JP2019055996A - インフルエンザ赤血球凝集素に対するヒト抗体 - Google Patents

インフルエンザ赤血球凝集素に対するヒト抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】インフルエンザ赤血球凝集素に対するヒト抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、該抗体を含む医薬組成物および使用方法を提供する。本発明の抗体は、インフルエンザウイルス活性を阻害または中和し、したがって、ヒトにおけるインフルエンザ感染を処置または防止する手段をもたらすために有用である。一部の実施形態では、本発明は、ウイルスの宿主細胞への付着および／または侵入を防止するための、インフルエンザＨＡに結合する１つまたは複数の抗体の使用を提供する。本発明の抗体は、予防的にまたは治療的に使用することができ、また、単独で使用することも１つもしくは複数の他の抗ウイルス剤またはワクチンと組み合わせて使用することもできる。【選択図】なし

Description

本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に特異的に結合するヒト抗体およびその抗原結合性断片、これらの抗体を含む組成物、ならびにこれらの抗体を使用する治療法および診断法に関する。
配列表
ＡＳＣＩＩに準拠したテキストファイルの配列表を本明細書と同時に提出する（連邦規則集第３７巻１．５２（ｅ）および連邦規則集第３７巻１．８２１）。テキストファイルの内容は参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は「１０１１９ＷＯ０１＿ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ」であり、２０１５年１１月１８日に作成されたものであり、２．１ＭＢを含有する。
インフルエンザは、伝染性の高い疾患であり、パンデミック、エピデミック、リサージェンスおよびアウトブレイクの波によって特徴付けられる長い歴史を有する。毎年のワクチン接種の試みにもかかわらず、インフルエンザ感染により、実質的な罹患率および死亡率が生じている。
インフルエンザウイルスは、Ａ、ＢおよびＣの３つの型からなる。さらに、Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルスの宿主細胞への付着および侵入に必要な表面糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする２つの遺伝子の抗原性領域内の対立遺伝子の変動に基づいて亜型に分類することができる。
赤血球凝集素は、２つの構造ドメイン、受容体結合性部位（頻繁に抗原ドリフトを受ける）からなる球状の頭部ドメインと幹領域（インフルエンザウイルスの様々な株の間でより保存されている）を含有する三量体糖タンパク質である。ＨＡタンパク質は、前駆体（ＨＡ０）として合成され、それがタンパク質プロセシングを受けて２つのサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）が生じ、これらが互いと会合して幹／球状頭部構造が形成される。ＨＡ１ペプチドは、ウイルスの細胞表面への付着に関与する。ＨＡ２ペプチドは、ウイルス膜と細胞膜のエンドソーム内での融合を媒介する幹様構造を形成し、それにより、リボ核タンパク質複合体の細胞質内への放出を可能にする。
現在、赤血球凝集素タンパク質（Ｈ１〜Ｈ１８）によって定義される亜型が１８種存在する。１８種のＨＡは、２つのグループに分類することができる。グループ１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８亜型からなり、グループ２は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５亜型を含む。
新しい異なるエピトープが生じる、抗原ドリフトと称される現象、またはＨＡ分子もしくはＮＡ分子の突然変異の結果として、同じ亜型の新しい株が生じる可能性がある。この結果、出現が予測されるウイルスに対する新しいワクチンを毎年作製しなくてはならず、これは、高価なだけでなく、非常に非効率的なプロセスである。科学技術的な進歩により、ワクチン組成物用の改善されたインフルエンザ抗原（複数可）を作製する能力は改善されているが、インフルエンザの新興の亜型および株に対処するための追加的な保護の供給源をもたらすことが依然として必要とされている。
患者において広範に中和性である抗体を生じさせるための目的の抗原（例えば、ＨＡおよび／またはＮＡ）を含むワクチン組成物という着想が一般に良好な手法だと考えられているが、ある特定の患者集団ではこの手法の使用が望ましいとは限らない。例えば、ある特定の患者、例えば、高齢者、若年者、免疫無防備状態の患者などでは、目的の抗原を含むワクチン組成物は必ずしも有効ではない。これらの患者集団または有効な免疫応答を開始することができない任意の患者では、グループ１および／またはグループ２亜型内の様々な株に共通するエピトープを標的とすることが可能な、広範に中和性である抗体をすでに含有する組成物をもたらすことがより有益であり得る。
現在まで、インフルエンザウイルスを広範に中和または阻害する抗体を同定することにおける成功は限られている。Ｏｋｕｎｏらは、Ａ型インフルエンザ／Ｏｋｕｄａ／５７（Ｈ２Ｎ２）を用いてマウスを免疫してＣ１７９と称する抗体を単離し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＨＡ２の保存されたコンフォメーショナルエピトープに結合し、グループ１のＨ２、Ｈ１およびＨ５亜型のＡ型インフルエンザウイルスを中和するものであった（Okunoら、（１９９３年）J. Virol.、６７巻（５号）：２５５２〜２５５８頁）。Ｔｈｒｏｓｂｙらは、ヒトＢ細胞から、グループ１亜型に対して広範な活性を有する１３種のモノクローナル抗体を同定した（Throsbyら、（２００８年）、PLOS one、３巻（２号）：ｅ３９４２頁）。Ｓｕｉらは、Ｈ５および他のグループ１ウイルスに結合するヒトモノクローナル抗体（Ｆ１０）を同定した（Suiら、（２００９年）、Nat. Struct. Mol. Biol.、１６巻（３号）：２６５〜２７３頁）。
Okunoら、（１９９３年）J. Virol.、６７巻（５号）：２５５２〜２５５８頁 Throsbyら、（２００８年）、PLOS one、３巻（２号）：ｅ３９４２頁 Suiら、（２００９年）、Nat. Struct. Mol. Biol.、１６巻（３号）：２６５〜２７３頁
しかし、この分野の数十年にわたる研究の後、現在、ほんの数種の抗体が、異なる亜型のインフルエンザウイルスを中和する能力を評価するために臨床試験されているが（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ Ｈｏｌｌａｎｄ（（ＵＳ２０１２／０２７６１１５、ＵＳ２０１４／００６５１５６、ＵＳ８４７０３２７、ＵＳ２０１４／０１２０１１３、ＥＰ２７３１９６７、ＵＳ８６９１２２３、ＵＳ２０１３／０２４３７９２、ＵＳ２０１４／００６５１６５、ＷＯ２００８／０２８９４６およびＷＯ２０１０／１３０６３６）；Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＳ２０１１／０３１９６００、ＥＰ２３８０９７６、ＵＳ２０１２／００５８１２４、ＵＳ２０１２／００５８１２４）、Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ（ＵＳ２０１３／０００４５０５、ＥＰ２５４５０７４、ＷＯ２０１４／１５８００１）；Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＳ２０１３／０２８９２４６）、ＳｅａＬａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳ２０１２／０１２８６７１）、Ｔｒｅｌｌｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（ＵＳ２０１２／００２０９７１、ＥＰ２５８２７２１）；Ｖｉｓｔｅｒｒａ，Ｉｎｃ．（ＵＳ２０１３／０３０２３４９）；Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ（ＵＳ２０１４／０１１９８２、ＥＰ２２２２７０１、ＷＯ２０１０／０２７８１８）；Ｔｅｍａｓｅｋ（ＵＳ８４４４９８６、ＵＳ８５７４５８１、ＵＳ ８６３７６４４、ＵＳ８６３７６４５、ＵＳ８３８３１２１、ＵＳ８５４０９９６、ＵＳ８５７４８３０、ＵＳ８５４０９９５）；ＨＵＭＡＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＵＳ８８７１２０７）；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（ＷＯ２０１５／０５１０１０）；およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（ＵＳ２０１４／０１６１８２２）により開発中の抗体を参照されたい）、Ａ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和もしくは阻害する、またはこのウイルスの様々な亜型によって引き起こされる疾患を和らげる抗体はいまだに販売されていない。したがって、インフルエンザウイルス感染を防止または処置するために使用することができる、Ａ型インフルエンザウイルスの多数の亜型を中和する新しい抗体を同定することが当技術分野において依然として必要とされている。
本発明の概要
本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、インフルエンザＨＡの活性を阻害または中和するために有用である。一部の実施形態では、抗体は、インフルエンザウイルスの宿主細胞への付着を遮断するため、および／またはインフルエンザウイルスの宿主細胞への侵入を防止するために有用である。一部の実施形態では、抗体は、ウイルスの細胞間伝達を阻害することによって機能する。ある特定の実施形態では、抗体は、対象におけるインフルエンザウイルス感染の少なくとも１つの症状を防止する、処置する、または好転させることにおいて有用である。ある特定の実施形態では、抗体は、インフルエンザウイルス感染を有する、またはそれが生じるリスクがある対象に、予防的にまたは治療的に投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体を含有する組成物は、ワクチンが禁忌である患者、またはワクチンの効果が少ない対象、例えば、高齢患者、若年患者、ワクチンの任意の１つもしくは複数の構成成分に対するアレルギーを有する可能性がある患者、またはワクチン中の免疫原に反応しない可能性がある免疫無防備状態の患者に投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体を含有する組成物は、インフルエンザのアウトブレイク中に、医療スタッフ、入院患者または養護施設の入所者または他のリスクが高い患者に投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体を含有する組成物は、毎年のワクチンが有効でないことが予測される場合に、または、主要な抗原シフトを受けた株によるパンデミックの場合に、患者に第一選択処置として投与することができる。
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってもよく、抗原結合性部分のみを含んでもよく（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）、また、機能性に影響を及ぼすため、例えば、宿主における持続を増大させるため、またはエフェクター機能を増大させるもしくは残留するエフェクター機能を排除するために改変することができる（Reddyら、２０００年、J. Immunol.、１６４巻：１９２５〜１９
３３頁）。ある特定の実施形態では、抗体は二重特異性であってよい。
第１の態様では、本発明は、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に特異的に結合する単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体が、以下の特性：
（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体であること；
（ｂ）リアルタイムバイオレイヤー干渉計に基づくバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸアッセイ）で測定した場合、インフルエンザＨＡに、１０−９Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合すること；
（ｃ）３７０分を超える解離半減期（ｔ１／２）を示すこと；
（ｄ）Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６およびＨ１６Ｎ３から選択されるグループ１のＡ型インフルエンザウイルスの、１３０ｎＭ未満のＩＣ５０での中和を示すこと；
（ｅ）インフルエンザウイルス感染細胞の、６６ｎＭ未満のＥＣ５０での補体媒介性溶解を示す；
（ｆ）ウイルスによる攻撃の前またはその後のいずれかに投与した場合に、インフルエンザウイルス感染の動物モデルにおける生存の増加によって測定される保護を示すこと；または
（ｇ）前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１または表１２に列挙されている重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、表１または表１２に列挙されている軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含むこと
のうちの２つまたはそれ超を有する、単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、本発明の抗体は、サルにおいて対照Ｉ ｍＡｂと称される比較用抗体の約１．５倍の解離半減期、およびマウスにおいて対照Ｉ ｍＡｂの約２倍の解離半減期を示す。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物に感染後４８時間の時点、または感染後７２時間の時点で投与した場合に、オセルタミビルと比較して保護の増大を示す。
関連する実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、皮下または静脈内のいずれかに投与した場合に、および／またはインフルエンザウイルスに感染前に、またはそれに感染した後に投与した場合に、保護の増大を付与する。
一実施形態では、本発明の抗体は、感染した哺乳動物に約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでにわたる単回皮下または静脈内用量として投与した場合に、アイソタイプ（陰性）対照抗体を投与した動物と比較して保護の増大を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物に、約１５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与した場合に、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間投与されるオセルタミビルの経口投与と比較して保護の増大を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇまでにわたる単回皮下用量として予防的に投与した場合に、約２０％を超える生存率を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、少なくとも感染後２４時間までに約７ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでにわたる単回静脈内用量として投与した場合に、約３０％を超える生存率を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、約７ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与した場合に、感染後４８時間の時点で投与した場合に、約３０％〜約６０％の生存率を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後４８時間またはそれよりも後の時点で約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与した場合に、約６０％と等しいまたはそれを超える生存率を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後４８時間またはそれより後の時点で約１５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与した場合に、約１００％の生存率を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、約１５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与した場合に、オセルタミビルを約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間、経口投与した場合に観察される４０％の生存率と比較して、約１００％の生存率を示す。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後４８時間超の時点でオセルタミビルと共に投与した場合に、相加的な保護効果をもたらす。
