoácidos de LCVR apresentada na Tabela 1.

[0020] Em um aspecto, a presente descrição fornece um polinu- cleotídeo que codifica o polipeptídeo discutido acima.

[0021] Em um aspecto, a presente descrição fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo discutido acima.

[0022] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma célula hospedeira que compreende o anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo ou polinucleotídeo ou vetor de ligação a antígeno, conforme discutido acima ou aqui.

[0023] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma compo- sição ou kit que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno discutido acima ou aqui em associação com um agente tera-

pêutico adicional.

[0024] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende a proteína de ligação a antígeno, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno discutido acima ou aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agen- te terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agente terapêuti- co adicional é um fármaco antiviral ou uma vacina. Em algumas moda- lidades, o agente terapêutico adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TMPRSS2 e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que especificamente liga-se a CoV-S. Em alguns casos, o agente antimalárico é a cloroquina ou a hidroxiclo- roquina. Em alguns casos, o agente anti-inflamatório é um anticorpo, como sarilumabe, tocilizumabe ou gimsilumabe. Em algumas modali- dades, o agente terapêutico adicional é um segundo anticorpo ou fra- gmento de ligação a antígeno que compreende sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da Tabela 1.

[0025] Em um aspecto, a presente descrição fornece um recipiente ou dispositivo de injeção que compreende a proteína de ligação a an- tígeno, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ou composição como discutido acima ou no presente documento.

[0026] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para tratar ou prevenir a infecção por um coronavírus, em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação a antígeno, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, conforme discutido aci- ma ou no presente documento. Em algumas modalidades, o coronaví- rus é selecionado a partir do grupo que consiste em SARS-CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV.

[0027] Em algumas modalidades do método para tratar ou prevenir infecção por um coronavírus, o indivíduo recebe um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em alguns casos, o um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais são um fármaco antiviral ou uma vacina. Em al- guns casos, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é selecio- nado a partir do grupo que consiste em: um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico, um anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo que se liga especificamente ao TMPRSS?2 e um anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a CoV-S. Em alguns casos, o agente antimalárico é a cloroquina ou a hidroxicloroquina. Em alguns casos, o agente anti-inflamatório é um anticorpo, como, por exemplo, sarilumabe, tocilizumabe ou gimsiluma- be. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um se- gundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que compreende sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da Tabela 1. Outros anticorpos que podem ser usados sozinhos ou em combinação um com o outro ou com um ou mais dos anticorpos divul- gados no presente documento para uso no contexto dos métodos da presente descrição incluem, por exemplo, LY-CoV555 (Eli Lilly); 47D11 (Wang et al Nature Communications Article No. 2251); B38, H4, B5 and/or H2 (Wu et al., 10.1126/science.abc2241 (2020); STI-1499 (Sor- rento Therapeutics); VIR-7831 e VIR-7832 (Vir Biotherapeutics).

[0028] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para administrar um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dis- cutido acima ou aqui no corpo de um indivíduo que compreende injetar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno no corpo do indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno é injetado no corpo do indivíduo por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular.

[0029] Em qualquer uma das várias modalidades discutidas acima ou aqui, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma sequência de domínio variável VH3-66 ou Vk1-33.

[0030] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável da ca- deia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e três regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210.

[0031] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 206, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 208, a LCDR1 compreende a sequência de aminoáci- dos estabelecida na SEQ ID NO: 212, a LCDR2 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55 e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

214. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreen- de a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma LCVR que compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em algu- mas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequên-

cia de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

210.

[0032] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e três regi- ões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabeleci- da na SEQ ID NO: 210.

[0033] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 206, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 208, a LCDR1 compreende a sequência de aminoáci- dos estabelecida na SEQ ID NO: 212, a LCDR2 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55 e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

214. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de ami- noácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 216 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 218. Em alguns casos, a região constante de imuno- globulina é uma região constante de IgG1. Em alguns casos, o anti- corpo isolado é um anticorpo recombinante. Em alguns casos, o anti- corpo isolado é multiespecífico.

[0034] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende um anticorpo isolado, como discu- tido acima ou aqui, e um veículo ou diluente farmaceuticamente acei- tável.

[0035] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente terapêutico. Em alguns casos, o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a an- tígeno, que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao TMPRSS?2.

[0036] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno, que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832. Em alguns ca- sos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma LOVR que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreende: HCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 642; HCDR2, que com- preende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

499; HCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabele- cida na SEQ ID NO: 644; LCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 648; LCDR2, que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 650; e LCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 652. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que com- preende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabele- cida na SEQ ID NO: 646. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 656.

[0037] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável da ca- deia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e três regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646.

[0038] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 642, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 499, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 644, a LCDR1 compreende a sequência de aminoáci- dos estabelecida na SEQ ID NO: 648, a LCDR2 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 650 e o LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

652. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreen- de uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em al- gumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646.

[0039] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e três regi- ões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabeleci- da na SEQ ID NO: 646.

[0040] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 642, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

499, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 644, a LCDR1 compreende a sequência de aminoáci- dos estabelecida na SEQ ID NO: 648, a LCDR2 compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 650 e o LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:

652. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende a sequência de ami- noácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 656. Em alguns casos, a região constante de imuno- globulina é uma região constante de IgG1. Em alguns casos, o anti- corpo isolado é um anticorpo recombinante. Em alguns casos, o anti- corpo isolado é multiespecífico.

[0041] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende um anticorpo isolado, como discu- tido acima ou aqui, e um veículo ou diluente farmaceuticamente acei- tável.

[0042] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente terapêutico. Em alguns casos, o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a an- tígeno, que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao TMPRSS?2.

[0043] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno, que se liga a uma proteína spike de SARS-CoV-2 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832. Em alguns ca- sos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma LOVR que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreende: HCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204; HCDR2, que com- preende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 206; HCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabele- cida na SEQ ID NO: 208; LCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212; LCDR2, que compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55; e LCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 214. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que com- preende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabele- cida na SEQ ID NO: 210. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 216 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 218.

[0044] Em várias modalidades, qualquer uma das características ou componentes das modalidades discutidas acima ou no presente documento pode ser combinada e essas combinações estão incluídas no escopo da presente descrição. Qualquer valor específico discutido acima ou aqui pode ser combinado com outro valor relacionado discu- tido acima ou aqui para recitar uma faixa com os valores representan- do as extremidades superior e inferior do intervalo, e esses intervalos estão incluídos no escopo da presente descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0045] A Figura 1 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0046] A Figura 2 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0047] A Figura 3 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0048] A Figura 4 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0049] A Figura 5 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0050] A Figura 6 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0051] A Figura 7 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an-

ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0052] A Figura 8 mostra os dados de bloqueio de ELISA para an- ticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína spike de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína spike ao seu receptor ACE?2.

[0053] A Figura 9A e a Figura 9B exibem frequências do gene V para cadeias Pesadas (eixo X) e Leves (eixo Y) emparelhadas de anti- corpos neutralizantes isolados para SARS-CoV-2 para camundongos VeloclMmmune&O (Figura 9A; N = 185) e humanos convalescentes doa- dores (Figura 9B; N = 68). A tonalidade e o tamanho do círculo corres- pondem ao número de pares de cadeias pesadas e leves presentes nos repertórios de anticorpos neutralizantes isolados. A neutralização é definida como> 70% com diluição 1:4 de anticorpo (- 2 ug/ml) no en- saio de neutralização de pseudopartículas de VSV.

[0054] A Figura 10A e a Figura 10B mostram a potência de neutra- lização. A Figura 10A mostra a potência de neutralização dos mAbs anti-Spike de SARS-CoV-2. Diluições em série de mAbs anti-Spike, controle de isotipo IIG1 e ACE2 dimérico recombinante (hACE2.hFc) foram adicionadas com pVSV-SARS-CoV-2-S-mNeon às células Vero e a expressão do mNeon foi medida 24 horas após a infecção como leitura para infecciosidade de vírus. Os dados são representados grafi- camente como porcentagem de neutralização em relação ao controle de infecção apenas por vírus. A Figura 10B mostra a potência de neu- tralização de mAbs anti-Spike individuais e combinações de mAbs contra o vírus SARS-CoV-2-S em células VeroE6.

[0055] A Figura 11 mostra a análise do escopo do epítopo a partir de uma matriz de ensaios de ligação pré-mistura para diferentes mAbs anti-SARS-CoV-2. A divisão do epítopo foi realizada contra nove mAb anti-SARS-CoV-2, como descrito. Havia três fases (1, Il e Ill) para cada gráfico. Na fase |, o mAb anti-SARS-CoV-2 (20 ug/ml) foi carregado na sonda anti-Fc humana. Na fase Il, solução de mAb humano bloquea- dor de I9gG1 (100 ug/ml). Na fase Ill, uma solução do complexo de pré- mistura de 100 nM CoVv-2 RBD-MMH de SARS de cada sítio de liga- ção do mAb 600 nM anti-SARS-CoV-2 fluiu sobre a sonda de captura de mAb.

[0056] A Figura 12 mostra um modelo de superfície 3D para a es- trutura do domínio RBD da proteína Spike que mostra os resultados de mapeamento de epítopo HDX-MS e interface de ACE2. Os resíduos de RBD protegidos por anticorpos anti-Spike de SARS-CoV2 são indi- cados com sombreamento que representa a extensão da proteção conforme determinado pelos experimentos com HDX-MS. A estrutura RBD é reproduzida a partir do PDB 6M 17.

[0057] A Figura 13A e a Figura 13B mostram um complexo de MmMAb10933 e mAb10987 com o SARS-CoV-2 RBD. A Figura 13A mos- tra um mapa de 3,9 À cryoEM do complexo mAb10933 + RBD + mMAb10987, sombreado de acordo com as cadeias no modelo refinado da Figura 13B.RBD, cadeias pesadas e leves de mAb10933 e cadeia pesada e leve de mAb10987 são identificadas.

[0058] A Figura 14 mostra as estatísticas dos dados cryoEM. As estatísticas de coleta e refinamento de dados são relatadas para a es- trutura complexa mAb10987 + mAb10933 + SARS-CoV-2 RBD mos- trada na Figura 13A e na Figura 13B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0059] Antes de os presentes métodos serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não se limitada a métodos particulares e às condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a termino- logia usada no presente documento é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a ser limitante, vis- to que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas rei- vindicações anexas.

[0060] Exceto se for definido de outro modo, todos os termos téc- nicos e específicos usados no presente documento têm o mesmo sig- nificado que é comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos des- critos no presente documento possam ser usados na prática ou no tes- te da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são descritos agora. Todas as publicações mencionadas no presente do- cumento são incorporadas ao presente documento a título de referên- cia em sua totalidade.

[0061] O termo "coronavírus" ou "CoV" refere-se a qualquer vírus da família dos coronavírus, incluindo, mas não está limitado a, SARS- CoV-2, MERS-CoV e SARS-CoV. O SARS-CoV-2 refere-se ao coro- navírus recém-emergido, identificado como a causa de um surto grave que começa em Wuhan, na China, e que está se espalhando rapida- mente para outras áreas do mundo. O SARS-CoV-2 também é conhe- cido como coronavírus 2019-nCoV e Wuhan. O mesmo liga-se através da proteína spike viral à enzima de conversão de angiotensina 2 (ACE2) do receptor da célula hospedeira humana. A proteína spike também se liga e é clivada pelo TMPRSS?, que ativa a proteína spike para a fusão do vírus pela membrana.

[0062] O termo "CoV-S", também chamado de "S" ou "proteína S" refere-se à proteína spike de um coronavírus e pode se referir a prote- ínas S específicas, como SARS-CoV-2-S, MERS-CoV S e SARS-CoV S. A proteína Spike de SARS-CoV-2 é uma glicoproteína de membra- na de 1273 aminoácidos tipo | que se agrupa em trímeros que consti- tuem os picos ou peplômeros na superfície da partícula de coronavírus envolvida. A proteína tem duas funções essenciais: ligação de receptor do hospedeiro e fusão da membrana, atribuídas às metades N- terminal (S1) e C-terminal (S2) da proteína S. CoV-S se liga ao seu receptor cognato através de um domínio de ligação de receptor (RBD) presente na subunidade S1. A sequência de aminoácidos da proteína spike de SARS-CoV-2 de comprimento total é exemplificada pela se- quência de aminoácidos fornecida na SEQ ID NO: 832. O termo "CoV- S" inclui variantes de proteína da proteína spike de CoV isolada de di- ferentes isolados de CoV, bem como proteína spike de CoV recombi- nante ou um fragmento da mesma. O termo também abrange a proteí- na spike de CoV ou um fragmento da mesma acoplado a, por exem- plo, um marcador de histidina, Fc de camundongo ou humano, ou uma sequência de sinal como ROR1.

[0063] O termo "infecção por coronavírus" ou "infecção por CoV", conforme usado aqui, refere-se à infecção por um coronavírus como SARS-CoV-2, MERS-CoV ou SARS-CoV. O termo inclui infecções do trato respiratório por coronavírus, geralmente no trato respiratório infe- rior. Os sintomas podem incluir febre alta, tosse seca, falta de ar, pneumonia, sintomas gastrointestinais como diarreia, falência de ór- gãos (insuficiência renal e disfunção renal), choque séptico e morte em Casos graves.

VÍRUS

[0064] A presente invenção inclui métodos para tratar ou prevenir uma infecção viral em um indivíduo. O termo "vírus" inclui qualquer vírus cuja infecção no corpo de um indivíduo seja tratável ou evitável pela administração de um anticorpo anti-CoV-S ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo (por exemplo, em que a infecciosidade do vírus é pelo menos parcialmente dependente no CoV-S). Em uma mo- dalidade da invenção, um "vírus" é qualquer vírus que expressa a pro- teína spike (por exemplo, CoV-S). O termo "vírus" também inclui um vírus respiratório dependente de CoV-S, que é um vírus que infecta o tecido respiratório de um indivíduo (por exemplo, trato respiratório su- perior e/ou inferior, traqueia, brônquios, pulmões) e é tratável ou evitá- vel por administração de um anticorpo anti-CoV-S ou fragmento de |li- gação a antígeno do mesmo. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o vírus inclui coronavírus, SARS-CoV-2 (coronavírus da sín- drome respiratória aguda grave 2), SARS-CoV (coronavírus da sín- drome respiratória aguda grave) e MERS-CoV (coronavírus da sín- drome respiratória do Oriente Médio (MERS)). Os coronavírus podem incluir os gêneros de alfacoronavírus, betacoronavírus, gamacoronaví- rus e deltacoronavírus. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno aqui fornecidos podem se ligar e/ou neutralizar um alfacoronavírus, um betacoronavírus, um gamacorona- vírus e/ou um deltacoronavírus. Em certas modalidades, essa ligação e/ou neutralização pode ser específica para um gênero específico de coronavírus ou para um subgrupo específico de um gênero. "Infecção viral" refere-se à invasão e multiplicação de um vírus no corpo de um indivíduo.

[0065] Os vírions de coronavírus são esféricos com diâmetros de aproximadamente 125 nm. A característica mais proeminente dos co- ronavírus são as projeções spike em forma de taco que emanam da superfície do vírion. Essas spikes são uma característica definidora do vírion e dão a eles a aparência de uma coroa solar (solar corona), soli- citando o nome de coronavírus. Dentro do envelope do vírion está o nucleocapsídeo. Os coronavírus têm nucleocapsídeos helicoidicamen- te simétricos, o que é incomum entre os vírus de RNA de sentido posi- tivo, mas muito mais comum para vírus de RNA de sentido negativo. SARS-CoV-2, MERS-CoV e SARS-CoV pertencem à família dos coro- navírus. A ligação inicial do vírion à célula hospedeira é iniciada por interações entre a proteína S e seu receptor. Os locais dos domínios de ligação de receptor (RBD) na região S1 de uma proteína S do coro- navírus variam dependendo do vírus, com alguns tendo o RBD no ter- minal C de S1. A interação proteína S/receptor é o principal determi- nante para um coronavírus infectar uma espécie hospedeira e também governa o tropismo tecidual do vírus. Muitos coronavírus utilizam pep- tidases como seu receptor celular. Após a ligação do receptor, o vírus deve obter acesso ao citosol da célula hospedeira. Isso é geralmente conseguido por clivagem proteolítica dependente de ácido da proteína S por uma catepsina, TMPRRS?2 ou outra protease, seguida pela fusão das membranas virais e celulares. ANTICORPOS ANTI-Cov-S E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO A ANTÍ-

GENO

[0066] A presente invenção fornece proteínas de ligação a antíge- no, tais como anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à proteína spike de CoV ou a um fragmento antigênico da mesma.

[0067] O termo "anticorpo", como aqui utilizado, refere-se a molé- culas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídi- cas, duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs) interco- nectadas por ligações dissulfeto (ou seja, "moléculas de anticorpo completas"), bem como a multímeros (por exemplo, IgM) das mesmas. Anticorpos exemplares incluem, por exemplo, os listados na Tabela 1. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pe- sada ("HCVR" ou "Vx") e uma região constante de cadeia pesada (compreendida pelos domínios CH1, Cx2 e CH3). Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve ("LCVR ou "V.") e uma região constante de cadeia leve (C1). As regiões Vx e V. podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade, de- nominadas de regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada Vu e V. é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir de aminoterminação à carboxitermina- ção na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As CDRs de cadeia pesada também podem ser chamadas de HCDRs ou CDR-Hs e numeradas conforme descrito acima (por exemplo, HCDR1, HCDR?2 e HCDR3 ou CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3). Da mesma forma, as CDRs da cadeia leve podem ser chamadas de LCDRs ou CDR-Ls e numeradas LCDR1, LCDR2 e LCDR3 ou CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. Em determinadas modalidades da invenção, as FR do anticorpo (ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana ou são modificadas natu- ral ou artificiamente.

Sequências de linha germinativa humanas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, VH3-66 e Vk1-33. As- sim, a presente descrição fornece anticorpos anti-CoV-S ou fragmen- tos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, anticorpos anti- SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos) que compreendem sequências HCDR e LCDR da Tabela 1 dentro de uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve variável VH3-66 ou Vk1-33. A presente descrição fornece ainda anticorpos anti-CoV-S ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, anti- corpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos) que compreendem sequências HCDR e LCDR da Tabela 1 dentro de uma combinação de uma cadeia leve selecionada a partir de IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, I9gKV1-12, I9gKV3-15, I9gKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, I9gKV2-24, IgKV1-33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1- 44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2-8, I9KV3-11, IgLV2-11, IgLV2- 14, IgLV2-23 ou IgLV6-57 e um cadeia pesada selecionada a partir de IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3-53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, I9gHV3-9, I9gHV1-8, I9gHV3-7, IgHV2-5, I9gHV1-2, I9gHV2-70,

IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4-31, IgHV3-30-3, IgHV2-26 ou IgHV7-4-1. A presente descrição fornece ainda anticor- pos anti-CoV-S ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos) que compreendem sequências HCVR e LCVR da Tabela 1 dentro de uma combinação de uma cadeia leve selecio- nada a partir de IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1-33, IgKV1- 39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2-8, I9KV3- 11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23 ou IgLV6-57 e um cadeia pesada selecionada a partir de IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, I9HV3-53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, I9gHV3-15, I9gHV3-11, IgHV3-9, I9gHV1-8, I9gHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, I9gHV2-70, I9gHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, I9gHV4-39, IgHV4- 31, IgHV3-30-3, IgHV2-26 ou IgHV7-4-1.

[0068] Tipicamente, os domínios variáveis das cadeias de imuno- globulina pesada e leve compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), localizadas dentro de regiões estruturais (FR) relativamente conservadas. Em geral, do terminal N ao terminal C, os domínios vari- áveis das cadeias leve e pesada compreendem FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em uma modalidade da invenção, a atribui- ção de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; Insti- tutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md.; 5º ed.; NIH Publ. 91 a 3.242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1 a 75; Kabat et al. (1977) J. Biol. Chem. 252: 6.609 a 6.616; Chothia et a/. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 a 917 ou Chothia, et a/., (1989) Nature 342: 878 a 883.

[0069] A presente invenção inclui proteínas monoclonais anti-CoV- S de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpos e fragmentos de liga-

ção a antígeno dos mesmos, bem como composições monoclonais que compreendem uma pluralidade de proteínas de ligação a antígeno monoclonal isoladas. O termo "anticorpo monoclonal", como aqui utili- zado, refere-se a uma população de anticorpos substancialmente ho- mogêneos, isto é, as moléculas de anticorpo que compreendem a po- pulação são idênticas na sequência de aminoácidos, exceto por possí- veis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Uma "pluralidade" desses anticorpos e fra- gmentos monoclonais em uma composição refere-se a uma concen- tração de anticorpos e fragmentos idênticos (isto é, como discutido acima, na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades) de anticorpos e fragmentos acima do que normalmente ocorreria na natureza, por exemplo, no sangue de um organismo hos- pedeiro, como um camundongo ou um ser humano.

[0070] Em uma modalidade da invenção, uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno, compreende um domínio constante da cadeia pesada, por exemplo, do tipo IgA (por exemplo, IgA1 ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e I9gG4) ou IgM. Em uma modalidade da invenção, uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio constante da cadeia leve, por exemplo, do tipo capa ou lambda.

[0071] O termo proteína de ligação a antígeno "humano", como um anticorpo, como usado aqui, inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha ger- minativa humana, seja em uma célula humana ou enxertada em uma célula não humana, por exemplo, uma célula de camundongo. Veja, por exemplo, os documentos US8502018, US6596541 ou US5789215. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoáci-

dos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por muta- gênese de sítio específico aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, na CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado no presente documento, não se destina a incluir mAbs nas quais as sequências de CDR deri- vadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo) foram enxertadas em sequências de FR hu- manas. O termo inclui anticorpos produzidos de maneira recombinante em um mamífero não humano ou em células de um mamífero não hu- mano. O termo não está destinado a incluir anticorpos isolados ou ge- rados em um indivíduo humano. Ver abaixo.

[0072] A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno quiméricas anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos, e métodos de uso dos mesmos. Como aqui utilizado, um "anticorpo quimérico" é um anticorpo que tem o do- mínio variável de um primeiro anticorpo e o domínio constante de um segundo anticorpo, em que o primeiro e o segundo anticorpos são de espécies diferentes. (US4816567; e Morrison et a/., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81: 6.851 a 6.855).

[0073] A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno híbridas anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, e métodos de uso dos mesmos. Como aqui utilizado, um "anticorpo híbrido" é um anticorpo que tem o domínio va- riável de um primeiro anticorpo e o domínio constante de um segundo anticorpo, em que o primeiro e o segundo anticorpos são de animais diferentes, ou em que o domínio variável, mas não a região constante, é de um primeiro animal. Por exemplo, um domínio variável pode ser retirado de um anticorpo isolado de um humano e expresso com uma região constante fixa não isolada desse anticorpo. Anticorpos híbridos exemplares são descritos no Exemplo 1, que se refere à região variá- vel produtos de PCR derivados de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpo que foram clonados em vetores de ex- pressão contendo uma região constante pesada e uma região cons- tante leve, respectivamente. Os anticorpos híbridos são sintéticos e não ocorrem naturalmente porque as regiões variáveis e constantes que eles contêm não são isoladas de uma única fonte natural.

[0074] O termo proteínas de ligação a antígeno "recombinante", tais como anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mes- mos, se refere a tais moléculas criadas, expressadas, isoladas ou ob- tidas por tecnologias ou métodos conhecidos na técnica, como tecno- logia de DNA recombinante que incluem, por exemplo, processamento de DNA e expressão transgênica. O termo se refere a anticorpos ex- pressos em um mamífero não humano (incluindo mamíferos não hu- manos transgênicos, por exemplo, camundongos transgênicos) ou em um sistema de expressão de células (por exemplo, células CHO) ou um sistema de expressão de células não humanas, ou isolados de uma biblioteca combinatorial de anticorpos humanos recombinantes. Em algumas modalidades, um anticorpo recombinante compartilha uma sequência com um anticorpo isolado de um organismo (por exemplo, um camundongo ou um ser humano), mas foi expresso por meio da tecnologia de DNA recombinante. Tais anticorpos podem ter modificações pós-traducionais (por exemplo, glicosilação) que diferem do anticorpo isolado do organismo.

[0075] As proteínas de ligação a antígeno recombinante anti-CoV- S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno, aqui divulgados também podem ser produzidos em um sistema de expres- são de E. coliT7. Nesta modalidade, os ácidos nucleicos que codifi- cam as moléculas de imunoglobulina do anticorpo anti-CoV-S da in- venção (por exemplo, conforme encontrado na Tabela 1) podem ser inseridos em um plasmídeo baseado em pET e expressos no sistema E. coliT7. Por exemplo, a presente invenção inclui métodos para ex- pressar um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou cadeia de imunoglobulina do mesmo em uma célula hospedeira (por exemplo, célula hospedeira bacteriana como E. coli como BL21 ou BL21DE3) que compreende expressar a polimerase de RNA T7 na célula que também inclui um polinucleotídeo que codifica uma cadeia de imunoglobulina que está operacionalmente ligada a um promotor de T7. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, uma célula hospe- deira bacteriana, como E. coli, inclui um polinucleotídeo que codifica o gene da polimerase de RNA T7 operacionalmente ligado a um promo- tor /lac e a expressão da polimerase e da cadeia é induzida pela incu- bação da célula hospedeira com IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopira- nósido). Ver documentos US4952496 e US5693489 ou Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 5 de maio de 1986; 189 (1): 113 a 130.

[0076] Existem vários métodos pelos quais produzir anticorpos re- combinantes que são conhecidos na técnica. Um exemplo de um mé- todo para produção recombinante de anticorpos é divulgado no docu- mento US4816567.

[0077] A transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo MRNA) em uma célula hospedeira. Os métodos para introduzir polinu- cleotídeos heterólogos nas células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibeno, fusão de pro- toplastos, eletroporação, encapsulamento do polinucleotídeo (ou poli- nucleotídeos) em lipossomas, tecnologia de nanopartículas lipídicas, injeção biolística e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Além dis-

so, moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas nas células de mamíferos por vetores virais, como lentivírus ou vírus adenoassociado. Os métodos para transformar células são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. n.º* 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 e 4.959.455. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente descrição pode ser introdu- zido a um indivíduo na forma de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo mMRNA), de modo que as próprias células do indivíduo produzam o anticorpo. A presente descrição fornece ainda modifica- ções nas sequências de nucleotídeos que codificam os anticorpos anti- CoV-S aqui descritos que resultam em maior expressão de anticorpos, maior estabilidade de anticorpos, maior estabilidade de ácidos nuclei- cos (por exemplo, mRNA) ou maior afinidade ou especificidade dos anticorpos para a proteína spike de CovV.

[0078] Assim, a presente invenção inclui métodos recombinantes para produzir uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da pre- sente invenção, ou uma cadeia de imunoglobulina da mesma, com- preendendo (i) introduzir um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, incluindo a sequência nucleotídica de qualquer uma ou mais das se- quências da Tabela 2) que codificam cadeias leves e/ou pesadas de imunoglobulina, ou CDRs, da proteína de ligação a antígeno, por exemplo, da Tabela 1, por exemplo, em que o polinucleotídeo está em um vetor; e/ou integrado a um cromossomo da célula hospedeira e/ou está operacionalmente ligado a um promotor; (ii) cultivar a célula hos- pedeira (por exemplo, CHO ou Pichia ou Pichia pastoris) sob condi- ções favoráveis à expressão do polinucleotídeo e, (iii) opcionalmente, isolar a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fra- gmento) ou cadeia da célula hospedeira e/ou meio em que a célula hospedeira é cultivada. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser in-

tegrado a um cromossomo da célula hospedeira através da inserção direcionada com um vetor como o vírus adenoassociado (AAV), por exemplo, após a clivagem do cromossomo usando um sistema de edi- ção de genes (por exemplo, CRISPR (por exemplo, CRISPR -Cas9), TALEN, megaTAL, dedo de zinco ou Argonaute). As inserções direcio- nadas podem ocorrer, por exemplo, em locais de células hospedeiras, como um local genômico de albumina ou imunoglobulina.

Alternativa- mente, a inserção pode ocorrer em um local aleatório, por exemplo, usando um vetor como o lentivírus.

