JP2024038003A - 抗sars-cov-2-スパイク糖タンパク質抗体および抗原結合断片 - Google Patents
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Abstract
【課題】コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびにウイルス感染を治療または予防するためにそのような抗体および断片を使用する方法を提供する。【解決手段】本開示は、SARS-CoV-2-Sに特異的に結合する中和ヒト抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供する。【選択図】なし
Description
配列表
配列表の公式コピーは、明細書と同時にEFS-Webを介して、ファイル名が「10753WO01-Sequence.txt」、作成日が2020年6月25日、サイズが約922,462バイトを有するASCII形式の配列表として電子的に提出される。このASCII形式の文書に含まれている配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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本発明は、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体および抗原結合断片、ならびに当該抗体および断片によりコロナウイルス感染を治療または予防するための方法に関する。
コロナウイルスなどの新たに同定されたウイルスは、十分に特徴付けられていないため、治療が難しい場合がある。これらの新たに同定されたウイルスの出現は、新しい抗ウイルス戦略の開発の必要性を浮き彫りにしている。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、重症急性呼吸器疾患COVID-19を引き起こす新たに出現したコロナウイルスである。SARS-CoV-2は、中国の武漢での発生から最初に同定され、2020年3月20日の時点で、世界保健機関は168の国、地域、または地方で209,839件の確定症例を報告し、8,778人が死亡した。COVID-19の臨床的特徴には、発熱、乾いた咳、および倦怠感が含まれ、この疾患は呼吸不全を引き起こして死に至る可能性がある。
これまでのところ、SARS-CoV-2感染を予防または治療するためのワクチンまたは治療薬はなかった。人間の健康に対する継続的な脅威を考慮して、SARS-CoV-2制御のための予防的および治療的抗ウイルス療法の緊急の必要性がある。このウイルスは、細胞受容体ACE2との相互作用のためにそのスパイク糖タンパク質を使用し、標的細胞への侵入にセリンプロテアーゼTMPRSS2を使用するため、このスパイクタンパク質は、抗体療法の魅力的な標的となる。特に、SARS-CoV-2-スパイクタンパク質(SARS-CoV-2-S)に高い親和性で特異的に結合し、ウイルス感染性を阻害する完全ヒト抗体は、COVID-19の予防および治療に重要である可能性がある。
治療用抗SARS-CoV-2-スパイクタンパク質(SARS-CoV-2-S)抗体を中和し、ウイルス感染を治療または予防するためにそれらを使用する必要がある。本開示は、部分的に、表1のものなどのヒト抗SARS-CoV-2-S抗体、および例えば、他の治療薬(例えば、抗炎症剤、抗マラリア剤、抗ウイルス剤、または他の抗体もしくは抗原結合断片)との組み合わせを含むそれらの組み合わせ、ならびにウイルス感染を治療するためのそれらの使用方法を提供することによって、この必要性に対処する。
本開示は、SARS-CoV-2-Sに特異的に結合する中和ヒト抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一態様において、本開示は、コロナウイルススパイクタンパク質(CoV-S)に特異的に結合する単離された組換え抗体またはその抗原結合断片であって、抗体が、以下の特徴:(a)約10-9M未満のEC50でCoV-Sに結合すること、(b)コロナウイルス
感染動物への投与後の当該コロナウイルス感染動物において、当該投与なしの同等のコロナウイルス感染動物と比較して、生存の増加を示すこと、および/または(c)表1のHCVRと少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)と、表1のLCVRと少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖CDR(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)と、を含むこと、のうちの1つ以上を有する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片を提供する。
感染動物への投与後の当該コロナウイルス感染動物において、当該投与なしの同等のコロナウイルス感染動物と比較して、生存の増加を示すこと、および/または(c)表1のHCVRと少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)と、表1のLCVRと少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖CDR(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)と、を含むこと、のうちの1つ以上を有する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、(a)表1の抗体のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および/または(b)表1の抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、(a)表1のHCVR配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン可変領域、および/または(b)表1のLCVR配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、表1の単一の抗体のCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、表1の単一の抗体のHCVRおよびLCVRを含む免疫グロブリンを含む。
一態様において、本開示は、CoV-Sへの結合について上記または本明細書で論じられる抗体または抗原結合断片のうちのいずれか1つと競合する抗原結合タンパク質を提供する。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる抗体または抗原結合断片のうちのいずれか1つと同じCoV-S上のエピトープ、または重複するCoV-S上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質を提供する。
様々な実施形態のうちのいずれにおいても、抗体または抗原結合断片は、多重特異性であり得る。
様々な実施形態のうちのいずれにおいても、抗体または抗原結合断片は、以下の特性:a)コロナウイルスの増殖を阻害すること、b)コロナウイルスの表面に結合すること、c)インビトロでの細胞のコロナウイルス感染の拡大を制限すること、ならびにd)コロナウイルス感染によって引き起こされる死および/または体重減少からヒトACE2またはTMPRSS2タンパク質を発現するように操作されたマウスを保護すること、のうちの1つ以上を含み得る。
様々な実施形態のうちのいずれにおいても、CoV-Sは、SARS-CoV-2-Sである。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられるCoV-Sポリペプチドに結合した抗体または抗原結合断片を含む複合体を提供する。いくつかの実施形態において、CoV-Sは、SARS-CoV-2-Sである。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる抗体または抗原結合断片
を作製するための方法であって、(a)当該抗体または抗原結合断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、(b)1つ以上のポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で宿主細胞を培養することと、(c)任意選択的に、抗体または抗原結合断片を宿主細胞および/または宿主細胞が増殖する培地から単離することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
を作製するための方法であって、(a)当該抗体または抗原結合断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、(b)1つ以上のポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で宿主細胞を培養することと、(c)任意選択的に、抗体または抗原結合断片を宿主細胞および/または宿主細胞が増殖する培地から単離することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
一態様において、本開示は、上記で論じられる方法の生成物である抗体または抗原結合断片を提供する。
一態様において、本開示は、(a)表1に記載のHCVRアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合断片のHCVRドメインのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3、または(b)表1に記載のLCVRアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖のLCVRドメインのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、ポリペプチドを提供する。
一態様において、本開示は、上記に論じられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
一態様において、本開示は、上記に論じられるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる抗体または抗原結合断片またはポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。
一態様において、本開示は、さらなる治療薬と関連して、上記または本明細書で論じられる抗体または抗原結合断片を含む組成物またはキットを提供する。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合断片、ならびに薬学的に許容される担体、および任意選択的にさらなる治療薬を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、抗ウイルス薬またはワクチンである。いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、抗炎症剤、抗マラリア剤、TMPRSS2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびCoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。場合によっては、抗マラリア剤は、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである。場合によっては、抗炎症剤は、サリルマブ、トシリズマブ、またはギムシルマブなどの抗体である。いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、表1のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む二次抗体または抗原結合断片である。
一態様において、本開示は、上記もしくは本明細書で論じられる抗原結合タンパク質、抗体もしくは抗原結合断片、または組成物を含む容器または注射器具を提供する。
一態様において、本開示は、コロナウイルスへの感染の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、上記または本明細書で論じられる治療有効量の抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合断片を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、SARS-CoV-2、SARS-CoV、およびMERS-CoVからなる群から選択される。
コロナウイルスによる感染を治療または予防するための方法のいくつかの実施形態にお
いて、対象は、1つ以上のさらなる治療薬を投与される。場合によっては、1つ以上のさらなる治療薬は、抗ウイルス薬またはワクチンである。場合によっては、1つ以上のさらなる治療薬は、抗炎症剤、抗マラリア剤、TMPRSS2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびCoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。場合によっては、抗マラリア剤は、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである。場合によっては、抗炎症剤は、例えば、サリルマブ、トシリズマブ、またはギムシルマブなどの抗体である。いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、表1のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む二次抗体または抗原結合断片である。単独で、または互いに組み合わせて、または本開示の方法の文脈で使用するために本明細書に開示される抗体のうちの1つ以上と組み合わせて使用することができる他の抗体には、例えば、LY-CoV555(Eli Lilly)、47D11(Wang et al Nature Communications Article No.2251)、B38、H4、B5、および/またはH2(Wu et al.,10.1126/science.abc2241(2020)、STI-1499(Sorrento Therapeutics)、VIR-7831、およびVIR-7832(Vir Biotherapeutics)が含まれる。
いて、対象は、1つ以上のさらなる治療薬を投与される。場合によっては、1つ以上のさらなる治療薬は、抗ウイルス薬またはワクチンである。場合によっては、1つ以上のさらなる治療薬は、抗炎症剤、抗マラリア剤、TMPRSS2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびCoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。場合によっては、抗マラリア剤は、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである。場合によっては、抗炎症剤は、例えば、サリルマブ、トシリズマブ、またはギムシルマブなどの抗体である。いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、表1のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む二次抗体または抗原結合断片である。単独で、または互いに組み合わせて、または本開示の方法の文脈で使用するために本明細書に開示される抗体のうちの1つ以上と組み合わせて使用することができる他の抗体には、例えば、LY-CoV555(Eli Lilly)、47D11(Wang et al Nature Communications Article No.2251)、B38、H4、B5、および/またはH2(Wu et al.,10.1126/science.abc2241(2020)、STI-1499(Sorrento Therapeutics)、VIR-7831、およびVIR-7832(Vir Biotherapeutics)が含まれる。
一態様において、本開示は、抗体または抗原結合断片を対象の体内に注射することを含む、上記または本明細書で論じられる抗体または抗原結合断片を対象の体内に投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、対象の体内に、皮下、静脈内、または筋肉内注射される。
上記または本明細書で論じられる様々な実施形態のうちのいずれかにおいて、抗体または抗原結合断片は、VH3-66またはVk1-33可変ドメイン配列を含む。
一態様において、本開示は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、当該単離された抗体または抗原結合断片が、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態において、HCDR1は、配列番号204に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号206に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号208に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号212に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号214に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。
一態様において、本開示は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体であって、当該単離された抗体が、免疫グロブリン定常領域と、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR
2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体を提供する。
2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、HCDR1は、配列番号204に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号206に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号208に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号212に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号214に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、配列番号216に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号218に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む。場合によっては、免疫グロブリン定常領域は、IgG1定常領域である。場合によっては、単離された抗体は、組換え抗体である。場合によっては、単離された抗体は、多重特異性である。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる単離された抗体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、第2の治療薬をさらに含む。場合によっては、第2の治療薬は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片、抗炎症剤、抗マラリア剤、およびTMPRSS2に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、第2の治療薬は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片である。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVR内に含まれる3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVR内に含まれる3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号642に記載のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号499に記載のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号644に記載のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号648に記載のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号650に記載のアミノ酸配列を含むLCDR2、配列番号652に記載のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号654に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号656に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む。
一態様において、本開示は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、当該単離された抗体または抗原結合断片が、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態において、HCDR1は、配列番号642に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号499に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号644に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号648に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号650に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号652に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。
一態様において、本開示は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体であって、当該単離された抗体が、免疫グロブリン定常領域と、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、HCDR1は、配列番号642に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号499に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号644に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号648に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号650に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号652に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、配列番号654に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号656に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む。場合によっては、免疫グロブリン定常領域は、IgG1定常領域である。場合によっては、単離された抗体は、組換え抗体である。場合によっては、単離された抗体は、多重特異性である。
一態様において、本開示は、上記または本明細書で論じられる単離された抗体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、第2の治療薬をさらに含む、医薬組成物。場合によっては、第2の治療薬は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片、抗炎症剤、抗マラリア剤、およびTMPRSS2に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、第2の治療薬は、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片である。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVR内に含まれる3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVR内に含まれる3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号204に記載のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号206に記載のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号208に記載のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号212に記載のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含むLCDR2、配列番号214
に記載のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号216に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号218に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む。
に記載のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む。場合によっては、二次抗体またはその抗原結合断片は、配列番号216に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号218に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む。
様々な実施形態において、上記または本明細書で論じられる実施形態の特徴または構成要素のいずれかを組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で論じられるいずれの特定の値も、上記または本明細書で論じられる別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲は本開示の範囲内に包含される。
本発明の方法を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、このような方法および条件に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語が、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の何らかの方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれより説明する。本明細書で言及されるすべての出版物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「コロナウイルス」または「CoV」という用語は、SARS-CoV-2、MERS-CoV、およびSARS-CoVを含むがこれらに限定されないコロナウイルスファミリーの任意のウイルスを指す。SARS-CoV-2は、中国の武漢で発生した深刻な発生の原因として同定され、世界中の他の地域に急速に広がっている、新たに出現したコロナウイルスを指す。SARS-CoV-2は、2019-nCoVおよび武漢コロナウイルスとしても知られている。ウイルススパイクタンパク質を介して、ヒト宿主細胞受容体アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合する。スパイクタンパク質はまた、ウイルスの膜融合のためにスパイクタンパク質を活性化するTMPRSS2に結合し、それによって切断される。
「S」または「Sタンパク質」とも呼ばれる「CoV-S」という用語は、コロナウイルスのスパイクタンパク質を指し、SARS-CoV-2-S、MERS-CoV S、およびSARS-CoV Sなどの特異的Sタンパク質を指し得る。SARS-CoV-2-スパイクタンパク質は、1273アミノ酸のI型膜糖タンパク質であり、包まれたコロナウイルス粒子の表面でスパイクまたはペプロマーを構成する三量体に集合する。このタンパク質には、宿主受容体結合および膜融合という2つの重要な機能があり、これらは、Sタンパク質のN末端(S1)およびC末端(S2)の半分に起因する。CoV-Sは、S1サブユニットに存在する受容体結合ドメイン(RBD)を介してその同族の受容体に結合する。全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号832に提供されるアミノ酸配列によって例示される。「CoV-S」という用語には、異なるCoV分離株から単離されたCoVスパイクタンパク質のタンパク質変異体、ならびに組換えCoVスパイクタンパク質またはその断片が含まれる。この用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスまたはヒトFc、またはROR1などのシグナル配列に連結されたCoVスパイクタンパク質またはその断片を包含する。
本明細書で使用される「コロナウイルス感染」または「CoV感染」という用語は、SARS-CoV-2、MERS-CoV、またはSARS-CoVなどのコロナウイルスによる感染を指す。この用語には、コロナウイルス気道感染症が含まれ、多くの場合、下気道に感染する。症状には、高熱、乾いた咳、息切れ、肺炎、下痢などの胃腸症状、臓器不全(腎不全および腎機能障害)、敗血症性ショック、および重症の場合の死亡が含まれ得る。
ウイルス
本発明は、対象におけるウイルス感染を治療または予防するための方法を含む。「ウイルス」という用語は、対象の体内での感染が、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片の投与によって治療可能または予防可能である任意のウイルス(例えば、ウイルスの感染力が少なくとも部分的にCoV-Sに依存するウイルス)を含む。本発明の一実施形態において、「ウイルス」は、スパイクタンパク質(例えば、CoV-S)を発現する任意のウイルスである。「ウイルス」という用語はまた、対象の呼吸器組織(例えば、上気道および/または下気道、気管、気管支、肺)に感染し、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片の投与によって治療可能または予防可能であるウイルスである、CoV-S依存性呼吸器ウイルスを含む。例えば、本発明の一実施形態において、ウイルスには、コロナウイルス、SARS-CoV-2(重度急性呼吸器症候群コロナウイルス2)、SARS-CoV(重度急性呼吸器症候群コロナウイルス)、およびMERS-CoV(中東呼吸器症候群(MERS)コロナウイルス)が含まれる。コロナウイルスには、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、およびデルタコロナウイルスの属が含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、および/またはデルタコロナウイルスに結合および/またはこれらを中和することができる。特定の実施形態において、この結合および/または中和は、コロナウイルスの特定の
属または属の特定のサブグループに特異的であり得る。「ウイルス感染」とは、対象の体内にウイルスが侵入し増殖することを指す。
本発明は、対象におけるウイルス感染を治療または予防するための方法を含む。「ウイルス」という用語は、対象の体内での感染が、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片の投与によって治療可能または予防可能である任意のウイルス(例えば、ウイルスの感染力が少なくとも部分的にCoV-Sに依存するウイルス)を含む。本発明の一実施形態において、「ウイルス」は、スパイクタンパク質(例えば、CoV-S)を発現する任意のウイルスである。「ウイルス」という用語はまた、対象の呼吸器組織(例えば、上気道および/または下気道、気管、気管支、肺)に感染し、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片の投与によって治療可能または予防可能であるウイルスである、CoV-S依存性呼吸器ウイルスを含む。例えば、本発明の一実施形態において、ウイルスには、コロナウイルス、SARS-CoV-2(重度急性呼吸器症候群コロナウイルス2)、SARS-CoV(重度急性呼吸器症候群コロナウイルス)、およびMERS-CoV(中東呼吸器症候群(MERS)コロナウイルス)が含まれる。コロナウイルスには、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、およびデルタコロナウイルスの属が含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、および/またはデルタコロナウイルスに結合および/またはこれらを中和することができる。特定の実施形態において、この結合および/または中和は、コロナウイルスの特定の
属または属の特定のサブグループに特異的であり得る。「ウイルス感染」とは、対象の体内にウイルスが侵入し増殖することを指す。
コロナウイルスビリオンは球形で、直径は約125nmである。コロナウイルスの最も顕著な特徴は、ビリオンの表面から発するクラブ形状のスパイク突起である。これらのスパイクは、ビリオンを特徴付けるものであり、太陽コロナの外観を与え、コロナウイルスという名前を促す。ビリオンのエンベロープ内には、ヌクレオカプシドがある。コロナウイルスはらせん状に対称なヌクレオカプシドを有しており、これはポジティブセンスRNAウイルスでは一般的ではないが、ネガティブセンスRNAウイルスでははるかに一般的である。SARS-CoV-2、MERS-CoV、およびSARS-CoVは、コロナウイルスファミリーに属している。ビリオンの宿主細胞への最初の付着は、Sタンパク質とその受容体との間の相互作用によって開始される。コロナウイルスSタンパク質のS1領域内の受容体結合ドメイン(RBD)の部位はウイルスによって異なり、S1のC末端にRBDを有しているものもある。Sタンパク質/受容体の相互作用は、コロナウイルスが宿主種に感染するための主要な決定因子であり、ウイルスの組織向性も支配する。多くのコロナウイルスは、細胞受容体としてペプチダーゼを利用している。受容体結合に続いて、ウイルスは、次に宿主細胞の細胞質ゾルにアクセスしなければならない。これは一般に、カテプシン、TMPRRS2、または別のプロテアーゼによるSタンパク質の酸依存性タンパク質分解切断と、それに続くウイルス膜と細胞膜との融合によって達成される。
抗CoV-S抗体および抗原結合断片
本発明は、CoVスパイクタンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質を提供する。
本発明は、CoVスパイクタンパク質またはその抗原性断片に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質を提供する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された4つのポリペプチド鎖、2つの重鎖(HC)および2つの軽鎖(LC)を含む免疫グロブリン分子(すなわち、「完全な抗体分子」)、ならびにそれらの多量体(例えば、IgM)を指す。例示的な抗体には、例えば、表1に列挙されたものが含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域(「HCVR」または「VH」)および重鎖定常領域(CH1ドメイン、CH
2ドメイン、およびCH3ドメインからなる)を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(「LC
VRまたは「VL」)および軽鎖定常領域(CL)からなる。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各VHおよびVLは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された3つのCDRおよび4つのFRを含む。重鎖CDRは、HCDRまたはCDR-Hと呼ばれることもあり、上記のように番号が付けられる(例えば、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3またはCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)。同様に、軽鎖CDRは、LCDRまたはCDR-Lと呼ばれ、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、またはCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3の番号が付けられる。本発明の特定の実施形態において、抗体(またはその抗原結合断片)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然にもしくは人工的に修飾される。例示的なヒト生殖系列配列には、VH3-66およびVk1-33が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本開示は、VH3-66またはVk1-33可変重鎖または軽鎖領域内に表1のHCDRおよびLCDR配列を含む、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を提供する。本開示はさらに、IgKV4-1、IgKV1-5、IgKV1-9、IgKV1-12、IgKV3-15、IgKV1-16、IgKV1-17、IgKV3-20、IgLV3-21、IgKV2-24、IgKV1-33、IgKV1-39、IgLV1-40、IgLV1-44、IgLV1-51、IgLV3-1、IgKV1-6、IgLV2-8、IgKV3-11、IgLV2-11、IgLV2-14、
IgLV2-23、またはIgLV6-57から選択される軽鎖と、IgHV1-69、IgHV3-64、IgHV4-59、IgHV3-53、IgHV3-48、IgHV4-34、IgHV3-33、IgHV3-30、IgHV3-23、IgHV3-20、IgHV1-18、IgHV3-15、IgHV3-11、IgHV3-9、IgHV1-8、IgHV3-7、IgHV2-5、IgHV1-2、IgHV2-70、IgHV3-66、IgHV5-51、IgHV1-46、IgHV4-39、IgHV4-31、IgHV3-30-3、IgHV2-26、またはIgHV7-4-1から選択される重鎖との組み合わせ内に、表1のHCDRおよびLCDR配列を含む、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を提供する。本開示はさらに、IgKV4-1、IgKV1-5、IgKV1-9、IgKV1-12、IgKV3-15、IgKV1-16、IgKV1-17、IgKV3-20、IgLV3-21、IgKV2-24、IgKV1-33、IgKV1-39、IgLV1-40、IgLV1-44、IgLV1-51、IgLV3-1、IgKV1-6、IgLV2-8、IgKV3-11、IgLV2-11、IgLV2-14、IgLV2-23、またはIgLV6-57から選択される軽鎖と、IgHV1-69、IgHV3-64、IgHV4-59、IgHV3-53、IgHV3-48、IgHV4-34、IgHV3-33、IgHV3-30、IgHV3-23、IgHV3-20、IgHV1-18、IgHV3-15、IgHV3-11、IgHV3-9、IgHV1-8、IgHV3-7、IgHV2-5、IgHV1-2、IgHV2-70、IgHV3-66、IgHV5-51、IgHV1-46、IgHV4-39、IgHV4-31、IgHV3-30-3、IgHV2-26、またはIgHV7-4-1から選択される重鎖との組み合わせ内の表1のHCVRおよびLCVR配列を含む、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を提供する。