一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後７２時間の時点でオセルタミビルと共に投与した場合に、相加的な保護効果をもたらす。
一実施形態では、本発明の抗体は、オセルタミビルと組み合わせて使用し、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物に抗体を約７ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでにわたる単回静脈内用量で投与し、オセルタミビルを約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間、経口投与した場合に、相加的な保護効果をもたらす。
関連する実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルス感染の７２時間後にオセルタミビルと組み合わせて使用し、抗体を約７ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでにわたる単回静脈内用量で投与し、オセルタミビルを約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間、経口投与した場合に、相加的な保護効果をもたらす。
一実施形態では、本発明の抗体は静脈内、鼻腔内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができ、オセルタミビルは経口的に投与することができる。
一実施形態では、オセルタミビルは、本発明の抗体を投与する前、それと同時に、またはその後に投与する。
一実施形態では、抗体および／またはオセルタミビルは、単回用量として投与することも複数回用量として投与することもできる。
例示的な本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体が本明細書の表１および２に列挙されている。表１は、例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
さらなる例示的な本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体が本明細書の表１２および１３に列挙されている。表１２は、例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表１３は、例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、インフルエンザＨＡに特異的に結合する、配列番号２、１８、３４、５０、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２４２、２５０、２５８、２６６、２７４、２８２および２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
一実施形態では、本発明は、インフルエンザＨＡに特異的に結合する、配列番号１０、２６、４２、５８、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかの対を含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１または表１２に列挙されている例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、５０／６６、７４／８２、７４／６６、９０／９８、１０６／１１４、１２２／１３０、１３８／１４６、１５４／１６２、１７０／１７８、１８６／１９４、２０２／２１０、２１８／２２６、２３４／６６、２４２／６６、２５０／６６、２５８／６６、２６６／６６、２７４／６６、２８２／６６および２９０／６６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号１８／２６（例えば、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ）、５０／５８（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ）、５０／６６（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２）、または１０６／１１４（例えば、Ｈ１Ｈ１４５７１Ｎ）からなる群から選択される。
一実施形態では、単離された抗体または抗原結合性断片は、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２４４、２５２、２６０、２６８、２７６、２８４、および２９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２４６、２５４、２６２、２７０、２７８、２８６、および２９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、および２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、および２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む。
一実施形態では、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２４のＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２８のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号３０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３２のＬＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号５２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５４のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号５６のＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号６８のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号５２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５４のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号５６のＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号６０のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号６２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６４のＬＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号１０８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１０のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１１２のＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１１６のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１１８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２０のＬＣＤＲ３を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかの対を含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１または表１２に列挙されている例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号２４／３２（例えば、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ）、５６／６４（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ）、５６／７２（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２）および１１２／１２０（例えば、Ｈ１Ｈ１４５７１Ｎ）からなる群から選択される。
本発明は、表１または表１２に列挙されている例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のいずれかに含有される６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号２０−２２−２４−２８−３０−３２（例えば、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ）、５２−５４−５６−６０−６２−６４（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ）；５２−５４−５６−６８−７０−７２（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２）および１０８−１１０−１１２−１１６−１１８および１２０（例えば、Ｈ１Ｈ１４５７１Ｎ）からなる群から選択される。
関連する実施形態では、本発明は、表１または表１２に列挙されている例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有される６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号１８／２６（例えば、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ）、５０／５８（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ）、５０／６６（例えば、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２）および１０６／１１４（例えば、Ｈ１Ｈ１４５７１Ｎ）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法が当技術分野で周知であり、それを使用して、本明細書に開示されている指定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣例としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般に述べると、Ｋａｂａｔ定義は配列の変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造的なループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ手法とＣｈｏｔｈｉａ手法の折衷である。例えば、Kabat、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、National Institutes of Health、Bethesda、Md.（１９９１年）；Al-Lazikaniら、J. Mol. Biol.、２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびMartinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）を参照されたい。公共のデータベースも、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
本発明は、グリコシル化パターンが改変された抗インフルエンザＨＡ抗体を含む。一部の実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変、または、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が有用であり得る（Shieldら、（２００２年）JBC、２７７巻：２
６７３３頁を参照されたい）。他の適用では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行うことができる。
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲが、それぞれ表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性断片と、インフルエンザＨＡへの特異的な結合について競合する抗体およびその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲが、それぞれ表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する、参照抗体またはその抗原結合性断片と、インフルエンザＨＡへの結合について交差競合する、または、インフルエンザＨＡ上の同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合性断片も提供する。
本発明は、インフルエンザＨＡの宿主細胞への付着および／または侵入を遮断する単離された抗体およびその抗原結合性断片も提供する。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、インフルエンザＨＡ上の第１のエピトープに対する第１の結合特異性および別の抗原に対する第２の結合特異性を含む二重特異性である。
第２の態様では、本発明は、抗インフルエンザＨＡ抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、表１または表１２に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
本発明は、３つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）のセットを含むＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１または表１２に列挙されている例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のいずれかによって定義される通りである核酸分子も提供する。
本発明は、３つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含むＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１または表１２に列挙されている例示的な抗インフルエンザＨＡ抗体のいずれかによって定義される通りである核酸分子も提供する。
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが、表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２もしくは表１３に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列と、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、その配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列とを含む。ある特定の実施形態では、本発明のこの態様によると、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはどちらも、表１または表１２に列挙されている、同じ抗インフルエンザＨＡ抗体に由来する。
本発明は、表１または表１２に列挙されている重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明は、表１または表１２に列挙されている軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。
関連する態様では、本発明は、抗インフルエンザＨＡ抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させることが可能な組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記の核酸分子のいずれか、すなわち、表１または表１２に記載されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに宿主細胞を抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で培養することによって抗体またはその一部を産生させ、したがって産生した抗体および抗体断片を回収する方法も本発明の範囲内に含まれる。