Ao fazer uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) que compreende mais de uma cadeia de imunoglobulina, por exemplo, um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas de imunoglobu- lina e duas cadeias leves de imunoglobulina, coexpressão das cadeias em uma única célula hospedeira leva à associação das cadeias, por exemplo, na célula ou na superfície celular ou fora da célula se essas cadeias forem secretadas, de modo a formar a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno). Os métodos incluem aqueles em que apenas uma cadeia pesada de imunoglobulina ou apenas uma cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, qualquer uma das discutidas aqui, incluindo fragmentos ma- duros e/ou domínios variáveis dos mesmos) é expressa.

Tais cadeias são úteis, por exemplo, como intermediárias na expressão de um anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno que inclui essa cadeia.

Por exemplo, a presente invenção também inclui proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, como anticorpos e fragmentos de ligação a antí- geno dos mesmos, que compreendem uma imunoglobulina de cadeia pesada (ou domínio variável da mesma ou que compreende suas CDRs) codificada por um polinucleotídeo que compreende uma se- quência de nucleotídeos estabelecida na Tabela 2 e uma imunoglobu- lina de cadeia leve (ou domínio variável da mesma ou que compreen-

de suas CDRs) codificada por uma sequência de nucleotídeos estabe- lecida na Tabela 2 que é o produto de tais métodos de produção e, opcionalmente, os métodos de purificação definidos aqui adiante. Por exemplo, em algumas modalidades, o produto do método é uma prote- ína de ligação a antígeno anti-CoV-S que é um anticorpo ou fragmento que compreende uma HCVR que compreende uma sequência de ami- noácidos estabelecida na Tabela 1 e uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1, em que as se- quências de HCVR e LCVR são selecionadas a partir de um único an- ticorpo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o produto do método é uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S que é um anticorpo ou fragmento que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 que compreendem sequências de aminoácidos estabelecidas na Ta- bela 1 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 que compreendem sequências de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, em que as seis sequências de CDR são selecionadas a partir de um único anticorpo listado na Tabela

1. Em algumas modalidades, o produto do método é uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S que é um anticorpo ou fragmento que compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos HC estabelecida na Tabela 1 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos LC estabelecida na Ta- bela 1.

[0079] Células hospedeiras eucarióticas e procarióticas, incluindo células de mamíferos, podem ser usadas como hospedeiros para ex- pressão de uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S. Tais célu- las hospedeiras são bem conhecidas na técnica e muitas estão dispo- níveis junto à American Type Culture Collection (ATCC). Essas células hospedeiras incluem, inter alia, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO0, SP2, células HeLa, células de rim de bebê de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 e várias outras linhas celulares. As células hos- pedeiras de mamíferos incluem células humanas, camundongos, ca- mundongos, cães, macacos, porcos, cabras, bovinos, cavalos e hams- ter. Outras linhas celulares que podem ser usadas são linhas celulares de insetos (por exemplo, Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni), células anfíbias, células bacterianas, células vegetais e células fúngi- cas. As células fúngicas incluem células de levedura e de fungos fila- mentosos incluindo, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia ther- motolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluy- veromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium luckno- wense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens e Neurospora crassa. A presente invenção inclui uma célula hospedeira isolada (por exemplo, uma célula CHO) que compreende uma proteína de ligação a antígeno, como as da Tabela 1; ou um polinucleotídeo que codifica esse polipeptídeo do mesmo.

[0080] O termo "liga-se especificamente" refere-se às proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, mAbs) que têm uma afinidade de |li- gação a um antígeno, como uma proteína de CoV-S (por exemplo, SARS-CoV-2-S), expressa como Kp, de pelo menos cerca de 10º M, medido em tempo real, ensaio de interferometria de biocamada livre de marcador, por exemplo, a 25ºC ou 37ºC, por exemplo, um biossen- sor Octetê HTX ou por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORETY ou por ELISA de afinidade de solução. A pre- sente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno que se ligam es-

pecificamente a uma proteína de CoV-S.

[0081] Os termos "porção de ligação a antígeno" ou "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo ou proteína de ligação a antígeno, e similares, como usado no presente documento, incluem qualquer glicoproteína ou polipeptídeo de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente modificado que se liga especifi- camente a um antígeno para formar um complexo. Exemplos não limi- tantes de fragmentos de ligação a antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade (CDR) isola- da, como um peptídeo CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restringi- do. Outras moléculas geneticamente modificadas, como anticorpos es- pecíficos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos com do- mínio excluído, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, como definidos no documento WOO08/020079 ou WO09/138519) (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes etc.), imu- nofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs) e domínios IINAR va- riáveis de tubarão, também são abrangidos pela expressão "fragmento de ligação a antígeno", conforme usado no presente documento. Em uma modalidade da invenção, o fragmento de ligação a antígeno com- preende três ou mais CDRs de um anticorpo da Tabela 1 (por exem- plo, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3; ou CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3).

[0082] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em uma modalidade da invenção, compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ter de qualquer tamanho ou compo- sição de aminoácidos e pode compreender geralmente pelo menos uma CDR que é adjacente ou em está sintonia com uma ou mais se- quências estruturais. Em fragmentos de ligação a antígeno que possu- em um domínio Vx associado a um domínio V., os domínios Vx e V. podem estar situados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e pode conter dímeros Vx - Vu, Vin - Vi ou V. - V.. Alternativamente, o frag- mento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um domínio de Vx ou Vi monomérico.

[0083] Em certas modalidades, um fragmento de ligação a antíge- no de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável cova- lentemente ligado a pelo menos um domínio constante. As configura- ções exemplificativas não limitantes de domínios variáveis e constan- tes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) Va-Cn1; (ii) VH-CnH2; (iii) Vi-CnH3; (iv) Vi-CH1-CH2; (v) Va-CH1-CH2-CnH3; (vi) Va-Cn2- CH3; (vii) VH-Cr; (viii) Vl-CnH1; (ix) Vl-CH2; (x) VI-CH3; (xi) Vl-CH1-Cn2; (xii) VI-CH1-CH2-Cn3; (xiii) Vl-CH2-Cn3; e (xiv) Vl-C1. Em qualquer con- figuração de domínios varieis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificativas listadas acima, os domínios variá- vel e constante podem ser ligados diretamente entre si ou podem estar ligados por uma região parcial do ligante ou da dobradiça. Uma região da dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo. Ademais, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma dentre as configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente uma com a outra e/ou com um ou mais domínios de Vx ou Vi monoméricos (por exemplo, por ligação (ou ligações) de dissulfeto).

[0084] As proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticor- pos e fragmentos de ligação a antígeno) podem ser monoespeciíficas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas). As proteínas multies- pecíficas de ligação a antígeno são discutidas aqui mais adiante.

[0085] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser conjugados a uma tal porção quími- ca ligante ou porção química terapêutica ("imunoconjugado"), como um fármaco antiviral, um segundo anticorpo anti-influenza ou qualquer outra porção química terapêutica útil para tratar uma infecção viral, por exemplo, infecção viral por influenza. Ver abaixo.

[0086] A presente invenção também fornece um complexo que compreende uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, discutido aqui complexado com o polipeptídeo de CoV-S ou um fragmento antigênico do mesmo e/ou com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno secundário do mesmo (por exemplo, anticorpo secundário marcado de forma detectável) que se liga especificamente ao anticorpo ou frag- mento anti-CoV-S. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento é in vitro (por exemplo, é imobilizado em um substrato sóli- do) ou está no corpo de um indivíduo. Em uma modalidade da inven- ção, o CoV-S é in vitro (por exemplo, é imobilizado em um substrato sólido) ou está na superfície de um vírus ou no corpo de um indivíduo. Anticorpos anti-CoV-S imobilizados e fragmentos de ligação a antíge- no dos mesmos que são covalentemente ligados a um material da ma- triz insolúvel (por exemplo, vidro ou polissacarídeo, como agarose ou sepharose, por exemplo, uma esfera ou outra partícula do mesmo) também fazem parte da presente invenção; opcionalmente, em que o anticorpo imobilizado é complexado com CoV-S ou fragmento do mesmo antigênico ou um anticorpo secundário ou fragmento do mes-

mo.

[0087] As proteínas "isoladas" de ligação a antígeno, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, polipeptídeos, polinucleotídeos e vetores, estão pelo menos parcialmente livres de outras moléculas biológicas das células ou cultura de células a partir da qual elas são produzidas. Tais moléculas biológicas incluem ácidos nucleicos, proteínas, outros anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, lipídios, carboidratos ou outro material, como detritos celulares e meio de crescimento. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno isolado pode ainda estar pelo menos parcialmente livre de componentes do sistema de expres- são, como moléculas biológicas de uma célula hospedeira ou do seu meio de crescimento. Geralmente, o termo "isolado" não se refere a uma completa ausência de tais moléculas biológicas ou a uma ausên- cia de água, tampões ou sais ou a componentes de uma formulação farmacêutica que inclui os anticorpos ou fragmentos.

[0088] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico (por exemplo, um polipeptídeo de CoV-S) que interage com um sítio de ligação a antígeno específico de uma proteína de ligação a antíge- no, por exemplo, uma região variável de uma molécula de anticorpo, conhecida como paratopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Desse modo, diferentes anticorpos podem se ligar a diferen- tes áreas de um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. O termo "epítopo" também se refere a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. O mesmo também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Os epítopos po- dem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcio- nais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da inte- ração. Os epítopos podem ser lineares ou conformacionais, isto é, compostos por aminoácidos não lineares. Em determinadas modalida-

des, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoáci- dos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específica.

[0089] Métodos para determinar o epítodo de uma proteína de |i- gação a antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptí- deo, incluem análise por varredura de mutações de alanina, análise por blot de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443 a 463), estudos cristalográficos de análise de clivagem de peptídeo e análise por RMN. Adicionalmente, podem ser empregados métodos, tais como excisão de epítopos, extração de epítopo e modificação química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487 a 496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo) (por exemplo, co- versina) interage é detectada troca de hidrogênio/deutério por espec- trometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogê- nio/deutério envolve marcar com deutério a proteína de interesse, se- guido pela ligação da proteína de ligação a antígeno, por exemplo, an- ticorpo ou fragmento ou polipeptídeo, à proteína marcada com deuté- rio. Em seguida, o complexo proteína de CoV-S/proteína de ligação a antígeno é transferido para água e os prótons trocáveis dentro dos aminoácidos que são protegidos pelo complexo de anticorpos são submetidos à troca reversa de deutério-por-hidrogênio em uma taxa mais lenta que os prótons trocáveis dentro de aminoácidos que não fazem parte da interface. Como resultado, os aminoácidos que fazem parte da interface da proteína/proteína de ligação a antígeno podem reter deutério e, portanto, podem exibir uma massa relativamente mai- or em comparação aos aminoácidos não incluídos na interface. Após a dissociação da proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo), a proteína-alvo é submetida à análise de clivagem de protease e espectrometria de massa, revelando, as- sim, os resíduos marcados com deutério que correspondem aos ami- noácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Consultar, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252 a 259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A a 265A.

[0090] O termo "compete", conforme usado aqui, refere-se a uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) que se liga a um antígeno (por exemplo, CoV- S) e inibe ou bloqueia a ligação de outra proteína de ligação a antíge- no (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) ao antígeno. O termo também inclui a competição entre duas proteínas de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpos em ambas as orientações, isto é, um primeiro anticorpo que se liga e bloqueia a liga- ção do segundo anticorpo e vice-versa. Em determinadas modalida- des, a primeira proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo) e segunda proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo) po- dem se ligar ao mesmo epítopo. Alternativamente, a primeira e a se- gunda proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos) po- dem se ligar a epítopos diferentes, porém em sobreposição, de modo que a ligação de um iniba ou bloqueie a ligação do segundo anticorpo, por exemplo, por meio de impedimento estérico. A competição cruzada entre proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos) pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um ensaio de interferometria de biocamada sem marcação em tempo real. O mapeamento de epítopos (por exemplo, por varredura de alanina ou troca de hidrogênio-deutério (HDX)) pode ser usado para determinar se dois ou mais anticorpos não são concorrentes (por exemplo, em um mo- nômero de domínio de ligação de receptor de proteína spike (RBD)),

competindo pelo mesmo epítopo, ou competindo, mas com diversos microepítopos (por exemplo, identificados por HDX). Em uma modali- dade da invenção, a competição entre uma primeira e segunda proteí- na de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo) é deter- minada medindo a capacidade de uma primeira proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo) imobilizada (não com- plexada inicialmente com a proteína de CoV-S) para se ligar à proteína solúvel de CoV-S complexada com uma segunda proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo). Uma redução na capa- cidade da primeira proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo) de se ligar à proteína de CoV-S complexada, em relação à proteína de CoV-S não complexada, indica que a primeira e a segunda proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos) competem. O grau de competição pode ser expresso como uma porcentagem da redução na ligação. Essa competição pode ser medida usando um teste de interferometria de biocamada sem marca- ção, em tempo real, por exemplo, em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), ELISA (ensaios de imunoabsorção enzimática) ou SPR (ressonância plasmônica de superfície).

[0091] A competição de ligação entre proteínas de ligação a antí- geno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos monoclonais (mAbs)) pode ser determinada usando um teste de interferometria de biocamada sem marcação em tempo real em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Por exemplo, para determinar a competição entre dois anticorpos monoclonais anti-CoV-S, o mAb anti-CoV-S pode ser captu- rado primeiro nas pontas de biossensores Octet revestidos com anti- corpo anti-hFc (Pall ForteBio Corp., número 18-5060) submergindo as pontas em uma solução de mAb anti-CoV-S (posteriormente chamado de "mAb1"). Como controle positivo para o bloqueio, as pontas do bi- ossensor capturadias por anticorpo podem então ser saturadas com um mAb de controle de isotipo de bloqueio conhecido (posteriormente denominado "mAb de bloqueio") mergulhando em uma solução de mMAb de bloqueio. Para determinar se o mAb2 compete com o mAb1, as pontas do biossensor podem ser mergulhadas subsequentemente em uma solução cocomplexada do polipeptídeo de CoV-S e em um segundo mAb anti-CoV-S (subsequentemente chamado de "mAb2"), que foi pré-incubado por um período de tempo e a ligação do mAb1 ao polipeptídeo de CoV-S pode ser determinada. As pontas do biossensor podem ser lavadas em tampão entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real pode ser monitorada durante o cur- so do experimento e a resposta de ligação no final de cada etapa pode ser registrada.

[0092] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o ensaio de competição é conduzido a 25 ºC e pH cerca de 7, por exemplo, 7,4, por exemplo, na presença de tampão, sal, tensoativo e uma proteína não específica (por exemplo, albumina de soro bovino).

[0093] Tipicamente, um anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno da invenção que é modificado de alguma maneira mantém a ca- pacidade de se ligar especificamente ao CoV-S, por exemplo, retém pelo menos 10% de sua atividade de ligação ao CoV-S (quando com- parado ao anticorpo parental) quando essa atividade é expressa em uma base molar. Preferencialmente, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da invenção retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação ao Cov-S como anticorpo parental. Pretende-se também que um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da invenção possa incluir substitui- ções de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras (denomi- nadas "variantes conservadoras" ou "variantes conservadas em fun- ção" do anticorpo) que não alterem substancialmente sua atividade biológica.

[0094] Uma "variante" de um polipeptídeo, como uma cadeia de imunoglobulina (por exemplo, mAb8021 Vrn, Vi, HC ou LC, mAb8028 VnH, V., HC ou LC ou mAb8029 Vu, V., HC, ou LC), refere-se a um po- lipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70 a 99,9% (por exemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) idêntica ou semelhante a uma sequência de aminoácidos referenciada aqui estabelecida (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 10, 18, 20, 22, 30, 38, 40, 42, 50, 58 ou 60); quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são se- lecionados para fornecer a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequên- cias de referência (por exemplo, limiar esperado: 10; tamanho da pala- vra: 3; correspondências máximas em um intervalo de consulta: 0; ma- triz BLOSUM 62; custos de gap: existência 11, extensão 1; ajuste da matriz de pontuação composicional condicional).

[0095] Uma "variante" de um polinucleotídeo refere-se a um poli- nucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 70 a 99,9% (por exemplo, pelo menos cerca de 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 ou 99,9%) idêntica a uma sequência nucleotídica referenciada aqui estabelecida (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 9, 17, 19, 21, 29, 37, 39, 41, 49, 57 ou 59); quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algorit- mo são selecionados para fornecer a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respecti- vas sequências de referência (por exemplo, limiar esperado: 10; tama- nho da palavra: 28; correspondências máximas em um intervalo de consulta: 0; pontuações de correspondência/incompatibilidade: 1, -2; custos de gap: linear).

[0096] As proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exem- plo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo da pre- sente invenção, em uma modalidade da invenção, incluem uma região variável de imunoglobulina da cadeia pesada que tem pelo menos 70% (por exemplo, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade da sequência de amino- ácidos com as sequências de aminoácidos de HCVR estabelecidas na Tabela 1; e/ou uma região variável de imunoglobulina de cadeia leve com pelo menos 70% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) da identidade da sequência de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de LCVR estabe- lecidas na Tabela 1.

[0097] Além disso, uma proteína de ligação a antígeno variante anti-CoV-S pode incluir um polipeptídeo que compreende uma se- quência de aminoácidos estabelecida no presente documento, exceto por uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) mutações como, por exemplo, mutações missenso (por exemplo, substituições conservadoras), mutações não senso, deleções ou inserções. Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno que incluem uma variante de cadeia leve de imunoglobulina que com- preende uma sequência de aminoácidos de LCVR apresentada na Ta- bela 1, mas tendo uma ou mais dessas mutações e/ou uma variante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR apresentada na Tabela 1, mas com uma ou mais dessas mutações. Em uma modalidade da invenção, uma proteí- na de ligação a antígeno variante anti-CoV-S inclui uma variante de cadeia leve de imunoglobulina que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que uma ou mais (por exemplo, 1 ou 2 ou 3) dessas CDRs tem uma ou mais dessas mutações (por exemplo, substituições conservadoras) e/ou uma variante de cadeia pesada de imunoglobuli-

na que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que uma ou mais (por exemplo, 1 ou 2 ou 3) dessas CDRs tem uma ou mais des- sas mutações (por exemplo, substituições conservadoras). As substi- tuições podem estar em uma região CDR, estrutural ou constante.

[0098] A invenção também fornece proteínas variantes de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos, que compreendem uma ou mais CDRs variantes (por exemplo, qualquer uma ou mais CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3) aqui estabelecidas com pe- lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou semelhança de se- quência, por exemplo, quanto às CDRs de cadeia pesada e cadeia le- ve da Tabela 1.

[0099] Modalidades da presente invenção também incluem proteí- nas variantes de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpos anti-CoV- S e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que compreendem imunoglobulina Vus e V.1s; ou HCs e LCs, que compreendem uma se- quência de aminoácidos com 70% ou mais (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou mais) de identidade geral da sequência de aminoácidos ou semelhança com as sequências de aminoácidos das correspondentes Vxs, Vis, HCs ou LCs especificamente estabelecidas aqui, mas em que CDR-L1, CDR- L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 dessas imunoglobulinas não são variantes e compreendem a sequência de aminoácidos CDR apresentada na Tabela 1. Assim, em tais modalidades, as CDRs den- tro das proteínas de ligação a antígeno variantes não são, elas pró- prias, variantes.

[00100] Anticorpos anti-CoV-S conservativamente variantes modifi- cados e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos também fazem parte da presente invenção. Uma "variante conservativamente modifi-

cada" ou uma "substituição conservadora" refere-se a uma variante em que há uma ou mais substituições de aminoácidos em um polipeptídeo com outros aminoácidos com características semelhantes (por exem- plo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação de cadeia principal e rigidez, etc.). Tais mudanças po- dem frequentemente ser feitas sem interromper significativamente a atividade biológica do anticorpo ou fragmento. Os versados nesta téc- nica reconhecem que, em geral, substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substanci- almente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4º Ed.)). Além disso, as substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes têm menos probabilidade de interrom- per significativamente a atividade biológica.

[00101] “Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias late- rais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias late- rais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; 3) cadeias laterais que contêm amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, ar- ginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato e 7) cadeias laterais que contêm enxofre: cisteína e metionina. Os grupos preferências de substituição de aminoácidos conservadores são: vali- na-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer alteração que tenha um va- lor positivo na matriz de probabilidade de PAM250 divulgada em Gon- net et al. (1992) Science 256: 1.443 a 1.445.

[00102] Variantes conservadoras de função dos anticorpos anti- CovV-S e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos também fa-

zem parte da presente invenção. Qualquer uma das variantes dos an- ticorpos anti-CoV-S e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (como discutido aqui) podem ser "variantes conservadoras de função". Tais variantes conservadoras de função podem, em alguns casos, também ser caracterizadas como variantes modificadas conservativa- mente. "Variantes conservadoras de função", como aqui utilizadas, re- fere-se a variantes dos anticorpos anti-CoV-S ou fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos nos quais um ou mais resíduos de ami- noácidos foram alterados sem alterar significativamente uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo ou fragmento. Em uma modali- dade da invenção, um anticorpo anti-CoV-S variante conservador de função ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente in- venção compreende uma sequência variante de aminoácidos e exibe uma ou mais das seguintes propriedades funcionais: e Inibe o crescimento de coronavírus (por exemplo, SARS- CovV-2, SARS-CoV e/ou MERS-CoV) em células que expressam ACE2 e/ou TMPRSS?2 (por exemplo, células Calu-3); e Não se liga significativamente a células MDCK/Tet-on que não expressam ACE2 e/ou TMPRSS?2; e Limita a propagação da infecção por coronavírus (por exemplo, por SARS-CoV-2, SARS-CoV e/ou MERS-CoV) de células, por exemplo, Calu-3, in vitro; e/ou e Protege um camundongo geneticamente modificado para expressar a proteína TMPRSS2 e/ou ACE2 humana contra a morte causada por infecção por coronavírus (por exemplo, SARS-CoV-2, SARS-CoV ou MERS-CoV), por exemplo, em que os camundongos são infectados por uma dose do vírus que, de outra forma, seria letal, opcio- nalmente quando combinada com um segundo agente terapêutico.

e Protege um camundongo geneticamente modificado para expressar a proteína TMPRSS2 e/ou ACE2 humana da perda de peso causada por infecção por coronavírus (por exemplo, SARS-CoV-2, SARS-CoV ou MERS-CoV), por exemplo, em que os camundongos estão infectados com uma dose do vírus que de outra forma causaria perda de peso, opcionalmente quando combinada com um segundo agente terapêutico.

[00103] Uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S "neutrali- zante" ou "antagonista", por exemplo, anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno, refere-se a uma molécula que inibe uma atividade da CoV-S em qualquer grau detectável, por exemplo, inibe a capacidade de CoV-S para se ligar a um receptor como ACE2, para ser clivado por uma protease como TMPRSS?2 ou para mediar a entrada viral em uma célula hospedeira ou a reprodução viral em uma célula hospedeira.

[00104] A Tabela 1 refere-se a proteínas de ligação a antígeno, co- mo anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que compreendem a cadeia pesada ou Vr (ou uma variante da mesma) e a cadeia leve ou V. (ou uma variante da mesma), conforme estabelecido abaixo; ou que compreendem um Vrx que compreende as CDRs (CDR- H1 (ou uma variante da mesma), CDR-H2 (ou uma variante da mes- ma) e CDR-H3 (ou uma variante da mesma)) e um V. que compreende as CDRs (CDR-L1 (ou uma variante da mesma), CDR-L2 (ou uma va- riante da mesma) e CDR-L3 (ou uma variante da mesma)), por exem- plo, em que as cadeias de imunoglobulina, regiões variáveis e/ou CDRs compreendem as sequências de aminoácidos específicas des- critas abaixo.

[00105] Os anticorpos aqui descritos também incluem modalidades em que a Vr é fundida com uma IgG4 de tipo selvagem (por exemplo, em que o resíduo 108 é S) ou com variantes de IgG4 (por exemplo, em que o resíduo 108 é P).

[00106] Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno da pre- sente invenção compreendem cadeias de imunoglobulina, incluindo as sequências de aminoácidos aqui estabelecidas, bem como modifica- ções celulares e in vitro pós-tradução para o anticorpo. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a CoV-S que compreende sequências de aminoácidos de cadeia pesada e/ou leve estabelecidas aqui (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3), bem como anticorpos e fragmentos em que um ou mais re- síduos de aminoácidos são glicosilados, um ou mais resíduos de Asn são desamidados, um ou mais resíduos (por exemplo, Met, Trp e/ou His) são oxidados, o Gln terminal N é piroglutamato (piroE) e/ou a Lisi- na terminal C está ausente.

[00107] As sequências de aminoácidos e nucleotídeos de anticor- pos anti-Spike de SARS-CoV-2 exemplares (SARS-CoV-2-S) são mos- tradas na Tabela de Sequências Exemplares, abaixo.

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NEN — ADMINISTRAÇÃO DE ANTICORPOS

[00108] A presente invenção fornece métodos para administrar uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S da presente invenção, por exemplo, as da Tabela 1, que compreendem a introdução da proteína de ligação a antígeno no corpo de um indivíduo (por exemplo, um ser humano). Por exemplo, o método compreende perfurar o corpo do in- divíduo com uma agulha de uma seringa e injetar a proteína de ligação a antígeno no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo.

[00109] A presente invenção fornece um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou de vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) que compreende uma proteína de ligação a antígeno anti- CoV-S da presente invenção, por exemplo, as da Tabela 1.

[00110] A presente invenção também fornece um dispositivo de in- jeção que compreende uma ou mais proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) que se ligam especificamente ao CoV-S, por exemplo, as da Tabela 1, ou uma composição farmacêutica do mesmo. O dispositivo de injeção po- de ser empacotado em um kit. Um dispositivo de injeção é um disposi- tivo que introduz uma substância no corpo de um indivíduo por uma via parenteral, por exemplo, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Por exemplo, um dispositivo de injeção pode ser uma seringa (por exemplo, pré-cheia com a composição farmacêutica, como um autoin- jetor) que, por exemplo, inclui um cilindro ou barril para reter o fluido a ser injetado (por exemplo, que compreende o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo), uma agulha para perfu- rar a pele e/ou vasos sanguíneos para injeção do fluido; e um êmbolo para empurrar o fluido para fora do cilindro e através do orifício da agulha. Em uma modalidade da invenção, um dispositivo de injeção que compreende uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de uma combinação da presente invenção ou uma composição farmacêutica do mesmo, é um dispositivo de injeção intravenosa (IV). Esse disposi- tivo pode incluir a proteína de ligação a antígeno ou uma composição farmacêutica da mesma em uma cânula ou trocarte/agulha que pode ser anexada a um tubo que pode ser anexado a uma bolsa ou reserva- tório para reter fluido (por exemplo, solução salina) introduzido no cor- po do indivíduo através da cânula ou trocarte/agulha.

O anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo pode, em uma modalidade da invenção, ser introduzida no dispositivo uma vez que o trocarte e a cânula são inseridos na veia de um indivíduo e o trocarte é removido da cânula inserida.

O dispositivo intravenoso pode, por exemplo, ser inserido em uma veia periférica (por exemplo, na mão ou no braço); na veia cava superior ou veia cava inferior, ou dentro do átrio direito do coração (por exemplo, um IV central); ou em uma veia subclávia, jugular interna ou femoral e, por exemplo, avançado em di- reção ao coração até atingir a veia cava superior ou o átrio direito (por exemplo, uma linha venosa central). Em uma modalidade da invenção, um dispositivo de injeção é um autoinjetor; um injetor de jato ou uma bomba de infusão externa.

Um injetor de jato usa um jato estreito de alta pressão de líquido que penetra na epiderme para introduzir o anti- corpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo no corpo de um indivíduo.

Bombas de infusão externas são dispositivos médicos que entregam o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo no corpo de um indivíduo em quantidades controladas.

As bombas de infusão externas podem ser alimentadas elétrica ou mecanicamente.

Bombas diferentes operam de maneiras diferentes, por exemplo, uma bomba de seringa retém fluido no reser- vatório de uma seringa e um pistão móvel controla a entrega de fluido,

uma bomba elastomérica retém fluido em um reservatório de balão elástico e pressão das paredes elásticas do balão impulsiona a entre- ga de fluidos. Em uma bomba peristáltica, um conjunto de rolos aperta um tubo flexível, empurrando o fluido para frente. Em uma bomba mul- ticanal, os fluidos podem ser fornecidos a partir de vários reservatórios a várias taxas.

PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANOS

[00111] Os métodos para gerar anticorpos humanos em camun- dongos transgênicos são conhecidos na técnica. Qualquer um dentre tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que se ligam especifica- mente a CoV-S. Um imunogênio que compreende qualquer um dentre os seguintes pode ser usado para gerar anticorpos para CoV-S. Em certas modalidades da invenção, os anticorpos da invenção são obti- dos de camundongos imunizados com um CoV-S nativo de compri- mento total ou com um vírus vivo atenuado ou inativado ou com DNA que codifica a proteína ou fragmento do mesmo. Alternativamente, a proteína de CoV-S ou um fragmento da mesma pode ser produzida com o uso de técnicas bioquímicas padrão e usada como imunogênio. Em uma modalidade da invenção, o imunogênio é uma proteína de CoV-S produzida de forma recombinante ou um fragmento da mesma. Em certas modalidades da invenção, o imunogênio pode ser uma va- cina polipeptídica de CoV-S. Em certas modalidades, uma ou mais in- jeções de reforço podem ser administradas. Em determinadas modali- dades, o imunogênio pode ser um polipeptídeo recombinante de CoV- S expressado em E. coli ou em quaisquer outras células eucarióticas ou de mamífero, como células de ovário de hamster chinês (CHO).

[00112] Como uso da tecnologia VELOCIMMUNEO (consultar, por exemplo, o documento nº U.S. 6.596.541, Regeneron Pharmaceuti- cals, VELOCIMMUNEO) ou qualquer outro método conhecido para ge-

rar anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para CoV-S são inicialmente isolados, tendo uma região variável hu- mana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELO- CIMMUNEO envolve a geração de um camundongo transgênico com um genoma que compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas ligadas de modo operacional aos loci de região constan- te de camundongo de modo que o camundongo produza um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo é isolado e ligado de maneira operacional ao DNA que codifica as regi- ões constantes de cadeia pesada e leve humanas. Em seguida, o DNA é expresso em uma célula com capacidade para expressar o anticorpo totalmente humano.

[00113] De modo geral, um camundongo VELOCIMMUNEOPO é desa- fiado com o antígeno de interesse, e as células linfáticas (como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem celular de mi- eloma para preparar linhagens celulares de hibridoma imortal, e essas linhagens celulares de hibridoma são triadas e selecionadas para iden- tificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos es- pecíficos para o antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da ca- deia leve. Tal proteína de anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos de antígeno específico ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente dos linfócitos específicos de antígeno.

[00114] Inicialmente, são isolados os anticorpos quiméricos de alta afinidade que têm uma região variável humana e uma região constante de camundongos. De acordo com a seção experimental abaixo, os an- ticorpos são caracterizados e selecionados para características dese- jáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo etc. As regiões cons- tantes de camundongos são substituídas por uma região constante humana desejada a fim de gerar o anticorpo totalmente humano da invenção, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificado. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, a ligação a antígeno de alta afinidade e as característi- cas de especificidade de alvo estão situadas na região variável. ANTICORPOS ANTIPROTEÍNA SPIKE DE CORONAVÍRUS QUE IN- CLUEM VARIANTES DE Fc

[00115] De acordo com certas modalidades da presente invenção, proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, são fornecidas, que compreen- dem um domínio Fc que compreende uma ou mais mutações que in- tensificam ou diminuem a ligação de anticorpo ao receptor de FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com o pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CoV-S que com- preendem uma mutação na região Cr2 ou CHx3 do domínio Fc, em que a mutação (ou mutações) aumenta a afinidade do domínio Fc ao FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossomo, em que as faixas de pH são de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações po- dem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administradas a um animal. Exemplos não limitantes de tais modifica- ções de Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exem- plo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, A, W, H, F ou

Y [N434A, N434W, N434H, N434F ou N434Y]); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modifica- ção compreende a modificação de 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação de 428L, 2591| (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação de 433K (por exemplo, H433K) e 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação de 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação de 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação de 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Em ainda outra modalida- de, a modificação compreende uma modificação de 265A (por exem- plo, D265A) e/ou 297A (por exemplo, N297A).

[00116] Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de liga- ção a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, que compreendem um domínio Fc que compreen- de um ou mais pares de grupos de mutação selecionados a partir do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q and M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 4348 (por exemplo, M428L e N434S); 2571l e 3111 (por exem- plo, P2571 e 03111); 2571 e 434H (por exemplo, P2571 e N434H); 376V e 434H (por exemplo, D376V e N434H); 307A, 380A e 434A (por exemplo, T307A, ES80A e N434A); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F).

[00117] Proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que com- preendem uma Vr e/ou V.L como aqui estabelecido que compreendem quaisquer combinações possíveis das mutações do domínio Fc prece- dentes, são contempladas dentro do âmbito da presente invenção.

[00118] A presente invenção também inclui proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que compreendem uma V+ estabelecida no presente documento e uma região constante de cadeia pesada (Cr) quimérica, em que a re- gião CH quimérica compreende segmentos derivados das regiões Cn de mais de um isótipo de imunoglobulina. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem compreender uma região quimérica CH que com- preende parte ou todo o domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou molécula IgG4 humana, combinada com parte ou com todo o domínio Cx3 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou de IgG4 humana. De acordo com cer- tas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem uma região quimérica Cy que contém uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos "de dobradiça superior" (resíduos de aminoácido das posições 216 a 227 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, uma IgG2 humana ou uma IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior" (resí- duos de aminoácidos das posições 228 a 236 de acordo com a numera- ção EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, uma IgG2 humana ou uma IgG4 humana. De acordo com determinadas mo- dalidades, a região da dobradiça quimérica compreende resíduos de aminoácidos derivados de uma dobradiça superior de I9gG1 humana ou de uma dobradiça superior de IgG4 humana e resíduos de aminoácido derivados de uma dobradiça inferior de I9G2 humana. Um anticorpo que compreende uma região quimérica Cn, conforme descrito no presente documento, em determinadas modalidades, pode exibir funções efetoras de Fc sem afetar adversamente as propriedades terapêuticas ou far- macocinéticas do anticorpo. (Ver, por exemplo, WO2014/022540).

IMUNOCONJUGADOS

[00119] A invenção abrange proteínas de ligação a antígeno anti- CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno,

conjugados com outra porção química, por exemplo, uma porção quí- mica terapêutica (um "imunoconjugado"), como um toxoide ou um me- dicamento antiviral para tratar a infecção pelo vírus influenza.

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo ou fragmento anti-CoV-S é con- jugado com qualquer um dos outros agentes terapêuticos aqui apre- sentados.

Conforme usado no presente documento, o termo "imu- noconjugado" se refere a uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, que está ligado química ou biologicamente a um agente radioativo, uma citoci- na, um interferon, uma porção química alvo ou repórter, uma enzima, um peptídeo ou proteína ou um agente terapêutico.

A proteína de liga- ção a antígeno pode estar ligada ao agente radioativo, citocina, interfe- ron, porção química alvo ou repórter, enzima, peptídeo ou agente te- rapêutico em qualquer localização ao longo da molécula desde que possa se ligar ao alvo da mesma (CoV-S). Os exemplos de imunocon- jugados incluem conjugados de fármaco-anticorpo e proteínas de fu- são anticorpo-toxina.

Em uma modalidade da invenção, o agente pode ser um segundo anticorpo diferente que se liga especificamente a CoV-S.

O tipo de porção química terapêutica que pode ser conjugada à proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo ou fragmento) levará em consideração a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado.

Veja, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243 a 256 (Alan R.

Liss, Inc. 1985); Hellstrom et a/l., "Antibod- ies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2º Ed.), Robinson et al. (eds.), p. 623 a 653 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclo- nal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), p. 475 a 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospec-

tive Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et a/. (eds.), p. 303 a 316 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Con- jugates", Immunol. Rev., 62: 119 a 158 (1982).

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[00120] A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antíge- no dos mesmos, bem como métodos de uso dos mesmos e métodos para produzir essas proteínas de ligação a antígeno. O termo proteí- nas de ligação a antígeno "anti-CoV-S", por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, inclui moléculas multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas ou biparatópicas) que incluem pelo menos um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente a CoV-S (por exemplo, um domínio de ligação a antígeno de um anti- corpo da Tabela 1) e pelo menos um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga a um antígeno diferente ou a um epítopo no CoV- S que é diferente daquele do primeiro domínio de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno são ambos selecionados a partir dos domínios de ligação a antígeno da Tabela 1. Em uma moda- lidade da invenção, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem. Em outra modalidade da invenção, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, um anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG biespecífico (por exemplo, IgG1 ou IgG4) que inclui um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente ao CoV-S, incluindo a cadeia pe- sada e leve de imunoglobulina de um anticorpo da Tabela 1 e um se- gundo domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente a um epítopo diferente de CoV-S. Em algumas modalidades, um anticorpo

IgG biespecífico (por exemplo, IgG1 ou IgG4) inclui um primeiro domí- nio de ligação a antígeno que se liga especificamente ao CoV-S e um segundo domínio de ligação que se liga a uma proteína da célula hos- pedeira, por exemplo, ACE2 ou TMPRSS?2.

[00121] Os anticorpos da Tabela 1 incluem moléculas multiespecífi- cas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos, que incluem CDR-Hs e CDR-Ls, Vx e V. ou HC e LC desses anticor- pos, respectivamente (incluindo variantes dos mesmos, conforme defi- nido adiante).

[00122] Em uma modalidade da invenção, um domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente ao CoV-S, que pode ser incluído em uma molécula multiespecífica, compreende: (1) uma sequência de domínio variável da cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 estabelecidas na Tabela 1 e (ii) uma sequência de domínio variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 estabelecidas na Tabela 1; ou (2) (i) uma sequência de domínio variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Ta- bela 1,e (ii) uma sequência de domínio variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1; ou (3) (i) uma sequência de imunoglobulina da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela le (ii) uma sequência de imunoglobulina de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela

1.

[00123] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento multiespecífico inclui mais de duas especificidades de ligação diferen- tes (por exemplo, uma molécula triespecífica), por exemplo, um ou mais domínios adicionais de ligação a antígeno que são iguais ou dife- rentes do primeiro e/ou segundo domínio de ligação a antígeno.

[00124] Em uma modalidade da invenção, um fragmento de ligação a antígeno biespecífico compreende um primeiro scFv (por exemplo, que compreende as sequências Vu e V. da Tabela 1) tendo especifici- dade de ligação para um primeiro epítopo (por exemplo, CoV-S) e um segundo scFv tendo especificidade de ligação para um segundo epíto- po diferente. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o primei- ro e o segundo scFv são amarrados a um ligante, por exemplo, um ligante peptídico (por exemplo, um ligante GS como (GGGGS)r (SEQ ID NO: 834) em que n é, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Outros fragmentos de ligação a antígeno biespecíficos incluem um F(ab)> de um anticorpo IgG biespecífico que compreende as CDRs das cadeias pesada e leve da Tabela 1 e de outro anticorpo que se liga a um epítopo diferente.

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[00125] A presente invenção fornece métodos para o tratamento ou prevenção de infecção viral (por exemplo, infecção por coronavírus) através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno (por exemplo, da Tabela 1) a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) que precise de tal tratamento ou prevenção.

[00126] A infecção por coronavírus pode ser tratada ou evitada, em um indivíduo, através da administração de uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S da presente invenção a um indivíduo.

[00127] Uma dose eficaz ou terapeuticamente eficaz de proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno (por exemplo, da Tabela 1), para tratamento ou prevenção de uma infecção viral refere-se à quantidade de anticorpo ou fragmento suficiente para aliviar um ou mais sinais e/ou sintomas da infecção no indivíduo tratado, induzindo a regressão ou eliminação de tais sinais e/ou sintomas ou inibindo a progressão de tais sinais e/ou sintomas. A dose pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo ao qual a mesma será administrada, da doença-alvo, das condições, da via de administração e semelhantes. Em uma mo- dalidade da invenção, uma dose eficaz ou terapeuticamente eficaz de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção, para tratamento ou prevenção de infecção viral, por exemplo, em um indivíduo humano adulto, é de cerca de 0,01 a cerca de 200 mg/kg, por exemplo, até cerca de 150 mg/kg. Em uma modalidade da inven- ção, a dosagem é de até 10,8 ou 11 gramas (por exemplo, cerca de 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 ou 11 gramas). Dependendo da gravidade da infecção, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajusta- das. Em certas modalidades, a proteína de ligação a antígeno da pre- sente invenção pode ser administrada em uma dose inicial, seguida por uma ou mais doses secundárias. Em determinadas modalidades, a dose inicial pode ser seguida da administração de uma segunda ou uma pluralidade de doses subsequentes de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo em uma quantidade que pode ser apro- ximadamente a mesma ou inferior àquela da dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias; pe- lo menos uma semana, pelo menos 2 semanas; pelo menos 3 sema-

nas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 semanas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas; ou pe- lo menos 14 semanas.

[00128] Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" refere-se a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, gato, cachorro, vaca, por- co, ovelha, cavalo, cabra, coelho), preferencialmente um ser humano, por exemplo, com necessidade de prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio, como infecção viral ou câncer. O indivíduo pode ter uma infecção viral, por exemplo, uma infecção por influenza, ou estar predisposto a desenvolver uma infecção. Os indivíduos predis- postos a desenvolver uma infecção ou indivíduos que podem estar em risco elevado de contrair uma infecção (por exemplo, de coronavírus ou vírus da influenza) incluem indivíduos com sistema imunológico comprometido por causa de doença autoimune, indivíduos que rece- bem terapia imunossupressora (por exemplo, após transplante de ór- gão), indivíduos afetados pela síndrome da imunodeficiência humana (HIV) ou síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), indivíduos com formas de anemia que empobrecem ou destroem os glóbulos brancos, indivíduos que recebem radiação ou quimioterapia ou indiví- duos afetados por um distúrbio inflamatório. Além disso, indivíduos muito jovens (por exemplo, 5 anos de idade ou menos) ou idosos (por exemplo, 65 anos de idade ou mais) correm maior risco. Além disso, um indivíduo pode estar em risco de contrair uma infecção viral devido à proximidade de um surto da doença, por exemplo, o indivíduo reside em uma cidade densamente povoada ou nas proximidades de indiví- duos com infecções confirmadas ou suspeitas de um vírus ou escolha de emprego, por exemplo, trabalhador de hospital, pesquisador farma- cêutico, viajante da área infectada ou passageiro frequente.

[00129] "Tratar" ou "que trata" significa administrar uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), a um indivíduo com um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou infecção, por exemplo, infecção viral, para a qual a proteína de |li- gação a antígeno é eficaz quando administrada ao indivíduo em uma quantidade ou dose eficaz ou terapeuticamente eficaz (como discutido aqui).

[00130] A presente invenção também abrange a administração pro- filática de uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exem- plo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da pre- sente invenção (por exemplo, da Tabela 1), a um indivíduo em risco de infecção viral, de modo para prevenir essa infecção. A imunoprofilaxia passiva baseada em anticorpos provou ser uma estratégia eficaz para a prevenção de infecções virais de indivíduos. Veja, por exemplo, Ber- ry et al., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influ- enza Res Treat. 2014; 2014:267.594. Epub 22 de setembro de 2014; e Jiangiang et al., Passive immune neutralization strategies for preven- tion and control of influenza A infections, Immunotherapy. Fevereiro de 2012; 4 (2): 175 a 186; Prabhu et al. Antivir Ther. 2009; 14 (7): 911 a 921, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclional antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal HSN1 influenza. "Prevenir" ou "impedir" significa administrar uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), a um in- divíduo para inibir a manifestação de uma doença ou infecção (por exemplo, infecção viral) no corpo de um indivíduo, para o qual a prote- ína de ligação a antígeno é eficaz quando administrada ao indivíduo em uma quantidade ou dose eficaz ou terapeuticamente eficaz (como discutido aqui).

[00131] Em uma modalidade da invenção, um sinal ou sintoma de uma infecção viral em um indivíduo é a sobrevivência ou proliferação de vírus no corpo do indivíduo, por exemplo, conforme determinado pelo teste de título viral (por exemplo, propagação de coronavírus em ovos de galinha embrionados ou teste de proteína spike de coronaví- rus). Outros sinais e sintomas de infecção viral são discutidos no pre- sente documento.

[00132] “Como observado acima, em algumas modalidades, o indi- víduo pode ser um animal não humano, e as proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno) discutidas aqui podem ser usadas em um contexto veterinário para tratar e/ou prevenir doenças nos animais não humanos (por exemplo, gatos, cães, porcos, vacas, cavalos, cabras, coelhos, ovelhas e simila- res).

[00133] A presente invenção fornece um método para tratar ou pre- venir a infecção viral (por exemplo, infecção por coronavírus) ou para induzir a regressão ou eliminação ou inibir a progressão de pelo me- nos um sinal ou sintoma de infecção viral, como: e febre ou sensação de febre/calafrios; e tosse; e dor de garganta; e Coriza ou nariz entupido; e espirros; e dores musculares ou corporais; e dores de cabeça; + fadiga (cansaço); e vômito; e diarreia; e infecção do trato respiratório; e desconforto no peito; e falta de ar;

e bronquite; e/ou * pneumoriia, cujo sinal ou sintoma é secundário à infecção viral, em um indivíduo com necessidade (por exemplo, um ser humano), adminis- trando uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, da Tabela 1) ao indivíduo, por exemplo, por injeção da proteína no corpo do indivíduo.

COMBINAÇÕES E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00134] Para preparar composições farmacêuticas das proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, da Tabela 1), a pro- teína de ligação a antígeno é misturada com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Ver, por exemplo, Remington's Pharma- ceutical Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, de Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Sci- ence and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et a/. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et a/. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Dis- perse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Ex- cipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica é estéril. Tais composições fazem parte da presente invenção.

[00135] O escopo da presente invenção inclui composições desse- cadas, por exemplo, liofiizadas, que compreendem proteínas de liga- ção a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, da Tabela 1), ou uma composição farmacêutica do mesmo que inclui um veículo farmaceuti- camente aceitável, mas carece substancialmente de água.

[00136] Em uma modalidade adicional da invenção, um agente te- rapêutico adicional que é administrado a um indivíduo em associação com uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, da Tabela 1), divulgado aqui é administrado ao indivíduo de acordo com o Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57º edição (1 de novembro de 2002)).

[00137] O modo de administração pode variar. As vias de adminis- tração incluem oral, retal, transmucosal, intestinal, parentérica; intra- muscular, subcutânea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraven- tricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, ina- lação, insuflação, tópica, cutânea, transdérmica ou intra-arterial.

[00138] Apresente invenção fornece métodos para administrar uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, da Tabela 1), compreendendo a introdução da proteína no corpo de um indivíduo. Por exemplo, o método compreende perfurar o corpo do indivíduo com uma agulha de uma seringa e injetar a proteína de ligação a antígeno no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo.

[00139] A presente invenção fornece um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou de vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) que compreende qualquer uma das proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos (por exemplo, da Tabela 1), polipeptídeos (por exemplo, um HC, LC, Vx ou V. da Tabela 1) ou polinucleotídeos (por exemplo, da Tabela 2) ou vetores estabelecidos aqui ou uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceutica- mente aceitável.

[00140] Em uma modalidade da presente descrição, uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmen- to de ligação a antígeno da presente invenção (por exemplo, da Tabe- la 1), é administrada em associação com um ou mais agentes terapêu- ticos adicionais. Um outro agente terapêutico inclui, mas não está limi- tado a: um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico, um se- gundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TMPRSS2 e um segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CoV-S. Em algumas modalidades, um agente antimalárico é cloroqui- na ou hidroxicloroquina. Em algumas modalidades, um agente anti- inflamatório é um anticorpo como sarilumabe, tocilizumabe ou gimsi- lumabe. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno aqui divul- gado, por exemplo, da Tabela 1. Em certas modalidades, um, dois, três, quatro ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da Tabela 1 podem ser administrados em combinação (por exemplo, de maneira simultânea ou sequencial). Combinações particulares de anticorpos da Tabela 1 estão listadas na Tabela de combinações de anticorpos exemplares abaixo (cada número repre- senta uma combinação específica, por exemplo, mAb10989 e mAb10987 são a Combinação 1, MAb10989 e mAb10934 são a Com- binação 2 e assim por diante). Em algumas modalidades, uma combi- nação de anticorpos pode ser selecionada dentre aqueles que se |i- gam a diferentes grupos de epítopos. Por exemplo, certos anticorpos aqui descritos pertencem a grupos de epítopos como se segue: Grupo 1, mAb10987, mAb10922, mAb10936 e mAb10934; Grupo 2, mAb10989, mAb10977 e mAb10933; Grupo 3, mMAb10920; Grupo 4,

mMAb10954, mAb10986 e mAb10964; e Grupo 5, mMAb10984. Assim, uma combinação de dois anticorpos pode ser selecionada de, por exemplo, Grupo 1 e Grupo 2, Grupo 1 e Grupo 3, Grupo 1 e Grupo 4, Grupo 1 e Grupo 5, Grupo 2 e Grupo 3, Grupo 2 e Grupo 4, Grupo 2 e Grupo 5, Grupo 3 e Grupo 4, Grupo 3 e Grupo 5 e Grupo 4 e Grupo 5. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga especificamente ao TMPRSS?2 é o H1H7017N, conforme descrito na Publicação de Pa- tente Internacional n.º WO/2019/147831.

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[00141] Em algumas modalidades, proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmen- tos de ligação a antígeno dos mesmos) de diferentes doadores huma- nos podem ser combinadas.

A presente invenção inclui uma composi- ção que compreende dois (ou mais) anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação a antígeno que compreende domínios variáveis de indivíduos humanos, em que os dois (ou mais) anticorpos ou fragmen- tos de ligação a antígeno são derivados de indivíduos diferentes (por exemplo, dois indivíduos humanos diferentes). As regiões variáveis de anticorpo derivadas de células B humanas são discutidas, por exemplo, nos Exemplos 1 e 2 (Tabela 3), que descreve que domínios variáveis clonados dessas células B são combinados com uma região constante que não é dessas células B para produzir anticorpos híbridos.

A fonte (doadora) dessas regiões variáveis de anticorpo é mostrada na Tabela de Regiões Variáveis de Anticorpo Derivado de Homem Exemplares, abaixo.

Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 1 e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com domínios variáveis deri- vados do doador 2. Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 1 e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com domí- nios variáveis derivados do doador 3. Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com domínios variáveis deri- vados do doador 2 e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 3. Em algumas mo- dalidades, uma composição pode compreender uma combinação de mAb10987 (por exemplo, um anticorpo que compreende as CDRs, as regiões variáveis ou as sequências de cadeia pesada e leve mostra- das na Tabela 1) do doador 1 e mAb10989 (por exemplo, um anticorpo que compreende o CDRs, as regiões variáveis ou as sequências de cadeia pesada e leve mostradas na Tabela 1) do Doador 3.

TABELA DE REGIÕES VARIÁVEIS DE ANTICORPO DERIVADAS DE

HUMANO EXEMPLARES mAb Doador mAb10954 Doador 3 mAb10955 Doador 3 mAb10956 Doador 3 mAb10957 Doador 3 mAb10964 Doador 1 mAb10965 Doador 2 mAb10966 Doador 3 mAb10967 Doador 3 mAb10970 Doador 1 mAb10971 Doador 1 mMAb10977 Doador 1 mAb10984 Doador 1 mAb10985 Doador 1 mAb10986 Doador 1 mAb10987 Doador 1 mAb10988 Doador 3 mAb10989 Doador 3 mAb10969 Doador 1

[00142] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um fármaco antiviral e/ou uma vacina. Como usado no presente do- cumento, o termo "fármaco antiviral" refere-se a qualquer fármaco ou terapia anti-infeccioso usado para tratar, prevenir ou melhorar uma in- fecção viral em um indivíduo. O termo "fármaco antiviral" inclui, mas não se limita a, um esteroide catiônico antimicrobiano, leupeptina, aprotinina, ribavirina ou interferon alfa2b. Os métodos para tratar ou prevenir a in- fecção por vírus (por exemplo, coronavírus) em um indivíduo em neces- sidade do dito tratamento ou prevenção, administrando um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da Tabela 1 em associação com um agente terapêutico adicional, fazem parte da presente invenção.

[00143] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional é uma vacina, por exemplo, uma vacina de coro- navírus. Em uma modalidade da invenção, uma vacina é uma vacina de vírus inativado/morto, uma vacina de vírus vivo atenuado ou uma vacina de subunidade de vírus.

[00144] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional é:

Q o O FAS NH sa. 9 Hs RN, * CH;SO,3H (mesilato de camostato); Nona LI NH> a IIS o NH * 20CH3SO3H (mesilato de nafamostato); Br Á J nHS" Br *HCIl (cloridrato de bromexina (BHH));

H2N SOzF cloridrato de fluoreto de (4-(2-aminometil)benzenossulfonila (AEBSF)); cl n º

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HO O N N O o HAS 5 HN de AS v NH AN nO o | (poliamida). Veja Shen et al. Biochimie 142: 1 a 10 (2017).

[00145] Em uma modalidade da invenção, o fármaco antiviral é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especifica- mente ao coronavírus, por exemplo, SARS-CoV-2, SARS-CoV ou MERS-CoV. Anticorpos anti-CoV-S exemplares incluem, mas não es- tão limitados a: H4sH15188P; H1H15188P; H1H15211P; H1H15177P;

H4sH15211P; H1IH15260P2; H1H15259P2; H1H15203P; H4sH 15260P2; H4sH15231P2; H1H15237P2; H1H15208P; H1H15228P2; H1H15233P2; H1IH15264P2; H1H15231P2; H1IH15253P2; H1IH 15215P; e H1H15249P2, conforme estabelecido na publicação do pe- dido de patente internacional n.º WO/2015/179535, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, por exemplo, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma imunoglobulina de cadeia leve que inclui CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (por exemplo, a V. ou sua cadeia leve); e uma cadeia pesada que inclui CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (por exemplo, a Vx ou sua cadeia pesada) de qualquer um dos anticorpos anti-CoV-S anteriores.

[00146] Em uma certa modalidade da invenção, o agente terapêuti- co adicional não é aprotinina, leupeptina, um antimicrobiano esteroide catiônico, uma vacina contra influenza (por exemplo, vacina de vírus inteiro morto, vivo, atenuado ou subunidade) ou um anticorpo contra vírus de influenza (por exemplo, um anticorpo anti-hemaglutinina).

[00147] O termo "em associação com" indica que os componentes, uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente inven- ção, juntamente com outro agente, podem ser formulados em uma única composição, por exemplo, para entrega simultânea, ou formula- dos separadamente em duas ou mais composições (por exemplo, um kit). Cada componente pode ser administrado a um indivíduo em um momento diferente do que quando o outro componente é administrado; por exemplo, cada administração pode ser administrada não simulta- neamente (por exemplo, separadamente ou sequencialmente) em in- tervalos durante um determinado período de tempo. Além disso, os componentes separados podem ser administrados a um indivíduo por uma via igual ou diferente (por exemplo, em que um anticorpo anti- CoV-S ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo).

KITS

[00148] Além disso, são fornecidos kits que compreendem um ou mais componentes que incluem, mas não estão limitados a, uma pro- teína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, conforme discutido aqui (por exem- plo, da Tabela 1), em associação com um ou mais componentes adici- onais, incluindo, mas não limitados a, um agente terapêutico adicional, como discutido aqui. A proteína de ligação a antígeno e/ou o agente terapêutico adicional podem ser formulados como uma composição única ou separadamente em duas ou mais composições, por exemplo, com um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma composição farmacêutica.

[00149] Em uma modalidade da invenção, o kit inclui uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo da invenção (por exemplo, da Tabela 1) ou uma composição farmacêutica em um contentor (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico) e outro agente te- rapêutico em outro contentor (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico).

[00150] Em outra modalidade, o Kit compreende uma combinação da invenção, incluindo uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção (por exemplo, da Tabela 1), ou composição farmacêutica da mesma em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adi- cionais formulados juntos, opcionalmente, em uma composição farma- cêutica, em um único contentor comum.

[00151] Seo kitincluiruma composição farmacêutica para adminis- tração parentérica a um indivíduo, o kit poderá incluir um dispositivo (por exemplo, um dispositivo de injeção) para realizar tal administra- ção. Por exemplo, o kit pode incluir uma ou mais agulhas hipodérmicas ou outros dispositivos de injeção, conforme discutido acima, que con- têm a proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente in- venção (por exemplo, da Tabela 1).