2ドメイン、およびCH3ドメインからなる)を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(「LC
VRまたは「VL」)および軽鎖定常領域(CL)からなる。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各VHおよびVLは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された3つのCDRおよび4つのFRを含む。重鎖CDRは、HCDRまたはCDR-Hと呼ばれることもあり、上記のように番号が付けられる(例えば、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3またはCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)。同様に、軽鎖CDRは、LCDRまたはCDR-Lと呼ばれ、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、またはCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3の番号が付けられる。本発明の特定の実施形態において、抗体(またはその抗原結合断片)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然にもしくは人工的に修飾される。例示的なヒト生殖系列配列には、VH3-66およびVk1-33が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本開示は、VH3-66またはVk1-33可変重鎖または軽鎖領域内に表1のHCDRおよびLCDR配列を含む、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を提供する。本開示はさらに、IgKV4-1、IgKV1-5、IgKV1-9、IgKV1-12、IgKV3-15、IgKV1-16、IgKV1-17、IgKV3-20、IgLV3-21、IgKV2-24、IgKV1-33、IgKV1-39、IgLV1-40、IgLV1-44、IgLV1-51、IgLV3-1、IgKV1-6、IgLV2-8、IgKV3-11、IgLV2-11、IgLV2-14、
IgLV2-23、またはIgLV6-57から選択される軽鎖と、IgHV1-69、IgHV3-64、IgHV4-59、IgHV3-53、IgHV3-48、IgHV4-34、IgHV3-33、IgHV3-30、IgHV3-23、IgHV3-20、IgHV1-18、IgHV3-15、IgHV3-11、IgHV3-9、IgHV1-8、IgHV3-7、IgHV2-5、IgHV1-2、IgHV2-70、IgHV3-66、IgHV5-51、IgHV1-46、IgHV4-39、IgHV4-31、IgHV3-30-3、IgHV2-26、またはIgHV7-4-1から選択される重鎖との組み合わせ内に、表1のHCDRおよびLCDR配列を含む、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を提供する。本開示はさらに、IgKV4-1、IgKV1-5、IgKV1-9、IgKV1-12、IgKV3-15、IgKV1-16、IgKV1-17、IgKV3-20、IgLV3-21、IgKV2-24、IgKV1-33、IgKV1-39、IgLV1-40、IgLV1-44、IgLV1-51、IgLV3-1、IgKV1-6、IgLV2-8、IgKV3-11、IgLV2-11、IgLV2-14、IgLV2-23、またはIgLV6-57から選択される軽鎖と、IgHV1-69、IgHV3-64、IgHV4-59、IgHV3-53、IgHV3-48、IgHV4-34、IgHV3-33、IgHV3-30、IgHV3-23、IgHV3-20、IgHV1-18、IgHV3-15、IgHV3-11、IgHV3-9、IgHV1-8、IgHV3-7、IgHV2-5、IgHV1-2、IgHV2-70、IgHV3-66、IgHV5-51、IgHV1-46、IgHV4-39、IgHV4-31、IgHV3-30-3、IgHV2-26、またはIgHV7-4-1から選択される重鎖との組み合わせ内の表1のHCVRおよびLCVR配列を含む、抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を提供する。
典型的には、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)内に位置する、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる3つの超可変領域を含む。一般に、N末端からC末端に、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。本発明の実施形態において、各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.;National Institutes of Health,Bethesda,Md.;5th ed.;NIH Publ.No.91-3242(1991);Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75、Kabat,et al.,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616、Chothia,et al.,(1987)J Mol.Biol.196:901-917、またはChothia,et al.,(1989)Nature 342:878-883の定義に従う。
本発明は、モノクローナル抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片、ならびに複数の単離されたモノクローナル抗原結合タンパク質を含むモノクローナル組成物を含む。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団を指す、すなわち、集団を構成する抗体分子は、少量で存在し得る可能な自然発生の変異を除いて、アミノ酸配列が同一である。組成物中の「複数」のこのようなモノクローナル抗体および断片は、自然界で、例えば、マウスまたはヒトなどの宿主生物の血液において通常発生するよりも高い、同一の(すなわち、上記に論じられるように、アミノ酸配列において少量で存在し得る可能な自然発生の変異を除いて)抗体および断片の濃度を指す。
本発明の実施形態において、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗
原結合断片は、例えば、IgA型(例えば、IgA1またはIgA2)、IgD型、IgE型、IgG型(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4)、またはIgM型の重鎖定常ドメインを含む。本発明の実施形態において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片は、例えば、カッパ型またはラムダ型の軽鎖定常ドメインを含む。
原結合断片は、例えば、IgA型(例えば、IgA1またはIgA2)、IgD型、IgE型、IgG型(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4)、またはIgM型の重鎖定常ドメインを含む。本発明の実施形態において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片は、例えば、カッパ型またはラムダ型の軽鎖定常ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、抗体などの「ヒト」抗原結合タンパク質という用語は、ヒト細胞において、または非ヒト細胞、例えば、マウス細胞内に移植されるかにかかわらず、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。例えば、US8502018、US6596541、またはUS5789215を参照されたい。本発明のヒトmAbは、例えば、CDR、特にCDR3における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異)によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖系列に由来するCDR配列がヒトFR配列上に移植されたmAbを含むことを意図するものではない。本用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換え生成された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。以下を参照されたい。
本発明は、抗CoV-Sキメラ抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片、ならびにそれらの使用方法を含む。本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、一次抗体からの可変ドメインおよび二次抗体からの定常ドメインを有する抗体であり、一次抗体および二次抗体は異なる種に由来する。(US4816567、およびMorrison et al.,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81:6851-6855)。
81:6851-6855)。
本発明は、抗CoV-Sハイブリッド抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片、ならびにそれらの使用方法を含む。本明細書で使用される場合、「ハイブリッド抗体」は、一次抗体からの可変ドメインおよび二次抗体からの定常ドメインを有する抗体であり、一次抗体および二次抗体は異なる動物に由来するか、または可変ドメイン(定常領域ではない)は、第1の動物に由来する。例えば、可変ドメインは、ヒトから単離された抗体から取得され、その抗体から単離されていない固定定常領域で発現され得る。例示的なハイブリッド抗体は、実施例1に記載されており、これらは、それぞれ、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む発現ベクターにクローン化された抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域由来のPCR生成物を指す。ハイブリッド抗体は、それらに含まれる可変領域および定常領域が単一の天然源から分離されていないため、合成であり、天然には存在しない。
抗体またはその抗原結合断片などの「組換え」抗原結合タンパク質という用語は、例えば、DNAスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む組換えDNA技術として当該技術分野で既知の技術または方法によって作成、発現、単離、または得られたこのような分子を指す。本用語は、非ヒト哺乳動物(トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む)、もしくは細胞(例えば、CHO細胞)発現系、もしくは非ヒト細胞発現系において発現された抗体、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を含む。いくつかの実施形態において、組換え抗体は、生物(例えば、マウスまたはヒト)から単離された抗体と配列を共有するが、組換えDNA技術を介して発現されてきた。そのような抗体は、生物から単離された抗体とは異なる翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)を有し得る。
本明細書に開示される組換え抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体および抗原結合断片は、E.coli/T7発現系においても生成され得る。この実施形態において、本発明の抗CoV-S抗体免疫グロブリン分子をコードする核酸(例えば、表1に見出される)は、pETベースのプラスミドに挿入され、E.coli/T7系において発現され得る。例えば、本発明は、宿主細胞(例えば、BL21またはBL21DE3などのE.coliなどの細菌宿主細胞)において、抗体またはその抗原結合断片もしくはその免疫グロブリン鎖を発現させるための方法を含み、これには、T7プロモーターに作動可能に連結される免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドも含む細胞において、T7 RNAポリメラーゼを発現させることを含む。例えば、本発明の実施形態において、E.coliなどの細菌宿主細胞は、lacプロモーターに作動可能に連結されたT7
RNAポリメラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリメラーゼおよび鎖の発現は、IPTG(イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド)と宿主細胞をインキュベーすることによって誘導される。US4952496およびUS5693489、またはStudier & Moffatt,Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes,J.Mol.Biol.1986 May 5;189(1):113-30を参照されたい。
RNAポリメラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリメラーゼおよび鎖の発現は、IPTG(イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド)と宿主細胞をインキュベーすることによって誘導される。US4952496およびUS5693489、またはStudier & Moffatt,Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes,J.Mol.Biol.1986 May 5;189(1):113-30を参照されたい。
当該技術分野で既知の組換え抗体を生成するための方法がいくつかある。抗体の組換え生成のための方法の一例は、US4816567に開示されている。
形質転換は、ポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA、mRNAを含む)を宿主細胞に導入するための任意の既知の方法によるものであり得る。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド(複数可)の封入、脂質ナノ粒子技術、微粒子銃注射、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子は、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入され得る。細胞を形質転換する方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第4,399,216号、同第4,912,040号、同第4,740,461号、および同第4,959,455号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、対象自身の細胞が抗体を生成するように、核酸形態(例えば、DNAまたはRNA、mRNAを含む)で対象に導入され得る。本開示はさらに、CoVスパイクタンパク質に対する抗体発現の増加、抗体安定性の増加、核酸(例えば、mRNA)安定性の増加、または抗体の親和性もしくは特異性の改善をもたらす、本明細書に記載の抗CoV-S抗体をコードするヌクレオチド配列への修飾を提供する。
したがって、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片、またはその免疫グロブリン鎖などの抗CoV-S抗原結合タンパク質を作製するための組換え方法であって、(i)抗原結合タンパク質、例えば、表1の免疫グロブリンの軽鎖および/または重鎖、またはCDRをコードする1つ以上のポリヌクレオチド(例えば、表2の配列のうちのいずれか1つ以上のヌクレオチド配列を含む)を導入することと(ポリヌクレオチドがベクター中にあり、かつ/または宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ/またはプロモーターに作動可能に連結されている)、(ii)ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で宿主細胞(例えば、CHOまたはPichiaまたはPichia pastoris)を培養することと、(iii)任意選択的に、抗原結合タンパク質(例えば、抗体または断片)または鎖を、宿主細胞および/または宿主細胞が増殖する培地から単離することと、を含む、組換え方法を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子編集システム(例
えば、CRISPR(例えば、CRISPR-Cas9)、TALEN、megaTAL、ジンクフィンガー、またはArgonaute)を使用して染色体を切断した後、アデノ随伴ウイルス(AAV)などのベクターを標的として挿入することにより、宿主細胞染色体に組み込むことができる。標的挿入は、例えば、アルブミンまたは免疫グロブリンゲノム遺伝子座などの宿主細胞遺伝子座で起こり得る。あるいは、挿入は、例えばレンチウイルスなどのベクターを使用して、ランダムな遺伝子座に行うことができる。1つ超の免疫グロブリン鎖を含む抗原結合タンパク質(例えば、抗体または抗原結合断片)、例えば、2つの免疫グロブリン重鎖および2つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を作製する場合、単一の宿主細胞において鎖を共発現することにより、例えば、抗原結合タンパク質(例えば、抗体または抗原結合断片)を形成するように、このような鎖が分泌される場合、細胞内または細胞表面上または細胞外において鎖の会合がもたらされる。本方法は、免疫グロブリン重鎖のみまたは免疫グロブリン軽鎖のみ(例えば、成熟断片および/またはその可変ドメインを含む本明細書で論じられたもののうちのいずれか)が発現されるものを含む。そのような鎖は、例えば、そのような鎖を含む抗体または抗原結合断片の発現における中間体として有用である。例えば、本発明はまた、表2に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる重鎖免疫グロブリン(またはその可変ドメインまたはそのCDRを含む)と、表2に記載のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖免疫グロブリン(またはその可変ドメインまたはそのCDRを含む)(そのような生産方法の生成物である)と、を含む、抗体およびその抗原結合断片などの抗CoV-S抗原結合タンパク質、および任意選択的に、本明細書に記載の精製方法を含む。例えば、いくつかの実施形態において、この方法の生成物は、表1に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、表1に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む抗体または断片である抗CoV-S抗原結合タンパク質であり、HCVRおよびLCVR配列は、表1に列挙されている単一の抗体から選択される。いくつかの実施形態において、この方法の生成物は、表1に記載のアミノ酸配列を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3と、表1に記載のアミノ酸配列を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3と、を含む抗体または断片である抗CoV-S抗原結合タンパク質であり、6つのCDR配列は、表1に列挙されている単一の抗体から選択される。いくつかの実施形態において、この方法の生成物は、表1に記載のHCアミノ酸配列を含む重鎖と、表1に記載のLCアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体または断片である抗CoV-S抗原結合タンパク質である。
えば、CRISPR(例えば、CRISPR-Cas9)、TALEN、megaTAL、ジンクフィンガー、またはArgonaute)を使用して染色体を切断した後、アデノ随伴ウイルス(AAV)などのベクターを標的として挿入することにより、宿主細胞染色体に組み込むことができる。標的挿入は、例えば、アルブミンまたは免疫グロブリンゲノム遺伝子座などの宿主細胞遺伝子座で起こり得る。あるいは、挿入は、例えばレンチウイルスなどのベクターを使用して、ランダムな遺伝子座に行うことができる。1つ超の免疫グロブリン鎖を含む抗原結合タンパク質(例えば、抗体または抗原結合断片)、例えば、2つの免疫グロブリン重鎖および2つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を作製する場合、単一の宿主細胞において鎖を共発現することにより、例えば、抗原結合タンパク質(例えば、抗体または抗原結合断片)を形成するように、このような鎖が分泌される場合、細胞内または細胞表面上または細胞外において鎖の会合がもたらされる。本方法は、免疫グロブリン重鎖のみまたは免疫グロブリン軽鎖のみ(例えば、成熟断片および/またはその可変ドメインを含む本明細書で論じられたもののうちのいずれか)が発現されるものを含む。そのような鎖は、例えば、そのような鎖を含む抗体または抗原結合断片の発現における中間体として有用である。例えば、本発明はまた、表2に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる重鎖免疫グロブリン(またはその可変ドメインまたはそのCDRを含む)と、表2に記載のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖免疫グロブリン(またはその可変ドメインまたはそのCDRを含む)(そのような生産方法の生成物である)と、を含む、抗体およびその抗原結合断片などの抗CoV-S抗原結合タンパク質、および任意選択的に、本明細書に記載の精製方法を含む。例えば、いくつかの実施形態において、この方法の生成物は、表1に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、表1に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む抗体または断片である抗CoV-S抗原結合タンパク質であり、HCVRおよびLCVR配列は、表1に列挙されている単一の抗体から選択される。いくつかの実施形態において、この方法の生成物は、表1に記載のアミノ酸配列を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3と、表1に記載のアミノ酸配列を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3と、を含む抗体または断片である抗CoV-S抗原結合タンパク質であり、6つのCDR配列は、表1に列挙されている単一の抗体から選択される。いくつかの実施形態において、この方法の生成物は、表1に記載のHCアミノ酸配列を含む重鎖と、表1に記載のLCアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体または断片である抗CoV-S抗原結合タンパク質である。
哺乳動物細胞を含む真核生物および原核生物の宿主細胞は、抗CoV-S抗原結合タンパク質の発現のための宿主として使用され得る。このような宿主細胞は当該技術分野で周知であり、多くはAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手することができる。これらの宿主細胞には、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0、SP2細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞、および他のいくつかの細胞株が含まれる。哺乳動物の宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびハムスターの細胞が含まれる。使用することができる他の細胞株は、昆虫細胞株(例えば、Spodoptera frugiperdaまたはTrichoplusia ni)、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞、および真菌細胞である。真菌細胞には、例えば、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia minuta (Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyce
s sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces
sp.、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens、およびNeurospora crassaを含む、酵母および糸状真菌細胞が含まれる。本発明は、表1のものなどの抗原結合タンパク質を含む単離された宿主細胞(例えば、CHO細胞)、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
s sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces
sp.、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens、およびNeurospora crassaを含む、酵母および糸状真菌細胞が含まれる。本発明は、表1のものなどの抗原結合タンパク質を含む単離された宿主細胞(例えば、CHO細胞)、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
「特異的に結合する」という用語は、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイ、例えば、25°Cまたは37°Cで、例えば、Octet(登録商標)HTXバイオセンサーによって、または表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)によって、または溶解親和性ELISAによって測定されるとき、KDとして表されるCoV-
Sタンパク質(例えば、SARS-CoV-2-S)などの抗原に対する結合親和性が少なくとも約10-8Mであるそれらの抗原結合タンパク質(例えば、mAb)を指す。本発明は、CoV-Sタンパク質に特異的に結合する抗原結合タンパク質を含む。
Sタンパク質(例えば、SARS-CoV-2-S)などの抗原に対する結合親和性が少なくとも約10-8Mであるそれらの抗原結合タンパク質(例えば、mAb)を指す。本発明は、CoV-Sタンパク質に特異的に結合する抗原結合タンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」もしくは「抗原結合断片」、または抗原結合タンパク質という用語、およびこれらに類するものは、任意の自然発生の、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体結合断片の非限定例としては、(i)Fab断片、(ii)F(ab’)2断片、(iii)Fd断片、(iv)Fv断
片、(v)一本鎖Fv(scFv)分子、(vi)dAb断片、および(vii)抗体の超可変領域(例えば、CDR3ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR))を模倣するアミノ酸残基、または拘束FR3-CDR3-FR4ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ(例えば、WO08/020079またはWO09/138519に定義されるような)(例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど)、小モジュラー免疫薬(SMIP)、およびサメ可変IgNARドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用する「抗原結合断片」の表現内に包含される。本発明の一実施形態において、抗原結合断片は、表1の抗体の3つ以上のCDR(例えば、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3、またはCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
片、(v)一本鎖Fv(scFv)分子、(vi)dAb断片、および(vii)抗体の超可変領域(例えば、CDR3ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR))を模倣するアミノ酸残基、または拘束FR3-CDR3-FR4ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ(例えば、WO08/020079またはWO09/138519に定義されるような)(例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど)、小モジュラー免疫薬(SMIP)、およびサメ可変IgNARドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用する「抗原結合断片」の表現内に包含される。本発明の一実施形態において、抗原結合断片は、表1の抗体の3つ以上のCDR(例えば、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3、またはCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
抗体の抗原結合断片は、本発明の実施形態において、少なくとも1つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、概して、1つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは1つ以上のフレームワーク配列と共にインフレームである少なくとも1つのCDRを含む。VLドメインと結合したVHドメインを有する抗原結合断片において、VHドメインおよびVLドメインは、何らかの好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、VH-VH、VH-VLまたはVL-VL二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体VHまたはVLドメインを含み得る。
特定の実施形態において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも1つの定常ドメインに共有結合された少なくとも1つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な立体配置には、(i)VH-CH1、(ii)VH-CH2、(iii)VH-CH3、(iv)VH-CH1-CH
2、(v)VH-CH1-CH2-CH3、(vi)VH-CH2-CH3、(vii)VH-C
L、(viii)VL-CH1、(ix)VL-CH2、(x)VL-CH3、(xi)VL-CH1-CH2、(xii)VL-CH1-CH2-CH3、(xiii)VL-CH2-CH3、
および(xiv)VL-CLが挙げられる。先に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび/または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも2つの(例えば、5、10、15、20、40、60またはそれより多数の)アミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとのおよび/または1つ以上の単量体VHもしくはVLドメインとの(例えば、ジスルフィド結合(複数可)による)非共有結合において、上に列記される可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体(または他の多量体)を含み得る。
2、(v)VH-CH1-CH2-CH3、(vi)VH-CH2-CH3、(vii)VH-C
L、(viii)VL-CH1、(ix)VL-CH2、(x)VL-CH3、(xi)VL-CH1-CH2、(xii)VL-CH1-CH2-CH3、(xiii)VL-CH2-CH3、
および(xiv)VL-CLが挙げられる。先に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび/または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも2つの(例えば、5、10、15、20、40、60またはそれより多数の)アミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとのおよび/または1つ以上の単量体VHもしくはVLドメインとの(例えば、ジスルフィド結合(複数可)による)非共有結合において、上に列記される可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体(または他の多量体)を含み得る。
抗原結合タンパク質(例えば、抗体および抗原結合断片)は、単一特異性または多重特異性(例えば、二重特異性)であり得る。多重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書でさらに論じられる。
特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、リガンドなどの部分、または抗ウイルス薬、第2の抗インフルエンザ抗体、または例えばインフルエンザウイルス感染などのウイルス感染の治療に有用である任意の他の治療部分などの治療部分(「免疫結合体」)にコンジュゲートすることができる。以下を参照されたい。
本発明はまた、抗CoV-Sポリペプチドもしくはその抗原性断片および/または抗CoV-S抗体もしくは断片に特異的に結合する二次抗体もしくはその抗原結合断片(例えば、検出可能に標識された二次抗体)と複合体化した、本明細書で論じられる抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片を含む複合体も提供する。本発明の実施形態において、抗体または断片は、インビトロである(例えば、固体基質に固定化されている)か、または対象の体内にある。本発明の実施形態において、CoV-Sは、インビトロである(例えば、固体基質に固定化されている)か、ウイルスの表面にあるか、または対象の体内にある。不溶性マトリックス材料(例えば、ガラスまたはアガロースもしくはセファロースなどの多糖類、例えば、ビーズまたはその他の粒子)に共有結合されている固定化された抗CoV-S抗体およびその抗原結合断片も、本発明の一部であり、任意選択的に、固定化された抗体は、CoV-Sもしくはその抗原性断片、または二次抗体もしくはその断片と複合体化する。
「単離された」抗原結合タンパク質、抗体またはその抗原結合断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターは、それらが生成される細胞または細胞培養物からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含まない。このような生物学的分子には、核酸、タンパク質、他の抗体もしくは抗原結合断片、脂質、炭水化物、または細胞破片および増殖培地などの他の材料が含まれる。単離された抗体または抗原結合断片はさらに、宿主細胞からの生物学的分子などの発現系構成成分またはその増殖培地を少なくとも部分的に含まない場合がある。一般に、「単離された」という用語は、このような生物学的分子の完全な欠如、または水、バッファー、もしくは塩の欠如、または抗体または断片)を含む医薬製剤の構成成分を指すことを意図するものではない。
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質の特異的抗原結合部位、例えば、パラトープとして既知である抗体分子の可変領域と相互作用する抗原決定基(例えば、CoV-Sポリペプチド)を指す。単一の抗原は、1つ超のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「
エピトープ」という用語は、B細胞および/またはT細胞が応答する抗原上の部位も指す。この用語は、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、線状または立体構造であってもよい、すなわち、非線状アミノ酸から構成され得る。特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、特定の実施形態において、特異的三次元構造特徴および/または比電荷特徴を有し得る。
エピトープ」という用語は、B細胞および/またはT細胞が応答する抗原上の部位も指す。この用語は、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、線状または立体構造であってもよい、すなわち、非線状アミノ酸から構成され得る。特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、特定の実施形態において、特異的三次元構造特徴および/または比電荷特徴を有し得る。
抗原結合タンパク質、例えば、抗体または断片またはポリペプチドのエピトープを決定するための方法には、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析(Reineke(2004)Methods Mol.Biol.248:443-63)、ペプチド切断分析、結晶学的研究、およびNMR分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を利用することができる(Tomer(2000)Prot.Sci.9:487-496)。抗原結合タンパク質(例えば、抗体または断片またはポリペプチド)が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法(例えば、coversin)は、質量分析によって検出される水素/重水素交換である。一般的にいえば、水素/重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗原結合タンパク質、例えば、抗体または断片またはポリペプチドを重水素標識タンパク質へ結合させることを含む。次に、CoV-Sタンパク質/抗原結合タンパク質複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されたアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンよりも低速で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質/抗原結合タンパク質界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持することができ、それゆえ、界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に大きな質量を呈する。抗原結合タンパク質(例えば、抗体または断片またはポリペプチド)の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗原結合タンパク質が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267:252-259;Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265Aを参照されたい。