第３の態様では、本発明は、治療有効量の、インフルエンザＨＡに特異的に結合する少なくとも１つの組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗インフルエンザＨＡ抗体と第２の治療剤の組合せである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗インフルエンザＨＡ抗体と有利に組み合わせられる任意の薬剤である。抗インフルエンザＨＡ抗体と有利に組み合わせられる例示的な薬剤としては、限定することなく、インフルエンザＨＡに結合し、かつ／もしくはその活性を阻害する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合性断片などを含める）および／または、インフルエンザＨＡに直接結合はしないが、それにもかかわらず宿主細胞への感染力を含むウイルスの活性を阻害する薬剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）第１の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）第２の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片であって、第１の抗体が、インフルエンザＨＡ上の第１のエピトープに結合し、第２の抗体がインフルエンザＨＡ上の第２のエピトープに結合し、第１のエピトープと第２のエピトープが別個のものであり、重複していない、第２の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片；および（ｃ）薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）第１の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）第２の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片であって、第１の抗体と第２の抗体がインフルエンザＨＡへの結合について交差競合しない、第２の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片；および（ｃ）薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）第１の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片；および（ｂ）異なるインフルエンザ抗原と相互作用する第２の抗インフルエンザ抗体またはその抗原結合性断片であって、第１の抗体が、インフルエンザＨＡ上のエピトープに結合し、第２の抗体が、異なるインフルエンザ抗原上のエピトープに結合する、第２の抗インフルエンザ抗体またはその抗原結合性断片；および（ｃ）薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）第１の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）異なるウイルス（非インフルエンザ）抗原と相互作用する、第２の抗体またはその抗原結合性断片であって、第１の抗体が、インフルエンザＨＡ上のエピトープに結合し、第２の抗体が、異なるウイルス（非インフルエンザ）抗原上のエピトープに結合する、第２の抗体またはその抗原結合性断片；および（ｃ）薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体を伴う追加的な組み合わせ治療および共製剤化が本明細書の他の箇所に開示されている。
第４の態様では、本発明は、インフルエンザＨＡに関連する疾患もしくは障害（例えば、対象におけるウイルス感染など）、またはウイルス感染に付随する少なくとも１つの症状を、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体または抗体の抗原結合性部分を使用して処置するための治療方法であって、本発明の抗体または抗体の抗原結合性断片を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に治療有効量で投与するステップを含む治療方法を提供する。治療される障害は、インフルエンザＨＡ活性の阻害によって改善される、好転する、阻害される、または防止される任意の疾患または状態である。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザ感染の少なくとも１つの症状を防止する、処置する、または好転させる方法であって、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片を、それを必要とする対象に治療有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染の少なくとも１つの症状の重症度、持続時間、または出現の頻度を、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体を投与することによって好転または低下させるための方法であって、少なくとも１つの症状が、頭痛、発熱、疼痛、鼻漏（鼻閉）、悪寒、疲労、衰弱、咽頭炎、咳、息切れ、嘔吐、下痢、肺炎、気管支炎、および死亡からなる群から選択される、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象におけるウイルス負荷量を低減する方法であって、対象に、インフルエンザＨＡに結合し、インフルエンザＨＡの宿主細胞への結合および／または侵入を遮断する、本発明の抗体またはその断片を有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、インフルエンザ感染を有する、またはそれを有するリスクがある、またはそれが発生する素因がある対象に、予防的にまたは治療的に投与することができる。リスクがある対象としては、これだけに限定されないが、免疫無防備状態の人、例えば、自己免疫疾患が原因で免疫無防備状態の人、または免疫抑制療法を受けている人（例えば、臓器移植後）、またはヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）もしくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、白血球が枯渇するもしくは破壊される特定の形態の貧血を患っている人、放射線療法もしくは化学療法を受けている人、または炎症性障害を患っている人が挙げられる。インフルエンザ感染が生じるリスクがある他の対象としては、高齢の成人（６５歳を超える）、２歳未満の小児、医療従事者、および肺感染症、心疾患または糖尿病などの基礎をなす医学的状態を有する人が挙げられる。また、感染した個体と物理的に接触するまたは密接な物理的近傍になるあらゆる人は、インフルエンザウイルス感染が発生するリスクが上昇している。さらに、例えば、人口密度の高い都市、もしくはインフルエンザウイルスへの感染が確認されたもしくは疑わしい対象の極めて近傍に住んでいる対象は、疾患のアウトブレイクの近傍にあることに起因して、または、例えば、病院職員、医薬研究者、感染地域への渡航者、または航空機を頻繁に利用する人は、職業選択に起因して、インフルエンザ感染にかかるリスクがある。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を第２の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与する。第２の治療剤は、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬など）、抗感染薬、インフルエンザＨＡに対する異なる抗体、異なるインフルエンザ抗原（例えば、ノイラミニダーゼ）に対する抗体、抗ウイルス薬、充血除去薬、抗ヒスタミン薬、インフルエンザに対するワクチン、抗酸化剤などの栄養補助食品、および、インフルエンザ感染の少なくとも１つの症状を好転させるため、または患者におけるウイルス負荷量を低減するために有用な当技術分野で公知の任意の他の薬物または治療からなる群から選択することができる。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片に関連する副作用（複数可）が起こるのであれば、そのようなあらゆる可能性のある副作用（複数可）に対して反作用するまたはそれを低下させる助けとなる薬剤であってよい。抗体またはその断片は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、鼻腔内、筋肉内、または頭蓋内に投与することができる。一実施形態では、抗体は、対象の血清中の抗体の最大の濃度のために単回静脈内注入として投与することができる。抗体またはその断片は、対象の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、５０ｍｇから５０００ｍｇまでの間で構成される１つまたは複数の用量で投与することができる。
本発明は、インフルエンザＨＡの結合および／または活性の遮断が有益であると思われる疾患または障害を治療するための、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片の使用も包含する。本発明は、インフルエンザＨＡの結合および／または活性の遮断が有益であると思われる疾患または障害を治療するための医薬の製造における、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片の使用も包含する。
他の実施形態は、続く発明の詳細な説明を精査すれば明らかになろう。
例えば、本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に特異的に結合する単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体が、以下の特性：
（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体であること；
（ｂ）リアルタイムバイオレイヤー干渉計に基づくバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸアッセイ）で測定した場合、インフルエンザＨＡに、１０ −９ Ｍ未満の解離定数（Ｋ Ｄ ）で結合すること；
（ｃ）３７０分を超える解離半減期（ｔ１／２）を示すこと；
（ｄ）Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６およびＨ１６Ｎ３から選択されるグループ１のＡ型インフルエンザウイルスの、１３０ｎＭ未満のＩＣ ５０ での中和を示すこと；
（ｅ）インフルエンザウイルス感染細胞の、６６ｎＭ未満のＥＣ ５０ での補体媒介性溶解を示すこと；
（ｆ）ウイルスによる攻撃の前またはその後のいずれかに投与した場合に、インフルエンザウイルス感染の動物モデルにおける生存の増加によって測定される保護を示すこと；または
（ｇ）前記抗体またはその抗原結合性断片が、表１または表１２に列挙されている重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、表１または表１２に列挙されている軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含むこと
のうちの２つまたはそれ超を有する、単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片。
（項目２）
サルにおいて対照Ｉ ｍＡｂの約１．５倍の解離半減期、およびマウスにおいて対照Ｉ
ｍＡｂの約２倍の解離半減期を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目３）
インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後４８時間の時点で投与した場合に、オセルタミビルと比較して保護の増大を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目４）
インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物に約１５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として投与した場合に、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間投与されるオセルタミビルの経口投与と比較して保護の増大を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目５）
インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後４８時間の時点で約１５ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与した場合に、約１００％の生存率を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目６）
インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、約１５ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与した場合に、オセルタミビルを約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間、経口投与した場合に観察される４０％の生存率と比較して、約１００％の生存率を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目７）
インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物において、感染後７２時間の時点でオセルタミビルと共に投与した場合に、相加的な保護効果を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目８）
オセルタミビルと組み合わせて使用し、前記抗体を約７ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでにわたる単回静脈内用量として投与し、前記オセルタミビルを約２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、５日間、経口投与した場合に、相加的な保護効果を示す、項目１に記載の単離された抗体。
（項目９）
表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１０）
配列番号２、１８、３４、５０、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２４２、２５０、２５８、２６６、２７４、２８２および２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１１）
表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１２）
配列番号１０、２６、４２、５８、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１３）
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２４４、２５２、２６０、２６８、２７６、２８４および２９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２４６、２５４、２６２、２７０、２７８、２８６および２９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８および２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４および２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６および２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１４）
（ａ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２４のＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２８のＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号３０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３２のＬＣＤＲ３を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１５）
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、５０／６６、７４／８２、７４／６６、９０／９８、１０６／１１４、１２２／１３０、１３８／１４６、１５４／１６２、１７０／１７８、１８６／１９４、２０２／２１０、２１８／２２６、２３４／６６、２４２／６６、２５０／６６、２５８／６６、２６６／６６、２７４／６６、２８２／６６および２９０／６６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合性断片。