[00152] O kit pode incluir uma bula que inclui informações sobre as composições farmacêuticas e formas de dosagem no kit. Geralmente, essas informações ajudam pacientes e médicos a usar as composições farmacêuticas e formas de dosagem incluídas de maneira eficaz e segu- ra. Por exemplo, as seguintes informações sobre uma combinação da invenção podem ser fornecidas no folheto informativo: farmacocinética, farmacodinâmica, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, avisos, precauções, reações adversas, su- perdosagem, dosagem e administração adequadas, como fornecidas, condições adequadas de armazenamento, referências, informações sobre o fabricante/distribuidor e informações sobre patentes.

USOS DE DIAGNÓSTICO DOS ANTICORPOS

[00153] As proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S, por exem- plo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), podem ser usadas para detectar e/ou medir CoV-S em uma amostra. Ensaios exemplares para CoV-S podem incluir, por exemplo, contatar uma amostra com uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S da invenção, em que a pro- teína de ligação a antígeno anti-CoV-S é marcada com uma molécula de marcador ou repórter detectável ou usada como um ligante de cap- tura para isolar seletivamente CoV-S de amostras. A presença de uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S complexada com Cov-S indica a presença de CoV-S na amostra. Alternativamente, um anticor- po anti-CoV-S não marcado pode ser usado em combinação com um anticorpo secundário que é, em si, identificado de modo detectável. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo,

tal como ?H, 1ºC, 3?P, ?ºS ou 11; uma unidade fluorescente ou quimio- luminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, B-galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase. Os ensaios exemplificativos específicos que podem ser usados para detectar ou medir CoV-S em uma amostra in- cluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimuno- ensaio (RIA) e separação celular ativada por fluorescência (FACS). Assim, a presente invenção inclui um método para detectar a presença de polipeptídeo de proteína spike em uma amostra que compreende o contato da amostra com uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV- S e a detecção da presença de uma proteína de ligação a antígeno CovV-S/anti-CoV-S em que a presença do complexo indica a presença de CoV-S.

[00154] Uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S da inven- ção (por exemplo, da Tabela 1) pode ser usada em um procedimento de Western blot ou blot de imunoproteína para detectar a presença de CoV-S ou um fragmento do mesmo em uma amostra. Tal procedimen- to faz parte da presente invenção e inclui as etapas de, por exemplo: (1) fornecer uma membrana ou outro substrato sólido que compreende uma amostra a ser testada para a presença de CoV-S, por exemplo, incluindo opcionalmente a etapa de transferir proteínas de uma amostra a ser testada para a presença de CoV-S (por exem- plo, de uma PAGE ou Separação eletroforética das proteínas na amostra por SDS-PAGE) em uma membrana ou outro substrato sólido usando um método conhecido na técnica (por exemplo, blotting semis- seco ou blotting de tanque); e contatar a membrana ou outro substrato sólido a ser testado quanto à presença de CoV-S ou um fragmento do mesmo com uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S da inven- ção.

[00155] Essa membrana pode assumir a forma, por exemplo, de uma membrana à base de nitrocelulose ou vinila (por exemplo, fluoreto de polivinilideno (PVDF)) na qual as proteínas a serem testadas quan- to à presença de CoV-S em uma PAGE (eletroforese em gel de polia- crilamida) não desnaturante ou gel SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio) foram transferidos (por exemplo, após separação eletroforética no gel). Antes contatar a membrana com a proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S, a mem- brana é opcionalmente bloqueada, por exemplo, com leite seco sem gordura ou semelhante, de modo a ligar locais de ligação a proteínas não específicos na membrana.

(2) lavar a membrana uma ou mais vezes para remover a proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S não ligada e outras subs- tâncias não ligadas; e (3) detectar a proteína de ligação a antígeno anti-CoV-S ligada.

[00156] A detecção da proteína de ligação a antígeno ligada indica que a proteína de CoV-S está presente na membrana ou substrato e na amostra. A detecção da proteína de ligação a antígeno ligada pode ser ligando a proteína de ligação a antígeno com um anticorpo secun- dário (um anticorpo anti-imunoglobulina) que é marcado de forma de- tectável e, em seguida, detectando a presença do marcador de anti- corpo secundário.

[00157] As proteínas de ligação a antígeno anti-CoV-S (por exem- plo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, da Tabela 1)) aqui divulgadas também podem ser usadas para imuno- histoquímica. Esse método faz parte da presente invenção e compre- ende, por exemplo, (1) contatar o tecido a ser testado quanto à presença de proteína de CoV-S com uma proteína de ligação a antígeno anti-CoV- S da invenção; e

(2) detectar a proteína de ligação a antígeno no ou dentro do tecido.

[00158] Sea própria proteína de ligação a antígeno for detectável, ela poderá ser detectada diretamente. Alternativamente, a proteína de ligação a antígeno pode ser ligada por um anticorpo secundário mar- cado de forma detectável, em que o marcador é então detectado.

EXEMPLOS

[00159] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a forne- cer àqueles versados na técnica uma descrição e descrição completas de como produzir e usar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores conside- ram sua invenção. Foram realizados esforços para assegurar a preci- são em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, tem- peratura, etc.), porém, alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo quanto indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a tempe- ratura está em graus Centígrados, a temperatura ambiente é de cerca de 25 ºC, e a pressão é a pressão atmosférica ou próxima da mesma. EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANOS PARA PRO- TEÍNA SPIKE DE SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S)

[00160] — Anticorpos humanos para a proteína Spike de SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) foram gerados em um camundongo VELOCIMMU- NE? compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia pesada e capa de imunoglobulina humana ou regiões variáveis de ca- deia leve pesada e lambda de imunoglobulina humana. Cada camun- dongo foi imunizado com um vetor que expressa o domínio de ligação de receptor SARS-CoV-2-S (RBD) (aminoácidos 1 a 1.273 do número de acesso NCBI (MN908947.3), SEQ ID NO: 832), seguido por um re- forço com um vetor de SARS-CoV-2-S ou uma proteína de SARS- CoV-2-S. A resposta imunológica de anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico de SARS-CoV-2-S. Quando uma resposta imune desejada foi alcançada, os linfócitos foram colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongos para preservar a sua viabili- dade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celula- res de hibridoma foram triadas e selecionadas para identificar linha- gens celulares que produzem anticorpos específicos de CSARS-CoV- 2-S. Os anticorpos anti-SARS-CoV-2-S também foram isolados dire- tamente de células B positivas para antígeno sem fusão às células de mieloma, conforme descrito na Patente nº U.S. 7582298, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Utili- zando este método, foram obtidos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S to- talmente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos).

[00161] Regiões variáveis de anticorpos também foram isoladas de amostras de sangue humano. O sangue total foi recebido dos pacien- tes 3 a 4 semanas após um teste positivo de PCR confirmado em labo- ratório para SARS-CoV-2 e doença sintomática COVID-19. Os glóbu- los vermelhos foram lisados usando um tampão de lise à base de clo- reto de amônio (Life Technologies) e as células B foram enriquecidas por seleção negativa. As células B únicas que ligam a proteína spike do SARS-CoV-2 foram isoladas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS). As células B isoladas foram plaqueadas em um único poço e misturadas com os iniciadores de PCR específicos para região variável leve e pesada de anticorpos. Os cDNAs para cada cé- lula B única foram sintetizados por meio de uma reação de transcrip- tase reversa (RT). Cada produto de RT resultante foi então dividido e transferido para dois poços correspondentes para subsequentes PCRs de cadeia pesada e leve de anticorpo. Um conjunto dos produtos de RT resultantes foi primeiro amplificado por PCR usando um iniciador degenerado 5 'específico para a sequência líder da região variável pe-

sada de anticorpo ou um iniciador degenerado 5' específico para a se- quência líder da região variável da cadeia leve do anticorpo e um inici- ador 3 'específico para a região constante do anticorpo, para formar um amplicon. Os amplicons foram então amplificados novamente por PCR usando um iniciador degenerado 5' específico para a estrutura 1 da região variável pesada de anticorpo ou um iniciador degenerado 5' específico para a estrutura 1 da região variável da cadeia leve do anti- corpo e um iniciador 3' específico para a região constante do anticor- po, para gerar amplicons para clonagem. Os produtos de PCR deriva- dos de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo foram clonados em vetores de expressão contendo região constante pesada e região constante leve, respectivamente, produzindo vetores de expressão pa- ra anticorpos híbridos. Os vetores de expressão que expressam pares de cadeia pesada e leve de comprimento total foram transfectados em células CHO para produzir proteínas de anticorpo para teste.

[00162] As propriedades biológicas dos anticorpos exemplificativos gerados em conformidade com os métodos desse Exemplo são descri- tas detalhadamente nos Exemplos apresentados abaixo. EXEMPLO 2: SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS E DE AMINOÁCI-

DOS DE REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA E LEVE

[00163] A Tabela 1 apresenta os identificadores da sequência de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e leve e CDRs, bem como as sequências da cadeia pesada e cadeia leve de exem- plos de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S. Os identificadores de sequên- cia de ácido nucleico correspondentes são apresentados na Tabela 2.

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[00164] Os anticorpos aqui divulgados têm regiões variáveis total- mente humanas, mas podem ter regiões constantes de camundongo (por exemplo, um IgG1 Fc de camundongo ou um IgG2 Fc de camun- dongo (isotipo a ou b)) ou regiões constantes humanas (por exemplo, um IgG1 Fc humano ou um IgG4 Fc humano). Conforme será obser- vado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo que tem um isótipo de Fc particular pode ser convertido em um anti- corpo com um isótipo de Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um IgG1 Fc de camundongo pode ser convertido em um anticorpo com IgG4 humano, etc.) porém, de todo modo, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - que são indicados pelo identificadores numéri- cos mostrados nas Tabelas 1 e 2 - permanecerão os mesmos, e espe- ra-se que as propriedades de ligação a antígeno sejam idênticas ou substancialmente semelhantes independente da natureza do domínio constante.

[00165] As regiões variáveis dos anticorpos derivados de camun- dongos VELOCIMMUNEO e de amostras humanas foram sequencia- das por Sequenciamento de Próxima Geração e o repertório para pa- res de cadeias pesadas e leves foi identificado (Figura 10A e Figura 10B). A linhagem predominante de anticorpos VI utilizou VH3-53 em- parelhado com VK1-9, VK1-33 ou VK1-39, enquanto os anticorpos de- rivados de humanos utilizaram VH3-66 emparelhado com VK1-33 ou VH2-70 emparelhado com VK1-39. Análises adicionais de sequências sobrepostas mostraram forte sobreposição no repertório de cadeias capa isoladas entre anticorpos derivados de humanos e VI. Embora o repertório de cadeias Lambda não tenha se sobreposto bem, isso po- de ser devido à inclusão de apenas dois camundongos lambda neste estudo. O comprimento médio de CDR para a cadeia pesada foi seme- lhante entre os anticorpos derivados de VI e humanos, com um com- primento médio de 13 e 14,5 aminoácidos, respectivamente. O com-

primento capa médio da CDR foi o mesmo para os anticorpos deriva- dos de VI e humanos com 9 aminoácidos e foi próximo para as cadei- as lambda com um comprimento médio de 11,1 e 10,6 aminoácidos, respectivamente. A disponibilidade de e anticorpos derivados humanos e de camundongo humanizados permitiu uma maior diversidade de genes V e permitiu a identificação posterior de anticorpos não concor- rentes.

[00166] Como descrito acima, os anticorpos foram obtidos a partir de hibridomas gerados a partir de camundongos VELOCIMMUNEGO, por isolamento direto de células B de camundongo VELOCIMMUNEGO positivas para antígeno, ou derivadas de regiões variáveis clonadas a partir de células B humanas positivas para antígeno. Um resumo des- sas fontes é mostrado na Tabela 3. TABELA 3: FONTES DE ANTICORPOS/REGIÕES VARIÁVEIS anfeero er aro Tae aro Tine oo fe EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO DE SOBRENADANTES DE HlI-

BRIDOMA POR LIGAÇÃO DE ELISA

[00167] Foirealizado um ensaio de ligação de ELISA para identifi- car sobrenadantes de anticorpos que se ligavam ao domínio de liga- ção de receptor de proteína Spike de SARS-CoV-2 (RBD). Uma prote- íÍna composta pelo RBD do SARS-CoV-2 (aminoácidos 319-541) ex- pressa com um marcador de histidina 6X e dois marcadores de epíto- po myc no terminal C (SARS-CoV-2-S-RBD-mmH; veja também O

Número de Acesso NCBI MN908947.3) foi revestida a 1 ug/ml em uma placa de 96 poços em tampão PBS durante a noite a 4 ºC. Os sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados com o uso de uma solução a 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Os sobrenadantes de anticorpo ou o meio isolado foram diluídos 1:40 ou 1:50 no tampão de bloqueio PSA + 0,5% de BSA e transferidos para as placas de mi- crotitulação lavadas. Após uma hora de incubação à temperatura am- biente, os poços foram lavados e o sobrenadante ligado à placa foi de- tectado com anticorpo IgG de cabra anti-humano conjugado com pero- xidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson Immunoresearch) ou anti- corpo IgG anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano sil- vestre (HRP) (pesquisa imunológica de Jackson). As placas foram en- tão desenvolvidas usando solução de substrato TMB (BD Biosciences) de acordo com a recomendação do fabricante e a absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de placas Victor X5.

[00168] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S de se li- gar ao domínio de ligação de receptor de SARS-CoV-2-S (SARS-CoV- 2-S-RBD) foi avaliada, conforme descrito acima, usando um ELISA de ligação com a proteína SARS-CoV-2-S-RBD-mmH revestida em uma microplaca. O sobrenadante do anticorpo de ponto único que se liga ao SARS-CoV-2-S-RBD-mmH revestido em placas de microtitulação de 96 poços foi detectado com um anticorpo anti-hFc ou anti-mFc con- jugado com HRP.

[00169] Os resultados de ligação de três ensaios estão resumidos na Tabela 4. Os sinais de ligação ao SARS-CoV-2 (absorbância de 450 nm) são indicados, com fundo somente de meio fornecido como referência negativa por cada experimento. Uma amostra marcada co- mo IC (Inconclusiva) apresentou uma anomalia experimental na placa e, portanto, é relatada sem um valor. Como mostrado em comparação com o controle apenas do meio, os sobrenadantes testados mostraram ligação substancial ao SARS-CoV-2-S-RBD.

TABELA 4: LIGAÇÃO DO SOBRENADANTE AO DOMÍNIO DE LIGA- ÇÃO DE RECEPTOR DA PROTEÍNA SPIKE DE SARS-COV-2 Diluição — de | Anticorpo Sinal de ligação (absorbân-

Diluição — de | Anticorpo Sinal de ligação (absorbân- EXEMPLO 4: LIGAÇÃO DE ANTICORPO A PARTÍCULA SEME- LHANTE A VÍRUS QUE EXPRESSA SARS-COV-2-S

[00170] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S de se ligar à glicoproteína spike de SARS-CoV-2, um ensaio de ligação in vitro utilizando partículas do tipo viral que expressam proteínas spike de SARS-CoV-2 (VLPs) em uma plataforma de detecção baseada em eletroquimiluminescência (MSD) foi desenvolvida.

[00171] Para expressar transitoriamente a proteína spike de SARS- CoV-2 (número de acesso NCBI MN908947.3, aminoácidos 16 a

1.211; SEQ ID NO: 833), o vírus da estomatite vesicular (VSV) sem glicoproteína G (VSV delta G) foi pseudotipado com proteína spike de SARS-CoV-2 (VSV-SARS-CoV-2-S) e gerado nas células HEK293T. Como controle de ligação negativo, o VSV delta G foi pseudotipado com a proteína VSV G (VSV-G).

[00172] Os experimentos foram realizados de acordo com o proce- dimento a seguir. Os dois tipos de VLPs descritos acima foram diluídos em PBS, semeados em placas de eletrodo de carbono de 96 poços (placa de alta ligação MULTI-CARRAY, MSD) e incubadas durante a noite a 4 ºC para permitir que as VLPs aderissem. Os sítios de ligação não específicos foram bloqueados por BSA a 2% (p/v) em PBS duran- te 1 hora à temperatura ambiente. Sobrenadantes contendo anticorpos produzidos a partir de camundongos imunizados a SARS CoV-2 ou soros humanos infectados, juntamente com controles somente de meio que foram diluídos 1:10 ou 1:20 em 1x PBS + tampão BSA a 0,5%, foram adicionados às partículas ligadas à placa. As placas fo- ram então incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com agitação, após o que as placas foram lavadas com 1x PBS para remover os an- ticorpos não ligados usando uma lavadora de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Os anticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo IgG anti-humano conjugado com SUL- FO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) ou um anticorpo IgG antica- mundongo conjugado com SULFO-TAGTM (Jackson Immunorese- arch) por 1 hora em temperatura ambiente. Após as lavagens, as pla- cas foram desenvolvidas com o Tampão Read (MSD) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Os sinais de ligação direta (em RLU) foram cap- turados e uma razão entre VLPs que expressam SARS-CoV-2-S e VLP irrelevante foi calculada.

[00173] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-

2-S para se ligar a VLPs que expressam SARS-CoV-2-S em compara- ção com a ligação a VLPs que expressam VSV irrelevantes foi avalia- da usando um ensaio de ligação imunológica, como descrito acima. À ligação de ponto único às VLPs imobilizadas em placas High Bind de 96 poços (MSD) foi realizada com uma diluição de sobrenadante de anticorpo de 1:10 ou 1:20, ligada por 1 hora, e detectada usando anti- corpo IgG anti-humano conjugado com SULFO-TAGTM ou IgG anti- camundongo. Os sinais de ligação da eletroquimiluminescência foram registrados em um Sector Imager 600 (MSD). Os valores de RLU fo- ram determinados para a ligação do anticorpo às VLPs. As razões fo- ram calculadas comparando os sinais de ligação do VLP que expres- sam SARS-CoV-2-S para controlar os VLPs.

[00174] Os resultados da ligação de três experimentos estão resu- midos na Tabela 5. Um sinal observado a partir de VLPs que expres- sam SARS-CoV-2-S indica ligação, enquanto a comparação com VLPs negativas fornece um fundo relativo. Amostras isoladas de meio forne- cem sinais de linha de base da ligação do anticorpo secundário a amostras sem sobrenadante. Os 46 anticorpos se ligaram especifica- mente a >4 vezes mais do que as amostras apenas de meio (20 a 35 RLU) nas VLPs que expressam SARS-CoV-2-S, com uma gama de sinais de ligação de 85 a 13.600 RLU. As razões entre VSVque ex- pressam SARS-CoV-2-S:VSV-VLPs (controle negativo) variaram de 1,1 a 22,7, com muitas tendo alto fundo de VSV-VLPs. A razão de mAb11002 de 0,9 é provavelmente devida a uma baixa concentração de anticorpo monoclonal na amostra de sobrenadante.

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EXEMPLO 5: NEUTRALIZAÇÃO DE ANTICORPO DA INFECCIOSI- DADE DE PSEUDOVÍRUS VSV-SARS-COV-2-S

[00175] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S de neutralizar o SARS-CoV-2, foi de- senvolvido um ensaio de neutralização in vitro utilizando pseudovírus VSV-SARS-CoV-2-S.

[00176] Como descrito acima, os vírus do pseudótipo VSV foram gerados por transfecção transiente de células 293T com um plasmídeo que codifica para a proteína spike de SARS-CoV-2. As células foram semeadas em placas de 15 cm a 1,2x107 células por placa em meio completo DMEM um dia antes da transfecção com 15 ug/DNA de pro- teína spike de placa usando 125 ul de lipofectamina LTX, 30 ul de rea- gente PLUS e até 3 ml de Opti-Mem. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com 10 ml de PBS e depois infectadas com um MOI de vírus 0,1 VSV A6:mNeon em 10 ml de Opti-Mem. O vírus foi incu- bado nas células por 1 hora, com agitação suave a cada 10 minutos. As células foram lavadas 3 vezes com 10 ml de PBS, depois cobertas com 20 ml de meios de infecção antes de incubação a 37 ºC, 5% de CO» durante 24 horas. O sobrenadante foi coletado em tubos de cen- trífuga de 250 ml em gelo, depois centrifugado a 3.000 rpm por 5 minu- tos para granular quaisquer detritos celulares, aliquotados em gelo, e depois congelados a -80 “ºC. A infecciosidade foi testada em células Vero antes do uso em ensaios de neutralização. Este material será referido como VSV-SARS-CoV-2-S. ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO COM VSV-SARS-COV-2-S

[00177] No dia 1, as células Vero foram semeadas com 80% de confluência em frascos T225. Para células de semeadura, o meio foi removido das células, as células foram lavadas com 20 ml de PBS (Gibco: 20012-043) e 5 ml de TrypLE foram adicionados e incubados por — 5 minutos a 37 ºC até as células se desalojarem. Foram adicio-

nados 5 ml de DMEM completo para inativar a tripsina e pipetados pa- ra cima e para baixo para distribuir as células. Para contar as células ressuspensas, foram colocadas 20.000 células Vero em 100 ul de DMEM completo pré-aquecido por poço em uma microplaca de polies- tireno preto de 96 poços (Corning: 3904).

[00178] Nodia2,oVSV-SARS-CoV-2-S foi descongelado em gelo e diluído 1:1 com meio de infecção.

[00179] Em uma placa de 96 poços com fundo em V, foi gerada uma diluição de cada sobrenadante em 60 ul de meio de infecção. Pa- ra controles de meio (negativos), 60 ul de meio condicionado diluído foram adicionados aos poços. Foram adicionados 60 ul de VSV-SARS- CovV-2-S diluído a todos os poços, exceto os poços de controle do meio. A esses poços, foram adicionados 60 ul de meio de infecção. Os pseudovírus foram então incubados com diluições sobrenadantes por minutos à temperatura ambiente. O meio foi removido das placas de células Vero, 100 ul de misturas/pseudovírus de sobrenadante fo- ram transferidos para as células, e a placa foi incubada a 37 ºC, 5% de CO 2 durante 24 horas. As diluições finais de sobrenadante de 1:4 e 1:20, e para algumas amostras 1:100, foram usadas para avaliar a neutralização dos pseudovírus VSV-SARS-CoV-2-S.

[00180] Nodia3, após a incubação de 24 horas, o sobrenadante foi removido dos poços celulares e substituído por 100 ul de PBS. As pla- cas foram então lidas em um SpectraMax i3 com citômetro de imagem MiniMax.

[00181] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S para neu- tralizar o vírus pseudotipado com expressão de SARS-CoV-2-S base- ado em VSV foi avaliada usando um ensaio de foco de fluorescência de neutralização. Os resultados de ligação de três ensaios estão re- sumidos abaixo. A potência de neutralização do anticorpo em cada diluição é representada como uma porcentagem em comparação com o controle simulado do sobrenadante.

Todos os anticorpos demonstra- ram capacidade de neutralização, e particularmente para o conjunto de anticorpos avaliados 1:100, aqueles que apresentaram maior neutraliza- ção podem representar uma capacidade de neutralização mais potente.

PENDENTE DE ANTICORPO

[00182] A capacidade dos anticorpos direcionados para a proteína spike de SARS-CoV-2 para interagir com FeyR3a, um receptor Fc ex- presso de forma proeminente em células exterminadoras naturais (NK) que induz citotoxicidade mediada por célula (ADCC) dependente de anticorpo, foi medida em um bioensaio substituto usando células re- pórteres e células alvo ligadas a anticorpos. Este ensaio utilizou célu- las T Jurkat que foram geneticamente modificadas para expressar o gene repórter luciferase sob o controle do fator de transcrição NFAT (NFAT-Luc) juntamente com o receptor do alótipo humano FceyR3a 176Val de alta afinidade (Jurkat/NFAT-Luc/hFeyR3a *76Val). As células alvo foram geneticamente modificadas por células T Jurkat que ex- pressam CD20 humano (usado como controle positivo com um anti- corpo IgG1 humano direcionado a CD20) e a proteína spike de SARS- CoV-2 de comprimento total controlada por um promotor indutível por doxiciclina. As células repórteres foram incubadas com células-alvo e o envolvimento de FcyR3a através do domínio Fc dos anticorpos I9G1 humanos ligados às células-alvo levou à ativação do fator de transcri- ção NFAT nas células repórteres e direcionou a expressão da lucifera- se que foi então medida através de uma leitura de luminescência.

[00183] As células T Jurkat foram geneticamente modificadas para expressar constitutivamente CD20 humano de comprimento total (ami- noácidos M1-P297 do número de acesso NCBI NP 690605.1), proteína transativadora Tet3G (clonada usando um vetor Takara pEF1a-Tet3G, número de catálogo 631167), bem como uma proteina de spike de SARS-CoV-2 de comprimento total induzível por doxiciclina (aminoácidos M1-T1273 do número de acesso NCBI YP 009724390.1). As células que expressam a proteína spike de Jurkat/Tet3G/hoCD20/SARS-CoV2 geneticamente modificada foram classificadas para alta expressão da proteína spike e subsequentemente mantidas em RPMI + 10% de FBS livre de Tet + P/S/G + 500 pg/ml de G418 + 1 ug/ml de puromicina + 250 pg/ml de meio de crescimento higromicina.

[00184] As células T Jurkat foram geneticamente modificadas para expressar de maneira estável um construtor repórter da luciferase do Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT), juntamente com o recep- tor de alótipo "Val FeyR3a de a alta afinidade humano (aminoácidos M1-K254 do número de acesso NCBI PO8637 VAR 003960). As células repórteres geneticamente modificadas foram mantidas em RPMI1640 + 10% de FBS + P/S/G + 0,5 ug/ml de puromicina + 500 pg/ml de meio de crescimento G418.

[00185] 36 horas antes do início do ensaio ADCC substituto, 5 x 10º células alvo/ml foram induzidas em meio RPMI + 10% de FBS livre de Tet + meios de cultura celular P/S/G contendo 1 ug/ml de doxiciclina (Sigma). Um dia antes do experimento, as células repórter foram divi- didas para uma densidade de 7,5 x 10 * células/ml em RPMI 1640 + FBS 10% + P/S/G + 0,5 ug/ml de puromicina + 500 ug/ml de meio de crescimento G418.

[00186] Resumidamente, no dia do experimento, as células alvo e repórter foram transferidas para o meio de ensaio (RPMI + 10% de FET livre de Tet + P/S/G) e adicionadas na razão de 3:2 (3 x 10%*/poço de células-alvo e 2 x 10º/poço de células repórter) para placas de mi- crotitulação de 384 poços brancas, seguido pela adição de sobrena- dante de anticorpo anti-SARS-CoV-2-S de concentrações variadas. Uma amostra de controle positivo (anticorpo CD20 com IgG1 humana) e uma amostra de controle negativo contendo nenhum anticorpo foram incluídas em cada placa para normalizar as atividades ADCC detecta- das dos sobrenadantes de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S. As placas foram incubadas a 37 º*C/5% de CO» durante 5 h, seguido pela adição de um volume igual de UM-Glo'Y (Promega) de reagente para lisar as células e detectar a atividade da luciferase. A luz emitida foi capturada em Unidades de Luz Relativa (RLU) em um leitor de placas de múlti- plas marcações, Envision (PerkinElmer), e os dados foram analisados e normalizados usando a seguinte equação: Atividade ADCC (%) = 100 x (Média em RLU (amostras de teste) - Média em RLU (sinal de fundo)) (Média em RLU (controle positivo) - Média em RLU (sinal de fundo))

[00187] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S para ativar receptores Fcy R3a foi avaliada em um ensaio de ADCC substituto usando Jurkat/NFAT-Luc/FeyR3a *”Val) como células repórteres e Spike de Jurkat/hCD20/SARS-CoV2 como células-alvo. Cada anticor- po testado continha um domínio IgG1.

[00188] A Tabela 7 resume os resultados, mostrando a atividade bruta da luciferase e a % calculada de controle positivo. Foi observada uma faixa de % de atividade do ADCC, indicando ativação de FcyR3a pelos sobrenadantes de anticorpos. Todas as amostras demonstraram alguma medida da atividade de ADCC substituto e 10 dos sobrenadan- tes de anticorpos demonstraram a atividade de ADCC substituto me-

lhor do que a observada nos controles positivos.

TABELA 7: ATIVIDADE DE ADCC SUBSTITUTO DOS SOBRENA- DANTES DE ANTICORPOS ANTI-SARS-COV-2-S.