本明細書で使用される場合、「競合する」という用語は、抗原(例えば、CoV-S)に結合し、別の抗原結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合断片)の抗原への結合を阻害または遮断する抗原結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合断片)を指す。本用語は、両方の配向における2つの抗原結合タンパク質、例えば、抗体間の競合、すなわち、結合し、二次抗体の結合を遮断する一次抗体も含み、その逆も同様である。特定の実施形態において、第1の抗原結合タンパク質(例えば、抗体)および第2の抗原結合タンパク質(例えば、抗体)は、同じエピトープに結合し得る。あるいは、第1および第2の抗原結合タンパク質(例えば、抗体)は、異なるが、例えば、重複しているエピトープに結合し得、一方の結合が、例えば、立体障害を介して二次抗体の結合を阻害または遮断する。抗原結合タンパク質(例えば、抗体)間の競合は、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイによって測定され得る。エピトープマッピング(例えば、アラニンスキャニングまたは水素-重水素交換(HDX)を介して)を使用して、2つ以上の抗体が(例えば、スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)単量体上で)競合していないか、同じエピトープに対して競合しているか、または競合するが、多様なマイクロエピトープ(例えば、HDXを介して同定される)と競合しているかを決定することができる。本発明の実施形態において、第1および第2の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)間の競合は、第2の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)と複合体化した可溶性CoV-Sタンパ
ク質に結合する固定化された第1の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)(最初はCoV-Sタンパク質と複合体化しない)の能力を測定することによって決定される。複合体化していないCoV-Sタンパク質と比較して、複合体化したCoV-Sタンパク質に結合する第1の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)の能力の低下は、第1および第2の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)が競合することを示す。競合の程度は、結合の低下の割合として表すことができる。このような競合は、例えば、Octet RED384バイオセンサー(Pall ForteBio Corp.)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、またはSPR(表面プラズモン共鳴)で、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを使用して測定することができる。
ク質に結合する固定化された第1の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)(最初はCoV-Sタンパク質と複合体化しない)の能力を測定することによって決定される。複合体化していないCoV-Sタンパク質と比較して、複合体化したCoV-Sタンパク質に結合する第1の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)の能力の低下は、第1および第2の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体)が競合することを示す。競合の程度は、結合の低下の割合として表すことができる。このような競合は、例えば、Octet RED384バイオセンサー(Pall ForteBio Corp.)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、またはSPR(表面プラズモン共鳴)で、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを使用して測定することができる。
抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、モノクローナル抗体(mAb))間の結合競合は、Octet RED384バイオセンサー(Pall ForteBio Corp.)でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定することができる。例えば、2つの抗CoV-Sモノクローナル抗体間の競合を決定するために、最初に、抗CoV-S mAbを、チップを抗CoV-S mAb(以降「mAb1」と呼ばれる)の溶液に浸すことによって抗hFc抗体でコーティングしたOctetバイオセンサーチップ(Pall ForteBio Corp.,#18-5060)上に捕捉することができる。次いで、遮断の正の対照として、抗体を捕捉したバイオセンサーチップを、mAbを遮断する溶液に浸漬することによって、既知の遮断アイソタイプ対照mAb(以降、「遮断mAb」と呼ばれる)で飽和させることができる。mAb2がmAb1と競合するかどうかを決定するために、次いで、バイオセンサーチップを、一定時間プレインキュベートしたCoV-Sポリペプチドおよび第2の抗CoV-S mAb(以降「mAb2」と呼ばれる)との共複合溶液に続いて浸漬し、mAb1のCoV-Sポリペプチドへの結合を決定することができる。バイオセンサーチップは、実験の各ステップ間にバッファーで洗浄され得る。リアルタイム結合応答が実験の過程の間監視され得、各ステップの終了時の結合応答が記録され得る。
例えば、本発明の実施形態において、競合アッセイを、例えば、バッファー、塩、界面活性剤、および非特異的タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)の存在下で、25℃および約7、例えば、7.4のpHで行った。
典型的には、何らかの方法で修飾される本発明の抗体または抗原結合断片は、CoV-Sに特異的に結合する能力を保持し、例えば、その活性がモルベースで表される場合、そのCoV-S結合活性の少なくとも10%(親抗体と比較した場合)を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合断片は、親抗体としてのCoV-S結合親和性の少なくとも20%、50%、70%、80%、90%、95%、または100%以上を保持する。本発明の抗体または抗原結合断片は、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換(抗体の「保存的変異体」または「機能保存的変異体」と呼ばれる)を含み得ることも意図される。
免疫グロブリン鎖などのポリペプチドの「変異体」(例えば、mAb8021 VH、
VL、HC、またはLC、mAb8028 VH、VL、HC、またはLC、またはmAb
8029 VH、VL、HC、またはLC)は、比較がBLASTアルゴリズムによって行われる場合、本明細書に記載の参照アミノ酸配列(例えば、配列番号2、10、18、20、22、30、38,40、42、50、58、または60)と少なくとも約70~99.9%(例えば、70、72、74、75、76、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9%)同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞ
れの配列間で最大の一致が得られるように選択される(例えば、期待しきい値:10、ワードサイズ:3、クエリー範囲における最大一致:0、BLOSUM 62マトリックス、ギャップコスト:存在11、拡張1、条件付き組成スコアマトリックス調整)。
VL、HC、またはLC、mAb8028 VH、VL、HC、またはLC、またはmAb
8029 VH、VL、HC、またはLC)は、比較がBLASTアルゴリズムによって行われる場合、本明細書に記載の参照アミノ酸配列(例えば、配列番号2、10、18、20、22、30、38,40、42、50、58、または60)と少なくとも約70~99.9%(例えば、70、72、74、75、76、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9%)同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞ
れの配列間で最大の一致が得られるように選択される(例えば、期待しきい値:10、ワードサイズ:3、クエリー範囲における最大一致:0、BLOSUM 62マトリックス、ギャップコスト:存在11、拡張1、条件付き組成スコアマトリックス調整)。
ポリヌクレオチドの「変異体」は、比較がBLASTアルゴリズムによって行われる場合、本明細書に記載の参照ヌクレオチド配列(例えば、配列番号1、9、17、19、21、29、37、39、41、49、57、または59)と少なくとも約70~99.9%(例えば、70、72、74、75、76、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9%)同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指し、アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致が得られるように選択される(例えば、期待しきい値:10、ワードサイズ:28、クエリー範囲における最大一致:0、一致/不一致スコア:1、-2、ギャップコスト:線形)。
本発明の実施形態における、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片は、表1に記載のHCVRアミノ酸配列と少なくとも70%(例えば、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上)のアミノ酸配列同一性を有する重鎖免疫グロブリン可変領域、および/または表1に記載のLCVRアミノ酸配列と少なくとも70%(例えば、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上)のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖免疫グロブリン可変領域を含む。
加えて、変異体抗CoV-S抗原結合タンパク質は、例えば、ミスセンス変異(例えば、保存的置換)、ナンセンス変異、欠失、または挿入などの1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)の変異を除いて、本明細書に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み得る。例えば、本発明は、表1に記載のLCVRアミノ酸配列を含むが、1つ以上のそのような変異を有する免疫グロブリン軽鎖変異体、および/または表1に記載のHCVRアミノ酸配列を含むが、1つ以上のそのような変異を有する免疫グロブリン重鎖変異体を含む抗原結合タンパク質を含む。本発明の実施形態において、変異体抗CoV-S抗原結合タンパク質は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む免疫グロブリン軽鎖変異体(このようなCDRのうちの1つ以上(例えば、1または2または3)は、このような変異(例えば、保存的置換)のうちの1つ以上を有する)、ならびに/またはCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む免疫グロブリン重鎖変異体(このようなCDRのうちの1つ以上(例えば、1または2または3)は、このような変異(例えば、保存的置換)のうちの1つ以上を有する)を含む。置換は、CDR、フレームワーク、または定数領域に含めることができる。
本発明はさらに、例えば、表1の重鎖および軽鎖CDRと、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の配列同一性または類似性を有する、本明細書に記載されている1つ以上の変異体CDR(例えば、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のうちのいずれか1つ以上)を含む、変異体抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明の実施形態はまた、本明細書に具体的に記載される対応するVH、VL、HC、またはLCのアミノ酸配列と70%以上(例えば、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上)の全
体的なアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンVHおよびVL、またはHCおよびLCを含む、変異体抗原結合タンパク質、例えば、抗CoV-S抗体およびその抗原結合断片も含むが、このような免疫グロブリンのCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3は、変異体ではなく、表1に記載のCDRアミノ酸配列を含む。したがって、このような実施形態において、変異体抗原結合タンパク質内のCDRは、それ自体、変異体ではない。
体的なアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンVHおよびVL、またはHCおよびLCを含む、変異体抗原結合タンパク質、例えば、抗CoV-S抗体およびその抗原結合断片も含むが、このような免疫グロブリンのCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3は、変異体ではなく、表1に記載のCDRアミノ酸配列を含む。したがって、このような実施形態において、変異体抗原結合タンパク質内のCDRは、それ自体、変異体ではない。
保存的に修飾された変異体抗CoV-S抗体およびその抗原結合断片もまた、本発明の一部である。「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、類似の特徴(例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性/親水性、骨格構造、および剛性など)を有する他のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の1つ以上の置換がある変異体を指す。このような変化は、抗体または断片の生物学的活性を著しく破壊することなく頻繁に行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する(例えば、Watson et al.(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th ED.を参照されたい)。加えて、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を著しく破壊する可能性が低い。
類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖:セリンおよびトレオニン、3)アミド含有側鎖:アスパラギンおよびグルタミン、4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、およびヒスチジン、6)酸性側鎖:アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに7)含硫側鎖:システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Gonnet et al.(1992)Science 256:1443 45に開示されるPAM250対数尤度マトリックスにおいて正値を有する任意の変化である。
抗CoV-S抗体の機能保存的変異体およびその抗原結合断片もまた、本発明の一部である。抗CoV-S抗体の変異体およびその抗原結合断片(本明細書で論じられる)のいずれも、「機能保存的変異体」であり得る。このような機能保存的な変異体は、場合によっては、保存的に修飾された変異体として特徴付けられることもある。本明細書で使用される「機能保存的変異体」は、抗体または断片の1つ以上の機能的特性を著しく変化させることなく1つ以上のアミノ酸残基が変更された抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片の変異体を指す。本発明の実施形態において、本発明の機能保存的変異体抗CoV-S抗体またはその抗原結合断片は、変異体アミノ酸配列を含み、以下の機能的特性のうちの1つ以上を示す。
・ACE2および/またはTMPRSS2発現細胞(例、Calu-3細胞)におけるコロナウイルス(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、および/またはMERS-CoV)の増殖を阻害すること、
・ACE2および/またはTMPRSS2を発現しないMDCK/Tet-on細胞に有意に結合しないこと、
・インビトロでの細胞、例えば、Calu-3のコロナウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、および/またはMERS-CoVによる)の拡大を制限すること、ならびに/または
・ヒトTMPRSS2および/またはACE2タンパク質を発現するように操作されたマウスを、コロナウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、もし
くはMERS-CoV)によって引き起こされる死亡から保護すること(例えば、任意選択的に第2の治療薬と組み合わせた場合、マウスはそうでなければ致死量のウイルスで感染される)。
・ヒトTMPRSS2および/またはACE2タンパク質を発現するように操作されたマウスを、コロナウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、もしくはMERS-CoV)によって引き起こされる体重減少から保護すること(例えば、任意選択的に第2の治療薬と組み合わせた場合、マウスはそうでなければ体重減少を引き起こすウイルスの用量で感染される)。
・ACE2および/またはTMPRSS2発現細胞(例、Calu-3細胞)におけるコロナウイルス(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、および/またはMERS-CoV)の増殖を阻害すること、
・ACE2および/またはTMPRSS2を発現しないMDCK/Tet-on細胞に有意に結合しないこと、
・インビトロでの細胞、例えば、Calu-3のコロナウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、および/またはMERS-CoVによる)の拡大を制限すること、ならびに/または
・ヒトTMPRSS2および/またはACE2タンパク質を発現するように操作されたマウスを、コロナウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、もし
くはMERS-CoV)によって引き起こされる死亡から保護すること(例えば、任意選択的に第2の治療薬と組み合わせた場合、マウスはそうでなければ致死量のウイルスで感染される)。
・ヒトTMPRSS2および/またはACE2タンパク質を発現するように操作されたマウスを、コロナウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、もしくはMERS-CoV)によって引き起こされる体重減少から保護すること(例えば、任意選択的に第2の治療薬と組み合わせた場合、マウスはそうでなければ体重減少を引き起こすウイルスの用量で感染される)。
「中和」または「アンタゴニスト」抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片は、CoV-Sの活性を任意の検出可能な程度に阻害する、例えば、TMPRSS2などのプロテアーゼによって切断される、または宿主細胞へのウイルス侵入または宿主細胞でのウイルス複製を仲介する、ACE2などの受容体に結合するCoV-Sの能力を阻害する分子を指す。
表1は、以下に記載されるような重鎖もしくはVH(もしくはその変異体)および軽鎖
もしくはVL(もしくはその変異体)を含むか、またはそれらのCDR(CDR-H1(
またはその変異体)、CDR-H2(またはその変異体)、およびCDR-H3(またはその変異体))を含むVH、ならびにそれらのCDR(CDR-L1(またはその変異体
)、CDR-L2(またはその変異体)、およびCDR-L3(またはその変異体))を含むVLを含む、抗体およびその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質を指し、例えば
、免疫グロブリン鎖、可変領域、および/またはCDRは、以下に説明する特定のアミノ酸配列を含む。
もしくはVL(もしくはその変異体)を含むか、またはそれらのCDR(CDR-H1(
またはその変異体)、CDR-H2(またはその変異体)、およびCDR-H3(またはその変異体))を含むVH、ならびにそれらのCDR(CDR-L1(またはその変異体
)、CDR-L2(またはその変異体)、およびCDR-L3(またはその変異体))を含むVLを含む、抗体およびその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質を指し、例えば
、免疫グロブリン鎖、可変領域、および/またはCDRは、以下に説明する特定のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の抗体はまた、VHが野生型IgG4(例えば、残基108がSである
)またはIgG4変異体(例えば、残基108がPである)に融合される実施形態を含む。
)またはIgG4変異体(例えば、残基108がPである)に融合される実施形態を含む。
本発明の抗体および抗原結合断片は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖、ならびに抗体に対する細胞およびインビトロ翻訳後修飾を含む。例えば、本発明は、本明細書に記載の重鎖および/または軽鎖アミノ酸配列(例えば、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、および/またはCDR-L3)を含むCoV-Sに特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびに1つ以上のアミノ酸残基がグリコシル化されている抗体および断片、1つ以上のAsn残基が脱アミド化されている抗体および断片、1つ以上の残基(例えば、Met、Trp、および/またはHis)が酸化されている抗体および断片、N末端Glnがピログルタメート(pyroE)である抗体および断片、ならびに/またはC末端リジンが欠けている抗体および断片を含む。
例示的な抗SARS-CoV-2-スパイクタンパク質(SARS-CoV-2-S)抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、以下の例示的な配列の表に示されている。
抗体の投与
本発明は、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、表1のものを投与するための方法であって、抗原結合タンパク質を対象(例えば、ヒト)の体内に導入することを含む、方法を提供する。例えば、本方法は、シリンジの針で対象の身体を刺し、抗原結合タンパク質を対象の体内、例えば、対象の静脈、動脈、腫瘍、筋肉組織、または皮下組織に注射することを含む。
本発明は、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、表1のものを投与するための方法であって、抗原結合タンパク質を対象(例えば、ヒト)の体内に導入することを含む、方法を提供する。例えば、本方法は、シリンジの針で対象の身体を刺し、抗原結合タンパク質を対象の体内、例えば、対象の静脈、動脈、腫瘍、筋肉組織、または皮下組織に注射することを含む。
本発明は、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、表1のものを含む容器(例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空ボア針、または注射器シリンダーを有するプラスチックまたはガラスバイアル)を提供する。
本発明はまた、CoV-S、例えば、表1のものに特異的に結合する1つ以上の抗原結合タンパク質(例えば、抗体または抗原結合断片)、またはその医薬組成物を含む注射器具を提供する。注射器具は、キットにパッケージされてもよい。注射器具は、非経口経路、例えば、筋肉内、皮下、または静脈内を介して対象の体内に物質を導入する器具である。例えば、注射器具は、例えば、注射される流体(例えば、抗体もしくは断片またはその医薬組成物を含む)を保持するためのシリンダーまたはバレル、流体を注射するための皮膚および/または血管を縫い合わせるための針、ならびに流体をシリンダーから押し出して針の穴に通すためのプランジャーを含むシリンジ(例えば、自動注射器などの医薬組成物で予め充填されている)であり得る。本発明の一実施形態において、本発明の組み合わせからの抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む注射器具、またはその医薬組成物は、静脈内(IV)注射器具である。そのような器具は、カニューレまたはトロカール/針を通して対象の体内に導入された流体(例えば、生理食塩水)を保持するためのバッグまたはリザーバーに取り付けられ得るチューブに取り付けられ得るカニューレまたはトロカール/針内の抗原結合タンパク質またはその医薬組成物を含み得る。本発明の一実施形態において、抗体またはその断片またはその医薬組成物は、トロカールおよびカニューレが対象の静脈に挿入され、トロカールが挿入されたカニューレから除去されると、器具内に導入され得る。IV器具は、例えば、末梢静脈(例えば、手または腕)、上大静脈もしくは下大静脈、または心臓の右心房内(例えば、中心IV)、または鎖骨下静脈、内頸静脈、または大腿静脈に挿入することができ、例えば、上大静脈または右心房(中心静脈ラインなど)に到達するまで心臓に向かって前進させる。本発明の一実施形態において、注射器具は、自動注射器、ジェットインジェクター、または外部注入ポンプである。ジェットインジェクターは、表皮を貫通する高圧の狭い液体ジェットを使用
して、抗体または断片またはその医薬組成物を対象の身体に導入する。外部注入ポンプは、抗体または断片またはそれらの医薬組成物を制御された量で対象の体内に送達する医療機器である。外部輸液ポンプは、電気的または機械的に電力を供給することができる。様々なポンプが様々な方法で動作し、例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバーに流体を保持し、可動ピストンは流体の供給を制御し、エラストマーポンプは伸縮性のあるバルーンリザーバーに流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力は流体の供給を促進する。蠕動ポンプでは、ローラーのセットが柔軟なチューブの長さをつまんで、液体を前方に押し出す。マルチチャネルポンプでは、流体を複数のリザーバーから複数の速度で供給することができる。
して、抗体または断片またはその医薬組成物を対象の身体に導入する。外部注入ポンプは、抗体または断片またはそれらの医薬組成物を制御された量で対象の体内に送達する医療機器である。外部輸液ポンプは、電気的または機械的に電力を供給することができる。様々なポンプが様々な方法で動作し、例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバーに流体を保持し、可動ピストンは流体の供給を制御し、エラストマーポンプは伸縮性のあるバルーンリザーバーに流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力は流体の供給を促進する。蠕動ポンプでは、ローラーのセットが柔軟なチューブの長さをつまんで、液体を前方に押し出す。マルチチャネルポンプでは、流体を複数のリザーバーから複数の速度で供給することができる。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。任意のこのような既知の方法は、CoV-Sに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本発明の文脈において使用され得る。CoV-Sに対する抗体を生成するために、以下のうちのいずれか1つを含む免疫原を使用することができる。本発明の特定の実施形態において、本発明の抗体は、完全長の天然CoV-Sで、または弱毒化生もしくは不活性化ウイルスで、またはタンパク質もしくはその断片をコードするDNAで免疫化したマウスから得られる。あるいは、CoV-Sタンパク質またはその断片は、標準的な生化学的技術を使用して生成され、修飾され、免疫原として使用され得る。本発明の一実施形態において、免疫原は、組換え生成されたCoV-Sタンパク質またはその断片である。本発明の特定の実施形態において、免疫原は、CoV-Sポリペプチドワクチンであり得る。特定の実施形態において、1回以上の追加免疫注射が投与され得る。特定の実施形態において、免疫原は、E.coliにおいて、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの任意の他の真核細胞もしくは哺乳動物細胞において発現された組換えCoV-Sポリペプチドであり得る。
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。任意のこのような既知の方法は、CoV-Sに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本発明の文脈において使用され得る。CoV-Sに対する抗体を生成するために、以下のうちのいずれか1つを含む免疫原を使用することができる。本発明の特定の実施形態において、本発明の抗体は、完全長の天然CoV-Sで、または弱毒化生もしくは不活性化ウイルスで、またはタンパク質もしくはその断片をコードするDNAで免疫化したマウスから得られる。あるいは、CoV-Sタンパク質またはその断片は、標準的な生化学的技術を使用して生成され、修飾され、免疫原として使用され得る。本発明の一実施形態において、免疫原は、組換え生成されたCoV-Sタンパク質またはその断片である。本発明の特定の実施形態において、免疫原は、CoV-Sポリペプチドワクチンであり得る。特定の実施形態において、1回以上の追加免疫注射が投与され得る。特定の実施形態において、免疫原は、E.coliにおいて、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの任意の他の真核細胞もしくは哺乳動物細胞において発現された組換えCoV-Sポリペプチドであり得る。
モノクローナル抗体を生成するためにVELOCIMMUNE(登録商標)技術(例えば、US6,596,541,Regeneron Pharmaceuticals,VELOCIMMUNE(登録商標)を参照されたい)または任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するCoV-Sに対する高親和性キメラ抗体がまず単離され得る。VELOCIMMUNE(登録商標)技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を生成するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするDNAを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするDNAに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてDNAを発現させる。
概して、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスに関心対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞(B細胞など)を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、関心対象の抗原に特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を同定するためにこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするDNAを単離し得、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域へ連結することができる。このような抗体タンパク質は、CHO細胞などの細胞において生成され得る。代替的に、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするDNAを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
まず、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験セクションと同様に、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴
について特徴付けられ、かつ選択される。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾IgG1もしくはIgG4を生成するために所望のヒト定常領域と置換される。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
について特徴付けられ、かつ選択される。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾IgG1もしくはIgG4を生成するために所望のヒト定常領域と置換される。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
Fc変異体を含む抗コロナウイルススパイクタンパク質抗体
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性pHと比較して酸性pHで、例えば、FcRn受容体への抗体結合を増強または減少させる1つ以上の変異を含むFcドメインを含む、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片が提供される。例えば、本発明は、FcドメインのCH2またはCH3領域での変異を含む抗CoV-S抗体を含み、変異(複数可)は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5~約6.0の範囲のエンドソームにおいて)FcRnに対するFcドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなFc修飾の非限定的な例には、例えば、250位(例えば、EまたはQ)、250位および428位(例えば、LまたはF)、252位(例えば、L/Y/F/WまたはT)、254位(例えば、SまたはT)、および256位(例えば、S/R/Q/E/DまたはT)での修飾、または428位および/もしくは433位(例えば、H/L/R/S/P/QまたはK)および/もしくは434位(例えば、A、W、H、F、またはY[N434A、N434W、N434H、N434F、またはN434Y])での修飾、または250位および/もしくは428位での修飾、または307位もしくは308位(例えば、308F、V308F)、および434位での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は428L(例えばM428L)および434S(例えばN434S)の修飾、428L、259I(例えば、V259I)、および308F(例えば、V308F)の修飾、433K(例えば、H433K)および434(例えば、434Y)の修飾、252、254、および256(例えば、252Y、254T、および256E)の修飾、250Qおよび428Lの修飾(例えば、T250QおよびM428L)、307および/または308の修飾(例えば、308Fまたは308P)を含む。さらに別の実施形態において、修飾は、265A(例えば、D265A)および/または297A(例えば、N297A)修飾を含む。
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性pHと比較して酸性pHで、例えば、FcRn受容体への抗体結合を増強または減少させる1つ以上の変異を含むFcドメインを含む、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片が提供される。例えば、本発明は、FcドメインのCH2またはCH3領域での変異を含む抗CoV-S抗体を含み、変異(複数可)は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5~約6.0の範囲のエンドソームにおいて)FcRnに対するFcドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなFc修飾の非限定的な例には、例えば、250位(例えば、EまたはQ)、250位および428位(例えば、LまたはF)、252位(例えば、L/Y/F/WまたはT)、254位(例えば、SまたはT)、および256位(例えば、S/R/Q/E/DまたはT)での修飾、または428位および/もしくは433位(例えば、H/L/R/S/P/QまたはK)および/もしくは434位(例えば、A、W、H、F、またはY[N434A、N434W、N434H、N434F、またはN434Y])での修飾、または250位および/もしくは428位での修飾、または307位もしくは308位(例えば、308F、V308F)、および434位での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は428L(例えばM428L)および434S(例えばN434S)の修飾、428L、259I(例えば、V259I)、および308F(例えば、V308F)の修飾、433K(例えば、H433K)および434(例えば、434Y)の修飾、252、254、および256(例えば、252Y、254T、および256E)の修飾、250Qおよび428Lの修飾(例えば、T250QおよびM428L)、307および/または308の修飾(例えば、308Fまたは308P)を含む。さらに別の実施形態において、修飾は、265A(例えば、D265A)および/または297A(例えば、N297A)修飾を含む。
例えば、本発明は、250Qおよび248L(例えば、T250QおよびM248L)、252Y、254T、および256E(例えば、M252Y、S254T、およびT256E)、428Lおよび434S(例えば、M428LおよびN434S)、257Iおよび311I(例えば、P257IおよびQ311I)、257Iおよび434H(例えば、P257IおよびN434H)、376Vおよび434H(例えば、D376VおよびN434H)、307A、380A、および434A(例えば、T307A、E380A、およびN434A)、ならびに433Kおよび434F(例えば、H433KおよびN434F)からなる群から選択される変異のうちの1つ以上の対または群を含む、Fcドメインを含む抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片を含む。
前述のFcドメイン変異の任意の可能な組み合わせを含む、本明細書に記載されるVH
および/またはVLを含む、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその
抗原結合断片は、本発明の範囲内に企図される。
および/またはVLを含む、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその
抗原結合断片は、本発明の範囲内に企図される。
本発明はまた、本明細書に記載のVHと、キメラ重鎖定常(CH)領域と、を含む、抗CoV-S抗原結合タンパク質、抗体、または抗原結合断片を含み、キメラCH領域は、1
つ超の免疫グロブリンアイソタイプのCH領域に由来するセグメントを含む。例えば、本
発明の抗体は、ヒトIgG1分子、ヒトIgG2分子、またはヒトIgG4分子に由来するCH3ドメインの一部または全部と組み合わされた、ヒトIgG1分子、ヒトIgG2