（項目１６）
配列番号１８／２６、５０／５８、５０／６６および１０６／１１４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合性断片。
（項目１７）
表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；および表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体または抗原結合性断片と、インフルエンザＨＡへの結合について競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１８）
表１または表１２に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲ；および表１または表１２に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体または抗原結合性断片と同じエピトープに結合する、単離された組換えヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１９）
インフルエンザウイルスの宿主細胞への付着および／または侵入を防止する、項目１から１８のいずれか一項に記載の単離された抗体。
（項目２０）
項目１から１９のいずれか一項に記載の、インフルエンザＨＡに結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
（項目２１）
（ａ）インフルエンザＨＡ上の第１のエピトープに結合する第１の抗体またはその抗原結合性断片と、（ｂ）インフルエンザＨＡ上の第２のエピトープに結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片と、（ｃ）薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
（項目２２）
項目１から１９のいずれか一項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２３）
項目１から１９のいずれか一項に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２４）
項目２２または２３に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
（項目２５）
項目２４に記載のベクターを発現する細胞。
（項目２６）
インフルエンザ感染の少なくとも１つの症状を防止する、治療する、または好転させる方法であって、項目１から１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片または項目２０または２１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
（項目２７）
前記少なくとも１つの症状が、発熱、咳、体の痛み、鼻漏、息切れ、肺炎または気管支炎からなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記医薬組成物を、それを必要とする前記対象に予防的にまたは治療的に投与する、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記医薬組成物を、免疫無防備状態の個体、高齢の成人（６５歳を超える）、医療従事者、ならびに医学的問題の履歴または基礎をなす医学的状態（例えば、心臓の問題、および糖尿病）がある人からなる群から選択される対象に予防的に投与する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記医薬組成物を第２の治療剤と組み合わせて投与する、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記第２の治療剤が、抗ウイルス薬、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬など）、インフルエンザＨＡに対する異なる抗体、インフルエンザに対するワクチン、抗酸化剤などの栄養補助食品およびインフルエンザ感染を処置するための任意の他の緩和療法からなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第２の治療剤を、前記抗体と同じ投与経路を通じて、または前記抗体とは異なる投与経路を通じて投与する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第２の治療剤を経口投与する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記抗ウイルス薬がオセルタミビルである、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記オセルタミビルを、前記抗体を投与する前、それと同時に、またはその後に投与する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記医薬組成物を皮下、静脈内、皮内、筋肉内、鼻腔内、または経口的に投与する、項目２６から３５のいずれか一項に記載の方法。
図１は、マウスにおける重症Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療において、感染後４８時間の時点におけるＨ１Ｈ１１７２９Ｐの単回用量により、感染後４８時間の時点におけるオセルタミビルよりも高い有効性が示されることを示す。４８時間ｐ．ｉ．の時点でもたらされた１５ｍｇ／ｋｇでのＨ１Ｈ１１７２９Ｐの単回用量（丸印）は、感染後２日目に開始して１日２回（ＢＩＤ）、５日間、２５ｍｇ／ｋｇ（逆三角形）または５ｍｇ／ｋｇ（ひし形）で投薬されたオセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））よりも有効である。０日目に、マウスに１０×ＭＬＤ５０のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）を鼻腔内に（ＩＮ）感染させた。対照群には、水およびＩｇＧ１アイソタイプ（陰性）対照としてＣＲ８０２０の経口胃管栄養を受けた非感染群（三角形、点線）および感染群（六角形）を含めた。
図２は、マウスにおける重症インフルエンザを処置するために、感染後７２時間の時点でＨ１Ｈ１１７２９Ｐの単回用量をオセルタミビルと組み合わせることにより相加的な有効性が観察されたことを示す。マウスに、１０×ＭＬＤ５０のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）を鼻腔内（ＩＮ）感染させた７２時間後に、単一の有効未満の用量である７ｍｇ／ｋｇ（四角、点線）、または１５ｍｇ／ｋｇ（丸印、点線）のＨ１Ｈ１１７２９Ｐ、対照ＩｇＧ（三角形）、２５ｍｇ／ｋｇで１日２回、５日間のオセルタミビル（ひし形、点線）、または、単回用量の７ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１１７２９Ｐ（四角、実線）もしくは１５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１１７２９Ｐ（丸印、実線）とオセルタミビルのレジメンの組合せを５日間受けさせた。３つの独立した試験（群当たりＮ＝１５）の結果が示されている。
図３は、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐと称される抗体のＨＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＶＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。
図４は、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２と称される抗体のＨＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＶＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。
本方法を記載する前に、特定の方法および記載されている実験条件は変動しうるので、本発明はそのような方法および条件に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解される。
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されている方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。
定義
「インフルエンザ赤血球凝集素」という用語は、「インフルエンザＨＡ」とも称され、ウイルスの宿主細胞への付着（α−２，３−およびα−２，６−シアル酸へのＨＡ１結合による）および侵入（コンフォメーションの変化による）を媒介する、インフルエンザビリオンの表面上に見いだされる三量体糖タンパク質である。ＨＡは、２つの構造ドメイン：受容体結合性部位（高頻度の抗原性突然変異を受ける）を含有する球状の頭部ドメイン、および幹領域（インフルエンザウイルスの様々な株の間でより保存されている）で構成される。インフルエンザＨＡは、前駆体（ＨＡ０）として合成され、それがタンパク質プロセシングを受けて２つのサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）が産生され、これらが互いと会合して幹／球状頭部構造が形成される。ウイルスＨＡは、ウイルス上の最も可変性の高い抗原であるが（１８種の亜型を２つの群に分類することができる）、幹（ＨＡ２）は各群の中で高度に保存されている。
全長インフルエンザＨＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＦＪ９６６０８２．１として提供されるインフルエンザ分離株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９のアミノ酸配列により例示される。「インフルエンザＨＡ」という用語は、異なるインフルエンザ分離株から単離されたインフルエンザＨＡのタンパク質バリアント、例えば、ＧＱ１４９２３７．１、ＮＣ＿００２０１７、ＫＭ９７２９８１．１なども包含する。「インフルエンザＨＡ」という用語は、組換えインフルエンザＨＡまたはその断片も包含する。この用語は、例えば、ヒスチジンタグ、マウスまたはヒトＦｃ、またはシグナル配列とカップリングしたインフルエンザＨＡまたはその断片も包含する。
「インフルエンザ感染」という用語は、本明細書で使用される場合、「ｆｌｕ」とも特徴付けられ、インフルエンザウイルスによって引き起こされる重症急性呼吸性疾病を指す。この用語は、気道感染症、ならびに高熱、頭痛、全身の疼痛および痛み、疲労および衰弱、一部の例では極度の消耗、鼻づまり、くしゃみ、咽頭炎、胸部不快感、咳、息切れ、気管支炎、肺炎および重症の場合では死亡を含む症状を包含する。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖で構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「抗体分子全体」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合性断片を指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）と重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される）とで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域と、点在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明のある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合性断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一のものであってもよく、天然にまたは人工的に改変されたものであってもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれ超のＣＤＲの並列分析に基づいて定義することができる。
１つまたは複数のＣＤＲ残基の置換または１つまたは複数のＣＤＲの省略も可能である。１つまたは２つのＣＤＲを結合のために分配することができる抗体が科学文献に記載されている。Padlanら（１９９５年、FASEB J.、９巻：１３３〜１３９頁）は、公開され
た結晶構造に基づいて抗体とそれらの抗原の間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約５分の１〜３分の１のみが実際に抗原と接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を有さない抗体も多く見出した（Vajdosら、２００２年、J Mol Biol、３２０巻：４１５〜４２８頁も参照されたい）。
抗原と接触しないＣＤＲ残基は、以前の試験に基づいて、分子モデリングによって、および／または経験的に、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から同定することができる（例えば、ＣＤＲＨ２の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、多くの場合に、必要でない）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）を省略し、通常、別のヒト抗体配列またはそのような配列のコンセンサス内の対応する位置を占有するアミノ酸で置換する。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も経験的に選択することができる。経験的な置換は保存的置換であっても非保存的置換であってもよい。
本明細書に開示されている完全ヒト抗インフルエンザＨＡモノクローナル抗体は、対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって容易に突きとめることができる。本発明は、本明細書に開示されているアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合性断片であって、１つまたは複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸が、抗体が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に突然変異した（そのような配列変化を本明細書では集合的に「生殖細胞系列突然変異」と称する）、抗体およびその抗原結合性断片を含む。当業者は、本明細書に開示されている重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列から開始して、１つまたは複数の個々の生殖細胞系列突然変異またはこれらの組合せを含む多数の抗体および抗原結合性断片を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖細胞系列配列に見いだされる残基に復帰突然変異している。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、元の生殖細胞系列配列に復帰突然変異している、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸の範囲内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸の範囲内にのみ突然変異した残基が見いだされるか、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の範囲内にのみ突然変異した残基が見いだされる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つまたは複数が、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基（複数可）に突然変異している。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれ超の生殖細胞系列突然変異の任意の組合せを含有し得る、例えば、ある特定の個々の残基は特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に突然変異しており、元の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持されているかまたは異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に突然変異している。１つまたは複数の生殖細胞系列突然変異を含有する抗体および抗原結合性断片が得られたら、それを、例えば、改善された結合特異性、増大した結合親和性、改善されたまたは増強されたアンタゴニスト性またはアゴニスト性の生物学的性質（場合によっては）、低下した免疫原性などの１つまたは複数の所望の性質について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られる抗体および抗原結合性断片は本発明の範囲に包含される。