[mabiodaa [678 68 [mabIod65 [678 Bo [mabtiodo7 [67 BE [mabtodsa [6940 BB

EXEMPLO 7: ENSAIO DE ESPECIFICIDADE DE LIGAÇÃO AO AN- TICORPO ANTI-SARS-COV-2-S

[00189] Foi realizado um ensaio de ligação Luminex para deter- minar a ligação de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S a um painel de antígenos. Para este ensaio, os antígenos foram acoplados a amina ou capturados por estreptavidina nas microesferas Luminex da se- guinte forma: aproximadamente 10 milhões de microesferas Mag- Plex (Luminex Corp., MagPlex Microspheres, número Cat. MC10000 e MC12000), foram ressuspensas por vórtice em 500 ul de 0,1 M de NaPO:, pH 6,2 (tampão de ativação) e em seguida centrifugadas pa- ra remover o sobrenadante. As microesferas foram protegidas da luz, pois são sensíveis à luz. As microesferas foram ressuspensas em 160 uL de tampão de ativação e os grupos carboxilato (-COOH) foram ativados pela adição de 20 ul de 50 mg/mL de N-hidroxis- succinimida (NHS, Thermo Scientific, número Cat. 24525) seguido pela adição de 20 uL de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodi-imida a 50 mg/mL (EDC, ThermoScientific, número Cat. 22980) a 25 ºC. Após 10 minutos, o pH da reação foi reduzido para 5,0 com a adição de 600 ul de MES 50 mM, pH 5 (tampão de acoplamento) e as mi- croesferas foram agitadas em vórtice e centrifugadas para remover o sobrenadante. As microesferas ativadas foram imediatamente mis- turadas com 500 uL de 25 ug/mL do antígeno proteico ou Streptavi- dina em tampão de acoplamento e incubadas por duas horas a 25 ºC. A reação de acoplamento foi extinta pela adição de 50 uL de 1 M de Tris-HCl, pH 8,0 e as microesferas foram agitadas em vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 800 ul de PBS 0,005% (Tween20 0,05%), para remover proteínas desacopladas e outros componentes de reação. As microesferas foram ressuspensas em 1 ml de PBS 2% e BSA 0,05% e Na Azida a 10 milhões de microesfe- ras/mL. Para captura de antígenos de estreptavidina, 500 uL de 12,5 vg/mL de proteína biotinilada em PBS foram adicionados às microes- feras acopladas a estreptavidina e incubadas por uma hora a 25 ºC. As microesferas foram submetidas a vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 800 uL de PBS e depois bloqueadas usando 500 ul de biotina a 30 mM (Millipore-Sigma, número Cat. B4501) em Tris 0,15 M, pH 8,0. As microesferas foram incubadas por 30 minutos, depois submetidas a vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 800 ul de PBS. As microesferas foram ressuspensas em 1 mL de PBS 2% e BSA 0,05% e Na Azida a 10 milhões de microesferas/mL.

[00190] As microesferas para as diferentes proteínas e proteínas biotiniladas foram misturadas a 2.700 esferas/mL, e 75 ul de micro- esferas foram semeados por poço em uma placa de fundo plano ProcartaPlex de 96 poços (ThermoFisher, número Cat. EPX-44444- 000) e misturados com 25 uL de anticorpo individual contendo o so- brenadante anti-SARS-CoV-2. As amostras e microesferas foram incubadas por duas horas a 25 º C e depois lavadas duas vezes com 200 ul de DPBS com Tween 20 a 0,05%. Para detectar os níveis de anticorpos ligados a microesferas individuais, 100 ul de capa anti- humano de cabra F(ab')2 conjugados com R-fitoeritrina (2,5' g) (Southern Biotech, número Cat 2063-09) em tampão de bloqueio (para anticorpos com regiões de Fc murino) ou 100 uL de 1,25 ug/mL de IgG anticamundongo de cabra de Fragmento R-Ficoeritrina Affi- niPure F(ab'),, específico de fragmento F(ab'), (Jackson Immunore- search, número Cat. 115-116-072) no tampão de bloqueio (para an- ticorpos com regiões Fc humanas), foram adicionados e incubados por 30 minutos a 25 “ºC. Após 30 minutos, as amostras foram lava- das duas vezes com 200 uL de tampão de lavagem e ressuspensas em 150 uL de tampão de lavagem. As placas foram lidas em um Luminex FlexMap 3D & (Luminex Corp.) e Luminex xPonent & ver- são de software 4.3 (Luminex Corp.). As proteínas SARS-CoV-2 usadas no ensaio são as seguintes: RBD (R319-F541).mmh: SEQ ID NO: 829 RBD (R319-F541).mFc: SEQ ID NO: 830 RBD (R319-F541).hFc): SEQ ID NO: 831

[00191] Os resultados da ligação Luminex são mostrados na Ta- bela 8 e na Tabela 9 como intensidades de sinal de intensidade me- diana de fluorescência (MFI). Os resultados mostram que os 46 so- brenadantes de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S se ligam especifica- mente às proteínas RBD SARS-CoV-2-S. Esses resultados também mostram que cinco desses anticorpos reagem de maneira cruzada com proteínas spike RBD de coronavírus SARS com sinal de ligação maior que 1.000 MFI. TABELA 8: SINAL DE LIGAÇÃO (MFI) DAS PROTEÍNAS SPIKE RBD DE SARS-COV-2, SPIKE S1 DE SARS-COV-2, RBD DE SARS, SPIKE S1 DE SARS, SPIKE DE MERS E RIKE DE MERS E RBD DE MERS A ANTI- CORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2 (COM HFC) ERRAR CE DD a a aa co ó,)IÍmc”macc————— E EEE Es Braiia —lSmedo Sptede |spede |SpkeDr Spade | SaRaCov. | SARS-COV. | SARS-Cov. SARSCov2 Cova — Jeovzao cons cova [cos | mancador | Subunidade | (subunidade, Roi RBD) [RBD [RBD [RBD |(R8D [FG iso A cada Fsstimet | 3 neta | FstimFe | FetnimFe | Fsanhre | Fsanare vos — |RGho | Snolisino [mábIOII4 31967 — 29650 159866 30740 [25957 30464 30591 14914 21609 [mabios33 33366 ooo 19383 asas oro 35106 Tras Doris T6og [mabIoI34 133797 32649 21238 [34325 [33016 35841 [33636 20643 1274863) |mAbIOS3S 34853 132603 (19328 35886 31444 1356617 [35037 [19991 [25554 [mábioa3s 33947 132306 121636 33740 [32810 3392 (336133 19487 (25187 [mabios37 133866 32295 19689 134233 31507 34624 133878 T1955635 Desa [mábios2o 34842 34440 Dooasa [36415 31708 136828 136277 121086 128516 [mábio922 [31768 [3097585 J18629 32355 (27854 33609 (31376 18287 24678 [mabios23 1356208 134289 J19593 137372 (335565 137766 (36324 (22507 Do8865 [mábioa3s [29409 127069 117205 30533 (24638 29593 (297138 15437 121163 [mábiosas 32196 — 130883 18746 (33900 (28857 132864 [32472 fig (23928) FABIO — [2488 —— [22160 — [19608 — [26098 — [21708 — [38809 — [29088 — [13918 — [6398 | [mábiosss “Tiresr 17286 Tiri8s Ti9568 Ti6d7 12435 T19316 [19263 [14234 [mAbiDa69 — [29550 — [27587 — [15391 [31386 [26565 [31042 [30960 — [18466 — [23959 [mAbIOITO [33154 — [31662 — [20184 [34739 [29182 [34901 — [34708 — [21047 — [2462 |mábiosT] 129365 28850 16660 28746 24602 130032 29848 16966 21579 [mabio96a — [31754 — [28907 — [19228 — [32420 — [27736 — [33074 — [32317 — [1860 — [24154 [mâbiogss — [30812 — [26063 [13707 [27138 [23361 [29618 [200% [14133 [18864 [mabioa6s — [309390 — [27440 [17905 [30363 [25115 [30778 [29869 — [16403 — [23308 [mâbiod67 [28453 — [26496 — [16/71 — [29650 [24263 — [28660 — [28061 — [15//6 — [21869 [mabIOIS5 — [29627 — [28476 — [16785 [30790 [24689 [31227 [31054 — [17858 — [22675 [mabi09s6 — [27900 — [25690 [12891 — [28348 — [24505 — 130225 — [28810 — [15013 — [19981 [mábioas? [23411 — [20615 — [10566 [18692 [16725 — [22560 — [20268 — [8451 — [11909 mAbIOST? 16770 14605 8845 1387 12774 15216 16783 6476 9.406

varão — |[005, noso. | ano7o. | 40060. | HS) (Sino | Vosem VoêB) | vosa) 0a6r Lmanrogas asa asas as 1a as asas mantogia Jar Ja a as asa as as as maotogis — faz Jan par so as as ao aa eo jo js mantosaa aa a A a a a a a Lmaniosas aa eg ag ag a aaa a sa a a a ps maos aa a a ag Lmapiosas asa a a aaa a aa |maniosaz ag so par is as as o 12 a 33 1 [mantosao 59 Jes fas 1 13 as das oo as as ja | Fmaniogat Bs BR o o o ss mara as a a a a a Lmabiosaa 5a ee a aa as ag a asa aa Lmaniosaa — Jar Ja sa asa as aa as Ro [maniosso faz Jan fre so ao aa ass [maoiosss — 38 Ja qe so o as os ao Te es as manrogas a A a a a a maos a a a a a a a as Emanrogat asa a a as o a mantossa aos ag a aee mabiosas — 1233 E 2 nn 1a 1 Te 20 27 247 TA [maniosas —J31537 J32343 [22721 Dis [28 Ja 13-22 Joss ss 158 [maniosss — 39 Ja pa is so a o a ss os 11 | pmantossz [araras aa as as as as as aa mantosss are as a aaa as a ae as Lmanrosss Tara a a asa 136 is [mantosea Jar Ja as aa as asa [ESSE E ES EO EE EC EC ES EU ES E E) rara e a a a |maviossa — 19999 J23855 [5186 Jos paras aa aa Lmantogss ao aa a a a ss ag ESTE EC EL E EC EC E EAR EE E E | mantosez fas Jana aaa as Lmaviossa 39 Ja údas zo as ao des ao 5 ao ja [manioass — [36 Jar fia so so as ass Te e pmantosse [32 Ja fre so so as aa ss aa maos A e a a a a ag maniostr— 136 28 2 ns e Ta a T 20 2 TABELA 9: SINAL DE LIGAÇÃO (MFI) DE SARS-COV-2 RBD, SPIKE S1 DE SARS-COV-2, SARS RBD, SARS SPIKE S1, PROTEÍNAS SL ZE SARRO VUV- E SARo ADI, voho SriÃE Sh, FRUTENNAÃOS

(2) vP) Pb) mm P) Ú 4oss1-vozr | Sing to [manisoio J11024 1255 938 1442 1568 Jeso Jews 51336 10794 Lmabisoos Ja30 — 11337 [429 Jassz 7655 Jaz emos Ja —Josos [mabi1o00 J17802 Jaogr Tnaas sont ses 736 seno Joass [5415 [mani1oos Jsia — Taz nas ss asa ess 79 aos Trost Lmani1oos —Jaoaz jlaazs 307 axo atos so 239 l6sso 1419 Lmaniossa —“J1847 36357 228 2230 ar 170 2005 je 177 Lmabiosss Jor2 — 2906 4319 Jere > sx 12084 > 16109 Jos 162 [mantioo2 L[115se [10187 [2167 —Losã0 541 —[o32 [841 [117 12867

[00192] Foirealizado um ensaio de ligação para determinar o per- fil de ligação dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S. Para este ensaio, os antígenos foram acoplados à amina como descrito para o ensaio de ligação de Luminex acima. Resumidamente, aproximadamente 9 milhões de microesferas MagPlex para 16 regiões diferentes de es- feras (Luminex Corp., MagPLex Microspheres, número Cat. Mag- PLex MC10000 e MC12000), foram ressuspensos por vórtice em 500 ul de 0,1 M NaPO;, pH 6,2 e em seguida centrifugados para re- mover o sobrenadante. As microesferas foram ressuspensas em 160 uL de tampão de ativação e os grupos carboxilato (-COOH) foram ativados pela adição de 20 ul de 50 mg/mL de N-hidroxissucci- nimida (NHS, Thermo Scientific, número Cat 24525), seguida pela adição de 20 ul de 50 mg/ml de 1-etil-3- [3-dimetilaminopro- pillcarbodiimida (EDC, ThermoScientific, número Cat 22980) a 25 ºC. Após 10 minutos, o pH da reação foi reduzido para 5,0 com a adição de 600 ul de MES a 50 mM, pH 5 (tampão de acoplamento) e as microesferas foram agitadas em vórtice e centrifugadas para remover o sobrenadante. As microesferas ativadas foram imediata- mente misturadas com 500 ul de 20 ug/mL de Proteína Spike de

SARS-CoV-2 (RBD) (R319-F541) -mmH em tampão de acoplamento e incubadas por duas horas a 25 º C. A reação de acoplamento foi extinta pela adição de 50 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 8,0 e as micro- esferas foram agitadas em vórtice, centrifugadas e lavadas três ve- zes com 1.000 uL de PBS. As microesferas foram ressuspensas em 250 uL de PBS a 9 milhões de microesferas/mL.

[00193] 15 das 16 regiões de microesfera com proteína acoplada a amina foram modificadas para o ensaio de binning da seguinte forma: as microesferas foram lavadas duas vezes com PBS 5% DMSO e 500 uL de um produto químico ou enzima foram dissolvidos por recomen- dações de fabricação e adicionados a 10 nM às microesferas acopla- das a amina descritas acima. Este foi subsequentemente submetido a vórtice e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente com rota- ção. Lave as microesferas 3 vezes com PBS 2% BSA. As microesferas foram ressuspensas em 1 mL de PBS a 9 milhões de microesferas/mL.

[00194] As microesferas modificadas e não modificadas por prote- ínas (intactas) foram misturadas a 2.700 esferas/mL e 75 ul de mi- croesferas foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços ProcartaPlex de 96 poços (ThermoFisher, número Cat. EPX-44444- 000) e misturado com 25 uL de anticorpo individual anti-SARS-CoV- 2-S contendo sobrenadante. As amostras e microesferas foram in- cubadas por duas horas a 25 ºC e depois lavadas duas vezes com 200 ul de DPBS com Tween 20 a 0,05%. Para detectar os níveis de anticorpos ligados a microesferas individuais, 100 ul de capa anti- humano de cabra F(ab')2 conjugados com R-fitoeritrina (2,5' g) (Southern Biotech, número Cat 2063-09) em tampão de bloqueio (para anticorpos com hFc) ou 100 uL de 1,25 ug/mL de IgG antica- mundongo de cabra de Fragmento R-Ficoeritrina AffiniPure F(ab'),, específico de fragmento F(ab'), (Jackson Immunoresearch, número Cat. 115-116-072) em tampão de bloqueio (para anticorpos com mFc), ou 100 ul de 1,25 ug/mL de R-Ficoeritrina Anti-His (Biole- gend, Cat. No: 362603) no tampão de bloqueio (para controle ACE- 2, P&D, número de ref. 933-ZN), foram adicionados e incubados por minutos a 25 ºC. Após 30 minutos, as amostras foram lavadas duas vezes com 200 uL de tampão de lavagem e ressuspensas em 150 ul de tampão de lavagem. As placas foram lidas em FlexMap 3DG (Luminex Corp.) e Luminex xPonent6 versão de software 4.3 (Luminex Corp.).

[00195] Os resultados dos resultados de binning Luminex são mos- trados na Tabela 10 como intensidades de sinal de intensidade media- na de fluorescência (MFI). Para determinar grupos, os dados foram normalizados para a proteína intacta (microesferas não modificadas) e agrupados. Os 46 anticorpos anti-SARS-CoV-2 foram classificados em 9 grupos com 2 ou mais anticorpos e 11 anticorpos foram classificados como nós únicos. Os grupos foram atribuídos com base nesses resul- tados do agrupamento hierárquico e do dendrograma. Estes resulta- dos mostram que os 46 sobrenadantes de anticorpos anti-SARS-CoV- 2-S tinham características e perfis de ligação diversos, sugerindo que a coleção de anticorpos se liga a diferentes epítopos na proteína spike de SARS-CoV-2.

TABELA 10: SINAL DE LIGAÇÃO (MFI) E ATRIBUIÇÃO DE GRUPO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S AO SARS- COV-2-S RBD.MMH (NÃO MODIFICADO E MODIFICADO QUIMICA- MENTE OU ENZIMATICAMENTE)

Proteina MOD1- MOD2- MOD3- MOD4- MODS - MODS - MOD7- Spike de Proteina Proteina Proteina Proteína Proteína Proteína Proteína SARS-CoV-2 | Spike de Spike de Spike de Spike de Spike de Spike de Spike de NÃO SARS-CoV- | SARS-CoV- | SARS-CoV- | SARS-CoV- | SARS-CoV- | SARS-CoV- | SARS-Cov- MODIFICADA | 2 (RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) (RBD) (R319- | (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- F541).mmH F541).mmH | F541).mmH | F541).mmH | F541).mmH | F541).mmH | F541).mmH ) F541).mmH nao a uu os O aa as soa 3546 os 103378 A a re a ess ss sz sas aa 4062 ao uu ga s389 123270 129344 15018 198738 27854 a a ur O unubsva sos aass saaa 30 958 mato aa a as 32305 33366 —l36082 7540 135335 133924 [mapiosão — 4 129502 110 21579 21533 2783 [6195 [26600 25103 at oa O bi e O aaaa7 gas seo az ss 34544 maos a user 16260 15765 13369 — 19566 15206 nto aa ra os aa assa 503 mara uu Ts 25092 — 31664 668 30801 29926 maos a uu uva ag Ag oro aa3es —36sor 16378 135565 134210

REC UEE E RS EE ECO E ELOS ECO A EO DC ENTE maos ua 5963 14842 — [20830 3536 120176 19499 ao a ra a a s728 119383 19993 fassa ara 47989 io a rs az a aaa ses saio rasa oz 91893 Emantosis ss sa 32489 126427 — 33545 9731 33566 31823 mao oa uu ag ss33 ogssz 31560 foge 1311233 29765 nao oa E ui aa ug ses gasosas gas gas 30918 maos uv ug 51863 126129 133637 — 9455 — 133154 31478 [mapiosãa — 6 5756 109 3465 [500095 24747 — [6880 [23630 23805 mara E a ag ua ssa ossz 36 esa aos 92813 na o vas 4108 eso sas sos asas 19779 maos uu O g 5o6&7 15243 32665 J6ewi 132930 31043 mao os cura aaa essa Wosost 14585 417 93770 nao gaz sp osso 2335 rest aro 7085 195.690 maos a Oss 1272 1303239 J6ast 17417 27785 maos A uu 3ago 122184 127850 —T6sss 125337 [25164 mara nba aa o3asea 23419 1278968 170865 127483 | 25968 io a ba NOSSO as moaato Tes Msg OST mara uoa ga 92836 19866 25738 5869 124217 26013 to o ag a aoza7 3760 osso 32 O343a maos ur og a rg soss sis sas sas 74332 ma ass uv a Vasas 121155 127912 Tata 193849 124862 ao as vg sas ea ssa ass oa os Emabrosas ag a ssa ae atas ras 31008 129293 aaa gg ag ssa oz 31348 5382 31313 109386 marra e ur a ss a T'562 | ICSECSCEE CR EE EUCT E ECC EX A ECO Er CR RETA ES po o uv gg aa a a aaa O ST76E Emaniioos Ts ros ao ss ore 1158 13750 1007 mto a a O aa aaa a oa Toa ara ua vs a assess asa 78 Ema sa una 7 J13463 120098 17756 J12409

TABELA 10 (CONTINUAÇÃO MODE: — TNODS- |MODTo- | MODTT- [MODiZ [MODIS | NODTE. | MODs- Proteína Proteína Proteina Proteína Proteina Proteína Proteina Proteina Spitede | Spixecde | Sspkede |Spkede |spíede | spkede | Spikede | spkede SARS.CoV. | SARS-.COV. | SARS.COV- | SARS.COV. | SARS-.COV- | SARS.COV- | SARS.COV- | SARS.COV- 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) 2(RBD) (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- (R319- F541).mmH | Fs41) mmbi | F541) mmH | FS41) mm | F541.mmH | F541).mmH | Fs41) mm | F541 mat fan Sa fas faso ao fame fasos = Jsom ato [ams | sem Ts Tem re fe es ss em sm | see Ts se sr ee ns rm e e | mana us goi [47 [77408 127036 — [24269 [2367572 [141968 | aa sos 22355 raia [25635 [23744 (231560 [14072 nao un seg ssa oro Dasa 3115 sao or7sa [sra manto a 7228 32758 [37463 (31910 [3574 (37185 32333 29949 | mara unos 4187 33809 35323 Tasso 35381 3338 33137 O) proa oa35 oa7aa 34516 26738 27958 [26968 [257296 [23957 a sz asos7 34708 [35070 [39385 [35462 [34922 [33674 nao un Ne 775 15530 16838 sa raio s100 [15946 Emabitoos Na ag aa 3749 106 462 2818 334 3566 | mao a urbe aA os 30364 30709 132873 309502 Tossat 597785) mato NS 285 33797 [35878 [38424 [34647 [33476 [31524 | mara 4808 og46s 29444 — j30698 33475 — [309566 [29721 27129 | mao uv 8329 19660 (20682 21770 [20130 —j16948 [16558 mara ba 357 19487 11Bses 121247 [18757 (17810 (16081 | mara uva 93442 131984 132902 135462 (31937 (32397 15090099 nara una 9122 [29074 (30433 33379 (39263 (29880 26795 | mao rss gos 130308 131264 33394 30314 T3ossa — To7751 mao us ssa 3a a3esa 3539 ras ao [sis manto sz oz [72065 122318 [261635 [23227 (227863 [19389 | papos eg sea 357 aesa 27394 [24677 24493 [2909787 pmantogss e ass os [21766 121720 (25207 (23400 [22214 [19698 | [manioor7 Se Ts005 4193 13616 [13320 16332 [13632 [14372 [13136 | mas uu Ns 77 39926 os 34437 [39409 (30525 (34367) rota og 3036 233137 23247 [26412 [24037 [23549 [16765 | [maior 7 1444 25637 [25345 26336 — 299985 — [27049 — [260822 [22871 | Emabiooss 8 pos 56157 97958 jo8752 30847 28522 27452 24816 | nao uu SR ooSS7 Doses 24384 1273901 — [os761 24774 [19590 | prato NoaAÇ loaTA 56 26400 29113 [27243 126763 [22405 | maos uva aa 194332 12497 27490 26554 —J24585 —J18580 | mora uu gs 22352 -—j22997 125506 [22641 J2283%6 (173867 | nana nba aaa oasis 23457 128200 [24887 124539 “19717 manos ag 219 sãos 23688 127210 255725 —J24677 f18948 |) praias su ssa 6336 6788 16229 15821 J3454 (132 Emanioaãs ss si sora 128775 30813 3171 129189 128522 121674 | manos gg ogsas sex 130373 132937 309625 — 158967 — [23399 mara uu ata leais 6790 — 18ass — /7ess Jeso 2016 manos sa sos 712862 71524 Jos6as — [21547 22767 [15077 |) no uu SS 7 ass asa 5387 15398 Tag5 nao oa ave asa 339 7a aa og) mara Hg uva as ag as ass az oag aaa a uu 665 167 595 ss sr aa) mo su gas 9230 730 os 17952 77 515 EXEMPLO 9: CINÉTICA DE LIGAÇÃO BIACORE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S

[00196] Constantes de dissociação de equilíbrio (Kp) para diferentes anticorpos de SARS-CoV-2-S a partir de sobrenadantes de células pri- márias CHOt ou a partir de hibridomas foram determinados utilizando um biossensor BlAcore T200/Biacore 8K com base em ressonância de plasmon de superfície em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e tensoativo Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET), tampão de corrida a 25 ºC. À superfície do chip do sensor Biacore CM5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com mAb específico de Fc de camundongo anti-

humano ou anticorpo monoclonal Fcy de coelho anticamundongo (GE, número de catálogo BR-1008-38) para capturar anticorpos anti-SARS- CoV-2. Foram realizados estudos de ligação em um domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD humano expresso com um marcador myc-myc- hexahistidina C-terminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD expresso com um domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD ou IgG2a de camundongo (SARS-CoV-2 RBD-mFc) C-terminal ex- presso com uma IgG1 humana C-terminal (SARS-CoV-2 RBD-hFc). Concentrações únicas de SARS-CoV-2 RBD-MMH, (100 nM); SARS- Cov-2 RBD-mFc (50 nM) ou SARS-CoV-2 RBD-hFc (50 nM), preparado em tampão de corrida HBS-ET, foram injetados por 1,5 minutos a uma taxa de fluxo de 30 uL/min enquanto a dissociação de diferentes reagen- tes SARS-CoV-2 RBD ligados a anticorpos foram monitorados por 2 mi- nutos em tampão de corrida HBS-ET. No final de cada ciclo, a superfície de captura de anticorpo SARS-CoV-2 RBD foi regenerada usando uma injeção de 10 segundos de ácido fosfórico a 20 mM para a superfície de anticorpo monocional específico para Fc anti-humano de camundongo ou uma injeção de 40 segundos de glicina, HCl 10 mM, pH 1,5 ao anticorpo policlonal específico para Fcy de coelho anticamundongo. A velocidade de associação (ka) e velocidade de dissociação (ks) foram determinados através do ajuste de sensogramas de tempo real de ligação a um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa utilizando software BlAevaluation v3.1 ou Biacore Insight Evaluation v2.0 ou software de ajuste de curvas. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (Kp) e meias-vidas dissociativas (t/2) foram calculadas a partir das cons- tantes de taxa de cinética como: Ko (M) = E, e t/ (min) = 22.

[00197] Os parâmetros de cinética de ligação para diferentes anti- corpos monoclionais de SARS-CoV-2 que se ligam a diferentes rea- gentes anti-SARS-CoV-2 RBD da invenção a 25 ºC são mostrados nas

Tabelas 11 e 12. TABELA 11: CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-COV-2 RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2 A 25ºC es cao. e Sobrenadante | Captura de | nM liga-

mAb (RU) | do (RU) [mantosta — [ato — ma Taa0msos [130502 [a0950s [os | [mantoses [rar — [790 — [oaresos [145608 [154000 1a es co cs e Sobrenadante | Captura de | nM liga- mAb (RU) | do (RU) [manioses [1455 Jos [195505 [22002 |117EO [os | imaitoo2 —j1oro —|8 => 3216x05 |2546-02 |7,936-08 [os | TABELA 12: CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-COV-2 RBD-MFC OU SARS-COV-2 RBD-HFC A ANTICORPOS MONOCLO- NAIS ANTI-SARS-COV-2-S A 25 ºC Nível de Ag de 50 Sobrenadan- Captura de am ligado E Fo aa ue fem Je Joe Je FRRAEAS Tm 6 ese rue se [Ts]

Sobrenadan- Nível de Ag de 50 [hm o Kb Te mAb (RU) | (RU)

mm e e | mAb (RU) | (RU) pro rs Tao asaemos [440503 [167608 126 *: Valor estimado com base no limite de medição da constante de taxa dissociativa e da meia-vida dissociativa nas condições experimentais. EXEMPLO 10: CARACTERIZAÇÃO DE ELISA DE BLOQUEIO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S

[00198] Um ensaio de bloqueio baseado em ELISA foi desenvolvido para determinar a capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV2-S para bloquear a ligação do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteí- na spike de SARS-CoV-2 à enzima 2 de conversão de angiotensina humana (hACE2).

[00199] A proteína SARS-CoV-2 usada nos experimentos foi compos- ta pela porção do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína spi- ke de SARS-CoV-2 (aminoácidos Arg319 a Phe541) expressa com a porção Fc da IgG1 humana no c-terminus (SARS-CoV-2 RBD-hFc; ver número de acesso NCBI MN908947.3). A proteína ACE2 humana usada nos experimentos foi comprada de R&D systems e é composta pelos aminoácidos glutamina 18 à serina 740 com um marcador c-terminal 10XHistidina (hnACE2-His; número de acesso NCBI Q9BYF1).