分子、またはヒトIgG4分子に由来するCH2ドメインの一部または全部を含む、キメ
ラCH領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を
有するキメラCH領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトIgG1ヒンジ領域、ヒト
IgG2ヒンジ領域、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列(EU番号付けによる位置228~236のアミノ酸残基)と組み合わされた、ヒトIgG1ヒンジ領域、ヒトIgG2ヒンジ領域、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列(EU番号付けによる位置216~227のアミノ酸残基)を含み得る。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトIgG1またはヒトIgG4上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトIgG2下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるようなキメラCH領域を含む抗体は、特定の実施形態
において、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Fcエフェクター機能を呈し得る。(例えば、WO2014/022540を参照されたい)。
つ超の免疫グロブリンアイソタイプのCH領域に由来するセグメントを含む。例えば、本
発明の抗体は、ヒトIgG1分子、ヒトIgG2分子、またはヒトIgG4分子に由来するCH3ドメインの一部または全部と組み合わされた、ヒトIgG1分子、ヒトIgG2
分子、またはヒトIgG4分子に由来するCH2ドメインの一部または全部を含む、キメ
ラCH領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を
有するキメラCH領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトIgG1ヒンジ領域、ヒト
IgG2ヒンジ領域、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列(EU番号付けによる位置228~236のアミノ酸残基)と組み合わされた、ヒトIgG1ヒンジ領域、ヒトIgG2ヒンジ領域、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列(EU番号付けによる位置216~227のアミノ酸残基)を含み得る。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトIgG1またはヒトIgG4上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトIgG2下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるようなキメラCH領域を含む抗体は、特定の実施形態
において、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Fcエフェクター機能を呈し得る。(例えば、WO2014/022540を参照されたい)。
免疫結合体
本発明は、トキソイドなどの別の部分、例えば治療部分(「免疫結合体」)、またはインフルエンザウイルス感染を治療するための抗ウイルス薬にコンジュゲートされた抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体もしくは抗原結合断片を包含する。本発明の実施形態において、抗CoV-S抗体または断片は、本明細書に記載のさらなる治療薬のうちのいずれかにコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、「免疫結合体」という用語は、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質、または治療薬に化学的または生物学的に連結した抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片を指す。抗原結合タンパク質は、その標的(CoV-S)に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療薬に連結され得る。免疫結合体の例としては、抗体薬剤結合体および抗体-毒素融合タンパク質が挙げられる。本発明の一実施形態において、薬剤は、CoV-Sに特異的に結合する第2の異なる抗体であり得る。抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体または断片)にコンジュゲートされ得る治療部分のタイプは、治療されるべき状態および達成されるべき所望の治療効果を考慮したものであろう。例えば、Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)、Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,Controlled Drug
Delivery(2nd ED.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)、Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,Monoclonal Antibodies 1984:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)、“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)、およびThorpe et al.,“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immun
olRev.,62:119-58(1982)を参照されたい。
本発明は、トキソイドなどの別の部分、例えば治療部分(「免疫結合体」)、またはインフルエンザウイルス感染を治療するための抗ウイルス薬にコンジュゲートされた抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体もしくは抗原結合断片を包含する。本発明の実施形態において、抗CoV-S抗体または断片は、本明細書に記載のさらなる治療薬のうちのいずれかにコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、「免疫結合体」という用語は、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質、または治療薬に化学的または生物学的に連結した抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片を指す。抗原結合タンパク質は、その標的(CoV-S)に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療薬に連結され得る。免疫結合体の例としては、抗体薬剤結合体および抗体-毒素融合タンパク質が挙げられる。本発明の一実施形態において、薬剤は、CoV-Sに特異的に結合する第2の異なる抗体であり得る。抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体または断片)にコンジュゲートされ得る治療部分のタイプは、治療されるべき状態および達成されるべき所望の治療効果を考慮したものであろう。例えば、Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)、Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,Controlled Drug
Delivery(2nd ED.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)、Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,Monoclonal Antibodies 1984:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)、“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)、およびThorpe et al.,“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immun
olRev.,62:119-58(1982)を参照されたい。
多重特異性抗体
本発明は、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片、ならびにその使用方法およびこのような抗原結合タンパク質を作製する方法を含む。「抗CoV-S」抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片という用語は、CoV-S(例えば、表1の抗体からの抗原結合ドメイン)に特異的に結合する少なくとも1つの第1の抗原結合ドメイン、および異なる抗原または第1の抗原結合ドメインのものとは異なるCoV-Sのエピトープに結合する少なくとも1つの第2の抗原結合ドメインを含む、多重特異性(例えば、二重特異性または二重パラトピック)分子を含む。いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、両方とも、表1の抗原結合ドメインから選択される。本発明の実施形態において、第1および第2のエピトープは重複する。本発明の別の実施形態において、第1および第2のエピトープは重複しない。例えば、本発明の実施形態において、多重特異性抗体は、表1の抗体の重鎖および軽免疫グロブリン鎖を含むCoV-Sに特異的に結合する第1の抗原結合ドメイン、およびCoV-Sの異なるエピトープに特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む、二重特異性IgG抗体(例えば、IgG1またはIgG4)である。いくつかの実施形態において、二重特異性IgG抗体(例えば、IgG1またはIgG4)は、CoV-Sに特異的に結合する第1の抗原結合ドメインおよび宿主細胞タンパク質、例えば、ACE2またはTMPRSS2に結合する第2の結合ドメインを含む。
本発明は、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片、ならびにその使用方法およびこのような抗原結合タンパク質を作製する方法を含む。「抗CoV-S」抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片という用語は、CoV-S(例えば、表1の抗体からの抗原結合ドメイン)に特異的に結合する少なくとも1つの第1の抗原結合ドメイン、および異なる抗原または第1の抗原結合ドメインのものとは異なるCoV-Sのエピトープに結合する少なくとも1つの第2の抗原結合ドメインを含む、多重特異性(例えば、二重特異性または二重パラトピック)分子を含む。いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、両方とも、表1の抗原結合ドメインから選択される。本発明の実施形態において、第1および第2のエピトープは重複する。本発明の別の実施形態において、第1および第2のエピトープは重複しない。例えば、本発明の実施形態において、多重特異性抗体は、表1の抗体の重鎖および軽免疫グロブリン鎖を含むCoV-Sに特異的に結合する第1の抗原結合ドメイン、およびCoV-Sの異なるエピトープに特異的に結合する第2の抗原結合ドメインを含む、二重特異性IgG抗体(例えば、IgG1またはIgG4)である。いくつかの実施形態において、二重特異性IgG抗体(例えば、IgG1またはIgG4)は、CoV-Sに特異的に結合する第1の抗原結合ドメインおよび宿主細胞タンパク質、例えば、ACE2またはTMPRSS2に結合する第2の結合ドメインを含む。
表1の抗体は、それらの抗体のそれぞれ、CDR-HおよびCDR-L、VH、および
VL、またはHCおよびLCを含む(本明細書に記載のそれらの変異体を含む)、多重特
異性分子、例えば、抗体または抗原結合断片を含む。
VL、またはHCおよびLCを含む(本明細書に記載のそれらの変異体を含む)、多重特
異性分子、例えば、抗体または抗原結合断片を含む。
本発明の実施形態において、多重特異性分子に含まれ得る、CoV-Sに特異的に結合する抗原結合ドメインは、
(1)
(i)表1に記載のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列、および
(ii)表1に記載のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、
あるいは
(2)
(i)表1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列、および
(ii)表1に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、
あるいは
(3)
(i)表1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン配列、および
(ii)表1に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
(1)
(i)表1に記載のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列、および
(ii)表1に記載のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、
あるいは
(2)
(i)表1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列、および
(ii)表1に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列、
あるいは
(3)
(i)表1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン配列、および
(ii)表1に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
本発明の実施形態において、多重特異性抗体または断片は、2つ超の異なる結合特異性(例えば、三重特異性分子)、例えば、第1および/または第2の抗原結合ドメインと同じまたは異なる1つ以上の追加の抗原結合ドメインを含む。
本発明の一実施形態において、二重特異性抗原結合断片は、第1のエピトープ(例えば、CoV-S)に対する結合特異性を有する第1のscFv(例えば、表1のVHおよび
VL配列を含む)および第2の異なるエピトープに対する結合特異性を有する第2のsc
Fvを含む。例えば、本発明の実施形態において、第1および第2のscFvは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー(例えば、(GGGGS)n(配列番号834)などのG
Sリンカー)で繋がれており、配列中、nは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。他の二重特異性抗原結合断片には、表1の重鎖および軽鎖CDRを含む二重特異性IgG抗体のF(ab)2と、異なるエピトープに結合する別の抗体
のF(ab)2が含まれる。
VL配列を含む)および第2の異なるエピトープに対する結合特異性を有する第2のsc
Fvを含む。例えば、本発明の実施形態において、第1および第2のscFvは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー(例えば、(GGGGS)n(配列番号834)などのG
Sリンカー)で繋がれており、配列中、nは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。他の二重特異性抗原結合断片には、表1の重鎖および軽鎖CDRを含む二重特異性IgG抗体のF(ab)2と、異なるエピトープに結合する別の抗体
のF(ab)2が含まれる。
治療方法
本発明は、ウイルス感染(例えば、コロナウイル感染)を治療または予防するための方法であって、治療有効量の抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片(例えば、表1の)をそのような治療または予防を必要としている対象(例えば、ヒト)に投与することによる方法を提供する。
本発明は、ウイルス感染(例えば、コロナウイル感染)を治療または予防するための方法であって、治療有効量の抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片(例えば、表1の)をそのような治療または予防を必要としている対象(例えば、ヒト)に投与することによる方法を提供する。
コロナウイルス感染は、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質を対象に投与することにより、対象において治療または予防することができる。
ウイルス感染を治療または予防するための抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗原結合断片(例えば、表1の)の有効量または治療有効量は、治療対象における感染の1つ以上の兆候および/または症状を、このような兆候および/もしくは症状の後退または排除を誘導することによるか、あるいはこのような兆候および/もしくは症状の進行を阻害することによるかにかかわらず、軽減するのに十分な抗体または断片の量を指す。投与の量は、投与される対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などによって変動し得る。本発明の実施形態において、例えば、成人の対象におけるウイルス感染を治療または予防するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の有効量または治療有効量は、約0.01~約200mg/kg、例えば、最大150mg/kgである。本発明の一実施形態において、投与量は、最大約10.8または11グラム(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11グラム)である。感染の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、初期用量で投与され得、その後、1回以上の二次用量が続く。特定の実施形態において、初期用量に続いて、初期用量とほぼ同じか、またはそれ未満であり得る量で、抗体またはその抗原結合断片の2回目または複数の後続用量の投与が行われ得、後続用量は、少なくとも1日~3日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、または少なくとも14週間離れている。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、例えば、ウイルス感染または癌などの疾患または障害の予防および/または治療を必要とする哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ)、好ましくは、ヒトを指す。対象は、ウイルス感染症、例えば、インフルエンザ感染症を患っているか、または感染症を発症する素因がある可能性がある。感染症を発症する素因がある対象、または感染症(例えば、コロナウイルスまたはインフルエンザウイルスの)にかかるリスクが高い可能性がある対象には、自己免疫疾患のために免疫系が低下している対象、免疫抑制療法を受けている対象(例えば、臓器移植後)、ヒト免疫不全症候群(HIV)もしくは後天性免疫不全症候群(AIDS)に苦しむ対象、白血球を枯渇もしくは破壊する貧血の形態の対象、放射線もしくは化学療法を受けている対象、または炎症性障害に苦しむ対象を含む。さらに、非常に若い(例えば、5歳以下)または老齢(例えば、65歳以上)の対象は、リスクが高い。さらに、対象は、疾患の発生に近接しているためにウイルス感染にかかるリスクがある可能性があり、例えば、対象は人口密度の高い都市に住んでいるか、あるいはウイルスの感染が確認もしくは疑われる対象、または雇用の選択、例えば、病院勤務者、製薬研究者、感染地域への旅行者、または頻繁な訪問者に非常に近接して住んでいる。
「治療する」または「治療すること」とは、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片(例えば、表1の)を、(本明細書で論じられるように)有効または治療的に有効な量または用量で対象に投与されたときに抗原結合タンパク質が有効である、疾患または感染症、例えばウイルス感染症の1つ以上の兆候または症状を有する対象を指す。
本発明はまた、ウイルス感染のリスクがある対象に、そのような感染を予防するために、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)を予防的に投与することを包含する。受動的抗体ベースの免疫予防は、対象がウイルス感染するのを予防するための効果的な戦略であることが証明されている。例えば、Berry et al.,Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis.Influenza Res
Treat.2014;2014:267594.Epub 2014 Sep 22、およびJianqiang et al.,Passive immune neutralization strategies for prevention and
control of influenza A infections,Immunotherapy.2012 February;4(2):175-186、Prabhu et al.,Antivir Ther.2009;14(7):911-21,Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenzaを参照されたい。「予防する」または「予防すること」とは、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片(例えば、表1の)を対象に投与して、対象の体内の疾患または感染(例えば、ウイルス感染)の兆候を阻害することを意味し、そのために有効または治療上有効な量または用量で対象に投与された場合に、抗原結合タンパク質は有効である(本明細書で論じられるように)。
Treat.2014;2014:267594.Epub 2014 Sep 22、およびJianqiang et al.,Passive immune neutralization strategies for prevention and
control of influenza A infections,Immunotherapy.2012 February;4(2):175-186、Prabhu et al.,Antivir Ther.2009;14(7):911-21,Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenzaを参照されたい。「予防する」または「予防すること」とは、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片(例えば、表1の)を対象に投与して、対象の体内の疾患または感染(例えば、ウイルス感染)の兆候を阻害することを意味し、そのために有効または治療上有効な量または用量で対象に投与された場合に、抗原結合タンパク質は有効である(本明細書で論じられるように)。
本発明の一実施形態において、対象におけるウイルス感染の徴候または症状は、例えば、ウイルス力価アッセイ(例えば、発育鶏卵またはコロナウイルススパイクタンパク質アッセイにおけるコロナウイルス増殖)によって決定されるような、対象の体内におけるウイルスの生存または増殖である。ウイルス感染の他の徴候および症状は、本明細書で論じられている。
上記のように、いくつかの実施形態において、対象は非ヒト動物であり得、本明細書で論じられる抗原結合タンパク質(例えば、抗体および抗原結合断片)は、動物の状況において、ヒト以外の動物(例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジなど)における疾患を治療および/または予防するために使用され得る。
本発明は、治療有効量の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、表1の)を対象に投与することによって、例えば、対象の体内へのタンパク質の注射によって、ウイルス感染(例えば、コロナウイルス感染)の治療もしくは予防、または以下のようなウイルス感染の少なくとも1つの徴候もしくは症状(徴候または症状はウイルス感染に続発する)の退行もしくは排除の誘導または進行の阻害を、
・発熱または発熱感/悪寒感、
・咳、
・喉の痛み、
・鼻水または鼻づまり、
・くしゃみ、
・筋肉または体の痛み、
・頭痛、
・倦怠感(疲れ)、
・嘔吐、
・下痢、
・気道感染症、
・胸の不快感、
・呼吸困難、
・気管支炎、および/または
・肺炎、
それを必要とする対象(例えば、ヒト)において行うための方法を提供する。
・発熱または発熱感/悪寒感、
・咳、
・喉の痛み、
・鼻水または鼻づまり、
・くしゃみ、
・筋肉または体の痛み、
・頭痛、
・倦怠感(疲れ)、
・嘔吐、
・下痢、
・気道感染症、
・胸の不快感、
・呼吸困難、
・気管支炎、および/または
・肺炎、
それを必要とする対象(例えば、ヒト)において行うための方法を提供する。
組み合わせおよび医薬組成物
抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片(例えば、表1の)の医薬組成物を調製するために、抗原結合タンパク質を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1984)、Hardman,et al.(2001)Goodman
and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.、Gennaro(2000)Remington:The Science and
Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.、Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY、Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY、Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY、Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.In an embodiment of the invention,the pharmaceutical composition is sterileを参照されたい。このような組成物は、本発明の一部である。
抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片(例えば、表1の)の医薬組成物を調製するために、抗原結合タンパク質を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1984)、Hardman,et al.(2001)Goodman
and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.、Gennaro(2000)Remington:The Science and
Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.、Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY、Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY、Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY、Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.In an embodiment of the invention,the pharmaceutical composition is sterileを参照されたい。このような組成物は、本発明の一部である。
本発明の範囲は、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)を含む、乾燥された、例えば、凍結乾燥された組成物、またはその医薬組成物(薬学的に許容される担体を含むが、実質的に水を欠いている)を含む。
本発明のさらなる実施形態において、本明細書に開示される抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)に関連する、対象に投与されるさらなる治療薬は、Physicians’Desk Reference 2003(Thomson Healthcare;57th edition(Nov.1,2002))に従って対象に投与される。
投与方法は様々であり得る。投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口、筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮、または動脈内が含まれる。
本発明は、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片(
例えば、表1の)を投与するための方法を提供し、これは、タンパク質を対象の体内に導入することを含む。例えば、本方法は、シリンジの針で対象の身体を刺し、抗原結合タンパク質を対象の体内、例えば、対象の静脈、動脈、腫瘍、筋肉組織、または皮下組織に注射することを含む。
例えば、表1の)を投与するための方法を提供し、これは、タンパク質を対象の体内に導入することを含む。例えば、本方法は、シリンジの針で対象の身体を刺し、抗原結合タンパク質を対象の体内、例えば、対象の静脈、動脈、腫瘍、筋肉組織、または皮下組織に注射することを含む。
本発明は、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)、ポリペプチド(例えば、表1のHC、LC、VH、またはVL)、またはポリヌクレオチド(例えば、表2の)、または本明細書に記載のベクター、または薬学的に許容される担体を含むその医薬組成物のうちのいずれかを含む容器(例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空ボア針、または注射器シリンダーを有するプラスチックまたはガラスバイアル)を提供する。
本開示の一実施形態において、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)は、1つ以上のさらなる治療薬と関連して投与される。さらなる治療薬には、抗炎症剤、抗マラリア剤、TMPRSS2に特異的に結合する二次抗体またはその抗原結合断片、およびCoV-Sに特異的に結合する二次抗体またはその抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗マラリア剤は、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである。いくつかの実施形態において、抗炎症剤は、サリルマブ、トシリズマブ、またはギムシルマブなどの抗体である。いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、本明細書に開示される、例えば、表1の二次抗体または抗原結合断片である。特定の実施形態において、表1の1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の抗体、またはそれらの抗原結合断片は、組み合わせて(例えば、同時にまたは連続して)投与することができる。表1の抗体の特定の組み合わせは、以下の例示的な抗体の組み合わせの表に記載されている(例えば、特定の組み合わせを表す各番号は、mAb10989およびmAb10987が組み合わせ1、mAb10989およびmAb10934が組み合わせ2などである)。いくつかの実施形態において、抗体の組み合わせは、異なるエピトープクラスターに結合するものの中から選択され得る。例えば、本明細書に記載の特定の抗体は、以下のようなエピトープクラスターに属する:クラスター1、mAb10987、mAb10922、mAb10936、およびmAb10934、クラスター2、mAb10989、mAb10977、およびmAb10933、クラスター3、mAb10920、クラスター4、mAb10954、mAb10986、およびmAb10964、およびクラスター5、mAb10984。したがって、2つの抗体の組み合わせは、例えば、クラスター1とクラスター2、クラスター1とクラスター3、クラスター1とクラスター4、クラスター1とクラスター5、クラスター2とクラスター3、クラスター2とクラスター4、クラスター2とクラスター5、クラスター3とクラスター4、クラスター3とクラスター5、およびクラスター4とクラスター5から選択され得る。いくつかの実施形態において、TMPRSS2に特異的に結合する抗体は、国際特許公開第WO/2019/147831号に記載されているように、H1H7017Nである。
いくつかの実施形態において、異なるヒトドナーからの抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗SARS-CoV-2-S抗体またはその抗原結合断片)を組み合わせることができる。本発明は、ヒト対象からの可変ドメインを含む2つ(またはそれ以上)の抗SARS-CoV-2-S抗体または抗原結合断片を含む組成物を含み、2つ(またはそれ以上)の抗体または抗原結合断片は、異なる対象(例えば、2つの異なるヒト対象)に由来する。ヒトB細胞に由来する抗体可変領域は、例えば、実施例1および2(表3)において論じられ、そのようなB細胞からクローン化された可変ドメインは、それらのB細胞からではない定常領域と組み合わされて、ハイブリッド抗体を生成する。そのような抗体可変領域の供給源(ドナー)は、以下の例示的なヒト由来抗体可変領域の表に示されている。いくつかの実施形態において、組成物は、ドナー1に由来する可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合断片と、ドナー2に由来する可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合断片との組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ドナー1に由来する可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合断片と、ドナー3に由来する可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合断片との組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ドナー2に由来する可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合断片と、ドナー3に由来する可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合断片との組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ドナー1からのmAb10987(例えば、CDR、可変領域、または表1に示される重鎖および軽鎖配列を含む抗体)と、ドナー3からのmAb10989(例えば、表1に示されているCDR、可変領域、または重鎖および軽鎖配列を含む抗体)との組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、さらなる治療薬は、抗ウイルス薬および/またはワクチンである。本明細書で使用される場合、「抗ウイルス薬」という用語は、対象におけるウイルス感染症を治療、予防、または改善するために使用される任意の抗感染薬物または療法を指す。「抗ウイルス薬」という用語には、カチオン性ステロイド抗菌剤、ロイペプチン、アプロチニン、リバビリン、またはインターフェロンアルファ2bが含まれるが、これらに限定されない。さらなる治療薬と併せて表1の抗体または抗原結合断片を投与することにより、ウイルス(例えば、コロナウイルス)感染の治療または予防を当該治療または予防を必要とする対象において行うための方法は、本発明の一部である。
例えば、本発明の一実施形態において、さらなる治療薬は、ワクチン、例えば、コロナウイルスワクチンである。本発明の一実施形態において、ワクチンは、不活化/死滅ウイルスワクチン、弱毒生ウイルスワクチン、またはウイルスサブユニットワクチンである。
例えば、本発明の一実施形態において、さらなる治療薬は:
Shen et al.Biochimie 142:1-10(2017)を参照されたい。
本発明の一実施形態において、抗ウイルス薬は、コロナウイルス、例えば、SARS-CoV-2、SARS-CoV、またはMERS-CoVに特異的に結合する抗体または抗原結合断片である。例示的な抗CoV-S抗体には、国際特許出願公開番号WO/2015/179535号に記載されているように、H4sH15188P、H1H15188P、H1H15211P、H1H15177P、H4sH15211P、H1H15260P2、H1H15259P2、H1H15203P、H4sH15260P2、H4sH15231P2、H1H15237P2、H1H15208P、H1H15228P2、H1H15233P2、H1H15264P2、H1H15231P2、H1H15253P2、H1H15215P、およびH1H15249P2、またはその抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されず、例えば、抗体または断片は、前述の抗CoV-S抗体のうちのいずれかのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖免疫グロブリン(例えば、VLまたはその軽鎖)、およびCDR-H1、CDR-H2、お
よびCDR-H3を含む重鎖(例えば、VHまたはその重鎖)を含む。
よびCDR-H3を含む重鎖(例えば、VHまたはその重鎖)を含む。
本発明の特定の実施形態において、さらなる治療薬は、アプロチニン、ロイペプチン、カチオン性ステロイド抗菌剤、インフルエンザワクチン(例えば、死滅、生、弱毒化全ウイルスまたはサブユニットワクチン)、またはインフルエンザウイルスに対する抗体(例えば、抗血球凝集素抗体)ではない。
「と関連して」という用語は、構成成分、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、
本発明の抗体またはその抗原結合断片が、別の薬剤と共に、例えば、同時送達のために単一の組成物に製剤化され得るか、または別個に2つ以上の組成物に製剤化され得る(例えば、キット)ことを示す。各構成成分は、他の構成成分が投与されるときとは異なる時に対象に投与することができ、例えば、各投与は、所与の期間にわたって間隔を置いて(例えば、別個にまたは連続的に)非同時に与えられてもよい。さらに、別個の構成成分は、同じ経路または異なる経路(例えば、抗CoV-S抗体またはその抗体結合断片によって対象に投与され得る。
本発明の抗体またはその抗原結合断片が、別の薬剤と共に、例えば、同時送達のために単一の組成物に製剤化され得るか、または別個に2つ以上の組成物に製剤化され得る(例えば、キット)ことを示す。各構成成分は、他の構成成分が投与されるときとは異なる時に対象に投与することができ、例えば、各投与は、所与の期間にわたって間隔を置いて(例えば、別個にまたは連続的に)非同時に与えられてもよい。さらに、別個の構成成分は、同じ経路または異なる経路(例えば、抗CoV-S抗体またはその抗体結合断片によって対象に投与され得る。
キット
本明細書で論じられるような、さらなる治療薬を含むがこれらに限定されない、1つ以上の追加の構成成分と関連して、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本明細書で論じられるような抗体または抗原結合断片(例えば、表1)を含むがこれらに限定されない1つ以上の構成成分を含むキットがさらに提供される。抗原結合タンパク質および/またはさらなる治療薬は、単一の組成物として、または別々に2つ以上の組成物に、例えば、薬学的に許容される担体と共に、医薬組成物中に処方することができる。