本発明は、１つまたは複数の保存的置換を有する本明細書に開示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む完全ヒト抗インフルエンザＨＡモノクローナル抗体も包含する。例えば、本発明は、本明細書に開示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して保存的アミノ酸置換を、例えば１０カ所またはそれ未満、８カ所またはそれ未満、６カ所またはそれ未満、４カ所またはそれ未満伴うＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗インフルエンザＨＡ抗体を含む。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異によって突然変異が導入されたもの）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列に移植されたｍＡｂを含むことは意図されない。この用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換えにより産生された抗体を包含する。この用語は、ヒト対象から単離されたまたはヒト対象において生成された抗体を含むことは意図されない。
「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む、組換えＤＮＡ技術として当技術分野で公知の技術または方法によって創出されたか、発現されたか、単離されたか、または得られる、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を指す。この用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む）もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現された、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を指す。
「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」または「に特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔｏ）」などの用語は、抗体またはその抗原結合性断片が、抗原と、生理的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、平衡解離定数が少なくとも約１×１０−８Ｍまたはそれ未満であることによって特徴付けられ得る（例えば、ＫＤが小さいほど、結合が緊密であるこが示される）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。本明細書に記載されている通り、インフルエンザＨＡに特異的に結合する抗体が、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーでのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイにより同定されている。さらに、インフルエンザＨＡの１つのドメイン、および１つもしくは複数の追加的な抗原に結合する多重特異性抗体、またはインフルエンザＨＡの２つの異なる領域に結合する二重特異性もなお、本明細書で使用される「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高親和性」抗体という用語は、インフルエンザＨＡに対して、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ、例えばＯｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーによって、または表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって、または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定して、少なくとも１０−８Ｍ；好ましくは１０−９Ｍ；より好ましくは１０−１０Ｍ、なおより好ましくは１０−１１Ｍ、なおより好ましくは１０−１２ＭのＫＤで表される結合親和性を有するｍＡｂを指す。
「遅い解離速度（ｓｌｏｗ ｏｆｆ ｒａｔｅ）」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーによって、または表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定した場合、抗体がインフルエンザＨＡから１×１０−３ｓ−１またはそれ未満、好ましくは１×１０−４ｓ−１またはそれ未満の速度定数で解離することを意味する。
抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性断片」などという用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在するものであるか、酵素によって得られたものであるか、合成されたものであるか、または遺伝子操作されたものであるポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合性断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、インフルエンザＨＡに結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、インフルエンザＨＡによって引き起こされる感染を治療するために有用な抗ウイルス薬、第２の抗インフルエンザ抗体または任意の他の治療用部分などのリガンドまたは治療用部分などの部分とコンジュゲートすることができる（「免疫コンジュゲート」）。
「単離された抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、インフルエンザＨＡに特異的に結合する単離された抗体、またはその断片は、インフルエンザＨＡ以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
「遮断抗体」または「中和抗体」（または「インフルエンザＨＡ活性を中和する抗体」または「アンタゴニスト抗体」）とは、本明細書で使用される場合、インフルエンザＨＡに結合することにより、インフルエンザＨＡの少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、インフルエンザの宿主細胞への付着または侵入を防止または遮断する。さらに、「中和抗体」とは、病原体の、宿主における感染を開始し、かつ／または永続する能力を中和することができる、すなわち、防止する、阻害する、低下させる、妨害するまたは干渉することができる抗体である。「中和抗体」および「中和する抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ）」または「中和する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの抗体は、単独でまたは他の抗ウイルス剤と組み合わせて、適切な製剤化の際に、もしくは能動的なワクチン接種に関連して予防剤もしくは治療剤として、または診断ツールとして使用することができる。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更を検出することによってリアルタイム生体分子相互作用を分析することを可能にする光学現象を指す。
バイオレイヤー干渉法は、生体分子相互作用を測定するための無標識技術である。バイオレイヤー干渉法は、２つの表面：バイオセンサーの先端上に固定化されたタンパク質の層、および内部参照層から反射する白色光の干渉パターンを分析する光学的な分析技法である。バイオセンサーの先端に結合した分子の数のあらゆる変化により、リアルタイムで測定することができる干渉パターンのシフトが引き起こされる（Abdiche, Y.N.ら、Analytical Biochemistry、（２００８年）、３７７巻（２号）、２０９〜２１７頁）。本発明のある特定の実施形態では、「リアルタイムバイオレイヤー干渉計に基づくバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸアッセイ）」を使用して、ある特定の抗インフルエンザＨＡ抗体の結合特性を評価した。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域内の特異的な抗原結合性部位と相互作用する抗原性決定因子を指す。単一の抗原は、１つ超のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し得、また、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。エピトープとは、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造にまたは機能的に定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、直鎖状ではないアミノ酸で構成されるコンフォメーショナルなものでもあり得る。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、もしくはスルホニル基などの、分子化学的に活性な表面の群分けである決定因子を含み得、また、ある特定の実施形態では、特定の３次元の構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。
「交差競合する」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、かつ別の抗体またはその抗原結合性断片の結合を阻害または遮断する抗体またはその抗原結合性断片を意味する。この用語は、２つの抗体の間の両方向の競合、すなわち、第１の抗体が結合し、第２の抗体の結合を遮断すること、およびその逆も包含する。ある特定の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、同じエピトープに結合し得る。あるいは、第１の抗体および第２の抗体は、異なるが、重複するエピトープに結合し得、したがって、一方の結合により、例えば立体的な障害によって第２の抗体の結合が阻害または遮断される。抗体間の交差競合は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイによって測定することができる。２つの抗体間の交差競合は、自己間結合（第１の抗体と第２の抗体が同じ抗体である場合）に起因してバックグラウンドシグナルを下回る第２の抗体の結合として表すことができる。２つの抗体間の交差競合は、例えば、自己間バックグラウンド結合（第１の抗体と第２の抗体が同じ抗体である場合）ベースラインを下回る第２の抗体の％結合として表すことができる。
「実質的な同一性」または「実質的に同一の」という用語は、核酸またはその断片について言及する場合に、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適にアラインメントした時に、以下に考察する通りＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなどの任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド配列同一性が、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であることを示す。特定の例では、参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに適用される通り、「実質的な類似性」または「実質的に類似した」という用語は、２つのペプチド配列が、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、初期値のギャップ重みづけ（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）を使用して最適にアラインメントした時に、少なくとも９０％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が同様の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換ではタンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。２つまたはそれ超のアミノ酸配列が保存的置換によって互いと異なる場合には、類似性のパーセントまたは程度を上向きに調整して置換の保存性を補正することができる。この調整を行うための手段は当業者には周知である（例えば、Pearson（１９９４年）Methods Mol. Biol.、２４巻：３０７〜３３１頁を参照された
い）。側鎖の化学的性質が同様であるアミノ酸の群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸塩、および７）硫黄を含有する側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置き換えは、Gonnetら、（１９９２年）Science、２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されているＰＡＭ２５０対数尤
度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的」な置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、一般には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアでは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の改変に割り当てられる類似性の評価基準を使用して、同様の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、初期パラメータを用いて使用して、異なる種の生物体に由来する相同なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用し、初期値または推奨されるパラメータを用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）により、クエリ配列と検索配列の間で最も良く重複する領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性がもたらされる（Pearson（２０００年）上記）。本発明の配列を、異なる生物体に由来する多数
の配列を含有するデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、初期パラメータを使用した、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschulら、（１９９０年）J. Mol. Biol.、２１５巻：４０
３〜４１０頁、および（１９９７年）Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁を参照されたい。
「治療有効量」という句は、投与に対して所望の効果が生じる量を意味する。正確な量は、処置の目的に左右され、当業者が公知の技法を使用して確認することができる（例えば、Lloyd（１９９９年）The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compoundingを参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ウイルス感染などの疾患または障害の好転、防止および／または処置を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。対象は、インフルエンザ感染を有する可能性がある、またはインフルエンザウイルス感染が発生する素因がある。「インフルエンザウイルス感染が発生する素因がある」対象、または「インフルエンザウイルス感染にかかるリスクが上昇している可能性がある」対象とは、自己免疫疾患に起因して免疫系が損なわれている対象、免疫抑制療法を受けている人（例えば、臓器移植後）、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）もしくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、白血球が枯渇するもしくは破壊される特定の形態の貧血を患っている人、放射線療法もしくは化学療法を受けている人、または炎症性障害を患っている人である。さらに、非常に若いかまたは高齢である対象はリスクが上昇している。感染した個体と物理的に接触するまたは密接な物理的近傍になるあらゆる人は、インフルエンザウイルス感染にかかるリスクが上昇している。さらに、例えば、人口密度の高い都市、もしくはインフルエンザウイルスへの感染が確認されたもしくは疑わしい対象の極めて近傍に住んでいる対象は、疾患のアウトブレイクの近傍にあることに起因して、または、例えば、病院職員、医薬研究者、感染地域への渡航者、または航空機を頻繁に利用する人は、職業選択に起因して、インフルエンザに感染するリスクがある。