[00200] Os experimentos foram realizados usando o procedimento a seguir. Um anticorpo monoclional anti-Penta-His (Qiagen) foi revesti- do a 1 ug/mlL em PBS em uma placa de microtitulação de 96 poços durante a noite a 4 ºC. O receptor hACE2-His foi adicionado a 0,2 vpg/mL em PBS e ligado durante 2 horas à temperatura ambiente. Os sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados com o uso de uma solução a 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Em outras placas de microtitulação, uma quantidade constante de 10 pM ou 15 pM (como indicado na Tabela 13) da proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc foi ligada com anticorpos diluídos 1:10 ou 1:20 em PBS + BSA a 0,5%. Estes complexos anticorpo-proteína, após uma incubação de uma ho- ra, foram transferidos para a placa de microtitulação revestida com hACE2-His. Após 1,5 hora de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados e a proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc ligada à pla- ca foi detectada com anticorpo IgG de cabra anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson). As placas foram então desenvolvidas usando a solução de substrato TMB (BD Biosci- ences, número de catálogo 555214) de acordo com a recomendação do fabricante e a absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de placas Victor X5.

[00201] A análise dos dados foi realizada calculando a % de redu- ção do sinal da concentração fixa de SARS-CoV-2-S RBD-hFc na pre- sença do anticorpo vs na ausência do anticorpo. No cálculo, o sinal de ligação da amostra do SARS-CoV-2-S RBD-hFc constante sem a pre- sença do anticorpo para cada placa foi referido como 100% de ligação ou 0% de bloqueio; e o sinal de linha de base da amostra de mídia apenas sem a presença de SARS-CoV-2 RBD-hFc foi referido como 0% de ligação ou 100% de bloqueio.

[00202] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S para blo- quear a ligação de SARS-CoV-2-S RBD à ACE2 humana foi avaliada utilizando um formato ELISA de bloqueio. O bloqueio do sobrenadante do anticorpo de teste de ponto único da ligação de 10 pM ou 15 pM de SARS-CoV-2-S RBD-hFc ao hACE2-His, que foi apresentado no anti- corpo anti-His revestido em placas de microtitulação de 96 poços, foi detectado com um anticorpo anti-hFc conjugado a HRP.

[00203] Os resultados do bloqueio de três ensaios estão resumidos na Tabela 13. O sinal de ligação SARS-CoV-2-S (450 nm) e a % de blo- queio calculado G são indicados. Uma faixa de bloqueio é observada pa- ra as amostras de teste. Para amostras em que um NA é indicado nas colunas 6 e 7, um valor corrigido por placa é incluído nas colunas 4 e 5, pois os dados eram consistentes com uma única troca de placa ocorren- do para essas amostras. 43 de 46 sobrenadantes de anticorpos bloquea- ram mais de 50% da ligação de SARS-CoV-2-S RBD-hFc ao ACE2 hu- mano revestido em placa, com 16 deles bloqueando > 90% do sinal.

TABELA 13: RESULTADOS DE ELISA DE BLOQUEIO COTERBOAEs | iiaáRAE | asia ae MAES | nc noqecas SRESIeIRAN o | Puto dt. — SS? Porfies | comia porpiaa | ACEZ apresentada | COVZRBDnfca, sta a6o no | apresentada por | nm) por His aaa O a Ts ox foos is o Je om Nes [manto a oa fa fes 5 | mantas Sm e foss "es fors [os Cias a eso e oe rs aa oa res oa ros Pnet Sa e Tere a for fe [manto e Ter ss fon sos Page a o er oe fr Penetra em Tons Patas a a es er [as Pnaetases Cs Tosa forms [7 [manto a a fes fes es | manta [rs e Tee fes for [os [amaro a a oz fes fox Joss MALI0940 159 1110 0,152 952 01h 952 [manter [E e Temer fem Pitas a os fes os es nas Cs O er Tae Tao pias a oia e no Patos sr To ef Ema oa fa fe no Latas Cs a oa os a [antes [SR re fasso fans ess [ota |anraass s ea o [e Pantera fo a Lona Cs a Te fem fee Emap ore fes fo Joss | manto [E e fosses forms [os Postas a oa fer os Jo Cia os fe for Tor Pass a oa ea o os Pensa CS O e er ee Ter Pass ar ore es ore Tess Pnet sa e Te fo fo Emater oa rs foas 7s mMAbI1010 10pM 1:20 0,186 ss 0,186 so [manias fr e e e Jen 7 Cia a O O A oa az Poemas ez fe os ss pras ra O oa ea Jess Paga o a ess er Toas JS [mano Tam fr fem 7

EXEMPLO 11: MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS MO- NOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S À GLICOPROTEÍNA SPIKE POR ESPECTROMETRIA DE MASSA POR TROCA DE HIDROGÊNIO-

DEUTÉRIO

[00204] A espectrometria de massa de troca hidrogênio-deutério (HDX-MS) foi realizada para determinar os resíduos de aminoácidos do domínio de ligação de receptor (RBD (aminoácidos R319-F541)) de proteína spike de SARS-CoV-2 que interagem com mAb10989, mAb10987, mAb10934, mAb10933, mAb10920, mAb10922, mMAb10936, mAb10954, mAb10964, mAb10977, mAb10984 e mMAb10986. Uma descrição geral do método de troca de H/D é apre- sentada em Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252 a 259; e Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A a 265A.

[00205] Os experimentos HDX-MS foram realizados em uma plata- forma HDX-MS integrada, consistindo em um sistema Leaptec HDX PAL para marcação e resfriamento de deutério, uma Waters Acquity |- Class (Binary Solvent Manager) para digestão e carregamento de amostras, uma Waters Acquity I|-Class (Binary Solvent Manager) para o gradiente analítico e um espectrômetro de massa Thermo Q Exacti- ve HF para medição de massa de peptídeos.

[00206] A solução de marcação foi preparada como tampão de PBS em D2O a pD 7,0 (tampão de 10 mM de fosfato, 140 mM de NaCl, e 3 mM de KCl, equivalente a pH 7,4 a 25 ºC). Para a marcação de deutério, ul de proteína RBD ou proteína RBD pré-misturada com cada um dos 12 anticorpos acima listados foram incubados a 20 ºC com 90 ul de solu- ção de marcação D2O para vários pontos de tempo, em duplicado. Para mMAb10989, mAb10987, mAb10934 e mAb10933, os pontos de tempo foram de O min (controle não deuterado), 5 min e 10 min. Para mMAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10964, mAb10977, mMAb10984 e mAb10986, os pontos de tempo foram de O min (controle não deuterado) e 10 min. A reação de deuteração foi extinta pela adição de 90 mL de tampão de resfriamento pré-resfriado (0,5 M TCEP-HCI, 4 M de ureia e 0,5% de ácido fórmico) a cada amostra para uma incubação de 90 segundos a 20 ºC. As amostras extintas foram então injetadas no sistema Leaptec HDX PAL para digestão em linha com pepsina/protease XIlIl. Os peptídeos digeridos foram capturados por uma coluna C18 (2,1 mm x 5 mm, Waters) e separados por outra coluna C18 (21 mm x 50 mm, Waters) a -5 ºC com um gradiente de 20 minutos (para mAb 10989, mMAb10987, mAb10934 e mAb10933) ou um gradiente de 10 minutos (para mMAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10956, mMAb10964, mAb10977 e mAb10984) de 0% a 90% da solução da fase móvel B (solução da fase móvel A: 0,5% de ácido fórmico e 4,5% de ace- tonitrila em água, solução móvel da fase B: 0,5% de ácido fórmico em acetonitrila). Os peptídeos eluídos foram analisados por uma espectro- metria de massa de Thermo Q Exactive HF no modo LC-MS/MS ou LC- MS.

[00207] Os dados de LC-MS/MS da amostra de proteína RBD não deuterada foram pesquisados em um banco de dados incluindo se- quências de aminoácidos da proteína RBD, pepsina, protease XIll e suas sequências reversas usando o mecanismo de pesquisa Byonic (Protein Metrics). Os parâmetros de pesquisa foram definidos como padrão usando digestão enzimática inespecífica e glicosilação humana como modificação comum de variável. A lista de peptídeos identifica- dos foi importada para o software HDExaminer (versão 3.1) para cal- cular a captação de deutério (captação de D) e as diferenças na por- centagem de captação de deutério (A%D) para todas as amostras deuteradas. A diferença na porcentagem de absorção de deutério (A%D) foi calculada da seguinte forma. Diferença na captação de deutério (AD) = Captação de D (RBD-mAb) - captação de D (apenas RBD)

Diferença na porcentagem de absorção de deutério (2º%D) 4D — Absorção teórica máxima de D do peptídeo * 20º

[00208] Um total de 190 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10989, re- presentando 86,06% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer pep- tídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 467 a 513 (DIS- TEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLOSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 835) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10989.

[00209] Um total de 187 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10987, representando 86,06% de cobertura de sequência de RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, co- mo -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes a aminoáci- dos 432 a 452 (CVIAWNNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10987.

[00210] Um total de 188 peptídeos do RBD foram identificados tanto no RBD sozinho quanto no RBD em complexo com amostras de mAb10934, representando 86,06% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, co- mo -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoá- cidos 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836),

467 a 474 (DISTEIYQ) (SEQ ID NO: 837) e 480 a 513 (CNGVEG- FNCYFPLOASYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 838): do RBD foram significativamente protegidos por mAb10934.

[00211] Um total de 188 peptídeos do RBD foi identificado tanto no RBD sozinho quanto no RBD em complexo com amostras de mAb10933, representando 86,06% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente prote- gido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 467 a 510 (DIS- TEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLOSYGFQPTNGVGYQPYRV) (SEQ ID NO: 839) do RBD foram significativamente protegidos por mAb 10933.

[00212] Um total de 75 peptídeos do RBD foram identificados a par- tir do RBD isolado e do RBD em complexo com amostras de mAb10920, representando 83,27% de cobertura da sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, co- mo -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoá- cidos 471 a 486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) e 491 a 515 (PLOSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 841) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10920.

[00213] Um totalde 386 peptídeos do RBD foram identificados a par- tir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10922, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e as- sim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10922.

[00214] Um total de 381 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10936, re- presentando 82,07% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer pep- tídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 351 a 360 (YAWNRKRISN) (SEQ ID NO: 842), 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467 a 486 (DISTEIYOAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 843) e 491 a 513 (PLOSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 844) do RBD foram significativamente protegidos por mAb 10936.

[00215] Um total de 84 peptídeos do RBD foram identificados a par- tir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10954, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e as- sim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 400 a 422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453 a 486 (YR- LFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) e 490a 515 (FPLOSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) do RBD foram significativamente protegidos por mAb 10954.

[00216] Um total de 109 peptídeos do RBD foram identificados tanto no RBD sozinho quanto no RBD em complexo com amostras de MAb 10964, representando 83,67% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 401 a 424

(VIRGDEVRQIAPGQOTGKIADYNYK) (SEQ ID NO: 848) e 471 a 513 (EIYQOAGSTPCNGVEGFNCYFPLOSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 849) do RBD foram significativamente protegidos por mMAb10964.

[00217] Um total de 78 peptídeos do RBD foram identificados a par- tir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10977, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e as- sim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 351 a 364 (YAWNRKRISNCVAD) (SEQ ID NO: 850) e 471 a 486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) do RBD foram significati- vamente protegidos por mMAb 10977.

[00218] Um totalde 388 peptídeos do RBD foram identificados a par- tir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10984, representando 87,25% de cobertura de sequência de RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e as- sim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 400 a 422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845) e 453 a 486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) do RBD foram significativamente protegidos por mAb 10984.

[00219] Um total de 84 peptídeos do RBD foram identificados a par- tir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10986, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de A%D inferior a -5%, como -6%, -10% e as- sim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 400 a 422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453 a 486 (YR- LFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) e 490 a 515 (FPLASYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) do RBD foram significativamente protegidos por mAb 10986.

[00220] Em suma, a maioria dos anticorpos neutralizantes testados contata o RBD de uma maneira que se sobrepõe aos resíduos RBD que compõem a interface ACE2; além disso, os anticorpos podem ser agrupados com base em seu padrão de contato com a superfície do RBD, conforme mostrado na Figura 15. Os dados acima também estão resumidos nas Tabelas 14 a 25.

TABELA 14: PEPTÍDEOS DE DOMÍNIO DE LIGAÇÃO DE RECEPTOR (RBD) DE PROTEÍNA SPIKE COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS À FORMAÇÃO DO RBD-MAB EM COMPARAÇÃO COM O RBD ISOLADO [emnsemaneão — [iommanaeão — | | RBD- RBD-

EC PCA grin [emo seo ENNIO Tao [mato soo GRASS Tao Tex | 467 a 474 | 267 316 -0,49 | 253 317 -0,64 | -10,5 470 a 473 | 948 0,98 -0,50 | 947 0,98 -0,51 [-28,0 470 a 474 | 9,99 1,46 -0,47 | 0,99 1,44 -0,45 | 16,9 471 a 474 | 051 0,89 -0,38 | 0,51 0,89 -0,38 | -20,9 475 a 486 | 220 2,93 -0,73 | 211 2,94 -0,83 |-9,7 4752487 [331 4,50 -1,19 | 3,61 4,48 -0,87 |-114 475 a 489 | 277 4,48 1,71 | 278 453 -1,75 | 16,0 475 a 490 | 2.63 4,96 233 | 267 497 -2,30 |-19,8 480 a 489 | 182 367 -1,85 | 1,77 3,69 -1,92 | -26,2 483 a 486 | 0,31 0,78 -0,47 | 9,30 0,78 -0,48 | -26,5 487 a 489 | 0,05 0,40 -0,35 | 9,02 0,39 -0,37 | 40,4 487 a 490 | 0,11 0,90 0,79 | 9,11 0,84 -0,73 | 42,3 487 a 491 | 9,10 1,05 -0,95 | 9,10 1,03 -0,93 | -52,0 487 a 495 | 0,62 1,59 -0,97 | 9,67 157 -0,90 | 17,4 487 a 509 | 5,63 6,99 -1,36 | 5,68 7,02 1,34 | 83 487 a 510 | 6,08 737 1,29 | 6,08 7,A4 1,36 |17 487 a 512 | 5,72 6,48 -0,76 | 5,60 6,77 1,17 |-51 487 a 513 | 5,15 6,16 1,01 | 5,07 6,14 1,07 |-5,3 488 a 490 | 903 0,22 -0,19 | 900 0,23 -0,23 |-23,2 488 2 491 | 004 0,37 0,33 | 9.04 0,36 -0,32 | -36,3

TABELA 15: PEPTÍDEOS DA PROTEÍNA SPIKE RBD COM PROTE- ÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD- MAB10987 EM COMPARAÇÃO A RBD ISOLADO |ómpdeiaenção = [romncementão = | | m em Ee mMAb10987 mAb10987 mana 7 Ta 5º Ss 5 de D de D de D de D D 432 a 441 1,62 217 -0,55 | 1,64 2,18 -0,54 | -7,6 432 a 449 5,60 6,59 -0,99 | 5,54 6,59 1,05 |-71 432 a 452 6,20 7,49 -1,29 | 6,20 7,46 1,26 |-7,5 433 a 441 1,50 2,00 -0,50 | 1,49 2,01 -0,52 | -81 440 a 452 3,95 4,81 -0,86 | 4,03 4,80 -0,77 |-8,3 442 a 449 2,49 2,98 -0,49 | 2,60 2,99 -0,39 | -8,2 TABELA 16: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10934 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO rara Tomas — TT mo ee EO rem o mMAb 10934 à mão ão O Jennao ao mo de de D deD de D 432 a 452 | 5,70 7,49 -1,79 | 5,62 7,46 -1,84 | -10,6 433 a 441 | 1,60 2,00 -0,40 | 1,63 2,01 -0,38 | -6,2 434 a 441 | 2,24 2,42 -0,18 | 2,13 2,52 -0,39 | -5,3 442 a 449 | 2,37 2,98 -0,61 | 2,37 2,99 -0,62 | -11,4 442 a 452 | 2,67 4,21 -1,54 | 2,66 4,23 -1,57 | -19,1 443 a 452 | 2,53 3,78 -1,25 | 2,52 3,78 -1,26 | 17,5 444 a 451 | 1,79 2,73 -0,94 | 1,80 2,73 -0,93 | 17,2 444 a 452 | 1,82 3,09 -1,27 | 1,75 3,09 -1,34 | -20,7 445 a 452 | 1,24 2,42 -1,18 | 1,24 2,43 -1,19 | -22,0 467 a 474 | 2,64 3,16 -0,52 | 2,58 3,17 -0,59 | -10,2 470 a 473 | 0,51 0,98 -0,47 | 0,55 0,98 -0,43 | -25,0 470 a 474 | 1,03 1,46 -0,43 | 1,01 1,44 -0,43 | -16,0 471 a 474 | 0,56 0,89 -0,33 | 0,55 0,89 -0,34 | -18,6 rara Tomas — TT mo ee EO rem o mMAb 10934 &u eo ae | amenso ue [ee de de D deD de D 480 a 489 | 3,19 3,67 -0,48 | 3,19 3,69 -0,50 | -6,8 487 a 489 | 0,04 0,40 -0,36 | 0,06 0,39 -0,33 | -38,6 487 a 490 | 0,54 0,90 -0,36 | 0,53 0,84 -0,31 | -18,8 487 a 491 | 0,63 1,05 -0,42 | 0,70 1,03 -0,33 | -20,5 487 a 495 | 0,73 1,59 -0,86 | 0,71 1,57 -0,86 | -16,0 487 a 509 | 5,55 6,99 -1,44 | 5,57 7,02 -1,45 | -8,9 487 a 510 | 5,89 7,37 -1,48 | 6,00 7,44 -1,44 | -8,5 487 a 513 | 4,37 6,16 -1,79 | 4,79 6,14 -1,35 | -7,9 488 a 509 | 4,50 5,49 -0,99 | 4,60 5,52 -0,92 | -6,2 488 a 510 | 5,84 6,58 -0,74 | 5,65 6,67 -1,02 | -5,4 490 a 509 | 5,16 6,01 -0,85 | 5,30 6,12 -0,82 | -5,8 490 a 512 | 5,15 6,37 -1,22 | 5,80 6,28 -0,98 | -6,4 490 a 513 | 4,90 6,10 -1,20 | 5,05 6,05 -1,00 | -6,1 503 a 509 | 1,19 1,39 -0,20 | 1,21 1,41 -0,20 | -5,5 TABELA 17: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10933 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO Ernane Jommenses — | | RBD- RBD- mo as o et | | tação captação captação captação 467 a 474 2,52 3,16 -0,64 2,55 3,17 -0,62 | 11,7 470 a 474 1,03 1,46 -0,43 1,03 1,44 -0,41 | -15,6 471 a 474 0,54 0,89 -0,35 0,54 0,89 -0,35 | 19,5 475 a 487 3,62 4,50 -0,88 3,63 4,48 -0,85 | -9,6 475 a 489 3,21 4,48 -1,27 3,26 4,53 1,27 | 11,8 480 a 486 1,79 2,06 -0,27 1,87 2,07 -0,20 | -5,1 480 a 489 2,13 3,67 -1,54 2,18 3,69 -1,51 | -21,2 483 a 486 0,61 0,78 -0,17 0,62 0,78 -0,16 | -9,3 487 a 489 0,02 0,40 -0,38 0,02 0,39 -0,37 | -41,6 [457240 for om [oa [os — om [oa [256] 487 a 491 0,46 1,05 -0,59 0,46 1,03 -0,57 | -32,0

Ernane — Jorn — | | RBD- RBD- 7 captação captação captação captação o, ana [2555 FT 15 so doa 487 a 495 0,74 1,59 -0,85 0,82 1,57 -0,75 | 14,8 487 a 509 6,01 6,99 -0,98 6,14 7,02 -0,88 | -5,7 487 a 510 6,29 7,37 -1,08 6,14 7,44 -1,380 | -7,0 488 a 490 0,19 0,22 -0,03 0,13 0,23 -0,10 | -7,4 488 a 491 0,26 0,37 -0,11 0,25 0,36 -0,11 | 12,3 TABELA 18: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10920 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO formam — |] 471 a 486 4,63 5,40 -0,77 -6,6 475 a 486 2,74 3,27 -0,53 -6,5 491 a 513 5,45 6,57 1,12 -6,6 495 a 510 4,51 5,43 -0,92 -8,5 495 a 513 4,41 5,13 -0,72 -5,4 496 a 515 3,58 4,35 -0,77 -5,4 TABELA 19: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10922 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO penses — 432 a 441 1,86 2,23 -0,37 442 a 452 3,52 4,57 -1,05

TABELA 20: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10936 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO ossenaso [| 351 a 360 2,68 3,10 -0,42 -5,9 432 a 441 1,85 2,23 -0,38 -5,3 442 a 452 2,55 4,57 -2,02 -25,0 443 a 452 2,98 4,01 -1,03 14,2 467 a 470 0,69 0,84 -0,15 -81 471 a 486 4,73 5,40 -0,67 -5,8 491 a 513 5,48 6,57 -1,09 -6,4 495 a 510 4,38 5,43 -1,05 -9,8 TABELA 21: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10954 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO sra 400 a 420 3,67 4,56 -0,89 -5,5 401 a 420 3,39 4,22 -0,83 -5,5 401 a 421 3,44 4,28 -0,84 -5,2 406 a 420 3,32 4,10 -0,78 7,2 406 a 421 3,23 4,11 -0,88 -7,6 406 a 422 3,41 4,16 -0,75 -5,9 407 a 420 2,86 3,62 -0,76 77 407 a 422 2,97 3,74 -0,77 -6,6 453 a 466 1,53 2,23 -0,70 A 453 a 470 3,63 4,53 -0,90 -6,7 453 a 471 4,42 5,22 -0,80 -5,6 471 a 486 4,34 5,40 -1,06 -9,1 472 a 486 4,47 5,29 -0,82 -7,6 [FE RR e Rs es 490 a 513 5,61 6,57 -0,96 -5,3

491 a 513 5,26 6,57 -1,31 77 493 a 512 4,86 5,69 -0,83 -5,7 493 a 513 4,74 5,72 -0,98 -6,4 495 a 510 4,77 5,43 -0,66 -6,2 495 a 513 4,10 5,13 -1,03 -7,6 496 a 512 3,60 4,60 -1,00 -8,6 496 a 515 3,43 4,35 -0,92 -6,4 TABELA 22: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10964 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO rsraR a — 401 a 421 3,87 4,84 -0,97 -6,0 406 a 419 3,34 3,91 -0,57 -5,8 406 a 420 3,47 4,15 -0,68 -6,3 406 a 421 3,53 4,22 -0,69 -5,9 406 a 422 3,66 4,37 -0,71 -5,6 406 a 424 3,31 4,24 -0,93 -6,5 410 a 422 3,04 3,56 -0,52 -5,8 471 a 486 4,65 5,41 -0,76 -6,4 475 a 489 3,34 4,56 1,22 11,3 480 a 489 2,32 3,19 -0,87 121 487 a 509 6,38 7,58 -1,20 TA 495 a 513 4,50 5,20 -0,70 -5,2 496 a 512 4,17 4,80 -0,63 -5,4 496 a 513 3,90 4,85 -0,95 -7,5 TABELA 23: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10977 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO sra [886 fem Rn [FsmSA [msn asno Tao mo 351 a 364 4,82 5,38 -0,56 471 a 486 3,81 5,40 -1,59 472 a 486 4,20 5,29 -1,09

TABELA 24: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10984 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO rsraR ca — 400 a 420 3,73 4,56 -0,83 -5,2 401 a 421 3,47 4,28 -0,81 -5,1 406 a 420 3,35 4,10 -0,75 -7,0 406 a 421 3,31 4,11 -0,80 -6,9 406 a 422 3,47 4,16 -0,69 -5,5 407 a 420 2,88 3,62 -0,74 -7,5 407 a 422 2,94 3,74 -0,80 -6,8 453 a 466 1,51 2,23 -0,72 7,3 453 a 470 3,70 4,53 -0,83 -6,2 453 a 471 4,49 5,22 -0,73 -5,1 471 a 486 4,45 5,40 -0,95 -81 472 a 486 4,63 5,29 -0,66 -6,1 TABELA 25: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10986 EM COMPA-

RAÇÃO COM RBD SOZINHO rsraRo ama EE ar e 400 a 420 3,58 4,56 -0,98 -6,1 400 a 421 3,60 4,61 -1,01 -5,9 401 a 420 3,30 4,22 -0,92 -6,1 401 a 421 3,29 4,28 -0,99 -6,1 401 a 422 3,44 4,43 -0,99 -5,8 406 a 420 3,28 4,10 -0,82 -7,6 406 a 421 3,24 4,11 -0,87 -7,5 406 a 422 3,35 4,16 -0,81 -6,4 407 a 420 2,81 3,62 -0,81 -8,2 407 a 422 2,91 3,74 -0,83 A 453 a 466 1,53 2,23 -0,70 A 453 a 470 3,55 4,53 -0,98 73 453 a 471 4,41 5,22 -0,81 -5,6

471 a 486 4,13 5,40 1,27 10,9 490 a 510 5,13 6,44 -1,31 -8,6 490 a 512 5,33 6,65 -1,32 77 490 a 513 5,25 6,57 -1,32 73 491 a 513 4,29 6,57 -2,28 13,3 493 a 512 4,46 5,69 -1,23 -8,5 493 a 513 4,62 5,72 -1,10 7,2 495 a 513 3,89 5,13 -1,24 -9,3 496 a 513 3,36 4,53 1,17 -9,3 496 a 515 3,05 4,35 -1,30 91 EXEMPLO 12: NEUTRALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS SPIKE DO TIPO SELVAGEM E VARIANTE DE SARS-COV-2

[00221] Para testar se os anticorpos anti-spike de SARS-CoV-2 po- dem neutralizar as variantes SARS-CoV-2, esses anticorpos foram rastreados contra um painel de vírus pseudótipos VSV que expressam proteínas spike de tipo selvagem e variante. Os vírus do pseudótipo VSV foram gerados por transfecção transitória de células 293T com um plasmídeo contento o código da proteína spike de SARS-CoV-2 ou o mesmo plasmídeo contendo variações de nucleotídeo que codificam variantes conhecidas da sequência de aminoácidos da proteína spike de SARS-CoV-2. Todos os plasmídeos foram confirmados por se- quenciação de Sanger. As células foram semeadas em placas de 15 cm a 1,2x107 células por placa em DMEM Complete Media (1.000 mL de DMEM, Gibco; 100 mL de FBS, Gibco; 10 mL de PSG, Gibco) um dia antes da transfecção com 15 ug/placa de DNA de Spike usando 125 uL de lipofectamina LTX, 30 uL de reagente PLUS e até 3 mL de Opti-Mem. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com mL de PBS, depois infectadas com um MOI de 0,1 de vírus VSVAê:mNeon em 10 mL de Opti-Mem. O vírus foi incubado nas células por 1 hora, com agitação suave a cada 10 minutos. As células foram lavadas 3 vezes com 10 mL de PBS e depois cobertas com 20 mL de meio de infecção (1.000 mL de DMEM, Gibco; 10 mL de piruvato de sódio, Gibco; 7 mL de BSA, Sigma; 5 mL de gentamicina, Gibco) antes da incubação a 37 ºC, 5% de CO,» por 24 horas. O sobrenadante do pseudovírus foi coletado em tubos de centrífuga de 250 mL em gelo, depois centrifugado a 3.000 rpm por 5 minutos para granular quaisquer detritos celulares, aliquotados em gelo, e depois congelados a -80 “ºC. A infecciosidade foi testada em células Vero antes do uso em ensaios de neutralização. Este material será referido como pseudovírus VSvAG:mNeon/Spike ou VSVAS:mNeon/Spike (mutação de aminoácido va- riante) (por exemplo, VSVAGS:mNeon/Spike H49Y).

[00222] No dia 1, as células Vero foram semeadas até 80% de con- fluência em frascos T225, as células foram lavadas com PBS (Gibco: 20012-043), o TrypLE foi adicionado para destacar as células do frasco e o DMEM completo foi adicionado para inativar a tripsina. Plaquearam-se

20.000 células Vero em 100 ul de DMEM completo pré-aquecido por poço em microplaca de 96 poços de poliestireno preto (Corning: 3904). No dia 2, o pseudovírus VSVAG:mNeon/Spjke foi descongelado em gelo e diluído com meio de infecção. Os anticorpos foram diluídos em uma pla- ca de 96 poços de fundo em U, gerando uma diluição de cada anticorpo em 210 uL de meio de infecção na concentração de ensaio 2X. 120 ul de anticorpos diluídos foram transferidos para uma placa de fundo em U fresca e meio e um anticorpo de controle IgG1 foram adicionados a cada placa. 120 ul de pseudovírus diluído foi adicionado a todos os poços, exceto os poços de controle de meio. Para esses poços, 120 ul de mei- os de infecção foi adicionado. Pseudovírus com anticorpos foram incuba- dos por 30 minutos em temperatura ambiente, então o meio foi removido das células Vero. 100 uL de mistura anticorpo/pseudovírus foram adicio- nados às células, e, em seguida, incubados a 37 ºC, 5% de CO» durante 24 horas. No dia 3, o sobrenadante foi removido dos poços celulares e substituído por 100 ul de PBS. As placas foram lidas em um SpectraMax i3 com citômetro de imagem MiniMax.