本明細書で論じられるような、さらなる治療薬を含むがこれらに限定されない、1つ以上の追加の構成成分と関連して、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本明細書で論じられるような抗体または抗原結合断片(例えば、表1)を含むがこれらに限定されない1つ以上の構成成分を含むキットがさらに提供される。抗原結合タンパク質および/またはさらなる治療薬は、単一の組成物として、または別々に2つ以上の組成物に、例えば、薬学的に許容される担体と共に、医薬組成物中に処方することができる。
本発明の一実施形態において、キットは、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)、またはその医薬組成物を1つの容器(例えば、滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中)に、さらなる治療薬を別の容器(例えば、滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中)に含む。
別の実施形態において、キットは、単一の共通の容器内で、任意選択的に、医薬組成物中に一緒に処方された1つ以上のさらなる治療薬と組み合わせて、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)、またはその医薬組成物を含む。
キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を含む場合、キットは、そのような投与を実施するための器具(例えば、注射器具)を含むことができる。例えば、キットは、抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)を含む、上記の1つ以上の皮下注射針または他の注射器具を含むことができる。
キットは、キット内の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含むことができる。一般に、そのような情報は、患者および医師が同封の医薬組成物および剤形を効果的かつ安全に使用するのに役立つ。例えば、本発明の組み合わせに関する以下の情報は、挿入物で提供され得る:薬物動態学、薬力学、臨床研究、有効性パラメーター、適応症および使用法、禁忌、警告、予防措置、副作用、過剰投与量、適切な投与量および投与、方法提供された、適切な保管条件、参照、製造業者/販売業者情報、および特許情報。
抗体の診断的使用
抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)は、サンプル中のCoV-Sを検出および/または測定するために使用され得る。CoV-Sの例示的なアッセイは、例えば、サンプルを本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させることを含み得、ここで、抗CoV-S抗原結合タンパク質は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されるか、またはサンプルからCoV-Sを選択的に単離するためのキャプチャーリガンドとして使用される。CoV-Sと複合体を形成した抗CoV-S抗原結合タンパク質の存在は、サンプル中にCoV-Sが存在することを示している。あるいは、標識されていない抗CoV-S抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて使用することができる。検出可能な標識もしくはレポーター分子は、3H、14C、32P、35S、もしくは125Iなどの放射性同位体、フ
ルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。サンプル中のCoV-Sを検出または測定するために使用することのできる具体的な例示的アッセイには、中和アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化細胞選別(FACS)が含まれる。したがって、本発明は、サンプルを抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させること、およびCoV-S/抗CoV-S抗原結合タンパク質の存在を検出することを含む、サンプル中のスパイクタンパク質ポリペプチドの存在を検出するための方法を含み、複合体の存在は、CoV-Sの存在を示す。
抗CoV-S抗原結合タンパク質、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片(例えば、表1の)は、サンプル中のCoV-Sを検出および/または測定するために使用され得る。CoV-Sの例示的なアッセイは、例えば、サンプルを本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させることを含み得、ここで、抗CoV-S抗原結合タンパク質は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されるか、またはサンプルからCoV-Sを選択的に単離するためのキャプチャーリガンドとして使用される。CoV-Sと複合体を形成した抗CoV-S抗原結合タンパク質の存在は、サンプル中にCoV-Sが存在することを示している。あるいは、標識されていない抗CoV-S抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて使用することができる。検出可能な標識もしくはレポーター分子は、3H、14C、32P、35S、もしくは125Iなどの放射性同位体、フ
ルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。サンプル中のCoV-Sを検出または測定するために使用することのできる具体的な例示的アッセイには、中和アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化細胞選別(FACS)が含まれる。したがって、本発明は、サンプルを抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させること、およびCoV-S/抗CoV-S抗原結合タンパク質の存在を検出することを含む、サンプル中のスパイクタンパク質ポリペプチドの存在を検出するための方法を含み、複合体の存在は、CoV-Sの存在を示す。
本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、表1の)は、サンプル中のCoV-Sまたはその断片の存在を検出するためのウエスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット手順において使用され得る。そのような手順は、本発明の一部を形成し、例えば、以下のステップを含む。
(1)CoV-Sの存在について試験されるサンプルを含む膜または他の固体基質を提供すること、例えば、任意選択的に、CoV-Sの存在について試験されるサンプルから(例えば、サンプル中のタンパク質のPAGEまたはSDS-PAGE電気泳動分離から)当該技術分野で知られている方法(例えば、セミドライブロッティングまたはタンクブロッティング)を使用して、膜または他の固体基質にタンパク質を移すステップ、およびCoV-Sまたはその断片の存在について試験される膜または他の固体基質を、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させるステップを含む。
(1)CoV-Sの存在について試験されるサンプルを含む膜または他の固体基質を提供すること、例えば、任意選択的に、CoV-Sの存在について試験されるサンプルから(例えば、サンプル中のタンパク質のPAGEまたはSDS-PAGE電気泳動分離から)当該技術分野で知られている方法(例えば、セミドライブロッティングまたはタンクブロッティング)を使用して、膜または他の固体基質にタンパク質を移すステップ、およびCoV-Sまたはその断片の存在について試験される膜または他の固体基質を、本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させるステップを含む。
このような膜は、例えば、ニトロセルロースまたはビニルベース(例えば、ポリフッ化ポリニリデン(PVDF))膜の形態をとることができ、これに対して、非変性PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルまたはSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルにおいてCoV-Sの存在について試験されるタンパク質が転写されている(例えば、ゲル内での電気泳動分離後)。膜を抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させる前に、膜は、膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合するように、例えば、脱脂粉乳などで任意選択的に遮断される。
(2)膜を1回以上洗浄して、結合していない抗CoV-S抗原結合タンパク質および他の結合していない物質を除去すること、ならびに
(3)結合した抗CoV-S抗原結合タンパク質を検出すること。
(2)膜を1回以上洗浄して、結合していない抗CoV-S抗原結合タンパク質および他の結合していない物質を除去すること、ならびに
(3)結合した抗CoV-S抗原結合タンパク質を検出すること。
結合した抗原結合タンパク質の検出は、CoV-Sタンパク質が膜または基質上およびサンプル中に存在することを示している。結合した抗原結合タンパク質の検出は、抗原結合タンパク質を、検出可能に標識された二次抗体(抗免疫グロブリン抗体)と結合させ、次に、二次抗体標識の存在を検出することによるものであり得る。
本明細書に開示される抗CoV-S抗原結合タンパク質(例えば、抗体および抗原結合断片(例えば、表1の))はまた、免疫組織化学のために使用され得る。そのような方法は、本発明の一部を形成し、例えば、以下を含む。
(1)CoV-Sタンパク質の存在について試験される組織を本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させること、および
(2)組織上または組織内の抗原結合タンパク質を検出すること。
(1)CoV-Sタンパク質の存在について試験される組織を本発明の抗CoV-S抗原結合タンパク質と接触させること、および
(2)組織上または組織内の抗原結合タンパク質を検出すること。
抗原結合タンパク質自体が検出可能に標識されている場合は、直接検出できる。あるいは、抗原結合タンパク質は、検出可能に標識された二次抗体によって結合され得、その後、標識が検出される。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値(例えば、量、温度など)に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約25℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
実施例1:SARS-CoV-2スパイクタンパク質(SARS-CoV-2-S)に対するヒト抗体の生成
SARS-CoV-2-スパイクタンパク質(SARS-CoV-2-S)に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域またはヒト免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖可変領域をコードするDNAを含むVELOCIMMUNE(登録商標)マウスで生成された。各マウスは、SARS-CoV-2-S受容体結合ドメイン(RBD)を発現するベクター(NCBI受託番号(MN908947.3)のアミノ酸1-1273、配列番号832)で免疫され、その後、SARS-CoV-2-SベクターまたはSARS-CoV-2-Sタンパク質と続いた。抗体免疫応答を、SARS-CoV-2-S特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、SARS-CoV-2-S特異的抗体を生成する細胞株を同定した。米国特許第7582298号(参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されているように、骨髄腫細胞に融合することなく、抗SARS-CoV-2-S抗体を抗原陽性マウスB細胞から直接単離した。この方法を使用して、完全にヒトの抗SARS-CoV-2-S抗体(すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体)が得られた。
SARS-CoV-2-スパイクタンパク質(SARS-CoV-2-S)に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域またはヒト免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖可変領域をコードするDNAを含むVELOCIMMUNE(登録商標)マウスで生成された。各マウスは、SARS-CoV-2-S受容体結合ドメイン(RBD)を発現するベクター(NCBI受託番号(MN908947.3)のアミノ酸1-1273、配列番号832)で免疫され、その後、SARS-CoV-2-SベクターまたはSARS-CoV-2-Sタンパク質と続いた。抗体免疫応答を、SARS-CoV-2-S特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、SARS-CoV-2-S特異的抗体を生成する細胞株を同定した。米国特許第7582298号(参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されているように、骨髄腫細胞に融合することなく、抗SARS-CoV-2-S抗体を抗原陽性マウスB細胞から直接単離した。この方法を使用して、完全にヒトの抗SARS-CoV-2-S抗体(すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体)が得られた。
抗体可変領域もヒト血液サンプルから分離された。SARS-CoV-2および症候性COVID-19疾患の検査室で確認されたPCR陽性検査の3~4週間後に、患者から全血を採取した。塩化アンモニウムベースの溶解バッファー(Life Technologies)を使用して赤血球を溶解し、ネガティブセレクションによりB細胞を濃縮した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合した単一のB細胞は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離された。単離されたB細胞をシングルウェルプレーティングし、抗体の軽および重可変領域特異的PCRプライマーと混合した。各単一B細胞のcDNAは、逆転写酵素(RT)反応を介して合成された。次に、得られた各RT生成物を分割し、2つの対応するウェルに移して、後続の抗体重鎖および軽鎖PCRを行った。得られたRT生成物の1セットを、抗体重可変領域リーダー配列に特異的な5’縮重プライマーまたは抗体軽鎖可変領域リーダー配列に特異的な5’縮重プライマーおよび抗体定数領域に特異的な3’プライマーを使用したPCRによって最初に増幅して、アンプリコンを形成した。次に、アンプリコンを、抗体重可変領域フレームワーク1に特異的な5’縮重プライマーまたは抗体軽鎖可変領域フレームワーク1に特異的な5’縮重プライマーおよび抗体定常領域に特異的な3’プライマーを使用してPCRによって再度増幅し、クローニング用のアンプリコンを生成した。抗体の重鎖および軽鎖由来のPCR生成物を、それぞれ重定常領域および軽定常領域を含む発現ベクターにクローン化し、それによってハイブリッド抗体の発現ベクターを作製した。全長の重鎖と軽鎖のペアを発現する発現ベクターをCHO細胞にトランスフェクトして、試験用の抗体タンパク質を作製した。
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に記載の実施例において詳細に記載する。
実施例2:重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列
表1は、例示的な抗SARS-CoV-2-S抗体の重鎖および軽鎖可変領域およびCDRのアミノ酸配列識別子、ならびに重鎖および軽鎖配列を示している。対応する核酸配列識別子を表2に記載する。
表1は、例示的な抗SARS-CoV-2-S抗体の重鎖および軽鎖可変領域およびCDRのアミノ酸配列識別子、ならびに重鎖および軽鎖配列を示している。対応する核酸配列識別子を表2に記載する。
本明細書に開示される抗体は、完全にヒトの可変領域を有するが、マウス定常領域(例えば、マウスIgG1 FcまたはマウスIgG2 Fc(aまたはbアイソタイプ))またはヒト定常領域(例えば、ヒトIgG1 FcまたはヒトIgG4 Fc)を有することができる。当業者によって認識されるように、特定のFcアイソタイプを有する抗体は、異なるFcアイソタイプを有する抗体に変換することができる(例えば、マウスIgG1 Fcを有する抗体は、ヒトIgG4などを有する抗体に変換することができる)が、任意の事象において、表1および2に示す数値識別子によって示される可変ドメイン(CDRを含む)は同じままであり、抗原に対する結合特性は、定常ドメインの性質にかかわらず、同一であるか、または実質的に類似していると予想される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウスおよびヒトサンプル由来の抗体の可変領域は、次世代シーケンシングにより配列決定し、重鎖および軽鎖ペアのレパートリーは、(図10Aおよび図10B)を同定した。VI抗体の主な系統は、VK1-9、VK1-33、またはVK1-39とペアになったVH3-53を利用し、ヒト由来抗体は、VK1-33とペアになったVH3-66またはVK1-39とペアになったVH2-70を利用した。オーバーレイされた配列のさらなる分析は、VIとヒト由来の抗体との間の単離されたカッパ鎖のレパートリーにおける強い重複を示した。ラムダチェーンのレパートリーはうまく重複していなかったが、それはこの試験に含まれているラムダマウスが2匹だけであることが原因である可能性がある。重鎖の平均CDR長は、VIとヒト由来抗体の間で類似しており、平均長はそれぞれ13アミノ酸と14.5アミノ酸であった。平均カッパCDRの長さは、VIとヒト由来の抗体で9アミノ酸で同じであり、平均長がそれぞれ11.1アミノ酸と10.6アミノ酸のラムダ鎖で近かった。ヒト化マウスおよびヒト由来の抗体が利用できるようになったため、V遺伝子の多様性が高まり、競合しない抗体を後で同定できるようになった。
上記のように、抗体は、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスから生成されたハイブリドーマから、抗原陽性VELOCIMMUNE(登録商標)マウスB細胞から直接単離することによって、または抗原陽性ヒトB細胞からクローン化された可変領域に由来して得られた。これらの供給源の要約を表3に示す。
実施例3:結合ELISAによるハイブリドーマ上清の特徴付け
ELISA結合アッセイを実施して、SARS-CoV-2-スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)に結合した抗体上清を同定した。6XヒスチジンタグおよびC末端に2つのmycエピトープタグ(SARS-CoV-2-S-RBD-mmH、NCBI受託番号MN908947.3参照)で発現したSARS-CoV-2のRBD(アミノ酸319-541)で構成されるタンパク質を、PBSバッファー中の96ウェルプレートに1μg/mlで4℃で一晩コーティングした。その後、非特異的結合部位を、PBS中のBSAの0.5(重量/体積)%溶液を使用して遮断した。抗体上清または培地のみをPSA+0.5%のBSA遮断バッファーで1:40または1:50に希釈し、洗浄したマイクロタイタープレートに移した。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートに結合した上清を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)、または西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Jackson Immunoresearch)に結合した抗マウスIgG抗体のいずれかで検出した。次に、メーカーの推奨に従ってTMB基質溶液(BD Biosciences)を使用してプレートを現像し、VictorX5プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。
ELISA結合アッセイを実施して、SARS-CoV-2-スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)に結合した抗体上清を同定した。6XヒスチジンタグおよびC末端に2つのmycエピトープタグ(SARS-CoV-2-S-RBD-mmH、NCBI受託番号MN908947.3参照)で発現したSARS-CoV-2のRBD(アミノ酸319-541)で構成されるタンパク質を、PBSバッファー中の96ウェルプレートに1μg/mlで4℃で一晩コーティングした。その後、非特異的結合部位を、PBS中のBSAの0.5(重量/体積)%溶液を使用して遮断した。抗体上清または培地のみをPSA+0.5%のBSA遮断バッファーで1:40または1:50に希釈し、洗浄したマイクロタイタープレートに移した。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートに結合した上清を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)、または西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Jackson Immunoresearch)に結合した抗マウスIgG抗体のいずれかで検出した。次に、メーカーの推奨に従ってTMB基質溶液(BD Biosciences)を使用してプレートを現像し、VictorX5プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。
抗SARS-CoV-2-S抗体がSARS-CoV-2-Sの受容体結合ドメイン(SARS-CoV-2-S-RBD)に結合する能力は、上記のように、マイクロプレートにコーティングされたSARS-CoV-2-S-RBD-mmHタンパク質との結合ELISAを使用して評価された。96ウェルマイクロタイタープレートにコーティングされたSARS-COV-2-S-RBD-mmHに結合するシングルポイント抗体上清が、HRP結合抗hFcまたは抗mFc抗体で検出された。
3つの試験の結合結果を表4に要約する。SARS-CoV-2結合シグナル(吸光度450nm)が示され、実験ごとに負の参照として培地のみのバックグラウンドが提供される。IC(不確定)とマークされたサンプルは、プレートに実験的な異常があったため、値なしで報告される。培地のみの対照と比較して示されるように、試験された上清は、SARS-CoV-2-S-RBDへの実質的な結合を示した。
実施例4:SARS-CoV-2-Sを発現するウイルス様粒子に結合する抗体
抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する能力を調査するために、エレクトロケミルミネッセンスベースの検出プラットフォーム(MSD)のSARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現するウイルス様粒子(VLP)を利用したインビトロ結合アッセイが開発された。
抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する能力を調査するために、エレクトロケミルミネッセンスベースの検出プラットフォーム(MSD)のSARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現するウイルス様粒子(VLP)を利用したインビトロ結合アッセイが開発された。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質(NCBI受託番号MN908947.3、アミノ酸16-1211、配列番号833)を一時的に発現させるために、糖タンパク質G(VSVデルタG)を欠く水疱性口内炎ウイルス(VSV)をSARS-CoV-2スパイクタンパク質(VSV-SARS-CoV-2-S)でシュードタイピングし、HEK293T細胞で生成した。負の結合対照として、VSVデルタGはVSV Gタンパク質(VSV-G)でシュードタイピングされた。
以下の手順で実験を行った。上記の2種類のVLPをPBSで希釈し、96ウェルカーボン電極プレート(MULTI-ARRAYハイバインドプレート、MSD)に播種し、4℃で一晩インキュベートしてVLPを接着させた。非特異的結合部位を、PBS中の2(重量/体積)%のBSAによって1時間室温で遮断した。SARS CoV-2免疫マウスまたは感染したヒト血清から生成された抗体を含む上清を、1×PBS+0.5%のBSAバッファーで1:10または1:20に希釈した培地のみの対照と共に、プレート結合粒子に添加した。次に、プレートを振とうしながら室温で1時間インキュベートした後、プレートを1×PBSで洗浄し、AquaMax2000プレートウォッシャー(MDS Analytical Technologies)を使用して未結合の抗体を除去した。プレート結合抗体は、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)またはSULFO-TAGTM結合抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して室温で1時間検出された。洗浄後、プレートを製造業者の推奨手順に従ってリードバッファー(MSD)で顕色させ、発光シグナルをSECTOR Imager 600(Meso Scale Development)機器で記録した。(RLUでの)直接結合シグナルを捕捉し、SARS-CoV-2-Sを発現するVLPと無関係なVLPの比率を計算した。
無関係のVSV発現VLPへの結合と比較したSARS-CoV-2-S発現VLPに結合する抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体の能力を、上記のように免疫結合アッセイを使用して評価した。96ウェルHigh Bindプレート(MSD)に固定化されたVLPへのシングルポイント結合は、1:10または1:20の抗体上清希釈
で実行され、1時間結合され、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgGまたは抗マウスIgG抗体を使用して検出された。エレクトロケミルミネッセンスからの結合シグナルは、セクターイメージャー600(MSD)で記録された。VLPに結合する抗体のRLU値を決定した。比率は、SARS-CoV-2-Sを発現するVLP結合シグナルを対照VLPと比較して計算された。
で実行され、1時間結合され、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgGまたは抗マウスIgG抗体を使用して検出された。エレクトロケミルミネッセンスからの結合シグナルは、セクターイメージャー600(MSD)で記録された。VLPに結合する抗体のRLU値を決定した。比率は、SARS-CoV-2-Sを発現するVLP結合シグナルを対照VLPと比較して計算された。
3つの実験からの結合結果を表5に要約する。SARS-COV-2-Sを発現するVLPから観察されたシグナルは結合を示し、負のVLPとの比較は相対的なバックグラウンドを提供する。培地のみのサンプルは、上清のないサンプルに結合する二次抗体のベースラインシグナルを提供する。46の抗体は、SARS-CoV-2-Sを発現するVLPの培地のみのサンプル(20~35RLU)よりも4倍以上高く特異的に結合し、85~13,600RLUの範囲の結合シグナルを示した。SARS-CoV-2-Sを発現するVSV:VSV-VLP(負の対照)の比率は1.1~22.7の範囲であり、多くはVSV-VLPのバックグラウンドが高かった。mAb11002の比率が0.9であるのは、上清サンプル中のモノクローナル抗体の濃度が低いためである可能性がある。
実施例5:VSV-SARS-CoV-2-Sシュードウイルス感染性の抗体中和
抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2を中和する能力を調査するために、VSV-SARS-CoV-2-Sシュードウイルスを利用したインビトロ中和アッセイが開発された。
抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2を中和する能力を調査するために、VSV-SARS-CoV-2-Sシュードウイルスを利用したインビトロ中和アッセイが開発された。
上記のように、VSVシュードタイプウイルスは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするプラスミドで293T細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成された。細胞は、125μLのリポフェクタミンLTX、30μLのPLUS試薬、および最大3mLのOpti-Memを使用した、15μg/プレートのスパイクタンパク質DNAとのトランスフェクションの1日前に、DMEM完全培地にプレートあたり1.2×107個の細胞で15cmのプレートに播種された。トランスフェクションの
24時間後、細胞を10mLのPBSで洗浄し、10mLのOpti-Mem中の0.1VSVΔG:mNeonウイルスのMOIに感染させた。ウイルスを細胞上で1時間インキュベ
ートし、10分ごとに穏やかに揺り動かした。次いで、細胞を24時間37℃、5%のCO2でインキュベートする前に、20mLの感染培地を重層し、10mLのPBSで3回
洗浄した。上清を氷上で250mLの遠心分離管に集め、3000rpmで5分間遠心分離して任意の細胞破片をペレット化し、氷上で分注し、-80℃で凍結した。中和アッセイで使用する前に、Vero細胞で感染力を試験した。この材料はVSV-SARS-CoV-2-Sと呼ばれる。
24時間後、細胞を10mLのPBSで洗浄し、10mLのOpti-Mem中の0.1VSVΔG:mNeonウイルスのMOIに感染させた。ウイルスを細胞上で1時間インキュベ
ートし、10分ごとに穏やかに揺り動かした。次いで、細胞を24時間37℃、5%のCO2でインキュベートする前に、20mLの感染培地を重層し、10mLのPBSで3回
洗浄した。上清を氷上で250mLの遠心分離管に集め、3000rpmで5分間遠心分離して任意の細胞破片をペレット化し、氷上で分注し、-80℃で凍結した。中和アッセイで使用する前に、Vero細胞で感染力を試験した。この材料はVSV-SARS-CoV-2-Sと呼ばれる。
VSV-SARS-CoV-2-Sによる中和アッセイ
1日目に、ベロ細胞をT225フラスコに80%の集密度で播種した。細胞を播種するために、培地を細胞から除去し、細胞を20mLのPBS(Gibco:20012-043)で洗浄し、5mLのTrypLEを添加し、細胞が外れるまで37℃で約5分間インキュベートした。5mLの完全DMEMを添加してトリプシンを不活化し、ピペットで上下に動かして細胞を分散させた。再懸濁した細胞をカウントするために、20,000個のVero細胞を96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート(Corning:3904)のウェルあたり100μLの予熱した完全DMEMに播種した。
1日目に、ベロ細胞をT225フラスコに80%の集密度で播種した。細胞を播種するために、培地を細胞から除去し、細胞を20mLのPBS(Gibco:20012-043)で洗浄し、5mLのTrypLEを添加し、細胞が外れるまで37℃で約5分間インキュベートした。5mLの完全DMEMを添加してトリプシンを不活化し、ピペットで上下に動かして細胞を分散させた。再懸濁した細胞をカウントするために、20,000個のVero細胞を96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート(Corning:3904)のウェルあたり100μLの予熱した完全DMEMに播種した。
2日目に、VSV-SARS-CoV-2-Sを氷上で解凍し、感染培地で1:1に希釈した。
V底96ウェルプレートでは、各上清の希釈液が60ulの感染培地で生成された。培
地(負の)対照の場合、60μlの希釈した馴化培地をウェルに加えた。60μLの希釈したVSV-SARS-CoV-2-Sを、培地対照ウェルを除くすべてのウェルに加えた。それらのウェルに、60μLの感染培地を加えた。次に、シュードウイルスを上澄み希釈液と共に室温で30分間インキュベートした。培地は、Vero細胞プレートから除去し、上清/シュードウイルス混合物の100μLを細胞に移し、プレートを37℃でインキュベートし、5%のCO2で24時間インキュベートした。1:4および1:20の
最終上清希釈液、および一部のサンプルでは1:100を使用して、VSV-SARS-CoV-2-Sシュードウイルスの中和を評価した。
地(負の)対照の場合、60μlの希釈した馴化培地をウェルに加えた。60μLの希釈したVSV-SARS-CoV-2-Sを、培地対照ウェルを除くすべてのウェルに加えた。それらのウェルに、60μLの感染培地を加えた。次に、シュードウイルスを上澄み希釈液と共に室温で30分間インキュベートした。培地は、Vero細胞プレートから除去し、上清/シュードウイルス混合物の100μLを細胞に移し、プレートを37℃でインキュベートし、5%のCO2で24時間インキュベートした。1:4および1:20の
最終上清希釈液、および一部のサンプルでは1:100を使用して、VSV-SARS-CoV-2-Sシュードウイルスの中和を評価した。
3日目に、24時間のインキュベーション後、上清を細胞ウェルから除去し、100μLのPBSと交換した。次に、プレートを、MiniMaxイメージングサイトメーターを備えたSpectraMax i3で読み取った。
VSVベースのSARS-CoV-2-S発現シュードタイプウイルスを中和する抗SARS-CoV-2-S抗体の能力は、中和蛍光フォーカスアッセイを使用して評価された。3つのアッセイの結合結果を以下に要約する。各希釈での抗体の中和効力は、模擬上清対照と比較したパーセンテージとして表される。すべての抗体は中和能力を示し、特に1:100と評価された抗体のセットでは、より高い中和を示す抗体は、より強力な中和能力を表す可能性がある。
実施例6:抗体依存性細胞媒介毒性代理アッセイにおける抗体の特徴付け
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を標的とする抗体が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘発するナチュラルキラー(NK)細胞で顕著に発現するFc受容体であるFcγR3aと相互作用する能力を、抗体に結合したレポーター細胞および標的細胞を使用した代理バイオアッセイで測定した。このアッセイは、高親和性ヒトFcγR3a 176Valアロタイプ受容体(Jurkat/NFAT-Luc/hFcγR3a 176Val)と共に、転写因子NFAT(NFAT-Luc)の制御下でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを発現するように操作されたJurkat T細胞を使用した。標的細胞は、ヒトCD20(CD20を標的とするヒトIgG1抗体の陽性対照として使用)およびドキシサイクリン誘導性プロモーターによって制御される完全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する操作されたJurkat T細胞であった。レポーター細胞を標的細胞とインキュベートし、標的細胞に結合したヒトIgG1抗体のFcドメインを介したFcγR3aの関与により、レポーター細胞の転写因子NFATが活性化され、ルシフェラーゼの発現が促進され、次にこれを発光読み出しを介して測定した。
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を標的とする抗体が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘発するナチュラルキラー(NK)細胞で顕著に発現するFc受容体であるFcγR3aと相互作用する能力を、抗体に結合したレポーター細胞および標的細胞を使用した代理バイオアッセイで測定した。このアッセイは、高親和性ヒトFcγR3a 176Valアロタイプ受容体(Jurkat/NFAT-Luc/hFcγR3a 176Val)と共に、転写因子NFAT(NFAT-Luc)の制御下でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを発現するように操作されたJurkat T細胞を使用した。標的細胞は、ヒトCD20(CD20を標的とするヒトIgG1抗体の陽性対照として使用)およびドキシサイクリン誘導性プロモーターによって制御される完全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する操作されたJurkat T細胞であった。レポーター細胞を標的細胞とインキュベートし、標的細胞に結合したヒトIgG1抗体のFcドメインを介したFcγR3aの関与により、レポーター細胞の転写因子NFATが活性化され、ルシフェラーゼの発現が促進され、次にこれを発光読み出しを介して測定した。
Jurkat T細胞は、全長ヒトCD20(NCBI受託番号NP_690605.1のアミノ酸M1-P297)、Tet3Gトランス活性化タンパク質(Takara pEF1α-Tet3Gベクター、カタログ番号631167を使用してクローニング)、ならびにドキシサイクリン-誘導性の完全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質(NCBI受託番号YP_009724390.1のアミノ酸M1-T1273)を構成的に発現するように操作された。操作されたJurkat/Tet3G/hCD20/SARS-CoV2スパイクタンパク質発現細胞は、スパイクタンパク質の高発現のために選別され、その後、RPMI+10%のTetフリーFBS+P/S/G+500μg/mlのG418+1μg/mlのピューロマイシン+250μg/mlのハイグロマイシン増殖培地で維持された。
Jurkat T細胞は、高親和性ヒトFcγR3a176Valアロタイプ受容体と共
に核因子活性化T細胞(NFAT)のルシフェラーゼレポーター構築物を安定して発現するように操作された(NCBI受託番号P08637 VAR_003960のアミノ酸M1-K254)。操作されたレポーター細胞は、RPMI1640+10%のFBS+P/S/G+0.5μg/mlのピューロマイシン+500μg/mlのG418増殖培地で維持された。
に核因子活性化T細胞(NFAT)のルシフェラーゼレポーター構築物を安定して発現するように操作された(NCBI受託番号P08637 VAR_003960のアミノ酸M1-K254)。操作されたレポーター細胞は、RPMI1640+10%のFBS+P/S/G+0.5μg/mlのピューロマイシン+500μg/mlのG418増殖培地で維持された。
代理ADCCアッセイの開始まで36時間、5×105個の標的細胞/mlを1μg/
mlのドキシサイクリン(Sigma)を含むRPMI+10%のTet-フリーFBS
+P/S/G細胞培養培地中で誘導した。実験の前日に、レポーター細胞を、RPMI1640+10%のFBS+P/S/G+0.5μg/mlのピューロマイシン+500μg/mlのG418増殖培地中で7.5×105細胞/mlの密度に分割した。
mlのドキシサイクリン(Sigma)を含むRPMI+10%のTet-フリーFBS
+P/S/G細胞培養培地中で誘導した。実験の前日に、レポーター細胞を、RPMI1640+10%のFBS+P/S/G+0.5μg/mlのピューロマイシン+500μg/mlのG418増殖培地中で7.5×105細胞/mlの密度に分割した。
簡単に説明すると、実験当日に、標的細胞およびレポーター細胞をアッセイ培地(RPMI+10%のTetフリーFBS+P/S/G)に移し、3:2の比率(3×104/