本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、それを必要とする対象に本発明の抗体などの治療剤を投与することによりインフルエンザ感染の少なくとも１つの症状または兆候の重症度を低下または好転させることを指す。この用語は、疾患の進行または感染の悪化の阻害を包含する。この用語は、疾患の正の予後、すなわち、本発明の抗体などの治療剤を投与すると、対象が感染を免れる可能性がある、またはウイルス力価が低下するもしくはなくなる可能性があることも包含する。治療剤は、治療用量で対象に投与することができる。
「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、本発明の抗体の投与でインフルエンザ感染の顕在化またはインフルエンザ感染のあらゆる症状もしくは兆候を阻害することを指す。この用語は、ウイルスに曝露した対象またはインフルエンザ感染を有するリスクがある対象における感染の拡散の防止を包含する。
本明細書で使用される場合、「保護効果」は、抗ウイルス剤などの薬剤、または本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体などの抗体が、例えば、感染因子に曝露した後の生存の増加、ウイルス負荷量の減少、または感染因子に関連する少なくとも１つの症状の好転の任意の１つまたは複数を示し得るかどうかを決定するための当技術分野で公知の任意の標準手順によって実証することができる。
本明細書で使用される場合、「抗ウイルス薬」という用語は、対象におけるウイルス感染を処置する、防止する、または好転させるために使用される任意の抗感染薬または治療薬を指す。「抗ウイルス薬」という用語は、ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）（オセルタミビル）、ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標）（ザナミビル）、リバビリン、またはインターフェロン−アルファ２ｂを包含するが、これらに限定されない。本発明では、処置される感染は、インフルエンザウイルスによって引き起こされるものである。
一般的な説明
インフルエンザは、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルス（インフルエンザウイルス）によって引き起こされる感染症である。インフルエンザウイルスは、コアタンパク質に基づいて、３つの属、Ａ、ＢおよびＣに分類され、これは、さらに、ウイルスエンベロープ糖タンパク質赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって決定される亜型に分けられる。Ａ型インフルエンザウイルスは、様々な哺乳動物種および鳥類種に感染するが、Ｂ型およびＣ型の感染は、ヒトに大きく制限される。あらゆる懸念されるヒト疾患を引き起こすのはＡ型およびＢ型のみである。
インフルエンザウイルスの突然変異率が高いことおよび遺伝子再集合の頻度が高いことが、ＨＡ抗原およびＮＡ抗原の変動性が大きいことに寄与する。小さな変化を引き起こす軽微な点突然変異（「抗原ドリフト」）が比較的多くの場合に起こる。抗原ドリフトにより、ウイルスが免疫認識を逃れることが可能になり、その結果、流行間の年にインフルエンザのアウトブレイクが繰り返される。ＨＡ抗原の主要な変化（「抗原シフト」）は、異なるＡ型インフルエンザ亜型に由来する遺伝子材料の再集合によって引き起こされる。新しいパンデミック株を生じさせる抗原シフトは希な事象であり、例えば、同時感染ブタにおいて、動物亜型とヒト亜型の間での再集合の間に起こる。
Ａ型インフルエンザウイルスに対する中和抗体応答は、一般には、所与のウイルス亜型に特異的である。Ａ型インフルエンザには、それらの赤血球凝集素（「ＨＡ」）タンパク質によって定義される亜型が１８種存在する。１８種のＨＡ、Ｈ１〜Ｈ１８は、２つのグループに分類することができる。グループ１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８亜型からなり、グループ２は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５亜型を含む。これらの理由で、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型ならびにそれらの毎年のバリアントを中和することが可能な、広範に中和性である抗体を誘導するワクチンを有することが高度に望ましい。さらに、広範に中和性であるヘテロサブタイプ抗体は、Ａ型インフルエンザ感染を防止または治療するための医薬として投与することができる。
ＨＡは、ホモ三量体前駆体ポリペプチドＨＡ０として合成される。各単量体は、翻訳後に独立に切断されて、単一のジスルフィド結合によって連結した２つのポリペプチド、ＨＡ１およびＨＡ２を形成し得る。より大きなＮ末端断片（ＨＡＬ、３２０〜３３０アミノ酸）は、受容体結合性部位およびウイルス中和抗体によって認識される大多数の決定因子を含有する膜遠位球状ドメインを形成する。ＨＡのＨＡ１ポリペプチドは、ウイルスの細胞表面への付着に関与する。より小さなＣ末端部分（ＨＡ２、およそ１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞膜またはウイルス膜に係留する幹様構造を形成する。ＨＡ２ポリペプチドは、ウイルス膜と細胞膜のエンドソーム内での融合を媒介し、それにより、リボ核タンパク質複合体の細胞質内への放出を可能にする。
Ａ型インフルエンザウイルスの１つ超の亜型を中和する抗体の同定に関しては、ほんの限られた成功しか収められていない。さらに、これまでに同定された抗体の中和の息は細く、また、それらの効力は低い。Ｏｋｕｎｏらは、インフルエンザウイルスＡ／Ｏｋｕｄａ／５７（Ｈ２Ｎ２）を用いてマウスを免疫して、動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＨＡ２の保存されたコンフォメーショナルエピトープに結合し、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１のＨ２、Ｈ１およびＨ５亜型を中和するモノクローナル抗体（Ｃ１７９）を単離した（（Okunoら、J. Virol.、６７巻：２５５２〜
８頁、１９９３）。
数十年に及ぶ研究にもかかわらず、Ａ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和もしくは阻害する、またはＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を和らげる抗体は販売されていない。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスの多数の亜型を中和するものであり、Ａ型インフルエンザ感染を防止または治療するための医薬として使用することができる新しい抗体を同定する必要がある。
感染症を予防または処置するための受動免疫療法が、通常は高力価の中和抗体を含有する回復期ヒト血清の形態で、１世紀超にわたって使用されてきた（Goodら、１９９１年；Cancer、６８巻：１４１５〜１４２１頁）。現在では、多数の精製モノクローナル抗体が、抗微生物薬として使用するために目下前臨床開発および臨床開発中である（Marascoら
、２００７年；Nature Biotechnology、２５巻：１４２１〜１４３４頁）。
本発明者らは、本明細書において、インフルエンザ赤血球凝集素に特異的に結合し、インフルエンザウイルスと宿主細胞の相互作用を調節する完全ヒト抗体およびその抗原結合性断片について記載している。抗インフルエンザＨＡ抗体は、インフルエンザウイルスＨＡに高親和性で結合することが可能である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザＨＡに結合し、ウイルスの宿主細胞への付着および／または侵入を遮断することが可能な遮断抗体である。一部の実施形態では、本発明の遮断抗体は、インフルエンザウイルスの細胞への結合を遮断することが可能であり、したがって、宿主細胞のウイルス感染力を阻害または中和することが可能である。一部の実施形態では、遮断抗体は、インフルエンザウイルス感染に罹患している対象を処置するために有用であり得る。抗体は、それを必要とする対象に投与されると、対象におけるインフルエンザなどのウイルスによる感染を低下させることが可能である。抗体は、対象におけるウイルス負荷量を減少させるために使用することができる。抗体は、単独で使用することもでき、補助療法として、ウイルス感染を処置するための当技術分野で公知の他の治療用部分またはモダリティと共に使用することができる。ある特定の実施形態では、これらの抗体は、ウイルスＨＡの幹領域内のエピトープに結合することが可能である。さらに、同定された抗体は、哺乳動物を感染から保護するために予防的に（感染前に）使用することもでき、以前に確立された感染を好転させるため、または感染に付随する少なくとも１つの症状を好転させるために治療的に（感染が確立された後に）使用することもできる。
例示的なインフルエンザＨＡの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＨＣ４８３３２４．１として示される（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０２７８１８号の配列番号６２を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、全長インフルエンザＨＡなどの一次免疫原を用いて、または組換え型のインフルエンザＨＡまたはその断片を用いて免疫し、その後、二次免疫原を用いて、またはインフルエンザＨＡの免疫原性的に活性な断片を用いて免疫したマウスから得られる。ある特定の実施形態では、抗体は、インフルエンザワクチン組成物を用いて免疫し、その後、１つまたは複数の組換えによって産生されたＨＡペプチドを用いて追加免疫したマウスから得られる。
免疫原は、インフルエンザＨＡの生物学的に活性な断片および／もしくは免疫原性断片、またはインフルエンザＨＡの活性断片をコードするＤＮＡであり得る。断片は、ＨＡタンパク質の幹領域に由来するものであってよい（Suiら、Nature Struct.およびMol. Biol.、２００９年２月２２日オンライン公開；１〜９頁）。
ペプチドは、タグ付けまたはＫＬＨなどの担体分子とのコンジュゲーションのために、ある特定の残基の付加または置換を含むように改変することができる。例えば、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにシステインを付加することもでき、リンカー配列を付加して、免疫のために例えばＫＬＨとのコンジュゲーションのためにペプチドを調製することもできる。
本発明のある特定の抗インフルエンザＨＡ抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイによって決定される通り、インフルエンザＨＡに結合し、その活性を中和することが可能である。本発明の抗体の、インフルエンザＨＡに結合し、その活性、したがって、ウイルスの宿主細胞への付着および／または侵入、その後に続くウイルス感染を中和する能力は、本明細書に記載されている結合アッセイ、または活性アッセイを含む当業者に公知の任意の標準方法を使用して測定することができる。
結合活性を測定するための、非限定的な例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが本明細書の実施例３に例証されている。実施例３では、抗インフルエンザＨＡ抗体のインフルエンザＨＡに対する結合親和性および解離定数をリアルタイムバイオレイヤー干渉計に基づくバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸアッセイ）によって決定した。実施例４および５では、中和アッセイを使用してインフルエンザウイルスの多様なグループ１株の感染力を決定した。実施例６では、ある特定の抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてウイルス感染細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することが示された。実施例７および１０では、本発明のある特定の抗体が、予防的にまたは治療的に投与した場合にｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡ型インフルエンザ感染を中和することができるものであることが実証される。
インフルエンザＨＡに特異的な抗体は、追加的な標識または部分を含有しなくてもよく、Ｎ末端またはＣ末端の標識または部分を含有してもよい。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（もしあれば）の位置により、ペプチドを結合させる表面に対するペプチドの方向を決定することができる。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように向き付けられる。一実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩにより検出可能な標識であってよい。ある特定の実施形態では、そのような標識された抗体を、イメージングアッセイを含む診断アッセイにおいて使用することができる。
抗体の抗原結合性断片
特に他の指示がなければ、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン重鎖２本と免疫グロブリン軽鎖２本で構成される抗体分子（すなわち、「抗体分子全体」）、ならびにその抗原結合性断片を包含すると理解されるものとする。抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在するものであるか、酵素によって得られたものであるか、合成されたものであるか、または遺伝子操作されたものであるポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合性断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、インフルエンザＨＡに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体断片とは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態では、「抗原結合性断片」という用語は、多重特異性抗原結合性分子のポリペプチド断片を指す。抗体の抗原結合性断片は、例えば、抗体分子全体から、タンパク質消化または抗体可変ドメインおよび（任意選択で）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子工学技法などの任意の適切な標準技法を使用して引き出すことができる。そのようなＤＮＡは公知であり、かつ／または、例えば商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能である、もしくは合成することができる。ＤＮＡは、配列決定し、例えば、１つまたは複数の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切なコンフィギュレーションに配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を創出するため、アミノ酸を修飾する、付加するもしくは欠失させるためになど、化学的にまたは分子生物学的技法を使用することによって操作することができる。
抗原結合性断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または制約されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の工学的に操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合性断片」という表現に包含される。
抗体の抗原結合性断片は、一般には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、一般に、１つまたは複数のフレームワーク配列と隣接しているかまたはインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＨドメインとＶＬドメインが会合した抗原結合性断片では、ＶＨドメインとＶＬドメインは、互いに対して任意の適切な配置に位置し得る。例えば、可変領域は、二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ二量体、ＶＨ−ＶＬ二量体またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合により連結した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な、例示的なコンフィギュレーションとしては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上に列挙されている例示的なコンフィギュレーションのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインのコンフィギュレーションのいずれにおいても、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いと直接連結していてもよく、完全なまたは部分的なヒンジまたはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはそれ超）のアミノ酸からなってよく、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に柔軟または半柔軟な連結をもたらす。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いと、かつ／または１つまたは複数の単量体ＶＨまたはＶＬドメインと非共有結合により会合した（例えば、ジスルフィド結合（複数可）による）、上に列挙されている可変ドメインおよび定常ドメインコンフィギュレーションのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでよい。