[00223] Além de testar a capacidade de neutralização com o vírus VSV-SARS-CoV-2-S não replicante, os anticorpos também foram tes- tados com o vírus SARS-CoV-2. Anticorpos monoclonais e combina- ções de anticorpos foram diluídos em série em DMEM (Quality Biologi- cal), suplementado com soro fetal bovino inativado por calor (Sigma) a 10% (v/v), penicilina/estreptomicina a 1% (v/v) (penicilina/estrepto- micina) (Gemini Bio-products) e 1% (v/v) de L-glutamina (concentração final de 2 mM, Gibco) (meio VeroE6) até um volume final de 250 ul. Em seguida, 250 mL de meio VeroE6 contendo SARS-CoV-2 (WA-1) (1.000 PFU/mL) foram adicionados a cada diluição de soro e 250 mL de meio como controle não tratado. As misturas vírus-anticorpo foram incubadas por 60 min a 37 ºC. Após a incubação, os títulos de vírus das misturas foram determinados por ensaio em placa. Finalmente, os valores de 50% do título de neutralização de redução de placa (PRNT50) (as diluições séricas nas quais a formação de placa foi re- duzida em 50% em relação à do controle não tratado) foram calcula- dos usando uma curva logística de 4 parâmetros, ajustada aos dados percentuais de neutralização (GraphPad Software, La Jolla, CA).

[00224] A metade da concentração inibitória máxima (IC50) de anti- corpo monoclonal individual contra pseudovírus que expressa a proteína (S) spike de VSV-SARS-CoV-2 que codifica a sequência Wuhan-Hu-1 (Número de acesso NCBIMN908947.3) da proteína spike (S-wt) foi de- terminada em células Vero (Tabela 26). A maioria dos anticorpos apre- sentou potência de neutralização na faixa picomolar (pM), com alguns exibindo potência de neutralização na faixa nanomolar (nM).

[00225] Embora o ACE2 recombinante tenha sido capaz de mediar a neutralização das pseudopartículas spike de VSV, conforme relatado anteriormente, sua potência era muito inferior à dos anticorpos mono- clonais, com uma diminuição de mais de 1.000 vezes a potência ob- servada em relação aos melhores mAbs neutralizantes (Figura 10A)

Além disso, a potente atividade neutralizante de mAb10987, mMAb10989, mAb10933 e mAb10934 foi confirmada em ensaios de neutralização, incluindo a neutralização de SARS-CoV-2 em células VeroE6 (Figura 10B). Todos os ensaios de neutralização geraram po- tência semelhante nos quatro mAbs (mAb10987, mAb10989, mMAb10933 e mAb10934) e nenhuma combinação demonstrou ativida- de de neutralização sinérgica (Figura 10B).

TABELA 26: POTÊNCIA DE NEUTRALIZAÇÃO DO MAB (IC50 (M))

CONTRA A CEPA DO TIPO SELVAGEM DAS PSEUDOPARTÍCULAS DE VSV-SARS-COV-2-S EM CÉLULAS VERO mAb10957 1,76E-10 mAb10964 5,70E-11 mAb10965 1,42E-10 mAb10966 1,00E-10 mAb10967 2,43E-10 mAb10970 1,26E-10 mAb10971 1,55E-10 mAb10977 5,15E-11 mAb10982 3,69E-10 mAb10984 9,73E-11 mAb10985 2,57E-10 mAb10986 9,91E-11 mAb10988 2,98E-10 mAb10969 2,27E-09 mAb10996 1,13E-08 mAb10998 9,51E-09 mAb11000 2,79E-08 mAb11004 6,00E-09 mAb11006 1,40E-09 mAb11008 2,05E-08

[00226] As variantes de aminoácidos na proteína spike (S) foram identificadas em mais de 7.000 sequências SARS-CoV-2 disponíveis ao público, representando isolados em circulação global, e clonadas em pseudopartículas de VSV. Foram realizados ensaios de neutraliza- ção com pseudopartículas que codificam variantes, para avaliar o im- pacto de cada variante na potência de neutralização dos anticorpos monoclonais. A Tabela 27 ilustra a potência relativa de neutralização de anticorpos monoclonais contra pseudopartículas que codificam va- riantes em relação a spike de SARS-CoV-2 (S-wt) a uma concentração única de 5 ug/mL. A percentagem de neutralização em relação a S-wt foi capturada para cada anticorpo e variante individual. Nenhum dos anticorpos demonstrou perda de potência de neutralização na concen- tração de 5 ug/mL, com exceção do mAb10985 e da variante R408I.

Esses dados demonstram ampla cobertura de neutralização funcional de anticorpos monoclonais contra variantes spike de SARS-CoV-2 em circulação global.

[00227] Para interrogar ainda mais o impacto das variantes da pro- teína S na potência de neutralização dos anticorpos monoclonais, fo- ram executadas curvas de neutralização completas para determinar o valor de IC50 dos anticorpos neutralizantes mais potentes contra um subconjunto de variantes localizadas no domínio de ligação de recep- tor (RBD) da proteína S. A Tabela 28 mostra os valores de neutraliza- ção de IC50 para cada pseudopartícula variante. Pode ser observada variabilidade intrínseca de até 3 vezes entre os ensaios de neutraliza- ção de pseudopartículas e a mesma não indica uma alteração na po- tência de neutralização. Estes dados demonstram que os anticorpos mantiveram sua potência de neutralização contra um painel diverso de variantes de proteína S RBD. TABELA 27 NEUTRALIZAÇÃO RELATIVA DE VARIANTES DE VSV- SARS-COV-2 QUE CODIFICAM PROTEÍNA S NA CONCENTRAÇÃO DE 5 MG/ML DE ANTICORPO EM CÉLULAS VERO mAb10989 [ 100% | 100% 100% 100% 100% | 100% mAb10987 | 100% | 100% 100% 100% | 100% mAb10933 [ 100% | 100% 100% 100% mAb10977 | 100% | 100% 100% 100% 100% | 100% mAb10934 | 100% | 100% 100% 100% 100% mAb10964 | 100% | 100% 100% 100% | 100% mAb10954 | 100% | 100% 100% 100% 100% | 100% mAb10984 | 100% | 100% 100% 100% mAb10986 | 100% | 100% 100% 100% | 100% mAb10966 | 100% | 100% 100% 100% | 100% mAb10936 | 100% | 100% 100% 100% [100% mAb10955 [| 100% | 100% 100% | 100% mAb10970 | 100% | 100% 100% [100% 100% | 100%

55 pese [55 [e [05 [rn rea [is [5 | TABELA 28. IC50 (M) DE NEUTRALIZAÇÃO DAS VARIANTES DE VSV-SARS-CoV-2-S RBD EM CÉLULAS VERO [ams vam [AT [ND [san [vsrF [GAS [ROM | Controle delsotipo G1 TABELA 28 (CONTINUAÇÃO) [avos Tasss Tassm [173 [caros [venia [Ysosm [5997 | mtas RR o mAb10933 | 11 11 n 11 10 11 n 11 [mana DR RR O mAb10934 |11 11 n 11 n 11 n 11

[as TARSS TRAS THA Tomas Tvasa vet THSS| 1,52E- |2/18E [1,59E [261E |[210E |[171E |/283E |1,08E mama [155 ET e e e] 195E |1,57E [1,006 /224E |[1,13E /[/9/70E |/201E |6,14E 4,06E- |3,88E- |1,68E- |4,/18E |1,86E [2,60E |275E |2,20E mAb10987 | 11 n nu n nu n nu n 2,12E- [1,10E |751E |[227E |[680E [878 |171E |[451E mAb10989 | 11 n 12 n 12 12 nu 12 B61E- [7,900E |[546E |[107E [342E [450E |[/102E /|/445E 264E- [211E |[145E [34E |[183E |[112E |[/205E |/140E mAb10954 | 10 10 10 10 10 10 10 10 Controle de Isotipo 1gG1 ND ND ND ND ND ND ND ND EXEMPLO 13: CINÉTICA DE LIGAÇÃO BIACORE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S PURIFICADOS

[00228] Constante de equilíbrio de dissociação (Kp) para diferen- tes reagentes SARS-CoV-2 RBD que se ligam a anticorpos mono- clonais (mAbs) CHOt anti-SARS-CoV-2 purificados foram determi- nadas usando um biossensor Biacore T200/Biacore 8K à base de ressonância de plasmon de tempo real de superfície. Todos os es- tudos de ligação foram realizados em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e tensoativo Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET) em tampão de corrida a 25 ºC e 37 ºC. A superfície do chip do sen- sor Biacore CMB5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com mAb específico para Fc anti-humano de camundongo (Regene- ron, mAb2567) para capturar anti-SARS-CoV-2bmAbs. Estudos de ligação foram realizados no domínio extracelular humano SARS- Cov-2 RBD expresso com um domínio C-terminal myc-myc- hexahistidina (SARS-CoV-2 RBD-MMH) e domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD expresso com um IgG2a C-terminal de camun- dongo (SARS-CoV-2 RBD-mFc). A utilização destes reagentes per- mitiu testar a capacidade dos anticorpos de se ligarem a peptídeos

RBD monoméricos e diméricos, respectivamente.

[00229] Diferentes concentrações de hSARS-CoV-2 RBD-MMH (90 nM - 3,33 nM, diluição de 3 vezes) e SARS-CoV-2 RBD-mFc (diluição de 3 vezes 30 nM a 1,11 nM) preparadas em tampão de corrida HBS- ET, foram injetados por 3 minutos a uma taxa de fluxo de 50 uL/min enquanto a dissociação de mAb ligou diferentes reagentes SARS- CoV-2 RBD foi monitorada por 6 a 10 minutos em tampão de corrida HBS-ET. No final de cada ciclo, a superfície de captura de mAb SARS-CoV-2 RBD foi regenerada usando injeção de 12 s de ácido fosfórico 20 mM para a superfície de mAb específico para Fc anti- humano de camundongo. A velocidade de associação (ka) e veloci- dade de dissociação (kJ) foram determinados através do ajuste de sensogramas de tempo real de ligação a um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa utilizando software BlAevalua- tion v3.1 ou Biacore Insight Evaluation v2.0 ou software de ajuste de curvas. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (Kp) e meias vidas dissociativas (t/2) foram calculadas a partir das constan- tes de taxa de cinética como: Kp (M) = = e t/º (min) = 22,

[00230] Parâmetros de cinética de ligação para diferentes mAbs de SARS-CoV-2 que se ligam a diferentes reagentes anti-SARS-CoV-2 RBD da invenção a 25 ºC e 37 ºC são mostrados nas Tabelas 29 a 32, respectivamente.

TABELA 29: PARAMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGA- ÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S A 25 ºC.

mAb capturado Nível de Captura de | Ag de 90 nM kh ka rA (número de mAb) mMAb(RU) ligado (RU) (1Ms) (1s) (min) oa ag A voe ea ease toa a a A ue g7eeos Janeo a Patos aa a osiea roseoa seo Tosa mabrogao agr a O a5sesos 130602 1ageog Toa toa a E O oresos sea amos agg oa poa a eres aseos o ae a a aaa ag O va seas eres saga masa ga O oe ae agora Rg mabroaao O og rag ss O a4esos 93403 a7aeor a [mabiosãa assa rag asseio 55 1260 > 1350 => = foss ==>) mara ag ses ore Tr exegs a atoa a o age seas aaa a as gia a goes eos ore ag mara a rr O re se H oreas gre nlÇÇ [mabronas aaa e ae Tae Jaateoo Tso [mabiosão 3342 la: [16805 J28Eso 5 = ja7rxeos 5 [aro >=) atoa ag ag oe seas age Pmabroaa ara a xeos = ane anos - 1oso mas ag gg a ue O 6aeça aeee ag [maniosss UU fossas ass ses 2 1388 5a [mariosss À age as ares Tsoseos — J18Eos Tag mabroasz O ogro segs asse reaeoo as [mabiosss —>>>/2sa6en2 —=>Jong 1656068 > 390604 >= Ja36e10 >> 1ase > | as asa pag a ae eos asas mapronss asse O ageos ese seo a [mantonez À agnasn a 44Esos = 63BE0S => lsoeo lg manos ara aa a a assess somos assess ag maio agora as aaresos 11063 asse Tas oa asa pa a SEO seda aves og mada aos gases Tosse > J106Eo Tag) mara agr asas ag vacas Pose reseoe

EXTUEC EMS A EMA PUT ETTA PUT EA mAbIO98S 306,9421 134 1,44E+06 1,55E-03 1,08E-09 75 Lmapross Passas oa O g6aeos QT raoeos ae 77,5 mara aro ge e vs ses oe oras a [mantosss UU fara s e gxesos amem — —/32reos fo,

EXT EEE EE EETZ EERTO EETET E DM atras aa aaa a aero asa aerea mabrosss aa a Na5aEsO5 reaeoo sam fo ma aa ga ag gv age raros oe ag [mabitoe Paga a ssesos = 167 —laoreos == [7 oras aaa Nose soe Tasso faça oras arg ga voa ae segs a [mero Jeni eo [ines ameno faser fo na ne a O A O O e

TABELA 30: PARÂMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGA- ÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S A 37 ºC. Em mer e E E E (número de mAb) maAb (RU) ligado (RU) (1) (min) met ze ao ses ser Er oz [mabioois —[aorsa [68 [2560 [15860 [63EM [07 [nabtoots o [aorta Soa [ASTES o [TSE [4BEdo o 153 [mabtogo asa 7a [eis [ae [56068 os 56 12 [mantas fassa fa fetos [2702 [aeets [os [mabtooa — [ao6es [ID [2996 [BABES [20E0S [19 [manto ana ro [ese [1ERo [eres os [manto fassa [9 [140605 [65E0 [asso Tre 14 [manto asa [Amo [ese [29602 [502E [os [mantas ass [75 [fases [374602 [sete [os maos ga a a Nose ssa sessena o, os [manto fassa [10 [tos [1260 [10608 [103 [manto ass o [20 — [94EN [39Et 12 nabo [asa [Bo [4426506 [123602 [670648 [os nabtoar [aero IM [19TEAS [1780 [amet — es [nabtoose ara [568Es [13860 [23860 [as [madtoss —asiso fato [asse [12602 [aneis Jos [mabtooss 38323 fa fosses [130602 [3648 09 manto [21 [o [eae — [61 fases [187

E [nabtones [aaa [6 [2296508 [919E0 [41E0S 13 [mabtoes —fasn229 [Bo [age [167ES [376608 [es manto assa a oresos 1 o6eeoas 138609 1447 [manto 34953 fa aoresos [159802 [aeee o [manto ae [Bo [ses fazes este [Ts as mAb10982 347,581,3 67 1,94E+05 9,42E-03 485E-08 12 Enaptoas [sor [RE [326508 [18609 [555600 6 [mabtoss — aos [8 [257608 [a2E0 [1660 7 [mabtoãs —aaeats [12 [8246505 [58604 70rEdo [198 [mabtoss —Jastsa fer faxes [251602 [200608 [os manos ea gi vv res 7a eae oa [mabtooss anseio [AR [297608 [146802 [39060 [to [mabtoos —fsaazo TAB [1066s0s o [128602 [14 [os [mantoos Jarno 115 [2860 [75 [26 [ts [mabtioo fiat fer [28960 [one [ate [1 15 CABO o [eat Ia [178680 o [148509 B4BETO [78 [mabtioos asa 198 [628605 o [148602 [236608 [08 [mabrioos Jesse fa [142605 [151609 [1060 [76 a o vp Rg E As ue os ma 66 ag NB RB NB

TABELA 31: PARÂMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGA- ÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-mFc A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S A 25 ºC.

sm mes E E E E (número de mAb) mMAb(RU) ligado (RU) (1Ms) (1s) (min) a sao eme ER [SE [ao | [nabtoota [ABsod Tao [286605 [14004 [640EID [885 [mabtoots — isso ao [283605 [91 [32EN [1268 [nantoso 650 [6 [see [asse [SBEIDO 1453 Enaptoa [osoa [a [266E0S — [a3ME0S [12EID [368 [mabiooaa A4eoEo [8 [320606 [5640 [476EI 12048 | [nabtooas to A [369Ee [138E [BEI 1856 manto [aros 7 [eme [7665 [aero 115 [mabtoso — iozaad [eo [945 o [7 [EO [6rS manto fisos 6 [assess [2880 [OE 1453 | [nabtooas ossos 72 6/6Es6 [610EAS mm [986EtE [1893 nantes sos 7 [12ero [asse [Berto 17 [mabtoas fizesse [13606 [10 [TSE [19 | [mabioogr — Aossoa 6 [178606 [540608 [BEI 12139 nantes as ao rage [166 [7BEITO 1684 Emantoso faso [6 ares [asse o [12SEI 1279 | Enaptoat [asso [6 [370608 [348E0S — [OBEI [BO [manto oeste frases [4780 [aBEITO 126 nabo [oazaas [12606 [3380 [AMEI [345 [manto foa35oa 7 [aos [assess [Agel 1330 [mabtoas — o2208 [6 [68MES [SEA [RETO [760 nano logar ss O vv e caes ass ga ess [mabioio — [aasaso [8 [46Mess o [1000 [246EID [1155 [mabtooro Basa as 219E06 [408E0A [ABB 1288 [manter [oe 7 [1826506 [22605 [126EITO [5044 [manto sagsot [5 [910Es0s [Bose [8MSEITo [183 | [mabtooa [iarsos [e [139606 o Sa9rEAS o [266 12009) mAb10985 112703 TT 8,09E+06 8,51E-05 1,05E-11 1357 [nantoas —foa2eos fe [a70E6 [24005 [essEir [as Fnabtoaer sBsaz IR [31966 [AE [BE [22 [nantes ionesoe 6 [aeee [50EM [1926 [227 [manto fieis [o [18607 [966 [6ER [1199 Enabtooas — [HoZ508 TB [562605 [802E0A [18E0 [16 [mabtooas — [o4Beod TS [1476506 [2S8E0S [24609 [32 [nano esa mo [es [EMO [115 as manto i2sos eo [554605 [24ES [4668 47 [manto feg2e0s — [66 [ósseos — [640605 — [92EN [1808 FmabTDOs o [a8Eo7 [7 [330605 [S2ENS [18860 [217 [manto iotesoe 6 [3905 [18280 [4826 [62 1285 mao as a BB ONE

TABELA 32: PARAMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGA- ÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-mFc A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S A 37 ºC sm Eme h =« E E (número de mab) mAb (RU) ligado (RU) (min) 7 525 mabtooas rasos a Tee somos [1seto [1675 manrosao ssa eae TT rsseos [ie 1153 matos Tasso Te Tessesos — 1369 1aneio — 9% mao oa ga a6oEsOS rea aaet 172 [masiosas [14:08 — 88 553606 1866 [338EM [624 mantogaa sia a nes 136 Tipen fo 193 manta seis RT augesos — Tesseos — [155610 — [1684 mantas sara a r5oesos — TT raseos — rose 155 navrossa ss TR ser rasos [anem o 139 [maoiogs Tiso [10 [5686 fame — [een — 234 Cmábtoga seio aa 3916 675Eos [EI [1 [maoiossz 11206 — 8 Tógess — [576 [136 [2012

176.1 [mantogso T1soso08 To 16666 — Tie — [1sewo — 700 maotogao asso as NT ssaesos soaeos — Jonez 127 natos sao o Tg0265s — TS soeos —1oEto [142 mabioosa razao os aos Treo een [6 mantonss assar ar 1926ss — Tosseos — [20eto — 295 [maiosso Treo — Tn Pres — 32x — [1sseo 38 [matos 377212 no T15sess — 716058 [4661 — [1606 [matos — 125203 Ta ser Tea 1xen Jo mantas asa Ee age ares 1a4o [mabtoges asa a ses ooo oe [163 [mantida 1233209 fat fases — [3336068 — [2261 [3668 91,9 215 noto ss asos a ogess JT aateos aee 17 [maior [1458:07 — [93 50606 —[10EM — [43EM [1079 [maniosz 15508 7a 133606 sexo [ane — [48 Cmantogsa — T1sg4zo7 no Dores —fg36os — [4oet [187 mAD1098S 1518207 o 9,36E+06 375604 401E1 208 nabtoses Tess Ta Te596x06 — 579605 — Tien 185 mantogaz so far 50466 sea sen 126 [maoioges — 1386305 — faz Teses 7a een 16 [maio 161206 — 2 Tim —6es — [asen 36 [maoiogos — 129:04 72 [ease 2468 — 26808 az [madtosss — Topssios Tm Tateeos — oem xe —Tos [manto sao a 1636 rea sen og manto rssasoz fa sois ese Taaseos Toy mabrioos essa a oe eos [1reso — Targ ) manto sor far assess reseos — irei — Tiso manto seo TR egos Tsoseoa Tae Dos oa uu cava SOS soe soe gg Cmaotssa O egos OS BB TB NWA EXEMPLO 14: ANTICORPOS ANTI-SARS-CoV-2 BLOQUEIAM A LI- GAÇÃO DE RBD A HACE2 CONFORME DETERMINADO POR ELISA

[00231] Um ensaio de bloqueio baseado em ELISA foi usado para determinar a capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2 para blo- quear a ligação do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína spike de SARS-CoV-2 ao seu receptor, enzima de conversão de an- giotensina humana 2 (hACE2).

[00232] A proteína SARS-CoV-2 utilizada neste ensaio foi composta pela porção do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína spi-

ke de SARS-CoV-2 (aminoácidos Arg319-Phe541) expressa com a porção Fc da IgG1 humana c-terminal (SARS-CoV-2 RBD-hFc). A pro- teína ACE2 humana usada nos experimentos foi adquirida da R&D Systems e era composta pelos aminoácidos Gln18-Ser740 com um marcador 10X-Histidina C-terminal (hACE2-His; Número de Acesso NCBI Q9BYF1).

[00233] Os experimentos foram realizados usando o procedimento a seguir. Um anticorpo monoclional anti-Penta-His (Qiagen) foi revesti- do a 1 ug/ml em PBS em uma placa de microtitulação de 96 poços du- rante a noite a 4 ºC. O receptor hACE2-His foi adicionado a 0,2 ug/ml em PBS e ligado durante duas horas à temperatura ambiente (RT). Os sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados com o uso de uma solução a 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Em outras placas de microtitulação, uma quantidade constante de 100 pM de pro- teína SARS-CoV-2 RBD-hFc foi ligada a anticorpos anti-SARS-CoV-2 e um controle de anticorpo isotipo IgG1 em diluições de 0,0008 nM a 50 nM em PBS + 0,5% de BSA. Após uma hora de incubação, as solu- ções da mistura foram transferidas para o hACE2-His revestido com placa de microtitulação. Após 1,5 horas de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados e o SARS-COV? ligado à placa foi detectado com anticorpo IgG de cabra anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson). As placas foram en- tão desenvolvidas usando solução de substrato TMB (BD Biosciences, número 555214) de acordo com a recomendação do fabricante e a ab- sorbância a 450 nm foi medida em um leitor de placas Victor X5.

[00234] Os dados de ligação foram analisados usando um modelo sigmoidal de dose-resposta no software Prism'“ (GraphPad). O valor calculado de IC50, definido como a concentração de anticorpo neces- sária para bloquear 50% da ligação de SARS-CoV-2 RBD-hFc ao hA- CE2-His revestido à placa, foi usado como um indicador de potência de bloqueio. O percentual de bloqueio foi definido com base no sinal de ligação corrigido de fundo observado na maior concentração de an- ticorpos testada usando esta fórmula e relatado para todos os anticor- pos testados: % de bloqueio —=100=( [Sinal experimental (conc de Ab mais ato) - Sinal de fundo (tampão)] x100) [Sinal máximo (somente nEGF.mFc) - Sinal de fundo (tampão)]

[00235] Os anticorpos que bloquearam a ligação menor ou igual a 50% na concentração mais alta testada foram classificados como não bloqueadores e os valores de IC50 não foram relatados para esses anticorpos.

[00236] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2 para blo- quear a ligação do SARS-CoV-2 RBD à ACE2 humana foi avaliada usando um ELISA de bloqueio. Neste ensaio, 100 pM de SARS-CoV-2 RBD-hFc foi titulado com uma ampla faixa de concentrações do anti- corpo anti-SARS-CoV-2-S e a inibição da presença do anticorpo na ligação de RBD à hACE2-His foi avaliados. O RBD-hFc ligado à placa foi detectado com um anticorpo anti-hFc conjugado com HRP.

[00237] OslC50s de bloqueio e o bloqueio máximo nas concentra- ções mais altas testadas dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S estão re- sumidos na Tabela 33 e as curvas de bloqueio mostradas nas Figuras 1 a 8. Dos 46 anticorpos testados, 44 exibiram bloqueio dependente da concentração de anticorpos da ligação de RBD.hFc a hACE-2. Os valores de IC50 variaram de 41 pM a 4,5 nM e o bloqueio máximo va- riando de 55% a cerca de 100% na maior concentração de anticorpos testada. Dois dos 46 anticorpos testados não mostraram atividades de bloqueio nas condições do ensaio. O anticorpo irrelevante de controle de isótipo não mostrou atividade bloqueadora, como esperado.

TABELA 33: POTÊNCIA DE BLOQUEIO DE ANTICORPOS ANTI- SAR-CoV-2 NA LIGAÇÃO DE SPIKE RBD-hFc À ACE-2 HUMANA

IMOBILIZADA % De Bloqueio do 2 5 areas, EEE ção de Ensaio | (RBD).hFc a ACE2 ICso, M (RBD).hFc a ACE2 mantoota [1 amei fo [mantoats [1 aero fe mantosar [1 asseio fe [mantosas [1 resto fa [mabiosa a eo [a [mantosso 2 aaeto fa [mantossa [1 arseto fe mantoess [1 rare fe mantoesa [1 agent fa [mantossa 3 serem fe [mabiossa 2 faser [mantoess [1 roeto fe [mantosss 12 ese fe mantoest [1 esse fe [mantosss [1 arseto fe A [mantosss 2 raseto fe [mabiossz 2 neto o [

% De Bloqueio do 2 em aaa, EEE ção de Ensaio | (RBD).hFc a ACE2 ICso, M (RBD).hFc a ACE2

[manto [2 [150Edo Ta A [mantoseT 2 a80eto fa rapto [2 [EO a A manto [2 BE o [9 [mabtosss [2 EE a [mabTos [2 RE [a A [manto [3 BET [mabtosso 2 aero fa [map [3 NB Ig A

Controle de

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Controle de

MAb193250 e ho |

Controle de

MAb193250 EL L k Nota: RBD-hFc a 100 pM foi titulado com anticorpos anti-SARS-CoV-2- S em diluições em série de 50 nM e RBD-hFc ligado no hACE2 imobi- lizado com um marcador de histidina 10x e detectado com anticorpo anti-hFc conjugado com HRP.

NBD; nenhum bloqueio detectado.

EXEMPLO 15: COMPETIÇÃO CRUZADA ENTRE mAb10987 mMAb10989, mAb10933 e mAb10934

[00238] “mAb10987, mAb10989, mAb10933 e mAb10934 foram examinados em ensaios de ligação de competição cruzada (Figura 11), identificando vários pares de mAbs não concorrentes com potên- cia de neutralização picomolar que potencialmente poderiam ser com- binados para formar coquetéis de anticorpos, por exemplo, mAb10987 e mAbO0933.

[00239] O binning epitópico dos mAbs anti-SARS-CoV-2-S foi con- duzido em um formato sanduíche pré-mistura envolvendo mAbs con- correntes uns contra os outros de maneira combinatória aos pares pa- ra ligação à proteína SARS-CoV-2 RBD-MMH usando um Instrumento de interferometria de biocamada ForteBio Octet HTX (Molecular Devi- ces ForteBio LLC, Fremont, CA) com tampão de corrida de HEPES 10 MM, NaCl 150 mM, Tween-20 a 0,05% (v/v), pH 7,4, BSA a 1 mg/ml. Os ensaios foram realizados a 30 ºC com agitação contínua a 1.000 rpm. Após a obtenção de uma linha de base inicial no tampão de corri- da, 20 ug/ml de mAbs anti-COVID19 foram capturados nas pontas do biossensor anti-Fc (AHC) humano por 300 s. Para bloquear os locais de ligação não saturados livres restantes nas pontas do biossensor AHC, todos os sensores foram expostos por 240 s ao poço de solução de bloqueio contendo 100 ug/ml de IgG1 irrelevante. Após este pro- cesso, os biossensores foram imersos em poços contendo solução pré-mistura de 100 nM de proteína SARS CoV-2 RBD-MMH e 600 nM de sítio de ligação a mAb anti-COVID19 de um segundo mAbs por 300 s. A resposta de ligação em cada etapa foi registrada e o sinal especí- fico foi normalizado subtraindo o controle competitivo do mAb autoblo- queador do conjunto de dados. A análise dos dados foi realizada com o software Octet Data Analysis HT 10.0, utilizando o Epitope Binning.