ウェル標的細胞および2×104/ウェルレポーター細胞)で384ウェル白色マイクロ
タイタープレートに加え、続いて様々な濃度の抗SARS-CoV-2-S抗体上清を添加した。抗SARS-CoV-2-S抗体上清の検出されたADCC活性を正規化するために、陽性対照(ヒトIgG1を含むCD20抗体)サンプルおよび抗体を含まない陰性対照サンプルを各プレートに含めた。プレートを37℃/5%のCO2で5時間インキュ
ベートした後、等量のONE-Glo(商標)(Promega)試薬を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。放出された光は、マルチラベルプレートリーダーEnvision(PerkinElmer)上の相対光単位(RLU)で捕捉され、以下の方程式を使用してデータを分析および正規化した。
ウェル標的細胞および2×104/ウェルレポーター細胞)で384ウェル白色マイクロ
タイタープレートに加え、続いて様々な濃度の抗SARS-CoV-2-S抗体上清を添加した。抗SARS-CoV-2-S抗体上清の検出されたADCC活性を正規化するために、陽性対照(ヒトIgG1を含むCD20抗体)サンプルおよび抗体を含まない陰性対照サンプルを各プレートに含めた。プレートを37℃/5%のCO2で5時間インキュ
ベートした後、等量のONE-Glo(商標)(Promega)試薬を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。放出された光は、マルチラベルプレートリーダーEnvision(PerkinElmer)上の相対光単位(RLU)で捕捉され、以下の方程式を使用してデータを分析および正規化した。
アクティベートFcγR3a受容体に対する抗SARS-COV-2-S抗体の能力を、レポーター細胞としてJurkat/N FAT-Luc/FcγR3a176Val)
を使用して、標的細胞としてJurkat/hCD20/SARS-COV2スパイクを使用して、代理ADCCアッセイで評価した。試験した各抗体にはIgG1ドメインが含まれていた。
を使用して、標的細胞としてJurkat/hCD20/SARS-COV2スパイクを使用して、代理ADCCアッセイで評価した。試験した各抗体にはIgG1ドメインが含まれていた。
表7は結果を要約したもので、生のルシフェラーゼ活性および陽性対照の計算された%が示されている。抗体上清によるFcγR3aの活性化を示す一定範囲の%ADCC活性が観察された。すべてのサンプルは、代理ADCC活性のある程度の測定値を示し、抗体上清の10は、陽性対照で観察されたよりも優れた代理ADCC活性を示した。
実施例7:抗SARS-CoV-2-S抗体結合特異性アッセイ
抗原のパネルへの抗SARS-COV-2-S抗体の結合を決定するために、Luminex結合アッセイを実施した。このアッセイでは、抗原をアミン結合するか、ストレプトアビジンによってLuminexミクロスフェアに次のように捕捉した:約1,000
万個のMagPlexミクロスフェア(Luminex Corp.,MagPlex Microspheres,カタログ番号MC10000およびMC12000)を、500μLの0.1MのNaPO4、pH6.2(活性化バッファー)にボルテックスして
再懸濁し、遠心分離して上清を除去した。ミクロスフェアは光に敏感であるため、光から保護された。ミクロスフェアを160μLの活性化バッファーに再懸濁し、20μLの50mg/mLのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS,Thermo Scientific,カタログ番号24525)に続いて、20μLの50mg/mLの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(EDC、ThermoScientific,カタログ番号22980)を25℃で添加することによって、カルボン酸基(-COOH)を活性化した。10分後、600μLの50mMのMES、pH5(カップリングバッファー)を添加して反応液のpHを5.0に下げ、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。活性化されたミクロスフェアは、カップリングバッファー中の500μLの25μg/mLのタンパク質抗原またはストレプトアビジンと直ちに混合され、25℃で2時間インキュベートされた。50μLの1MのTris-HCl、pH8.0を添加してカップリング反応を停止し、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離し、800μLのPBS0.005%(Tween20 0.05%)で3回洗浄して、脱共役タンパク質および他の反応構成成分を除去した。ミクロスフェアを1mLのPBS2% BSA0.05%のアジ化ナトリウムに1,000万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。ストレプトアビジンによる抗原の捕捉のために、PBS中の12.5μg/mLのビオチン化タンパク質500μLをストレプトアビジン結合ミクロスフェアに添加し、25℃で1時間インキュベートした。ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離し、800μLのPBSで3回洗浄した後、0.15MのTris pH8.0中、500μLの30mMのビオチン(Millipore-Sigma,カタログ番号B4501)を使用して遮断した。ミクロスフェアを30分間インキュベートした後、ボルテックスし、遠心分離し、800μLのPBSで3回洗浄した。ミクロスフェアを1mLのPBS2%BSA0.05%のアジ化ナトリウムに1,000万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。
抗原のパネルへの抗SARS-COV-2-S抗体の結合を決定するために、Luminex結合アッセイを実施した。このアッセイでは、抗原をアミン結合するか、ストレプトアビジンによってLuminexミクロスフェアに次のように捕捉した:約1,000
万個のMagPlexミクロスフェア(Luminex Corp.,MagPlex Microspheres,カタログ番号MC10000およびMC12000)を、500μLの0.1MのNaPO4、pH6.2(活性化バッファー)にボルテックスして
再懸濁し、遠心分離して上清を除去した。ミクロスフェアは光に敏感であるため、光から保護された。ミクロスフェアを160μLの活性化バッファーに再懸濁し、20μLの50mg/mLのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS,Thermo Scientific,カタログ番号24525)に続いて、20μLの50mg/mLの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(EDC、ThermoScientific,カタログ番号22980)を25℃で添加することによって、カルボン酸基(-COOH)を活性化した。10分後、600μLの50mMのMES、pH5(カップリングバッファー)を添加して反応液のpHを5.0に下げ、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。活性化されたミクロスフェアは、カップリングバッファー中の500μLの25μg/mLのタンパク質抗原またはストレプトアビジンと直ちに混合され、25℃で2時間インキュベートされた。50μLの1MのTris-HCl、pH8.0を添加してカップリング反応を停止し、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離し、800μLのPBS0.005%(Tween20 0.05%)で3回洗浄して、脱共役タンパク質および他の反応構成成分を除去した。ミクロスフェアを1mLのPBS2% BSA0.05%のアジ化ナトリウムに1,000万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。ストレプトアビジンによる抗原の捕捉のために、PBS中の12.5μg/mLのビオチン化タンパク質500μLをストレプトアビジン結合ミクロスフェアに添加し、25℃で1時間インキュベートした。ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離し、800μLのPBSで3回洗浄した後、0.15MのTris pH8.0中、500μLの30mMのビオチン(Millipore-Sigma,カタログ番号B4501)を使用して遮断した。ミクロスフェアを30分間インキュベートした後、ボルテックスし、遠心分離し、800μLのPBSで3回洗浄した。ミクロスフェアを1mLのPBS2%BSA0.05%のアジ化ナトリウムに1,000万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。
異なるタンパク質およびビオチン化タンパク質のミクロスフェアを、2700ビーズ/mlで混合し、ウェルあたり75μLのミクロスフェアを96ウェルProcartaPlex平底プレート(ThermoFisher,カタログ番号EPX-44444-000)に播種し、抗体を含む25μLの個々の抗SARS-CoV-2上清と混合した。サンプルおよびミクロスフェアを25℃で2時間インキュベートした後、0.05%のTween20を含む200μLのDPBSで2回洗浄した。個々のミクロスフェアへの結合抗体レベルを検出するために、遮断バッファー(マウスFc領域を有する抗体用)中の100μLの2.5μg/mL-のR-フィコエリスリン結合ヤギF(ab’)2抗ヒトカッパ(Southern Biotech、カタログ番号2063-09)または遮断バッファー(ヒトFc領域を有する抗体用)中の100μLの1.25μg/mLのR-フィコエリスリンアフィニピュアF(ab’)2断片ヤギ抗マウスIgG、F(ab’)2断片特異的(Jackson Immunoresearch,カタログ番号115-116-072)を添加し、25℃で30分間インキュベートした。30分後、サンプルを200μlの洗浄バッファーで2回洗浄し、150μLの洗浄バッファーに再懸濁した。プレートは、Luminex FlexMap 3D登録商標(Luminex Corp.)およびLuminex xPonent登録商標ソフトウェアバージョン4.3(Luminex Corp.)で読み取られた。アッセイで使用したSARS-CoV-2タンパク質は次のとおりである。
RBD_(R319-F541).mmh:配列番号829
RBD_(R319-F541).mFc:配列番号830
RBD_(R319-F541).hFc):配列番号831
RBD_(R319-F541).mmh:配列番号829
RBD_(R319-F541).mFc:配列番号830
RBD_(R319-F541).hFc):配列番号831
Luminex結合の結果は、蛍光強度の中央値(MFI)信号強度として表8および表9に示されている。結果は、46の抗SARS-CoV-2-S抗体上清がSARS-CoV-2-S RBDタンパク質に特異的に結合したことを示している。これらの結果はまた、これらの抗体のうち5つがSARSコロナウイルススパイクRBDタンパク質と交差反応し、1000MFIを超える結合シグナルを示すことも示している。
実施例8:抗SARS-CoV-2-S抗体多様性アッセイ
結合アッセイを実施して、抗SARS-COV-2-S抗体の結合プロファイルを決定した。このアッセイでは、上記のLuminex結合アッセイで説明したように抗原をアミン結合させた。簡単に説明すると、16の異なるビーズ領域に対する約900万個のMagPlexミクロスフェア(Luminex Corp.,MagPLex Microspheres,カタログ番号MagPLex MC10000およびMC12000)を、500μLの0.1MのNaPO4、pH6.2にボルテックスして再懸濁し、遠
心分離して上清を除去した。ミクロスフェアを160μLの活性化バッファーに再懸濁し
、20μLの50mg/mLのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS、Thermo Scientific、カタログ番号24525)を添加し、続いて20μLの50mg/mLの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(EDC、ThermoScientific、カタログ番号22980)を25℃で添加することにより、カルボン酸基(-COOH)を活性化した。10分後、600μLの50mMのMES、pH5(カップリングバッファー)を添加して反応液のpHを5.0に下げ、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。活性化されたミクロスフェアは、カップリングバッファー中の500μLの20μg/mLのSARS-CoV-2スパイクタンパク質(RBD)(R319-F541)-mmHと直ちに混合され、25℃で2時間インキュベートされた。50μLの1MのTris-HCl、pH8.0を添加することにより、カップリング反応液をクエンチし、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離し、100μLのPBSで3回洗浄した。ミクロスフェアを250μLのPBSに900万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。
結合アッセイを実施して、抗SARS-COV-2-S抗体の結合プロファイルを決定した。このアッセイでは、上記のLuminex結合アッセイで説明したように抗原をアミン結合させた。簡単に説明すると、16の異なるビーズ領域に対する約900万個のMagPlexミクロスフェア(Luminex Corp.,MagPLex Microspheres,カタログ番号MagPLex MC10000およびMC12000)を、500μLの0.1MのNaPO4、pH6.2にボルテックスして再懸濁し、遠
心分離して上清を除去した。ミクロスフェアを160μLの活性化バッファーに再懸濁し
、20μLの50mg/mLのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS、Thermo Scientific、カタログ番号24525)を添加し、続いて20μLの50mg/mLの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(EDC、ThermoScientific、カタログ番号22980)を25℃で添加することにより、カルボン酸基(-COOH)を活性化した。10分後、600μLの50mMのMES、pH5(カップリングバッファー)を添加して反応液のpHを5.0に下げ、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。活性化されたミクロスフェアは、カップリングバッファー中の500μLの20μg/mLのSARS-CoV-2スパイクタンパク質(RBD)(R319-F541)-mmHと直ちに混合され、25℃で2時間インキュベートされた。50μLの1MのTris-HCl、pH8.0を添加することにより、カップリング反応液をクエンチし、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離し、100μLのPBSで3回洗浄した。ミクロスフェアを250μLのPBSに900万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。
アミン結合タンパク質を含む16個のミクロスフェア領域のうち15個を、ビニングアッセイ用に次のように改変した:ミクロスフェアをPBS5%のDMSOで2回洗浄し、製造上の推奨事項に従って500μlの化学物質または酵素を溶解し、10nMで上記のアミン結合ミクロスフェアに添加した。続いてこれをボルテックスし、回転させながら室温で2時間インキュベートした。ミクロスフェアをPBS2%のBSAで3回洗浄する。ミクロスフェアを1mLのPBSに900万ミクロスフェア/mLで再懸濁した。
タンパク質修飾およびタンパク質非修飾(無傷)ミクロスフェアを、2700ビーズ/mlで混合し、75μLのミクロスフェアを96ウェルProcartaPlex96ウェル平底プレート(ThermoFisher,カタログ番号EPX-44444-000)に播種し、25μLの個々の抗SARS-CoV-2-S上清含有抗体と混合した。サンプルおよびミクロスフェアを25℃で2時間インキュベートした後、0.05%のTween20を含む200μLのDPBSで2回洗浄した。個々のミクロスフェアへの結合抗体レベルを検出するために、遮断バッファー(hFcを有する抗体用)中の100μLの2.5μg/mL-のR-フィコエリスリン結合ヤギF(ab’)2抗ヒトカッパ(Southern Biotech、カタログ番号2063-09)または遮断バッファー(mFcを有する抗体用)中の100μLの1.25μg/mLのR-フィコエリスリンアフィニピュアF(ab’)2断片ヤギ抗マウスIgG、F(ab’)2断片特異的(Jackson Immunoresearch,カタログ番号115-116-072)、または遮断バッファー(ACE-2対照、R&D、カタログ番号933-ZN)中の100μLの1.25μg/mLのR-フィコエリスリン抗-His(Biolegend,カタログ番号362603)を添加し、25℃で30分間インキュベートした。30分後、サンプルを200μlの洗浄バッファーで2回洗浄し、150μLの洗浄バッファーに再懸濁した。プレートは、FlexMap 3D登録商標(Luminex Corp.)およびLuminex xPonent登録商標ソフトウェアバージョン4.3(Luminex Corp.)で読み取られた。
Luminexのビニング結果の結果を、蛍光強度の中央値(MFI)信号強度として表10に示す。クラスターを決定するために、データをインタクトなタンパク質(未修飾のミクロスフェア)に正規化し、クラスター化した。46の抗SARS-CoV-2抗体は2つ以上の抗体を持つ9つのクラスターに分類され、11の抗体は単一ノードとして分類された。クラスターは、階層的クラスタリングおよび樹状図のこれらの結果に基づいて割り当てられた。これらの結果は、46の抗SARS-CoV-2-S抗体上清が多様な結合特性およびプロファイルを持っていることを示しており、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の異なるエピトープに結合した抗体の集合を示唆している。
実施例9:抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のBiacore結合速度
CHOt細胞またはハイブリドーマの一次上清からの異なるSARS-CoV-2-S抗体の平衡解離定数(KD)は、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのBiacor
e T200/Biacore8Kバイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05v/v%のSurfactant Tween-20、pH7.4(HBS-ET)ランニングバッファーで25℃で実施した。Biacore CM5センサーチップ表面は、最初に、マウス抗ヒトFc特異的mAbまたはウサギ抗マウスFcγモノクローナル抗体(GE、カタログ番号BR-1008-38)とのアミンカップリングによって誘導体化され、抗SARS-CoV-2抗体を捕捉した。結合研究は、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグ(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現されたヒトSARS-CoV-2 RBD細胞外ドメイン、C-末端マウスIgG2a(SARS-COV-2 RBD-mFc)で発現されたSARS-CoV-2 RBD細胞外ドメイン、またはC末端ヒトIgG1(SARS-COV-2 RBD-hFc)で発現されたSARS-CoV-2 RBD細胞外ドメインで実施された。HBS-ETランニングバッファーで調製した、単一濃度のSARS-COV-2 RBD-MMH(100nM)、SARS-COV-2 RBD-mFc(50nM)またはSARS-COV-2 RBD-hFc(50nM)を、30μL/分の流速で1.5分間注入し、抗体に結合した様々なSARS-CoV-2 RBD試薬の解離を、HBS-ETランニングバッファーで2分間モニターした。各サイクルの終わりに、SARS-CoV-2 RBD抗体捕捉表面は、マウス抗ヒトFc特異的モノクローナル抗体表面用の20mMのリン酸の10秒間の注入、またはウサギ抗マウスFcγ特異的ポリクローナル抗体用の10mMのグリシン、HCl、pH1.5の40秒間の注入のいずれかを使用して再生された。会合速度(Ka)および解離速度(Kd)は、BiaEvaluationソフトウェアv3.1またはBiacore Insight Evaluationソフトウェア v2.0または曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界(mass transport limitation)を有する1:1結合モデルにあてはめることにより決定された。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1
/2)を、運動速度から以下のように計算した:
CHOt細胞またはハイブリドーマの一次上清からの異なるSARS-CoV-2-S抗体の平衡解離定数(KD)は、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのBiacor
e T200/Biacore8Kバイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05v/v%のSurfactant Tween-20、pH7.4(HBS-ET)ランニングバッファーで25℃で実施した。Biacore CM5センサーチップ表面は、最初に、マウス抗ヒトFc特異的mAbまたはウサギ抗マウスFcγモノクローナル抗体(GE、カタログ番号BR-1008-38)とのアミンカップリングによって誘導体化され、抗SARS-CoV-2抗体を捕捉した。結合研究は、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグ(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現されたヒトSARS-CoV-2 RBD細胞外ドメイン、C-末端マウスIgG2a(SARS-COV-2 RBD-mFc)で発現されたSARS-CoV-2 RBD細胞外ドメイン、またはC末端ヒトIgG1(SARS-COV-2 RBD-hFc)で発現されたSARS-CoV-2 RBD細胞外ドメインで実施された。HBS-ETランニングバッファーで調製した、単一濃度のSARS-COV-2 RBD-MMH(100nM)、SARS-COV-2 RBD-mFc(50nM)またはSARS-COV-2 RBD-hFc(50nM)を、30μL/分の流速で1.5分間注入し、抗体に結合した様々なSARS-CoV-2 RBD試薬の解離を、HBS-ETランニングバッファーで2分間モニターした。各サイクルの終わりに、SARS-CoV-2 RBD抗体捕捉表面は、マウス抗ヒトFc特異的モノクローナル抗体表面用の20mMのリン酸の10秒間の注入、またはウサギ抗マウスFcγ特異的ポリクローナル抗体用の10mMのグリシン、HCl、pH1.5の40秒間の注入のいずれかを使用して再生された。会合速度(Ka)および解離速度(Kd)は、BiaEvaluationソフトウェアv3.1またはBiacore Insight Evaluationソフトウェア v2.0または曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界(mass transport limitation)を有する1:1結合モデルにあてはめることにより決定された。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1
/2)を、運動速度から以下のように計算した:
25℃で本発明の異なる抗SARS-COV-2 RBD試薬に結合する異なるSARS-CoV-2モノクローナル抗体の結合速度パラメーターを表11および12に示す。
実施例10:ELISAを遮断することによる抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体の特徴付け
ELISAベースの遮断アッセイは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)のヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)への結合を遮断する抗SARS-CoV2-S抗体の能力を決定するために開発された。
ELISAベースの遮断アッセイは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)のヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)への結合を遮断する抗SARS-CoV2-S抗体の能力を決定するために開発された。
実験で使用したSARS-CoV-2タンパク質は、C-末端(SARS-CoV-2
RBD-hFc、NCBI受託番号MN908947.3を参照)でヒトIgG1のFc部分で発現された、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)部分(アミノ酸Arg319~Phe541)で構成された。実験で使用したヒトACE2タンパク質は、R&Dシステムから購入され、C末端-10Xヒスチジンタグ(hACE2-His、NCBI受託番号Q9BYF1)を有するアミノ酸グルタミン18~セリン740で構成されている。
RBD-hFc、NCBI受託番号MN908947.3を参照)でヒトIgG1のFc部分で発現された、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)部分(アミノ酸Arg319~Phe541)で構成された。実験で使用したヒトACE2タンパク質は、R&Dシステムから購入され、C末端-10Xヒスチジンタグ(hACE2-His、NCBI受託番号Q9BYF1)を有するアミノ酸グルタミン18~セリン740で構成されている。
以下の手順で実験を行った。モノクローナル抗Penta-His抗体(Qiagen)を、96ウェルマイクロタイタープレート上でPBS中1μg/mlで4℃で一晩コーティングした。hACE2-His受容体をPBS中0.2μg/mlで添加し、室温で2時間結合させた。その後、非特異的結合部位を、PBS中のBSAの0.5(重量/体積)%溶液を使用して遮断した。他のマイクロタイタープレートでは、一定量の10pMまたは15pM(表13に示す)のSARS-CoV-2 RBD-hFcタンパク質を、PBS+0.5%のBSAで1:10または1:20に希釈した抗体と結合させた。これらの抗体-タンパク質複合体は、1時間のインキュベーション後、hACE2-Hisでコーティングされたマイクロタイタープレートに移された。室温で1.5時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートに結合したSARS-CoV-2 RBD-hFcタンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Jackson)と結合したヤギ抗ヒトIgG抗体で検出した。次に、メーカーの推奨に従ってTMB基質溶液(BD Biosciences、カタログ番号555214)を使用してプレートを現像し、VictorX5プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。
データ分析は、抗体の存在下と非存在下での固定SARS-CoV-2-S RBD-hFc濃度のシグナルの減少率を計算することによって実行された。計算では、各プレートの抗体が存在しない一定のSARS-CoV-2-S RBD-hFcのサンプルの結合シグナルは、100%の結合または0%の遮断として参照され、SARS-CoV-2
RBD-hFcが存在しない場合のみの培地サンプルのベースラインシグナルは、0%の結合または100%の遮断として参照された。
RBD-hFcが存在しない場合のみの培地サンプルのベースラインシグナルは、0%の結合または100%の遮断として参照された。
抗SARS-CoV-2-S抗体がSARS-CoV-2-S RBDのヒトACE2への結合を遮断する能力は、遮断ELISAフォーマットを使用して評価された。96ウェルマイクロタイタープレートにコーティングされた抗His抗体に提示された、hACE2-Hisへの10pMまたは15pMのSARS-CoV-2S RBD-hFc結合のシングルポイント試験抗体上清遮断が、HRP結合抗hFc抗体で検出された。
3つのアッセイの遮断結果を表13に要約する。SARS-CoV-2-S結合シグナル(450nm)およびGで計算された%遮断が示されている。試験サンプルでは、様々な遮断が観察されている。NAが列6と7に示されているサンプルの場合、データはこれらのサンプルで発生する単一プレートスイッチと一致していたため、プレート補正値が列4と5に含まれている。46個の抗体上清のうち43個が、プレートコーティングされたヒトACE2へのSARS-CoV-2-S RBD-hFc結合の50%以上を遮断し、そのうち16個がシグナルの90%以上を遮断した。
実施例11:水素-重水素交換質量分析によるスパイク糖タンパク質に対する抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のエピトープマッピング
水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)を実行して、mAb10989、mAb10987、mAb10934、mAb10933、mAb10920、mAb10922、mAb10936、mAb10954、mAb10964、mAb10977、mAb10984、およびmAb10986と相互作用するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD(アミノ酸R319-F541))のアミノ酸残基を決定した。HDX/MS法の一般的な説明は、Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259、およびEngen
and Smith(201)Anal.Chem.73:256A-265Aに記載されている。
水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)を実行して、mAb10989、mAb10987、mAb10934、mAb10933、mAb10920、mAb10922、mAb10936、mAb10954、mAb10964、mAb10977、mAb10984、およびmAb10986と相互作用するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD(アミノ酸R319-F541))のアミノ酸残基を決定した。HDX/MS法の一般的な説明は、Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259、およびEngen
and Smith(201)Anal.Chem.73:256A-265Aに記載されている。
HDX-MS実験は、統合型HDX/MSプラットフォーム上で行われ、これは重水素標識およびクエンチングのためのLeaptec HDX PALシステム、サンプル消化および充填のためのWaters Acquity I-Class(Binary Solvent Manager)、分析勾配のためのWaters Acquity I-Class(BinarySolvent Manager)、およびペプチド質量測定のためのThermo Q Exactive HF質量分析計からなる。
標識溶液は、pD7.0でD2O中のPBSバッファーとして調製した(10mMのリ
ン酸バッファー、140mMのNaCl、および3mMのKCl、25℃でpH7.4と等価)。重水素標識では、上記の12個の抗体のそれぞれと事前に混合した10μLのRBDタンパク質またはRBDタンパク質を、90μLのD2O標識溶液と共に20℃で様
々な時点で2回インキュベートした。mAb10989、mAb10987、mAb10934、およびmAb10933の場合、時点は0分(重水素化されていない対照)、5分、および10分であった。mAb10920、mAb10922、mAb10936、mAb10954、mAb10964、mAb10977、mAb10984、およびmAb10986の場合、時点は0分(重水素化されていない対照)および10分であった。重水素化反応は、90μLの予冷したクエンチバッファー(0.5MのTCEP-HCl、4Mの尿素、0.5%のギ酸)を各サンプルに加え、20℃で90秒間インキュベートすることによりクエンチした。次に、クエンチしたサンプルをLeaptec HDX
PALシステムに注入して、オンラインペプシン/プロテアーゼXIII消化を行った
。消化したペプチドをC18カラム(2.1mm×5mm、Waters)でトラップし、別のC18カラム(2.1mm×50mm、Waters)で-5℃、20分の勾配(mAb10989、mAb10987、mAb10934、およびmAb10933の場合)、または0%~90%の移動相B溶液(移動相A溶液:0.5%のギ酸および4.5%のアセトニトリル水溶液、移動相B溶液:アセトニトリル中の0.5%のギ酸)からの10分の勾配(mAb10920、mAb10922、mAb10936、mAb10954、mAb10956、mAb10964、mAb10977、およびmAb10984の場合)で分離した。溶出したペプチドを、Thermo Q Exactive HF質量分析によってLC-MS/MSまたはLC-MSモードで分析した。
ン酸バッファー、140mMのNaCl、および3mMのKCl、25℃でpH7.4と等価)。重水素標識では、上記の12個の抗体のそれぞれと事前に混合した10μLのRBDタンパク質またはRBDタンパク質を、90μLのD2O標識溶液と共に20℃で様
々な時点で2回インキュベートした。mAb10989、mAb10987、mAb10934、およびmAb10933の場合、時点は0分(重水素化されていない対照)、5分、および10分であった。mAb10920、mAb10922、mAb10936、mAb10954、mAb10964、mAb10977、mAb10984、およびmAb10986の場合、時点は0分(重水素化されていない対照)および10分であった。重水素化反応は、90μLの予冷したクエンチバッファー(0.5MのTCEP-HCl、4Mの尿素、0.5%のギ酸)を各サンプルに加え、20℃で90秒間インキュベートすることによりクエンチした。次に、クエンチしたサンプルをLeaptec HDX
PALシステムに注入して、オンラインペプシン/プロテアーゼXIII消化を行った
。消化したペプチドをC18カラム(2.1mm×5mm、Waters)でトラップし、別のC18カラム(2.1mm×50mm、Waters)で-5℃、20分の勾配(mAb10989、mAb10987、mAb10934、およびmAb10933の場合)、または0%~90%の移動相B溶液(移動相A溶液:0.5%のギ酸および4.5%のアセトニトリル水溶液、移動相B溶液:アセトニトリル中の0.5%のギ酸)からの10分の勾配(mAb10920、mAb10922、mAb10936、mAb10954、mAb10956、mAb10964、mAb10977、およびmAb10984の場合)で分離した。溶出したペプチドを、Thermo Q Exactive HF質量分析によってLC-MS/MSまたはLC-MSモードで分析した。
重水素化されていないRBDタンパク質サンプルからのLC-MS/MSデータは、Byonic検索エンジン(Protein Metrics)を使用して、RBDタンパク質、ペプシン、プロテアーゼXIII、およびそれらの逆配列のアミノ酸配列を含むデータベースに対して検索された。検索パラメータは、非特異的酵素消化およびヒトグリコシル化を一般的な可変修飾として使用してデフォルトとして設定された。次に、同定されたペプチドのリストをHDExaminerソフトウェア(バージョン3.1)にインポートして、すべての重水素化サンプルの重水素取り込み(D取り込み)および重水素取り込みパーセンテージの差(Δ%D)を計算した。重水素取り込みパーセンテージの差(Δ%D)は次のように計算された。
重水素取り込みの差(ΔD)=D-取り込み(RBD-mAb)-D-取り込み(RBDのみ)
重水素取り込みの差(ΔD)=D-取り込み(RBD-mAb)-D-取り込み(RBDのみ)
RBDからの合計190のペプチドが、RBDのみとmAb10989サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの86.06%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸467~513(DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL)(配列番号835)に対応するペプチドは、mAb10989によって有意に保護された。
RBDからの合計187のペプチドが、RBDのみとmAb10987サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの86.06%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸432~452(CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL)(配列番号836)に対応するペプチドは、mAb10987によって有意に保護された。
RBDからの合計188のペプチドが、RBDのみおよびmAb10934サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの86.06%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸432~452(CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL)(配列番号836)、467~474(DISTEIYQ)(配列番号837)、および480~513(CNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL)(配列番号838)に対応するペプチドは、mAb10934によって有意に保護された。
RBDからの合計188個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10933サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの86.06%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸467~510(DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV)(配列番号839)に対応するペプチドは、mAb10933によって有意に保護された。
RBDからの合計75個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10920サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの83.27%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸471~486(EIYQAGSTPCNGVEGF)(配列番号840)および491~515(PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF)(配列番号841)に対応するペプチドは、mAb10920によって有意に保護された。
RBDからの合計86個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10922サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの87.25%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸432~452(CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL)(配列番号836)に対応するペプチドは、mAb10922によって有意に保護された。