抗体分子全体と同様に、抗原結合性断片は、単一特異性であっても多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。多重特異性抗体の抗原結合性断片は、一般には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインが、別々の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示されている例示的な二重特異性抗体形式を含む多重特異性抗体形式はいずれも、当技術分野において利用可能な常套的な技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合性断片に関する使用に適応させることができる。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当技術分野で公知である。任意のそのような公知の方法を本発明に関して使用して、インフルエンザＨＡに特異的に結合するヒト抗体を作出することができる。以下の任意の１つを含む免疫原を使用して、インフルエンザＨＡに対する抗体を生成することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、全長のネイティブなインフルエンザＨＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９６６０８２．１を参照されたい）、または弱毒生ウイルスもしくは不活化ウイルス、またはタンパク質もしくはその断片をコードするＤＮＡを用いて免疫したマウスから得られる。あるいは、インフルエンザＨＡタンパク質またはその断片は、標準の生化学的技法を使用して作成し、改変し、免疫原として使用することができる。一実施形態では、免疫原は、組換えによって産生されたインフルエンザＨＡタンパク質またはその断片である。本発明のある特定の実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスワクチンであってよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫注射を投与することができる。ある特定の実施形態では、追加免疫注射は、１つもしくは複数のインフルエンザウイルス株、またはこれらの株に由来する赤血球凝集素を含んでよい。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５、Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１、Ｈ７ Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３、またはＨ９ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９８８を参照されたい。ある特定の実施形態では、追加免疫注射は、インフルエンザ株の１：１混合物、またはその株に由来する赤血球凝集素の１：１混合物を含有してよい。ある特定の実施形態では、免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの任意の他の真核細胞もしくは哺乳動物細胞、またはインフルエンザウイルスそれ自体において発現させた組換えインフルエンザＨＡペプチドであってよい。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１参照、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、インフルエンザＨＡに対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、内在性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結したヒト重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を伴い、したがって、マウスは、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。次いで、ＤＮＡを、完全ヒト抗体を発現することが可能な細胞において発現させる。
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを目的の抗原を用いて攻撃し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞など）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合して不死ハイブリドーマ細胞株を調製することができ、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、望ましいアイソタイプの重鎖および軽鎖の定常領域と連結することができる。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生させることができる。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
最初に、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する高親和性キメラ抗体を単離する。下の実験の節と同様に、抗体を特徴付け、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ４を生成する。選択される定常領域は特定の使用に応じて変動し得るが、可変領域には高親和性の抗原結合性および標的特異性の特徴が備わっている。
生物学的同等性
本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体および抗体断片は、記載されている抗体のアミノ酸配列とは異なるが、インフルエンザＨＡに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載されている抗体と本質的に同等の生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示されている配列と比較して１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と本質的に生物学的同等である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
２つの抗原結合性タンパク質、または抗体は、例えば、それらが、同じモル濃度の用量で、同様の実験条件下、単回用量または複数回用量のいずれかで投与した場合に、吸収の速度および程度に有意差が示されない医薬等価物または医薬代替物であれば、生物学的同等であるとみなされる。一部の抗体は、それらの吸収の程度が等価であるが、それらの吸収速度は等価でなく、それでも、そのような吸収速度の差が意図的なものであり、標識に反映され、例えば長期使用に関して有効な体内薬物濃度を実現するために必須ではなく、試験される特定の薬品に関して医学的に重要でないことが理由で生物学的同等性とみなすことができれば、等価物または医薬代替物とみなされる。
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度、または効力に臨床的に意味のある差異がなければ、生物学的同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、患者が、参照製品と生物学的製剤の１回または複数回の切り替えを、そのような切り換えを行わずに継続される治療と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの上昇、または効果の減弱の予測を伴わずに行うことができれば、生物学的同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、その両方が、使用される条件（複数可）に関して、共通の作用機構（複数可）によって作用するものであれば、そのような機構が分かっている限りでは、生物学的同等である。
生物学的同等性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法によって実証することができる。生物学的同等性の評価基準としては、例えば、（ａ）血液、血漿、血清、または他の生体液中の抗体またはその代謝産物の濃度を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトｉｎ ｖｉｖｏ生物学的利用能データと相関し、それが合理的に予測される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生物学的利用能または生物学的同等性を確立する、良好に管理された臨床試験が挙げられる。
本発明の抗体の生物学的同等性バリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または、生物学的活性に必要ではない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を、欠失させるか、または他のアミノ酸で置き換えて、復元時の不必要なまたは正しくない分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の状況では、生物学的同等な抗体とは、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸の変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する突然変異を含む抗体バリアントを含み得る。
Ｆｃバリアントを含む抗インフルエンザＨＡ抗体
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、酸性ｐＨにおいて中性ｐＨと比較してＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強するまたは減弱させる、１つまたは複数の突然変異を含むＦｃドメインを含む抗インフルエンザＨＡ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２領域またはＣＨ３領域に突然変異を含み、この突然変異（複数可）により、酸性環境（例えば、約５．５から約６．０までのｐＨ範囲であるエンドソーム内）におけるＦｃドメインのＦｃＲｎへの親和性が増大している、抗インフルエンザＨＡ抗体を包含する。そのような突然変異により、動物に投与した際の抗体の血清中半減期の増大をもたらすことができる。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、２５０位における改変（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位および４２８位における改変（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）；または４２８位および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦもしくはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦもしくはＮ４３４Ｙ］）；または２５０位および／もしくは４２８位における改変；または３０７位もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、改変は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）の改変を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つまたは複数の突然変異の対または群を含むＦｃドメインを含む抗インフルエンザＨＡ抗体を包含する。本明細書に開示されている抗体可変ドメイン内の全ての可能性のある前述のＦｃドメイン突然変異および他の突然変異の組合せが本発明の範囲内に入るものと企図される。
本発明は、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含み、キメラＣＨ領域が、１つ超の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む抗インフルエンザＨＡ抗体も包含する。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含むキメラＣＨ領域と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「ヒンジ上部」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基２１６〜２２７位）と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「ヒンジ下部」配列（ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸残基２２８〜２３６位）の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ヒンジ上部に由来するアミノ酸残基およびヒトＩｇＧ２ヒンジ下部に由来するアミノ酸残基を含む。本明細書に記載されているキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態では、抗体の治療的または薬物動態的性質に悪影響を及ぼすことなく、改変されたＦｃエフェクター機能を示す（例えば、２０１３年２月１日出願の米国仮出願第６１／７５９，５７８号を参照されたい）。
抗体の生物学的特性
一般に、本発明の抗体は、インフルエンザＨＡに結合することによって機能する。例えば、本発明は、インフルエンザＨＡに（例えば、２５℃または３７℃で）、リアルタイムバイオレイヤー干渉計に基づくバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸアッセイ）によって、または表面プラズモン共鳴によって測定して、１０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体および抗体の抗原結合性断片を包含する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、インフルエンザＨＡに、例えば本明細書に記載されているアッセイ形式、または実質的に類似したアッセイを使用し、表面プラズモン共鳴によって測定して、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。
本発明は、例えば、本明細書で定義されているアッセイ形式または実質的に類似したアッセイを使用し、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定して、解離半減期（ｔ１／２）が約１００分超である、インフルエンザＨＡに結合する抗体およびその抗原結合性断片も包含する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、インフルエンザＨＡに、例えば本明細書で定義されているアッセイ形式（例えば、ｍＡｂ捕捉形式もしくは抗原捕捉形式）または実質的に類似したアッセイを使用し、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定して、約２００分超、約３００分超、約４００分超、約５００分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、または約１０００分超のｔ１／２で結合する。一実施形態では、本発明の抗体および抗原結合性断片は、インフルエンザＨＡに、３００分超の解離半減期（ｔ１／２）で結合する。一実施形態では、本発明の抗体では、サルおよびマウスにおいて試験した場合に、対照Ｉ ｍＡｂと称される比較用抗体と比較して約１．５〜２倍の解離半減期の増大がもたらされる。
本発明は、インフルエンザウイルスのその宿主細胞に対する感染力を中和する抗体またはその抗原結合性断片も包含する。一部の実施形態では、抗体は、様々な代表的なグループ１インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４；Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１９３３；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／１９９７、Ｈ９Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３３９８２／２００９、Ｈ１３Ｎ６ ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／１９７７およびＨ１６Ｎ３ Ａ／ｓｈｏｒｅｂｉｒｄ／Ｄｅｌａｗａｒｅ／１７２／２００６）に対して、例えば実施例４および５で示されるようなマイクロ中和アッセイまたは実質的に類似したアッセイにおいて、約１．６ｎＭから約１３０ｎＭまでの範囲のＩＣ５０で中和効力を示す。一実施形態では、インフルエンザウイルスのその宿主細胞に対する感染力を中和する抗体またはその抗原結合性断片は、１３０ｎＭ未満のＩＣ５０で感染力を中和する。