[00240] A comparação dos ensaios de ligação de competição cru-

zada com os resultados de HDX-MS descritos acima fornece informa- ções estruturais sobre o mecanismo pelo qual pares de anticorpos não concorrentes podem se ligar simultaneamente ao RBD e, portanto, po- dem ser parceiros ideais para um coquetel de anticorpos terapêuticos. O mAb10987 e o mAb10933 representam esse par de anticorpos. O mAb10933 tem como alvo a região de loop tipo spike em uma extremi- dade da interface ACE2. Dentro dessa região, os resíduos que mos- tram a proteção HDX mais significativa pelo mAb10933 estão voltados para cima, sugerindo que a região Fab do mAb10933 se liga ao RBD a partir da direção superior, onde o mMAb10933 terá colisões significati- vas com o ACE2. Para evitar a competição com o mAb10933, o mMAb10987 se liga apenas às regiões protegidas definidas por HDX do lado frontal ou inferior esquerdo (na vista frontal do mAb10987 na Fi- gura 12). Isso é consistente com os dados de neutralização descritos acima, pois o mMAb10987 o orientaria em uma posição com alta proba- bilidade de interferir com a ACE2.

EXEMPLO 16: DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA DA PROTEÍNA

SPIKE LIGADA AO ANTICORPO

[00241] — Para entender melhor a ligação de mAb10933 e mAb10987 à proteína spike RBD, a análise estrutural foi realizada por microscopia crioeletrônica (cryoEM). Os fragmentos Fab de mAb10933 e mAb10987 foram isolados usando o kit FApDALACTICA (Genovis). 600 pg do mAb10933 Fab e 600 ug do mAb10987 Fab foram misturados com 300 ug de SARS-CoV-2-S RBD e incubados em gelo por — 1 hora e depois injetados em uma coluna de filtração em gel de aumento Su- perdex 200 equilibrada para 50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM. As fra- ções de pico que contêm o complexo mAb10933 Fab - mAb10987 Fab - RBD foram coletadas e concentradas usando um filtro centrífugo de kDa MWCO. Para a preparação da grade cryoEM, a amostra de proteína foi diluída para 1,5 mg/ml e foi adicionado 0,15% de anfipol de

PMAL-C8. Foram depositados 3,5 ul de proteína em uma grelha UIl- trAufoil limpa com plasma recente (1,2/1,3, malha 300). A solução em excesso foi removida por blot com papel de filtro e mergulhada em etano líquido usando uma Vitrobot Mark IV. A grade cryoEM foi trans- ferida para um Titan Krios (Thermo Fisher) equipado com um detector K3 (Gatan). Os filmes foram coletados usando EPU (Thermo Fisher) com ampliação de 105.000x, correspondendo a um tamanho de pixel de 0,85 À. Foi utilizada uma taxa de dose de 15 elétrons por pixel por segundo e cada filme foi de 2 segundos, correspondendo a uma dose total de — 40 elétrons por À2.

[00242] “Todo o processamento dos dados do cryoEM foi realizado usando o cryoSPARC v2.14.2. 2.821 filmes foram alinhados usando correção de movimento de patch e estimativa de patch CTF. 2.197 mi- crografias alinhadas foram selecionadas para processamento adicional com base nos valores estimados de desfocagem e nas resoluções de ajuste do CTF. Um conjunto inicial de partículas colhidas usando o se- letor de blob foi submetido à classificação 2D para gerar modelos para a seleção de modelos. 989.553 partículas colhidas por coleta de mo- delos foram submetidas a várias rodadas de classificação 2D para re- mover fabs não ligadas e partículas contendo um complexo incomple- to. A reconstrução ab initio com três classes gerou uma única classe contendo 61.707 partículas que correspondiam ao complexo mAb10933 Fab - mAb10987 Fab - RBD. O refinamento heterogêneo das partículas desta classe, seguido de um refinamento não uniforme, resultou em um mapa de resolução de 3,9 À (FSC = 0,143) contendo

48.140 partículas que foram usadas para a construção do modelo. Neste mapa, modelos de RBD (retirados do código PDB 6M17) e os dois Fabs (retirados de estruturas de anticorpos anteriores, exceto a cadeia leve lambda de mAb10987 que veio do PDB código 5U15), fo- ram colocados manualmente. Esses modelos foram reconstruídos ma-

nualmente usando Coot e o espaço real refinado no mapa usando Phenix.

[00243] “Confirmando os dados acima descritos, o cryoEM de partí- cula única do complexo de spike de SARS-CoV-2 RBD ligado a frag- mentos Fab de mAb10933 e mAb10987 mostra que os dois anticorpos neste coquetel podem se ligar simultaneamente a regiões distintas do RBD (Figura 13A, Figura 13B e Figura 14). Um mapa reconstruído em 3D do complexo com resolução nominal de 3,9À mostra que os dois fragmentos Fab se ligam em diferentes epítopos no RBD, confirmando que são anticorpos não concorrentes. O mAb10933 se liga na parte superior do RBD, sobrepondo extensivamente o sítio de ligação da ACE?2. Por outro lado, o epítopo do mAb10987 está localizado no lado do RBD, bem longe do epítopo do mMAb10933, e tem pouca ou nenhu- ma sobreposição com o local de ligação ao ACE2. EXEMPLO 17: COMPETIÇÃO CRUZADA ENTRE MABS ANTI-SARS- CoV-2-S

[00244] A competição de ligação entre os anticorpos monocionais (mAbs) anti-SARS-CoV-2-S foi determinada usando um ensaio de in- terferometria de camada biológica (BLI) sem marcador em tempo real na plataforma de biossensor Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo o experimento foi realizado a 25 ºC em 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, 1 mg/ml de BSA, pH de 7,4 (HBS-EBT), com a placa agitando a uma velocidade de 1.000 rpm. Para avaliar se dois mAbs foram capazes de competir entre si pela ligação a seus respectivos epítopos no domínio extracelu- lar SARS-CoV-2-S RBD expresso com um myc-myc-hexahistidina C- terminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), -— 0,51 nm de SARS-CoV-2-S RBD-MMH foram capturados pela primeira vez nas pontas de biossen- sores Octet revestidos com anticorpo anti-Penta-His (Fortebio Inc, nú- mero 18-5122) submergindo as pontas de biossensores por 1 minuto em poços contendo uma solução de 10 ug/ml de SARS-CoV-2-S RBD- MMH. As pontas do biossensor capturado por SARS-CoV-2-S RBD- MMH foram então saturadas com um primeiro anticorpo monoclional anti-SARS-CoV-2-S (posteriormente dito como mAb-1) mergulhando em poços contendo 50 pg/ml de solução mAb-1 por 5 minutos. As pon- tas do biossensor foram posteriormente mergulhadas em poços con- tendo 50 pg/ml de solução de um segundo anticorpo monoclonal anti- SARS-CoV-2 (subsequentemente dito como mAb-2) por 5 minutos. As pontas do biossensor foram lavadas em tampão HBS-ETB entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real foi monito- rada durante todo o curso do experimento e a resposta de ligação no final de cada etapa foi registrada. A resposta da ligação do mAb-2 ao SARS-CoV-2 RBD-MMH pré-complexado com o mAb-1 foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticor- pos monoclonais anti-SARS-CoV-2 foi determinado como mostrado na Tabela 34.

TABELA 34: COMPETIÇÃO CRUZADA ENTRE ANTICORPOS ANTI- SARS-CoV-2-S mto ra compeldo comrAbA

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PE ORE mAb11010 men mes mAb10987

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E PE OO ARTRAETAA

RR aa comeemás om Am EXEMPLO 18: SENSIBILIDADE AO pH DE ANTICORPOS MONO- CLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S QUE SE LIGAM A REAGENTES MO- NOMÉRICOS SARS-CoV-2-S RBD MEDIDOS A 37 “ºC

[00245] As constantes da taxa de dissociação (ka) para diferentes anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S em tampões de pH 7,4, pH 6,0 e pH 5,0 foram determinadas usando um biossensor Biacore T200 baseado em ressonância plasmônica de superfície (SPR) em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados a 37 “ºC, usando três tampões de corrida, (i) PBS, 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, pH7,4 (PBS-T-pH7,4) (ii) PBS, 0,05% v/v de tensoativo

Tween-20, pH6,0 (PBS-T-pH6,0) e (iii) PBS, 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, pH5,0 (PBS-T-pH5,0). A superfície do chip do sensor Bia- core CMB5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com um mAb específico para Fc anti-humano de camundongo (Regeneron) pa- ra capturar anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S. Foram reali- zados estudos de ligação no domínio extracelular humano do SARS- CovV-2-S RBD expresso com uma myc-myc-hexahistidina C-terminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), concentrações únicas de SARS-CoV-2-S RBD- MMH (90 nM) preparadas no tampão PBS-T-pH 7,4 foram injeta- das a uma taxa de fluxo de 25 ul/min por 3 minutos, seguido pela disso- ciação do SARS-CoV-2-S RBD-MMH ligado em tampões de corrida PBS-T-pH 7,4, PBS-T-pH 6,0 ou PBS-T PBS-T-pH 5,0 por 5 minutos.

[00246] As constantes da taxa de dissociação (ks) em quatro tam- pões de pH foram determinadas ajustando os diagramas dos sensores de ligação em tempo real a um modelo de ligação 1:1 usando o sof- tware de ajuste de curva Scrubber 2.0c. A meia-vida dissociativa (t7) foi calculada a partir dos valores de ka como: ta (min) = 22.

[00247] Os valores kg e t/º para ligação a SARS-CoV-2-S RBD- MMH para diferentes anticorpos monoclonais de anti-SARS-CoV-2-S em PBS-T-pH 7,4, seguida por dissociação em PBS-T-pH 7,4 e PBS - T-pH 6,0 a 37 ºC, são mostrados na Tabela 35. Os valores kg e t'/º pa- ra ligação a SARS-CoV-2-S RBD-MMH para diferentes anticorpos mo- noclonais de anti-SARS-CoV-2-S em PBS-T-pH 7,4, seguida por dis- sociação em PBS-T-pH 7,4 e PBS -T-pH 5,0 a 37 ºC, são mostrados na Tabela 36. A comparação da meia-vida dissociativa (t/2) de SARS- CovV-2 RBD-MMH em tampões de pH 7,4, pH 6,0 e pH 5,0.

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EXEMPLO 19: ANTICORPOS ANTI-SARS-CoV-2-S QUE SE LIGAM A

PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS

[00248] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2 para se ligar à glicoproteína spike de SARS-CoV-2, foi desenvolvido um ensaio de ligação in vitro utilizando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína spike de SARS-CoV-2 em uma plataforma de detecção baseada em eletroquimioluminescência (MSD).

[00249] Partículas semelhantes a vírus (VLPs) do vírus da estomati- te vesicular (VSV) pseudotipadas foram geradas a partir de células HEK293T para expressar transitoriamente a proteína spike de SARS- CoV-2 (número de acesso MN908947.3, aminoácidos 16 a 1.211). VLPs que expressam apenas VSV também foram geradas como um controle de ligação negativo.

[00250] Os experimentos foram realizados de acordo com o proce- dimento a seguir. As VLPs das duas fontes descritas acima foram dilu- ídos em PBS, semeados nas placas de eletrodo de carbono de 96 po- ços (placa de alta ligação MULTI-ARRAY, MSD) e incubadas durante a noite a 4 ºC para permitir que as VLPs aderissem. Os sítios de liga- ção não específicos foram bloqueados por BSA a 2% (p/v) em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Às partículas ligadas à placa, foram adicionados anticorpos anti-SARS-CoV-2 e um controle I9G1 humano não ligado, diluído em PBS + BSA a 0,5% em uma faixa de concentrações de 0,0008 nM a 50 nM e tampão sem anticorpo em du- plicata e as placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambi- ente com agitação. As placas, então, foram lavadas com 1X PBS para remover os anticorpos não ligados com o uso de um lavador de placa AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Os an- ticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo IgG anti- humano conjugado com SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch)

por 1 hora à temperatura ambiente. Após as lavagens, as placas foram desenvolvidas com o Tampão Read (MSD) de acordo com o procedi- mento recomendado pelo fabricante e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Os sinais de ligação direta (em RLU) foram capturados para VLPs que expressam SARS-CoV-2 e VLP apenas de VSV.

[00251] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV- 2-S para se ligarem a VLPs que expressam SARS-CoV-2-S em com- paração com a ligação a VLPs que expressam VSV irrelevantes foi avaliada usando um ensaio de ligação imunológica. A ligação às VLPs imobilizadas em placas High Bind de 96 poços (MSD) foi realizada com uma série de diluições de anticorpos e os anticorpos ligados fo- ram detectados usando IgG anti-humana conjugada com SULFO- TAGTM. Os sinais de ligação da eletroquimiluminescência foram regis- trados em um Sector Imager 600 (MSD). Os valores de RLU foram de- terminados para a ligação do anticorpo às VLPs. Todos os anticorpos exibiram uma ligação dependente da concentração e as razões de |i- gação entre VSV apenas e VLPs que expressam SARS-CoV-2-S fo- ram analisadas a 5,5 nM e 0,20 nM.

[00252] Os resultados de ligação de mAbs anti-SARS-CoV-2-S nas duas concentrações para VLPs de VSV/spike e somente VSV estão resumidos na Tabela 37. Dos 46 anticorpos testados, 44 anticorpos se ligaram especificamente ao VSV/spike com uma razão de VSV de 3 ou superior em qualquer concentração. No anticorpo a 0,2 nM, a razão entre VSV/spike e VSV variou de 3 a 56, e a 5 nM, a razão variou de 3 a 303. Embora dois anticorpos (mMAb10998 e mAb11002) exibissem fraca ligação às VLPs VSV/Spike, com razões inferiores a 3 às VLPs VSV, os sinais a 5 nM eram mais altos nas VSV/spike do que nas VSV. Um anticorpo irrelevante do isotipo IIG1 mostrou uma ligação mínima, como esperado.

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EXEMPLO 20: ANTICORPOS ANTI-SARS-CoV-2-S QUE SE LIGAM A

CÉLULAS QUE EXPRESSAM PROTEÍNA SPIKE

[00253] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S de se ligar a células que expressam SARS-CoV-2-S, um ensaio de ligação in vitro utilizando células que expressam SARS-CoV-2-S em uma plataforma de detecção baseada em eletroquimiluminescência (MSD) foi desenvolvida.

[00254] As células induzíveis Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G foram geneticamente modificadas para expressar transitoriamente a proteína spike de SARS-CoV-2 (número de acesso MN908947.3, aminoácidos 16 a 1.211, Jurkat/Tet3G/hcD20/Tet-On 3G Inducible COVID-19 Spike Protein High Sorted) e citometria de fluxo classificou para seleção de alta expressão da proteína SARS-CoV-2. Jurkat/Tet3G/hcD20/Tet-3G parentais também foram incluídos nos experimentos como um controle de ligação negativo.

[00255] Os experimentos foram realizados de acordo com o proce- dimento a seguir. As células das duas linhas descritas acima foram induzidas com 1 pg/ml de doxiciclina a 37 ºC por 36 horas antes da colheita, centrifugadas, lavadas com PBS e depois diluídas em PBS, semeadas nas placas de eletrodos de carbono de 96 poços (MULTI- ARRAY placa de alta ligação, MSD) e incubada durante a noite a 4 ºC para permitir a adesão das células. Os sítios de ligação não específi- cos foram bloqueados por BSA a 2% (p/v) em PBS durante uma hora à temperatura ambiente. Às células ligadas à placa, foram adicionados anticorpos anti-SARS-CoV-2 e um controle I9gG1 humano não ligado, diluído em PBS + BSA a 0,5% em uma faixa de concentrações de 0,0008 nM a 50 nM e tampão sem anticorpo em duplicata e as placas foram in- cubadas por uma hora em temperatura ambiente com agitação. As pla- cas, então, foram lavadas com 1X PBS para remover os anticorpos não ligados com o uso de um lavador de placa AquaMax2000 (MDS Analyti-

cal Technologies, Sunnyvale, CA). Os anticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo IgG anti-humano conjugado com SUL- FO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) por uma hora à temperatura ambiente. Após as lavagens, as placas foram desenvolvidas com o Tampão Read (MSD) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Os si- nais de ligação direta (em RLU) foram capturados para células que expressam SARS-CoV-2-S e uma linha celular de controle negativo.

[00256] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV- 2 de se ligarem às células que expressam a proteína spike de SARS- CoV-2 em comparação com a ligação às células parenterais foi avalia- da usando um ensaio de ligação imunológica. A ligação às células imobilizadas em placas de ligação alta de 96 poços (MSD) foi realiza- da com uma série de diluições de anticorpos e os anticorpos ligados foram detectados usando IgG anti-humano conjugada com SULFO- TAGTM. Os sinais de ligação da eletroquimiluminescência foram regis- trados em um Sector Imager 600 (MSD). Todos os anticorpos exibiram uma ligação dependente da concentração e a razão da ligação entre as células que expressam spike e as células parentais foi analisada nas concentrações de 5,5 nM e 0,20 nM.

[00257] Os resultados de ligação dos mAbs anti-SARS-CoV-2-S, nas duas concentrações para células Jurkat que expressam a proteína Spike e parenterais, estão resumidos na Tabela 38. Dos 46 anticorpos testados, 44 anticorpos se ligaram especificamente às células Jur- kat/spike (Jurkat/Tet3G/hCcCD20/Tet-On 3G Inducible SARS-CoV-2 Spi- ke Protein High Sorted cells) com uma razão para as células parentais de 4 ou mais em qualquer concentração. A 0,2 nM, as razões dos si- nais de ligação entre as células Jurkat/spike e as células parentais va- riavam de 4 a 36 e, a 5 nM, a razão variava de 4 a 63. Embora os dois anticorpos (mMAb10998 e mAb11002) exibissem fraca ligação a células Jurkat/spike com razão de ligação às células parentais inferior a 4, a 5 NM os sinais de ligação eram mais altos em Jurket/spike do que nas células parentais.

Um anticorpo irrelevante do isotipo I9gG1 mostrou uma ligação mínima, como esperado.

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[00258] Todas as referências aqui citadas são incorporadas por re- ferência na mesma extensão que se cada publicação, entrada no ban- co de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GenelD), pedido de patente ou patente individual, fosse específica e individual- mente indicado como incorporado por referência.

Esta declaração de incorporação por referência destina-se, por parte dos Depositantes, a se relacionarem com cada publicação, entrada em banco de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GenelD), pedido de patente ou patente individual identificado, mesmo que essa citação não esteja imediatamente adjacente a uma declaração dedicada de incorporação por referência.

A inclusão de declarações de incorpora- ção dedicadas por referência, se houver, dentro do relatório descritivo não enfraquece de maneira alguma essa declaração geral de incorpo- ração por referência.

A citação das referências aqui contidas não se destina a admitir que a referência é pertinente ao estado da técnica, nem constitui qualquer admissão quanto ao conteúdo ou data dessas publicações ou documentos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que com- preende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo isolado ou frag- mento de ligação a antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 202 e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável de cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 210.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 204, a HCDR2 compreende a sequência de aminoá- cidos apresentada em SEQ ID NO: 206, a HCDR3 compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 208, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 212, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresen- tada em SEQ ID NO: 55 e a LCDR3 compreende a sequência de ami- noácidos apresentada em SEQ ID NO: 214.

3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR que compreende a sequência de amino- ácidos apresentada em SEQ ID NO: 202.

4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma LCVR que compreende a sequência de aminoá-

cidos apresentada em SEQ ID NO: 210.

5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR que compreende a sequência de amino- ácidos apresentada em SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreen- de a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 210.

6. Anticorpo isolado que se liga uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresen- tada em SEQ ID NO: 832, caracterizado pelo fato de que o dito anti- corpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1), HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoáci- dos apresentada em SEQ ID NO: 202 e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável de cadeia leve (LCVR) que compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 210.

7. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 204, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 206, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 208, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 212, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 55 e a LCDR3 compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 214.

8. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em

SEQ ID NO: 210.

9. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que o dito anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos apresen- tada em SEQ ID NO: 216 e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 218.

10. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que a dita região constante de imunoglobulina é uma região constante de IgG1.

11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que é um anticorpo recombinante.

12. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que é multiespecífico.

13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado como definido na reivindicação 6 e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo agente terapêutico.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 14, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de ami- noácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, um agente anti- inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à TMPRSS?2.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 14, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga a uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que com- preende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:

832.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende três CDRs de ca- deia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) conti- das em uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende: HCDR1, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 642; HCDR?2, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 499; HCDR3, a qual compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 644; LCDR1, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 648; LCDR?2, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 650; e LCDR3, a qual compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 652.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 18, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag-

mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pe- sada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 656.

21. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno compreende três regiões determinan- tes de complementaridades (CDRs) de cadeia pesada (HCDRI1, HCDR?2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e três regiões determinantes de complementari- dade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável de cadeia leve (LCVR) que compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.

22. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresen- tada em SEQ ID NO: 642, a HCDR2 compreende a sequência de ami- noácidos apresentada em SEQ ID NO: 499, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 644, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 648, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 650 e a LCDR3 compreende a sequên- cia de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 652.

23. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640.

24. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.

25. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que com- preende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:

646.

26. Anticorpo isolado que se liga a uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresen- tada em SEQ ID NO: 832, caracterizado pelo fato de que o dito anti- corpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoáci- dos apresentada em SEQ ID NO: 640 e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável de cadeia leve (LCVR) que compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.

27. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 642, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 499, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 644, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 648, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 650 e a LCDR3 compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 652.

28. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR que compre- ende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.

29. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 656.

30. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita região constante de imunoglobu- lina é uma região constante de IgG1.

31. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo recombinante.

32. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é multiespecífico.

33. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado como definido na reivindicação 26 e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 33, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo agente terapêutico.

35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 34, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga a uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de ami- noácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, um agente anti- inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à TMPRSS?2.

36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 34, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga a uma proteína Spike de SARS-CoV-2 que com- preende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:

832.

37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 36, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende três CDRs de ca- deia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 202 e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) conti- das em uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 210.

38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 37, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende: HCDR1, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 204; HCDR?2, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 206; HCDR3, a qual compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 208 LCDR1, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 212; LCDR?2, a qual compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 55; e LCDR3, a qual compreende a se- quência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 214.

39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 38, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID

NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 210.

40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 39, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pe- sada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 216 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 218.

41. Anticorpo recombinante isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma proteína Spi- ke de coronavírus (CoV-S), caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma ou mais das seguintes características: (a) se liga à CoV-S com uma ECs5o de menos de cerca de 10º M; (b) demonstra um aumento na sobrevida de um animal in- fectado pelo coronavírus após administração ao dito animal infectado pelo coronavírus comparado com um animal comparável infectado pe- lo coronavírus sem a dita administração; e/ou (c) compreende três regiões determinantes de complemen- taridade (CDRs) de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 ) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que com- preende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência com uma HCVR da Tabela 1; e três CDRs de cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) contidas em uma região variável de cadeia leve (LCVR) que compreende uma sequên- cia de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência com uma LCVR da Tabela 1.

42. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acor- do com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que compreen- de:

(a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobuli- na que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um anticorpo da Tabela 1; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um anticorpo da Ta- bela 1.

43. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acor- do com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobuli- na que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo me- nos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos com uma se- quência de HCVR da Tabela 1; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de LCVR da Tabela 1.

44. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com- preende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um único anticorpo da Tabela 1.

45. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 41-44, caracterizado pelo fato de que compreende uma imunoglobulina que compreende a HCVR e a LCVR de um único anticorpo da Tabela 1.

46. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que compete com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 45 pela liga- ção à CoV-S.

47. Proteína de ligação a antígeno caracterizada pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo que, ou a um epítopo sobreposto sobre, a CoV-S que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.

48. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que é multiespecífico.

49. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 41 a 48, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais das seguintes propriedades: (a) inibe o crescimento de coronavírus; (b) se liga à superfície de um coronavírus; (c) limita a propagação da infecção pelo coronavírus de cé- lulas in vitro; e (d) protege camundongos modificados para expressar a proteína ACE2 ou TMPRSS2 humana contra morte e/ou perda de pe- so causada por infecção pelo coronavírus.

50. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, caracte- rizado pelo fato de que a dita CoV-S é SARS-CoV-2-S.

51. Complexo que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 41 a 50, caracterizado pelo fato de que se liga a um polipeptídeo de CoV-S.

52. Complexo, de acordo com a reivindicação 51, caracteri- zado pelo fato de que a dita CoV-S é SARS-CoV-2-S.

53. Método para fabricar um anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 50, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir em uma célula hospedeira um ou mais polinu-

cleotídeos que codificam o dito anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições favoráveis à expressão de um ou mais polinucleotídeos; e (c) opcionalmente, isolar o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno da célula hospedeira e/ou um meio no qual a célula hospedeira é cultivada.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de ovário de hâmster Chinês.

55. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno caracteri- zado pelo fato de que é um produto do método como definido na rei- vindicação 53 ou 54.

56. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreen- de: (a) CDR-H1, CDR-H2, e CDR-H3 de um domínio de HCVR de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR apresentada na Tabela 1; ou (b) CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um domínio de LCVR de uma cadeia de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de LCVR apresentada na Tabela 1.

57. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 56.

58. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo como definido na reivindicação 57.

59. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que com- preende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 50 ou o polipeptídeo ou po- linucleotídeo ou vetor como definido em qualquer uma das reivindica-

ções 55 a 58.

60. Composição ou kit caracterizado pelo fato de que com- preende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como defini- do em qualquer uma das reivindicações 41 a 50 e 55, em associação com um agente terapêutico adicional.

61. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 50 e 55 e um carreador farma- ceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agente terapêutico adici- onal.

62. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que está em associação com um agente terapêutico adicional o qual é um medicamento antiviral ou uma vacina.

63. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62, caracterizado pelo fato de que o agente tera- pêutico adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico, um anticorpo ou fra- gmento de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS? e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente à CoV-S.

64. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o dito agente antimalárico é cloroquina ou hidroxicloroquina.

65. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o dito agente anti-inflamatório é um an- ticorpo.

66. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é sarilumabe, tocilizu- mabe ou ginsilumabe.

67. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de um segundo anticorpo da Tabela 1.

68. Recipiente ou dispositivo de injeção caracterizado pelo fato de que compreende a proteína de ligação a antígeno ou a compo- sição como definida em qualquer uma das reivindicações 41-51, 55 e 60-63.

69. Método para tratar ou prevenir a infecção por um coro- navírus em um indivíduo que precisa do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 50 e 55.

70. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracteriza- do pelo fato de que o dito coronavírus é selecionado a partir do grupo que consiste de SARS-CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV.

71. Método, de acordo com a reivindicação 69 ou 70, carac- terizado pelo fato de que o indivíduo recebe um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteriza- do pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um medicamento antiviral ou uma vacina.

73. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteriza- do pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em: um agente anti- inflamatório, um agente antimalárico, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS?2 e um anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente à CoV-S.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracteriza-

do pelo fato de que o dito agente antimalárico é cloroquina ou hidroxi- cloroquina.

75. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracteriza- do pelo fato de que o dito agente anti-inflamatório é um anticorpo.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do pelo fato de que o dito anticorpo é sarilumabe, tocilizumabe ou gin- silumabe.

77. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR?2 e LCDR3 de um segundo anticorpo da Tabela 1.

78. Método para administrar um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 50 e 55, ao corpo de um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende injetar o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno no corpo do indivíduo.

79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é injetado no corpo do indivíduo pela via subcutânea, intravenosa ou in- tramuscular.

80. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, composi- ção, kit, complexo, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, célula ou mé- todo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 79, carac- terizados pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma sequência de domínio variável VH3-66 ou Vk1-33.