RBDからの合計81個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10936サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの82.07%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。アミノ酸351~360(YAWNRKRISN)(配列番号842)、432~452(CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL)(配列番号836)、467~486(DISTEIYQAGSTPCNGVEGF)(配列番号843)、および491~513(PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL)(配列番号844)に対応するペプチドRBDは、mAb10936によって有意に保護された。
RBDからの合計84個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10954サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの87.25%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸400~422(FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN)(配列番号845)、453~486(YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF)(配列番号846)、および490~515(FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF)(配列番号847)に対応するペプチドは、mAb10954によって有意に保護された。
RBDからの合計109個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10964サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの83.67%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義
された。RBDのアミノ酸401~424(VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYK)(配列番号848)および471~513(EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL)(配列番号849)に対応するペプチドは、mAb10964によって有意に保護された。
された。RBDのアミノ酸401~424(VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYK)(配列番号848)および471~513(EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL)(配列番号849)に対応するペプチドは、mAb10964によって有意に保護された。
RBDからの合計78個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10977サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの87.25%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸351~364(YAWNRKRISNCVAD)(配列番号850)および471~486(EIYQAGSTPCNGVEGF)(配列番号840)に対応するペプチドは、mAb10977によって有意に保護された。
RBDからの合計88個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10984サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの87.25%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸400~422(FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN)(配列番号845)および453~486(YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF)(配列番号846)に対応するペプチドは、mAb10984によって有意に保護された。
RBDからの合計84個のペプチドが、RBDのみおよびmAb10986サンプルと複合体を形成したRBDの両方から同定され、RBDの87.25%の配列カバレッジを表している。mAb結合時に重水素取り込みの5%以上の減少(すなわち、-6%、-10%などの-5%未満のΔ%D値)を示したペプチドは、有意に保護されたとして定義された。RBDのアミノ酸400~422(FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN)(配列番号845)、453~486(YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF)(配列番号846)、および490~515(FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF)(配列番号847)に対応するペプチドは、mAb10986によって有意に保護された。
要約すると、試験された中和抗体の大部分は、ACE2インターフェースを構成するRBD残基と重複する方法でRBDに接触する。さらに、図15に示すように、抗体はRBD表面に接触するパターンに基づいてグループ化できる。上記のデータは、表14~25にも要約されている。
実施例12:SARS-CoV-2野生型および変異型スパイクタンパク質の中和
抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質抗体がSARS-CoV-2変異体を中和できるかどうかを試験するために、これらの抗体を、野生型および変異型スパイクタンパク質を発現するVSVシュードタイプウイルスのパネルに対してスクリーニングした。VSVシュードタイプウイルスは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするプラスミドまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列の既知の変異体をコードするヌクレオチド変異を含む同じプラスミドで293T細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成された。すべてのプラスミドはサンガーシーケンシングによって確認された。125μLのリポフェクタミンLTX、30μLのPLUS試薬、および最大3mLのOpti-Memを使用して、15μg/プレートのスパイクDNAを用いたトランスフェクションの1日前に、DMEM完全培地(1000mLのDMEM、Gibco、100mlのFBS、Gibco、10mLのPSG、Gibco)中で細胞をプレートあたり1.2×107個の細胞で15cmのプレートに播種した。トランス
フェクションの24時間後、細胞を10mLのPBSで洗浄し、10mLのOpti-Mem中の0.1VSVΔG:mNeonウイルスのMOIに感染させた。ウイルスを細胞上で1
時間インキュベートし、10分ごとに穏やかに揺り動かした。細胞を10mLのPBSで3回洗浄した後、20mLの感染培地(1000mLのDMEM、Gibco、10mLのピルビン酸ナトリウム、Gibco、7mLのBSA、Sigma、5mLのゲンタマイシン、Gibco)で覆った後、37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした
。シュードウイルスの上清を氷上で250mLの遠心分離管に収集し、3000rpmで5分間遠心分離して任意の細胞破片をペレット化し、氷上で分注し、-80℃で凍結した。中和アッセイで使用する前に、Vero細胞で感染力を試験した。この材料は、VSVΔG:mNeon/スパイクシュードウイルス、またはVSVΔG:mNeon/スパイク_(変異体アミノ酸変異)(例えば、VSVΔG:mNeon/スパイク_H49Y)と呼ばれる。
抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質抗体がSARS-CoV-2変異体を中和できるかどうかを試験するために、これらの抗体を、野生型および変異型スパイクタンパク質を発現するVSVシュードタイプウイルスのパネルに対してスクリーニングした。VSVシュードタイプウイルスは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするプラスミドまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質アミノ酸配列の既知の変異体をコードするヌクレオチド変異を含む同じプラスミドで293T細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成された。すべてのプラスミドはサンガーシーケンシングによって確認された。125μLのリポフェクタミンLTX、30μLのPLUS試薬、および最大3mLのOpti-Memを使用して、15μg/プレートのスパイクDNAを用いたトランスフェクションの1日前に、DMEM完全培地(1000mLのDMEM、Gibco、100mlのFBS、Gibco、10mLのPSG、Gibco)中で細胞をプレートあたり1.2×107個の細胞で15cmのプレートに播種した。トランス
フェクションの24時間後、細胞を10mLのPBSで洗浄し、10mLのOpti-Mem中の0.1VSVΔG:mNeonウイルスのMOIに感染させた。ウイルスを細胞上で1
時間インキュベートし、10分ごとに穏やかに揺り動かした。細胞を10mLのPBSで3回洗浄した後、20mLの感染培地(1000mLのDMEM、Gibco、10mLのピルビン酸ナトリウム、Gibco、7mLのBSA、Sigma、5mLのゲンタマイシン、Gibco)で覆った後、37℃、5%のCO2で24時間インキュベートした
。シュードウイルスの上清を氷上で250mLの遠心分離管に収集し、3000rpmで5分間遠心分離して任意の細胞破片をペレット化し、氷上で分注し、-80℃で凍結した。中和アッセイで使用する前に、Vero細胞で感染力を試験した。この材料は、VSVΔG:mNeon/スパイクシュードウイルス、またはVSVΔG:mNeon/スパイク_(変異体アミノ酸変異)(例えば、VSVΔG:mNeon/スパイク_H49Y)と呼ばれる。
1日目に、Vero細胞をT225フラスコに80%の集密度まで播種し、細胞をPBS(Gibco:20012-043)で洗浄し、TrypLEを添加して細胞をフラスコから分離し、完全DMEMを添加してトリプシンを不活化した。20,000個のVero細胞を、96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート(Corning:3904)のウェルあたり100μLの予熱した完全DMEMに播種した。2日目に、VSVΔG:mNeon/スパイクシュードウイルスを氷上で解凍し、感染培地で希釈した。抗体をU
底96ウェルプレートで希釈し、210μlの感染培地で2倍のアッセイ濃度で各抗体の希釈液を生成した。120μLの希釈抗体を新しいU底プレートに移し、培地とIgG1対照抗体を各プレートに加えた。120μlの希釈したシュードウイルスを、培地対照ウェルを除くすべてのウェルに加えた。それらのウェルに、120μLの感染培地を加えた。抗体を含むシュードウイルスを室温で30分間インキュベートした後、培地をベロ細胞から除去した。抗体/シュードウイルスの混合物の100μLを細胞に添加し、次いで24時間5%のCO2、37℃でインキュベートした。3日目に、上清を細胞ウェルから除
去し、100μLのPBSと交換した。プレートを、MiniMaxイメージングサイトメーターを備えたSpectraMax i3で読み取った。
底96ウェルプレートで希釈し、210μlの感染培地で2倍のアッセイ濃度で各抗体の希釈液を生成した。120μLの希釈抗体を新しいU底プレートに移し、培地とIgG1対照抗体を各プレートに加えた。120μlの希釈したシュードウイルスを、培地対照ウェルを除くすべてのウェルに加えた。それらのウェルに、120μLの感染培地を加えた。抗体を含むシュードウイルスを室温で30分間インキュベートした後、培地をベロ細胞から除去した。抗体/シュードウイルスの混合物の100μLを細胞に添加し、次いで24時間5%のCO2、37℃でインキュベートした。3日目に、上清を細胞ウェルから除
去し、100μLのPBSと交換した。プレートを、MiniMaxイメージングサイトメーターを備えたSpectraMax i3で読み取った。
非複製VSV-SARS-CoV-2-Sウイルスによる中和能力の試験に加えて、抗体はSARS-CoV-2ウイルスでも試験された。モノクローナル抗体および抗体の組み合わせをDMEM(Quality Biological)で段階希釈し、10%(v/v)熱不活化ウシ胎児血清(Sigma)、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン(Gemini Bio-products)、および1%(v/v)L-グルタミン(2mMの最終濃度、Gibco)(VeroE6培地)を補充して、最終容量250μLにした。次に、SARS-CoV-2(WA-1)(1000PFU/mL)を含む250μLのVeroE6培地を、各血清希釈液および未処理の対照として250μLの培地に添加した。ウイルス-抗体混合物を37℃で60分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物のウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。最後に、50%のプラーク減少中和力価(PRNT50)値(プラーク形成が未処理の対照と比較して50%減少した血清希釈)を、中和パーセントデータ(GraphPadソフトウェア、カリフォルニア州ラホーヤ)に適合した4パラメーターロジスティック曲線を使用して計算した。
スパイクタンパク質(S-wt)の武漢-Hu-1(NCBI受託番号MN908947.3)配列をコードするVSV-SARS-CoV-2スパイクタンパク質(S)発現シュードウイルスに対する個々のモノクローナル抗体の最大阻害濃度(IC50)の半分を、Vero細胞で測定した(表26)。抗体の大部分は、ピコモル範囲(pM)で中和効力を示し、一部はナノモル(nM)範囲で中和効力を示した。
以前に報告されたように、組換えACE2はVSVスパイクシュード粒子の中和を仲介
することができたが、その効力はモノクローナル抗体の効力よりはるかに劣り、最良の中和mAbと比較して効力の1000分の1以上の減少が見られた(図10A)。加えて、mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934の強力な中和活性が、VeroE6細胞でのSARS-CoV-2の中和を含む中和アッセイで確認された(図10B)。すべての中和アッセイは、4つのmAb(mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934)で同様の効力を生成し、相乗的な中和活性を示す組み合わせはなかった(図10B)。
することができたが、その効力はモノクローナル抗体の効力よりはるかに劣り、最良の中和mAbと比較して効力の1000分の1以上の減少が見られた(図10A)。加えて、mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934の強力な中和活性が、VeroE6細胞でのSARS-CoV-2の中和を含む中和アッセイで確認された(図10B)。すべての中和アッセイは、4つのmAb(mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934)で同様の効力を生成し、相乗的な中和活性を示す組み合わせはなかった(図10B)。
スパイク(S)タンパク質のアミノ酸変異体は、世界中で循環している分離株を表す700以上の公的に入手可能なSARS-CoV-2配列から同定され、VSVシュード粒子にクローン化された。モノクローナル抗体の中和効力に対する各変異体の影響を評価するために、変異体をコードするシュード粒子を用いた中和アッセイを実施した。表27は、5μg/mlの単一濃度でのSARS-CoV-2スパイク(S-wt)と比較した、シュード粒子をコードする変異体に対するモノクローナル抗体の相対的な中和効力を例示している。S-wtに対する中和の割合は、個々の抗体および変異体ごとに取得された。mAb10985およびR408I変異体を除いて、5μg/mlの濃度で中和効力の喪失を示した抗体はなかった。これらのデータは、世界的に循環しているSARS-CoV-2スパイク変異体に対するモノクローナル抗体の幅広い機能的中和範囲を示している。
モノクローナル抗体の中和効力に対するSタンパク質変異体の影響をさらに調査するために、完全中和曲線を実行して、Sタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)内に局在する変異体のサブセットに対する最も強力な中和抗体のIC50値を決定した。表28は、各変異体疑似粒子のIC50中和値を示している。最大3倍の内在的変動は、疑似粒子中和アッセイ間で観察でき、中和効力の変化を示すものではない。これらのデータは、抗体がSタンパク質RBD変異体の多様なパネルに対して中和効力を保持していることを示している。
実施例13:精製された抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のBiacore結合速度
精製されたCHOt抗SARS-COV-2モノクローナル抗体(mAb)に結合する様々なSARS-COV-2 RBD試薬の平衡解離定数(KD)は、リアルタイム表面
プラズモン共鳴ベースのBiacore T200/Biacore 8Kバイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH7.4(HBS-ET)ランニングバッファーで25℃および37℃で実施した。Biacore CM5センサーチップ表面は、抗SARS-COV-2bmAbを捕捉するために、マウス抗ヒトFc特異的mAb(Regeneron、mAb2567)とのアミンカップリングによって最初に誘導体化された。結合研究は、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジン(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現されたヒトSARS-COV-2 RBD細胞外ドメインおよびC末端マウスIgG2a(SARS-COV-2 RBD-mFc)で発現されたSARS-COV-2 RBD細胞外ドメインで実施された。これらの試薬を使用することで、それぞれ単量体および二量体のRBDペプチドに結合する抗体の能力を試験することができた。
精製されたCHOt抗SARS-COV-2モノクローナル抗体(mAb)に結合する様々なSARS-COV-2 RBD試薬の平衡解離定数(KD)は、リアルタイム表面
プラズモン共鳴ベースのBiacore T200/Biacore 8Kバイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH7.4(HBS-ET)ランニングバッファーで25℃および37℃で実施した。Biacore CM5センサーチップ表面は、抗SARS-COV-2bmAbを捕捉するために、マウス抗ヒトFc特異的mAb(Regeneron、mAb2567)とのアミンカップリングによって最初に誘導体化された。結合研究は、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジン(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現されたヒトSARS-COV-2 RBD細胞外ドメインおよびC末端マウスIgG2a(SARS-COV-2 RBD-mFc)で発現されたSARS-COV-2 RBD細胞外ドメインで実施された。これらの試薬を使用することで、それぞれ単量体および二量体のRBDペプチドに結合する抗体の能力を試験することができた。
HBS-ETランニングバッファーで調製した異なる濃度のhSARS-COV-2 RBD-MMH(90nM-3.33nM、3倍希釈)およびSARS-COV-2 RBD-mFc(30nM-1.11nMの3倍希釈)を、50μL/分の流速で3分間注入し、mAbに結合した様々なSARS-COV-2 RBD試薬の解離をHBS-ETランニングバッファーで6~10分間モニターした。各サイクルの終わりに、SARS-COV-2 RBD mAb捕捉表面は、マウス抗ヒトFc特異的mAb表面に20mM
のリン酸を12秒間注入することで再生された。会合速度(Ka)および解離速度(Kd)は、BiaEvaluationソフトウェアv3.1またはBiacore Insight Evaluationソフトウェア v2.0または曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界(mass transport limitation)を有する1:1結合モデルにあてはめることにより決定された。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を、運動速度から以
下のように計算した:
のリン酸を12秒間注入することで再生された。会合速度(Ka)および解離速度(Kd)は、BiaEvaluationソフトウェアv3.1またはBiacore Insight Evaluationソフトウェア v2.0または曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界(mass transport limitation)を有する1:1結合モデルにあてはめることにより決定された。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を、運動速度から以
下のように計算した:
25℃および37℃で本発明の異なる抗SARS-COV-2 RBD試薬に結合する異なるSARS-COV-2 mAbの結合速度パラメーターを、それぞれ表29~32に示す。
実施例14:ELISAによって決定されるように、抗SARS-CoV-2抗体は、hACE2へのRBD結合を遮断する
ELISAベースの遮断アッセイを使用して、SARS-COV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)のその受容体であるヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)への結合を遮断する抗SARS-CoV-2抗体の能力を決定した。
ELISAベースの遮断アッセイを使用して、SARS-COV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(RBD)のその受容体であるヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)への結合を遮断する抗SARS-CoV-2抗体の能力を決定した。
このアッセイで使用したSARS-CoV-2タンパク質は、C-末端(SARS-CoV-2 RBD-hFc)でヒトIgG1のFc部分で発現された、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)部分(アミノ酸Arg319~Phe541)で構成された。実験で使用したヒトACE2タンパク質は、R&Dシステムから購入され、C末端-10Xヒスチジンタグ(hACE2-His、NCBI受託番
号Q9BYF1)を有するアミノ酸Gln18~Ser740で構成された。
号Q9BYF1)を有するアミノ酸Gln18~Ser740で構成された。
以下の手順で実験を行った。モノクローナル抗Penta-His抗体(Qiagen)を、96ウェルマイクロタイタープレート上のPBS中1μg/mlで4℃で一晩コーティングした。hACE2-His受容体をPBS中0.2ug/mlで添加し、室温(RT)で2時間結合させた。その後、非特異的結合部位を、PBS中のBSAの0.5(重量/体積)%溶液を使用して遮断した。他のマイクロタイタープレートでは、一定量の100pMのSARS-CoV-2 RBD-hFcタンパク質が抗SARS-COV-2抗体およびアイソタイプIgG1抗体対照とPBS+0.5%のBSAで0.0008nM~50nMの希釈率で結合した。1時間のインキュベーション後、混合溶液をマイクロタイタープレートでコーティングされたhACE2-Hisに移した。室温で1.5時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートに結合したSARS-COV2を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Jackson)と結合したヤギ抗ヒトIgG抗体で検出した。次に、メーカーの推奨に従ってTMB基質溶液(BD Biosciences、#555214)を使用してプレートを現像し、VictorX5プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。
結合データは、Prism(商標)ソフトウェア(GraphPad)内のシグモイド用量反応モデルを使用して分析された。プレートコーティングされたhACE2-HisへのSARS-CoV-2 RBD-hFc結合の50%を遮断するために必要な抗体の濃度として定義される計算されたIC50値は、遮断効力の指標として使用された。遮断率は、この式を使用して試験した最高の抗体濃度で観察され、試験したすべての抗体について報告されたバックグラウンド補正された結合シグナルに基づいて定義された。
試験した最高濃度で50%以下の結合を遮断した抗体は、非遮断薬として分類され、IC50値は、それらの抗体について報告されていない。
ヒトACE2へのSARS-CoV-2 RBD結合を遮断する抗SARS-CoV-2抗体の能力は、遮断ELISAを使用して評価された。このアッセイでは、100pMのSARS-COV-2 RBD-hFcを広範囲の濃度の抗SARS-CoV-2-S抗体で滴定し、hACE2-HisへのRBD結合に対する抗体の存在の阻害は評価された。プレートに結合したRBD-hFcは、HRP結合抗hFc抗体で検出された。
抗SARS-CoV-2-S抗体の最高試験濃度での遮断IC50および最大遮断を表33に要約し、遮断曲線を図1~8に示す。試験した46個の抗体のうち、44個はhACE-2へのRBD.hFc結合の抗体濃度依存性遮断を示した。IC50値は、41pM~4.5nMの範囲であり、最大遮断は試験した最高の抗体濃度で55%~約100%の範囲であった。試験した46個のうち2個の抗体は、アッセイ条件下で遮断活性を示さなかった。予想通り、無関係なアイソタイプ対照抗体は遮断活性を示さなかった。
実施例15:mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934間の相互競合
mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934を交差競合結合アッセイで調べ(図11)、組み合わせて抗体カクテルを形成する可能性の
あるピコモル中和能を持つ非競合mAbのいくつかのペアを同定した(例えば、mAb10987およびmAb0933)。
mAb10987、mAb10989、mAb10933、およびmAb10934を交差競合結合アッセイで調べ(図11)、組み合わせて抗体カクテルを形成する可能性の
あるピコモル中和能を持つ非競合mAbのいくつかのペアを同定した(例えば、mAb10987およびmAb0933)。
抗SARS-CoV-2-S mAbのエピトープビニングは、10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.05%(v/v)Tween-20、pH7.4、1mg/mLのBSAのランニングバッファーを含む、ForteBio Octet HTXバイオレイヤー干渉測定装置(Molecular Devices ForteBio
LLC、カリフォルニア州フリーモント)を使用して、SARS-CoV-2 RBD-MMHタンパク質に結合するために、ペアワイズコンビナトリアル方式で互いに競合するmAbを含むプレミックスサンドイッチ形式で実施された。アッセイは、1000rpmで連続的に撹拌しながら30℃で実施した。ランニングバッファーで初期ベースラインを取得した後、20μg/mLの抗COVID19mAbを抗ヒトFc(AHC)バイオセンサーチップに300秒間捕捉した。AHCバイオセンサーチップ上の残りの遊離不飽和結合部位を遮断するために、すべてのセンサーを240秒間、100μg/mLの無関係なIgG1を含む遮断溶液にさらした。このプロセスに続いて、バイオセンサーを、100nMのSARS CoV-2 RBD-MMHタンパク質のプレミックス溶液および2番目のmAbの600nMの抗COVID19mAb結合部位を含むウェルに300秒間浸漬した。各ステップでの結合応答を記録し、データセットから自己遮断mAb競合対照を差し引くことによって特定のシグナルを正規化した。データ分析は、Epitope
Binningを使用してOctet Data Analysis HT 10.0ソフトウェアで実行された。
LLC、カリフォルニア州フリーモント)を使用して、SARS-CoV-2 RBD-MMHタンパク質に結合するために、ペアワイズコンビナトリアル方式で互いに競合するmAbを含むプレミックスサンドイッチ形式で実施された。アッセイは、1000rpmで連続的に撹拌しながら30℃で実施した。ランニングバッファーで初期ベースラインを取得した後、20μg/mLの抗COVID19mAbを抗ヒトFc(AHC)バイオセンサーチップに300秒間捕捉した。AHCバイオセンサーチップ上の残りの遊離不飽和結合部位を遮断するために、すべてのセンサーを240秒間、100μg/mLの無関係なIgG1を含む遮断溶液にさらした。このプロセスに続いて、バイオセンサーを、100nMのSARS CoV-2 RBD-MMHタンパク質のプレミックス溶液および2番目のmAbの600nMの抗COVID19mAb結合部位を含むウェルに300秒間浸漬した。各ステップでの結合応答を記録し、データセットから自己遮断mAb競合対照を差し引くことによって特定のシグナルを正規化した。データ分析は、Epitope
Binningを使用してOctet Data Analysis HT 10.0ソフトウェアで実行された。
クロスコンペティション結合アッセイを上記のHDX-MSの結果と比較すると、競合しない抗体ペアが同時にRBDに結合できるメカニズムについての構造的洞察が得られ、したがって治療用抗体カクテルの理想的なパートナーになり得る。mAb10987およびmAb10933は、そのような抗体のペアを表す。mAb10933は、ACE2インターフェースの一方のエッジにあるスパイク状のループ領域を対象としている。その領域内で、mAb10933による最も重要なHDX保護を示す残基は上向きであり、mAb10933のFab領域が上方向からRBDに結合し、mAb10933がACE2と重大な衝突を起こすことを示唆している。mAb10933との競合を回避するために、mAb10987は、正面または左下からHDXで定義された保護領域にのみ結合する(図12のmAb10987の正面図)。これは、mAb10987がACE2に干渉する可能性が高い位置に配向するため、上記の中和データと一致している。
実施例16:抗体結合スパイクタンパク質の構造決定
スパイクタンパク質RBDへのmAb10933およびmAb10987の結合をよりよく理解するために、構造解析を低温電子顕微鏡(cryoEM)を介して実行した。mAb10933およびmAb10987のFab断片は、FabALACTICAキット(Genovis)を使用して分離した。600μgのmAb10933 Fabおよび600μgのmAb10987 Fabを300μgのSARS-CoV-2-S RBDと混合し、氷上で約1時間インキュベートした後、50mMのTris pH7.5、150mMのNaClに平衡化したSuperdex200増加ゲル濾過カラムに注入した。mAb10933 Fab-mAb10987 Fab-RBD複合体を含むピーク画分を収集し、10kDaのMWCO遠心フィルターを使用して濃縮した。cryoEMグリッドの調製では、タンパク質サンプルを1.5mg/mLに希釈し、0.15%のPMAL-C8アンフィポールを添加した。3.5μLのタンパク質を、プラズマで洗浄したばかりのUltrAufoilグリッド(1.2/1.3、300メッシュ)に沈着させた。濾紙を使用して過剰な溶液を吸い取り、Vitrobot Mark IVを使用して液体エタンにプランジ凍結した。cryoEMグリッドは、K3検出器(Gatan)を備えたTitan Krios(Thermo Fisher)に移された。映画は
、EPU(Thermo Fisher)を使用して、0.85Åのピクセルサイズに対応する105,000倍の倍率で収集された。ピクセルあたり毎秒15電子の線量率が使用され、各ムービーは2秒で、Å2あたり約40電子の総線量に相当する。
スパイクタンパク質RBDへのmAb10933およびmAb10987の結合をよりよく理解するために、構造解析を低温電子顕微鏡(cryoEM)を介して実行した。mAb10933およびmAb10987のFab断片は、FabALACTICAキット(Genovis)を使用して分離した。600μgのmAb10933 Fabおよび600μgのmAb10987 Fabを300μgのSARS-CoV-2-S RBDと混合し、氷上で約1時間インキュベートした後、50mMのTris pH7.5、150mMのNaClに平衡化したSuperdex200増加ゲル濾過カラムに注入した。mAb10933 Fab-mAb10987 Fab-RBD複合体を含むピーク画分を収集し、10kDaのMWCO遠心フィルターを使用して濃縮した。cryoEMグリッドの調製では、タンパク質サンプルを1.5mg/mLに希釈し、0.15%のPMAL-C8アンフィポールを添加した。3.5μLのタンパク質を、プラズマで洗浄したばかりのUltrAufoilグリッド(1.2/1.3、300メッシュ)に沈着させた。濾紙を使用して過剰な溶液を吸い取り、Vitrobot Mark IVを使用して液体エタンにプランジ凍結した。cryoEMグリッドは、K3検出器(Gatan)を備えたTitan Krios(Thermo Fisher)に移された。映画は
、EPU(Thermo Fisher)を使用して、0.85Åのピクセルサイズに対応する105,000倍の倍率で収集された。ピクセルあたり毎秒15電子の線量率が使用され、各ムービーは2秒で、Å2あたり約40電子の総線量に相当する。
すべてのcryoEMデータ処理は、cryoSPARC v2.14.2を使用して実行された。2,821本の映画は、パッチモーション補正およびパッチCTF推定を使用して調整された。推定された焦点ぼけ値およびCTF適合解像度に基づいて、さらに処理するために2,197枚の位置合わせされた顕微鏡写真が選択された。ブロブピッカーを使用してピッキングされた粒子の初期セットは、テンプレートピッキング用のテンプレートを生成するために2D分類に供された。テンプレートピッキングによってピッキングされた989,553個の粒子は、未結合のファブおよび不完全な複合体を含む粒子を除去するために、2D分類の複数のラウンドに供された。3つのクラスを使用したAb initio再構築により、mAb10933 Fab-mAb10987 Fab-RBD複合体に対応する61,707個の粒子を含む単一のクラスが生成された。このクラスの粒子の不均一な精製とそれに続く不均一な精製により、モデル構築に使用された48,140個の粒子を含む3,9Åの解像度(FSC=0.143)のマップが得られた。このマップに、RBD(PDBコード6M17から取得)および2つのFab(PDBコード5U15から取得したmAb10987のラムダ軽鎖を除く以前の抗体構造から取得)のモデルを手動で配置した。次に、これらのモデルはCootを使用して手動で再構築され、Phenixを使用してマップに対して実空間が調整された。
上記のデータを確認すると、mAb10933およびmAb10987のFab断片に結合したSARS-CoV-2スパイクRBDの複合体の単一粒子cryoEMは、このカクテルの2つの抗体がRBDの異なる領域に同時に結合できることを示している(図13A、図13B、および図14)。公称解像度3.9Åの複合体の3D再構築マップは、両方のFab断片がRBDの異なるエピトープに結合することを示しており、それらが非競合抗体であることを確認している。mAb10933は、RBDの上部に結合し、ACE2の結合部位と広範囲に重なる。一方、mAb10987のエピトープは、RBDの側にあり、mAb10933エピトープからかなり離れており、ACE2結合部位とほとんどまたはまったく重複していない。
実施例17:抗SARS-CoV-2-S mAb間の相互競合
抗SARS-CoV-Sモノクローナル抗体(mAb)間の結合競合は、Octet HTXバイオセンサープラットフォーム(Pall ForteBio Corp.)でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法(BLI)アッセイを使用して決定された。実験全体は、25℃で10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、1mg/mLのBSA、pH7.4(HBS-EBT)バッファーで、プレートを1000rpmの速度で振とうしながら実施した。2つのmAbが、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジン(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現したSARS-COV-2-S RBD細胞外ドメイン上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合できるかどうかを評価するために、約0.51nmのSARS-COV-2-S RBD-MMHは、バイオセンサーチップをSARS-COV-2-S RBD-MMHの10μg/mLの溶液を含むウェルに1分間浸すことにより、抗ペンタ-His抗体でコーティングされたOctetバイオセンサーチップ(Fortebio Inc、#18-5122)に最初に捕捉された。次に、SARS-COV-2-S RBD-MMHを捕捉したバイオセンサーチップを、50μg/mLのmAb-1溶液を含むウェルに5分間浸浸漬することにより、第1の抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体(以降、mAb-1と呼ばれる)で飽和させた。次に、バイオセンサーチップを、50μg/mLの第2の抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体(以降、mAb-2と呼ばれる)溶液を含むウェルに5分間浸
漬した。バイオセンサーチップは、実験の各ステップ間にHBS-ETBバッファーで洗浄された。リアルタイム結合応答が実験の全過程の間監視され、各ステップの終了時の結合応答が記録された。mAb-1と予め複合体化されたSARS-COV-2 RBD-MMHに結合するmAb-2の応答を比較し、表34に示すように、異なる抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体の競合/非競合挙動を決定した。
抗SARS-CoV-Sモノクローナル抗体(mAb)間の結合競合は、Octet HTXバイオセンサープラットフォーム(Pall ForteBio Corp.)でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法(BLI)アッセイを使用して決定された。実験全体は、25℃で10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、1mg/mLのBSA、pH7.4(HBS-EBT)バッファーで、プレートを1000rpmの速度で振とうしながら実施した。2つのmAbが、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジン(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現したSARS-COV-2-S RBD細胞外ドメイン上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合できるかどうかを評価するために、約0.51nmのSARS-COV-2-S RBD-MMHは、バイオセンサーチップをSARS-COV-2-S RBD-MMHの10μg/mLの溶液を含むウェルに1分間浸すことにより、抗ペンタ-His抗体でコーティングされたOctetバイオセンサーチップ(Fortebio Inc、#18-5122)に最初に捕捉された。次に、SARS-COV-2-S RBD-MMHを捕捉したバイオセンサーチップを、50μg/mLのmAb-1溶液を含むウェルに5分間浸浸漬することにより、第1の抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体(以降、mAb-1と呼ばれる)で飽和させた。次に、バイオセンサーチップを、50μg/mLの第2の抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体(以降、mAb-2と呼ばれる)溶液を含むウェルに5分間浸
漬した。バイオセンサーチップは、実験の各ステップ間にHBS-ETBバッファーで洗浄された。リアルタイム結合応答が実験の全過程の間監視され、各ステップの終了時の結合応答が記録された。mAb-1と予め複合体化されたSARS-COV-2 RBD-MMHに結合するmAb-2の応答を比較し、表34に示すように、異なる抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体の競合/非競合挙動を決定した。
実施例18:37℃で測定された単量体SARS-CoV-2-S RBD試薬に結合する抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のpH感受性
pH7.4、pH6.0、およびpH5.0バッファー中の様々な抗SARS-CoV-2-S モノクローナル抗体の解離速度定数(Kd)は、リアルタイム表面プラズモン
共鳴(SPR)ベースのBiacore T200バイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、3つのランニングバッファー(i)PBS、0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH7.4(PBS-T-pH7.4)(ii)PBS、0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH6.0(PBS-T-pH6.0)、および(iii)PBS、0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH5.0(PBS-T-pH5.0)を使用して37℃で実施した。Biacore CM5センサーチップ表面は、最初に、マウス抗ヒトFc特異的mAb(Regeneron)とのアミンカップリングによって誘導体化され、抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジン(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現されたヒトSARS-COV-2-S RBD細胞外ドメインで実施され、PBS-T-pH7.4バッファー中で調製された単一濃度のSARS-COV-2-S RBD-MMH(90nM)を、25μL/分の流速で3分間注入した後、結合したSARS-COV-2-S RBD-MMHをPBS-T-pH7.4、PBS-T-pH6.0、またはPBS-T PBS-T-pH5.0ランニングバッファー中で5分間解離させた。
pH7.4、pH6.0、およびpH5.0バッファー中の様々な抗SARS-CoV-2-S モノクローナル抗体の解離速度定数(Kd)は、リアルタイム表面プラズモン
共鳴(SPR)ベースのBiacore T200バイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、3つのランニングバッファー(i)PBS、0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH7.4(PBS-T-pH7.4)(ii)PBS、0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH6.0(PBS-T-pH6.0)、および(iii)PBS、0.05v/v%の界面活性剤Tween-20、pH5.0(PBS-T-pH5.0)を使用して37℃で実施した。Biacore CM5センサーチップ表面は、最初に、マウス抗ヒトFc特異的mAb(Regeneron)とのアミンカップリングによって誘導体化され、抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジン(SARS-COV-2 RBD-MMH)で発現されたヒトSARS-COV-2-S RBD細胞外ドメインで実施され、PBS-T-pH7.4バッファー中で調製された単一濃度のSARS-COV-2-S RBD-MMH(90nM)を、25μL/分の流速で3分間注入した後、結合したSARS-COV-2-S RBD-MMHをPBS-T-pH7.4、PBS-T-pH6.0、またはPBS-T PBS-T-pH5.0ランニングバッファー中で5分間解離させた。
Scrubber 2.0cカーブフィッティングソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを1:1結合モデルにフィッティングすることにより、4つのpHランニングバッファーの解離速度定数(kd)を決定した。解離半減期(T1/2)と
してKd値から計算した。
してKd値から計算した。
PBS-T-pH7.4およびPBS-T-pH6.0中の37℃での解離に続いて、PBS-T-pH7.4中で異なる抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体に結合するSARS-COV-2-S RBD-MMHのKdおよびt1/2値を表35に示
す。PBS-T-pH7.4およびPBS-T-pH5.0中の37℃での解離に続いて、PBS-T-pH7.4中で異なる抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体に結合するSARS-COV-2-S RBD-MMHのKdおよびt1/2値を表36に
示す。pH7.4、pH6.0、およびpH5.0のバッファーにおけるSARS-COV-2 RBD-MMHの解離性半減期(t1/2)の比較。
す。PBS-T-pH7.4およびPBS-T-pH5.0中の37℃での解離に続いて、PBS-T-pH7.4中で異なる抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体に結合するSARS-COV-2-S RBD-MMHのKdおよびt1/2値を表36に
示す。pH7.4、pH6.0、およびpH5.0のバッファーにおけるSARS-COV-2 RBD-MMHの解離性半減期(t1/2)の比較。
実施例19:ウイルス様粒子に結合する抗SARS-CoV-2-S抗体
抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する能力を調査するために、エレクトロケミルミネッセンスベースの検出プラットフォーム(MSD)のSARS-CoV-2スパイクタンパク質でシュードタイピングされた水疱性口内炎ウイルス(VSV)を利用したインビトロ結合アッセイが開発された。
抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に結合する能力を調査するために、エレクトロケミルミネッセンスベースの検出プラットフォーム(MSD)のSARS-CoV-2スパイクタンパク質でシュードタイピングされた水疱性口内炎ウイルス(VSV)を利用したインビトロ結合アッセイが開発された。
シュードタイプ水疱性口内炎ウイルス(VSV)ウイルス様粒子(VLP)は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質(受託番号MN908947.3、アミノ酸16-1211)を一時的に発現するためにHEK293T細胞から生成された。VSVのみを発現するVLPも陰性結合対照として生成された。
以下の手順で実験を行った。上記の2つのソースからのVLPをPBSで希釈し、96ウェルカーボン電極プレート(MULTI-ARRAYハイバインドプレート、MSD)に播種し、4℃で一晩インキュベートしてVLPを接着させた。非特異的結合部位を、PBS中の2(重量/体積)%のBSAによって1時間室温で遮断した。プレートに結合した細胞に、抗SARS-CoV-2抗体および非結合ヒトIgG1対照を、0.0008nM~50nMの濃度範囲でPBS+0.5%のBSAで希釈し、抗体を含まないバッファーを2回添加し、プレートを振とうしながら室温で1時間インキュベートした。次に、プレートを1×PBSで洗浄し、AquaMax2000プレートウォッシャー(MDS
Analytical Technologies)を使用して未結合の抗体を除去した。プレート結合抗体は、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して室温で1時間検出された。洗浄後、プレートを製造業者の推奨手順に従ってリードバッファー(MSD)で顕色させ、発光シグナルをSECTOR Imager 600(Meso Scale Development)機器で記録した。(RLUでの)直接結合シグナルは、SARS-CoV-2を発現するVLPおよびVSVのみのVLPについて捕捉された。
Analytical Technologies)を使用して未結合の抗体を除去した。プレート結合抗体は、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して室温で1時間検出された。洗浄後、プレートを製造業者の推奨手順に従ってリードバッファー(MSD)で顕色させ、発光シグナルをSECTOR Imager 600(Meso Scale Development)機器で記録した。(RLUでの)直接結合シグナルは、SARS-CoV-2を発現するVLPおよびVSVのみのVLPについて捕捉された。
無関係のVSV発現VLPへの結合と比較したSARS-CoV-2-S発現VLPに結合する抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体の能力を、免疫結合アッセイを使用して評価した。96ウェルHigh Bindプレート(MSD)に固定化されたVLPへの結合は、一連の抗体希釈で実行され、結合した抗体はSULFO-TAGTM結合抗ヒトIgGを使用して検出された。エレクトロケミルミネッセンスからの結合シグナルは、セクターイメージャー600(MSD)で記録された。VLPに結合する抗体のRLU値を決定した。すべての抗体は濃度依存性の結合を示し、SARS-COV-2-Sを発現するVLPでのVSVのみへの結合の比率を5.5nMおよび0.20nMで分析した。
2つの濃度の抗SARS-CoV-2-S mAbのVSV/スパイクおよびVSVのみのVLPへの結合結果を表37に要約する。試験した46の抗体のうち、44の抗体がVSV/スパイクに特異的に結合し、VSVに対する比率はいずれかの濃度で3以上であった。0.2nM抗体では、VSV/スパイクとVSVの比率は3~56の範囲であり、5nMでは比率は3~303の範囲であった。2つの抗体(mAb10998およびmAb11002)はVSV/スパイクVLPへの弱い結合を示し、VSV VLPに対する比率は3未満であったが、5nMでのシグナルはVSV/スパイクでVSVよりも高かった。予想通り、無関係なIgG1アイソタイプ抗体は最小限の結合を示した。
実施例20:スパイクタンパク質発現細胞に結合する抗SARS-CoV-2-S抗体
抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2-S発現細胞に結合する能力を調査するために、エレクトロケミルミネッセンスでSARS-CoV-2-S発現細胞を利用するインビトロ結合アッセイベースの検出プラットフォーム(MSD)が開発された。
抗SARS-CoV-2-Sモノクローナル抗体のパネルがSARS-CoV-2-S発現細胞に結合する能力を調査するために、エレクトロケミルミネッセンスでSARS-CoV-2-S発現細胞を利用するインビトロ結合アッセイベースの検出プラットフォーム(MSD)が開発された。
Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G誘導性細胞は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質(受託番号MN908947.3、アミノ酸16-1211、Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-On 3G誘導性COVID-19スパイクタンパク質High Sorted)、およびSARS-CoV-2タンパク質の高発現を選択するために分類されたフローサイトメトリーを過渡的に発現するように操作された。親のJurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3Gも負の結合対照として実験に含まれた。
以下の手順で実験を行った。上記の2つの系統の細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで37℃で36時間誘導した後、採取し、スピンダウンし、PBSで洗浄し、PBSで希釈して、96ウェルカーボン電極プレートに播種し(MULTI-ARRAYハイバインドプレート(MSD)を使用し、4℃で一晩インキュベートして細胞を接着させる。非特異的結合部位を、PBS中の2(重量/体積)%のBSAによって1時間室温で遮断した。プレートに結合した細胞に、抗SARS-CoV-2抗体および非結合ヒトIgG1対照を、0.0008nM~50nMの濃度範囲でPBS+0.5%のBSAで希釈し、抗体を含まないバッファーを2回添加し、プレートを振とうしながら室温で1時間インキュベートした。次に、プレートを1×PBSで洗浄し、AquaMax2000プレートウォッシャー(MDS Analytical Technologies)を使用して
未結合の抗体を除去した。プレート結合抗体は、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して室温で1時間検出された。洗浄後、プレートを製造業者の推奨手順に従ってリードバッファー(MSD)で顕色させ、発光シグナルをSECTOR Imager 600(Meso Scale
Development)機器で記録した。直接結合シグナル(RLU)は、SARS-CoV-2-S発現細胞および陰性対照細胞株で捕捉された。
未結合の抗体を除去した。プレート結合抗体は、SULFO-TAGTM結合抗ヒトIgG抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して室温で1時間検出された。洗浄後、プレートを製造業者の推奨手順に従ってリードバッファー(MSD)で顕色させ、発光シグナルをSECTOR Imager 600(Meso Scale
Development)機器で記録した。直接結合シグナル(RLU)は、SARS-CoV-2-S発現細胞および陰性対照細胞株で捕捉された。
親細胞への結合と比較した、SARS-CoV-2スパイクタンパク質発現細胞に結合する抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体の能力を、免疫結合アッセイを使用して評価した。96ウェル高結合プレート(MSD)上の固定化細胞への結合は、一連の抗体希釈で実行され、結合した抗体はSULFO-TAGTM結合抗ヒトIgGを使用して検出された。エレクトロケミルミネッセンスからの結合シグナルは、セクターイメージャー600(MSD)で記録された。すべての抗体は濃度依存性の結合を示し、親細胞に対するスパイク発現細胞の結合の比率を5.5nMおよび0.20nMの濃度で分析した。
2つの濃度の抗SARS-COV-2-S mAbのスパイクタンパク質発現細胞および親Jurkat細胞への結合結果を表38に要約する。試験した46の抗体のうち、44の抗体がJurkat/スパイク細胞(Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-On 3G誘導性SARS-CoV-2スパイクタンパク質High Sorted細胞)に特異的に結合し、どちらかの濃度で親細胞との比率は4以上であった。0.2nMでは、Jurkat/スパイク細胞および親細胞の結合シグナルの比率は、4~36の範囲であり、5nMでは比率は4~63の範囲であった。2つの抗体(mAb10998およびmAb11002)は、Jurkat/スパイク細胞への弱い結合を示し、親細胞への結合比は4未満であったが、5nMでは、結合シグナルは親細胞よりもJurket/スパイクの方が高かった。予想通り、無関係なIgG1アイソタイプ抗体は最小限の結合を示した。
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本明細書で引用されたすべての参考文献は、各個々の出版物、データベースエントリ(例えば、Genbank配列またはGeneIDエントリ)、特許出願、または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に参照により組み込まれる。この参照による組み込みの記載は、申請者によって、このような引用が参照により組み込まれる特定の記載に直接隣接していない場合でも、個々のすべての出版物、データベースエントリ(例えば、Genbank配列またはGeneIDエントリ)、特許出願、または特許に関連することが意図される。本明細書内に、存在する場合、参照により組み込まれる特定の記載を包含することにより、参照により組み込まれるこの一般的な記載が弱められるものでは決してない。本明細書における参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であることの承認として意図されるものでも、これらの出版物または文書の内容または日付に関するいずれの承認を構成するものでもない。
Claims (80)
- 配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記単離された抗体または抗原結合断片が、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- HCDR1が、配列番号204に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号206に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号208に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1が、配列番号212に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号214に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRを含む、請求項2に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む、請求項2に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む、請求項2に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体であって、前記単離された抗体が、免疫グロブリン定常領域と、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体。
- HCDR1が配列番号204に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2が配列番号206に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3が配列番号208に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1が配列番号212に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2が配列番号55に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3が配列番号214に記載のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の単離された抗体。
- 配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む、請求項6に記載の単離された抗体。
- 前記単離された抗体が、配列番号216に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号218に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項6に記載の単離された抗体。
- 前記免疫グロブリン定常領域が、IgG1定常領域である、請求項6に記載の単離された抗体。
- 組換え抗体である、請求項6に記載の単離された抗体。
- 多重特異性である、請求項6に記載の単離された抗体。
- 請求項6に記載の単離された抗体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
- 第2の治療薬をさらに含む、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片、抗炎症剤、抗マラリア剤、およびTMPRSS2に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVR内に含まれる3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVR内に含まれる3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号642に記載のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号499に記載のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号644に記載のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号648に記載のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号650に記載のアミノ酸配列を含むLCDR2、配列番号652に記載のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号654に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号656に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項19に記載の医薬組成物。
- 配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記単離された抗体または抗原結合断片が、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- HCDR1が、配列番号642に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号499に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号644に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1が配列番号648に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号650に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号652に記載のアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRを含む、請求項21に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む、請求項21に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む、請求項21に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する単離された抗体であって、前記単離された抗体が、免疫グロブリン定常領域と、配列番号640に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、単離された抗体。
- HCDR1が、配列番号642に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号499に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号644に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1が、配列番号648に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号650に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号652に記載のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の単離された抗体。
- 配列番号640に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号646に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む、請求項26に記載の単離された抗体。
- 前記単離された抗体が、配列番号654に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号656に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項26に記載の単離された抗体。
- 前記免疫グロブリン定常領域が、IgG1定常領域である、請求項26に記載の単離された抗体。
- 組換え抗体である、請求項26に記載の単離された抗体。
- 多重特異性である、請求項26に記載の単離された抗体。
- 請求項26に記載の単離された抗体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
- 第2の治療薬をさらに含む、請求項33に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片、抗炎症剤、抗マラリア剤、およびTMPRSS2に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項34に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、配列番号832に記載のアミノ酸配列を含むSARS-CoV-
2スパイクタンパク質に結合する二次抗体またはその抗原結合断片である、請求項34に記載の医薬組成物。 - 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVR内に含まれる3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)と、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVR内に含まれる3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)と、を含む、請求項36に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号204に記載のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号206に記載のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号208に記載のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号212に記載のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含むLCDR2、配列番号214に記載のアミノ酸配列を含むLCDR3を含む、請求項37に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号202に記載のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号210に記載のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含む、請求項38に記載の医薬組成物。
- 前記二次抗体またはその抗原結合断片が、配列番号216に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号218に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項39に記載の医薬組成物。
- コロナウイルススパイクタンパク質(CoV-S)に特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、以下の特徴:
(a)約10-9M未満のEC50でCoV-Sに結合すること、
(b)コロナウイルス感染動物への投与後の前記コロナウイルス感染動物において、前記投与なしの同等のコロナウイルス感染動物と比較して、生存の増加を示すこと、および/または
(c)表1のHCVRと少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(CDR)(CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)と、表1のLCVRと少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる3つの軽鎖CDR(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)と、を含むこと、のうちの1つ以上を有する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片。 - (a)表1の抗体のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および/または
(b)表1の抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、を含む、請求項41に記載の抗体または抗原結合断片。 - (a)表1のHCVR配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン可変領域、および/または
(b)表1のLCVR配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン可変領域、を含む、請求項41または42に記載の抗体または抗原結合断片。 - 前記抗体または抗原結合断片が、表1の単一抗体のCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、請求項41~43のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 表1の単一抗体のHCVRおよびLCVRを含む免疫グロブリンを含む、請求項41~44のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
- CoV-Sへの結合について請求項41~45のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片と競合する、抗原結合タンパク質。
- 請求項41~46のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片と同じCoV-S上のエピトープ、または重複するCoV-S上のエピトープに結合する、抗原結合タンパク質。
- 多重特異性である、請求項41~47のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 以下の特性:
(a)コロナウイルスの増殖を阻害すること、
(b)コロナウイルスの表面に結合すること、
(c)インビトロでの細胞のコロナウイルス感染の拡大を制限すること、ならびに
(d)コロナウイルス感染によって引き起こされる死および/または体重減少からヒトACE2またはTMPRSS2タンパク質を発現するように操作されたマウスを保護すること、のうちの1つ以上を含む、請求項41~48のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。 - 前記CoV-Sが、SARS-CoV-2-Sである、請求項41~49のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
- CoV-Sポリペプチドに結合した請求項41~50のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、複合体。
- 前記CoV-Sが、SARS-CoV-2-Sである、請求項51に記載の複合体。
- 請求項41~50のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を作製するための方法であって、
(a)前記抗体または抗原結合断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、
(b)前記1つ以上のポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で前記宿主細胞を培養することと、
(c)任意選択的に、前記宿主細胞および/または前記宿主細胞が増殖する培地から前記抗体または抗体結合断片を単離することと、を含む、方法。 - 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項53に記載の方法。
- 請求項53または54に記載の方法の生成物である、抗体または抗原結合断片。
- (a)表1に記載のHCVRアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合断片のHCVRドメインのCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3、または
(b)表1に記載のLCVRアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖のLCVRドメインのCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、を含む、ポリペプチド。 - 請求項56に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項57に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項41~50のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または請求項55~58のいずれか一項に記載のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドもしくはベクターを含む、宿主細胞。
- さらなる治療薬と関連して、請求項41~50および55のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、組成物またはキット。
- 請求項41~50および55のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、任意選択的に、さらなる治療薬と、を含む、医薬組成物。
- 抗ウイルス薬またはワクチンであるさらなる治療薬と関連する、請求項60または61に記載の組成物またはキット。
- 前記さらなる治療薬が、抗炎症剤、抗マラリア剤、TMPRSS2に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびCoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項60~62のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
- 前記抗マラリア剤が、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである、請求項63に記載の組成物またはキット。
- 前記抗炎症剤が、抗体である、請求項63に記載の組成物またはキット。
- 前記抗体が、サリルマブ、トシリズマブ、またはギムシルマブである、請求項65に記載の組成物またはキット。
- 前記抗体または抗原結合断片が、表1の二次抗体のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む、請求項63に記載の組成物またはキット。
- 請求項41~51、55、および60~63のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または組成物を含む、容器または注射器具。
- コロナウイルスによる感染の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、請求項41~50および55のいずれか一項に記載の治療有効量の抗原結合タンパク質を投与することを含む、方法。
- 前記コロナウイルスが、SARS-CoV-2、SARS-CoV、およびMERS-CoVからなる群から選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記対象が、1つ以上のさらなる治療薬を投与される、請求項69または70に記載の方法。
- 前記1つ以上のさらなる治療薬が、抗ウイルス薬またはワクチンである、請求項71に記載の方法。
- 前記1つ以上のさらなる治療薬が、抗炎症剤、抗マラリア剤、TMPRSS2に特異的
に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびCoV-Sに特異的に結合する抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、請求項71に記載の方法。 - 前記抗マラリア剤が、クロロキンまたはヒドロキシクロロキンである、請求項73に記載の方法。
- 前記抗炎症剤が、抗体である、請求項73に記載の方法。
- 前記抗体が、サリルマブ、トシリズマブ、またはギムシルマブである、請求項75に記載の方法。
- 前記抗体または抗原結合断片が、表1の二次抗体のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む、請求項73に記載の方法。
- 請求項41~50および55のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を対象の体内に投与するための方法であって、前記抗体または抗原結合断片を前記対象の体内に注射することを含む、方法。
- 前記抗体または抗原結合断片が、前記対象の体内に、皮下、静脈内、または筋肉内注射される、請求項78に記載の方法。
- 前記抗体または抗原結合断片が、VH3-66またはVk1-33可変ドメイン配列を含む、請求項41~79のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片、組成物、キット、複合体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または方法。
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