本発明は、感染細胞の補体依存性細胞傷害を、約２０ｎＭから約６６ｎＭまでにわたるＥＣ５０で媒介する抗体またはその抗原結合性断片も包含する（実施例６を参照されたい）。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、感染細胞の補体依存性細胞傷害を、６６ｎＭ未満のＥＣ５０で媒介する。
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡ型インフルエンザ感染に対する保護の増大、または強力な中和を示す抗Ａ型インフルエンザＨＡ抗体も包含する。ある特定の抗体は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に；実施例７を参照されたい）投与した場合に、強力な中和を示す。ある特定の実施形態では、抗体のいくつか（Ｈ１Ｈ１１７２９ＰおよびＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２）では、１ｍｇ／ｋｇの単回用量として予防的に投与した場合に、マウスの１００％生存が示された。ある特定の抗体では、０．５ｍｇ／ｋｇの低さ（Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐと称される抗体を使用して１００％生存）、０．１ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１１７２９Ｐ（４０％生存）、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２（２０％生存）の用量で予防的に投与した場合に、マウスの有意な生存が示された。有意な生存は、ある特定の例示的な抗体（Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐ）を感染後に１５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合にも観察された。一実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザに感染している哺乳動物において、抗ウイルス薬であるオセルタミビルと組み合わせると相加的な保護効果を示す。
一実施形態では、本発明は、特異的にインフルエンザＨＡに結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片であって、以下の特性：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体であること；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、インフルエンザＨＡに、１０−９Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合すること；（ｃ）約３７０分から１０００分超までにわたる解離半減期（ｔ１／２）を示すこと；（ｄ）Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６およびＨ１６Ｎ３から選択されるグループ１のＡ型インフルエンザウイルスの、約１．６ｎＭから約１３０ｎＭまでにわたるＩＣ５０での中和を示すこと；（ｅ）インフルエンザウイルス感染細胞の、約２０ｎＭ〜約６６ｎＭのＥＣ５０での補体媒介性溶解を示すこと；または（ｆ）ウイルスによる攻撃の前またはその後のいずれかに投与した場合に、インフルエンザウイルス感染の動物モデルにおける生存の増加によって測定される保護を示すことのうちの２つまたはそれ超を示す単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明の抗体は、上述の生物学的特性の２つまたはそれ超、またはそれらの任意の組合せを有し得る。本発明の抗体の他の生物学的特性は、本明細書に実施例を含む本開示についての総説から当業者には明らかになろう。
エピトープマッピングおよび関連する技術
本発明は、インフルエンザＨＡ分子の１つまたは複数のドメイン内に見いだされる１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する抗インフルエンザＨＡウイルス抗体を包含する。抗体が結合するエピトープは、インフルエンザＨＡ分子内に位置する３個またはそれ超（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ超）のアミノ酸の単一の連続した配列からなり得る（例えば、ドメイン内の直鎖状エピトープ）。あるいは、エピトープは、インフルエンザＨＡ分子内に位置する複数の連続していないアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る（例えば、コンフォメーショナルエピトープ）。
当業者に公知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技法としては、例えば、Antibodies、HarlowおよびLane（Cold Spring Harbor Press
、Cold Spring Harbor、NY）に記載されているものなどの常套的な交差遮断アッセイ（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）が挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異性分析、ペプチドブロット分析（Reineke（２００４年）Methods Mol. Biol.、２４８巻：４４３〜６３頁）、ペプチド切断分析結晶学的試験およびＮＭＲ
分析が挙げられる。さらに、エピトープ切り出し、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法を使用することができる（Tomer（２０００年）Prot. Sci.、９巻：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用する、ポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般に述べると、水素／重水素交換方法は、目的のタンパク質を重水素で標識し、その後、重水素で標識したタンパク質に抗体を結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体により保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、重水素から水素への逆交換を、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持することができ、したがって、界面に含まれないアミノ酸と比較して高い質量を示す。抗体を解離させた後、標的タンパク質をプロテアーゼによる切断および質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に対応する、重水素で標識された残基を明らかにする。例えば、Ehring（１９９９年）Analytical Biochemistry、２６７巻：２５２〜２５９頁；EngenおよびSmith（２００１年）Anal. Chem.、７３巻：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照されたい。
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸、または、タンパク質の三次フォールディングによって並んだ連続していないアミノ酸のどちらからも形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、一般には、変性溶媒に曝露しても保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、一般には、変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、一般には、少なくとも３個、通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を独特の空間的コンフォメーションで含む。
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）は、同じ抗原を対象とする多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的にまたは酵素によって修飾した抗原表面への各抗体の結合プロファイルの類似性に応じてカテゴリーに分ける方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明瞭に異なるかまたは部分的に重複する独特のエピトープを反映し得る。この技術により、遺伝的に同一の抗体を迅速にフィルタリングすることが可能になり、したがって、特徴付けの焦点を遺伝的に別個の抗体に合わせることができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用する場合には、ＭＡＰにより、所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にすることができる。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を異なるエピトープに結合する抗体の群に分別することができる。
ある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡ抗体またはその抗原結合性断片は、天然の形態もしくは組換えによって産生された、インフルエンザＨＡにおいて例示された領域の任意の１つまたは複数内のエピトープ、またはその断片に結合する。
本発明は、同じエピトープ、またはそのエピトープの一部に結合する抗インフルエンザＨＡ抗体を包含する。同様に、本発明は、本明細書に記載されている特定の例示的な抗体のいずれかと、インフルエンザＨＡまたはその断片への結合について競合する抗インフルエンザＨＡ抗体も包含する。例えば、本発明は、表１および１２に記載されている抗体から得られる１つまたは複数の抗体と、インフルエンザＨＡへの結合について交差競合する抗インフルエンザＨＡ抗体を包含する。
抗体が参照抗インフルエンザＨＡ抗体と同じエピトープに結合するかどうか、または結合について競合するかどうかは、当技術分野で公知の常套的な方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗インフルエンザＨＡ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でインフルエンザＨＡまたはペプチドに結合させる。次に、試験抗体の、インフルエンザＨＡ分子に結合する能力を評価する。参照抗インフルエンザＨＡ抗体による飽和結合後に試験抗体がインフルエンザウイルスＨＡに結合することができれば、試験抗体が参照抗インフルエンザＨＡ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方では、参照抗インフルエンザＨＡ抗体による飽和結合後に試験抗体がインフルエンザＨＡに結合することができなければ、試験抗体は、本発明の参照抗インフルエンザＨＡ抗体が結合したエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
抗体が参照抗インフルエンザＨＡ抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法を２つの方向で実施する：第１の方向では、参照抗体を飽和条件下でインフルエンザＨＡに結合させ、その後、試験抗体のインフルエンザＨＡ分子への結合を評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でインフルエンザＨＡ分子に結合させ、その後、参照抗体のインフルエンザＨＡ分子への結合を評価する。どちらの方向でも第１の（飽和）抗体のみがインフルエンザＨＡ分子に結合することができた場合、試験抗体と参照抗体がインフルエンザＨＡへの結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解される通り、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するのではない可能性があり、重複または隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断する可能性もある。
２つの抗体は、それぞれが他方の抗体の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰の一方の抗体により、他方の結合が、競合結合アッセイで測定した場合、少なくとも５０％であるが好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％阻害される（例えば、Junghansら、Cancer Res. １９９０年、５０巻：１４９５〜１５０２頁を参照されたい）。あるいは、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低下させるまたは排除する抗原のアミノ酸突然変異の本質的に全てにより他方の結合も低下するまたは排除される場合、同じエピトープを有する。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低下させるまたは排除するアミノ酸突然変異の一部により他方の結合も低下するまたは排除される場合、重複するエピトープを有する。
次いで、追加的な常套的な実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠如が実際に参照抗体と同じエピトープに結合することに起因するものであるか、または観察された結合の欠如の原因が立体的遮断（もしくは別の現象）であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、当技術分野において利用可能なＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは任意の他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
免疫コンジュゲート
本発明は、インフルエンザウイルス感染を処置するためにトキソイドまたは抗ウイルス薬などの治療用部分とコンジュゲートしたヒト抗インフルエンザＨＡモノクローナル抗体（「免疫コンジュゲート」）を包含する。本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」という用語は、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、ペプチドまたはタンパク質または治療剤と化学的にまたは生物学的に連結した抗体を指す。抗体は、その標的と結合することが可能な限りは分子に沿った任意の位置で、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療剤と連結することができる。免疫コンジュゲートの例としては、抗体薬物コンジュゲートおよび抗体−毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、薬剤は、インフルエンザＨＡに対する第２の異なる抗体であってよい。ある特定の実施形態では、抗体は、ウイルス感染細胞に特異的な薬剤とコンジュゲートすることができる。抗インフルエンザＨＡ抗体とコンジュゲートすることができる治療用部分の型は、処置される状態および実現したい所望の治療効果を考慮にいれる。免疫コンジュゲートを形成するための適切な薬剤の例は当技術分野で公知である；例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的なものであってもよく、１つ超の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合性ドメインを含有するものであってもよい。例えば、Tuttら、１９９１年、J. Immunol.、１４７巻：６０〜６９頁；Kuferら、２
００４年、Trends Biotechnol.、２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい。
本発明の多重特異性抗原結合性分子またはそのバリアントはいずれも、当業者には分かるであろう標準の分子生物学的技法（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質の発現技術）を使用して構築することができる。
一部の実施形態では、インフルエンザＨＡ特異的抗体を、インフルエンザＨＡの別個のドメインに結合する可変領域が連結して単一の結合性分子内に二重ドメイン特異性が付与された二重特異性形式（「二重特異性」）で生成する。適切に設計された二重特異性体は、特異性および結合活性の両方が増大することにより、全体的なインフルエンザ−ＨＡタンパク質阻害有効性を増強し得る。個々のドメイン（例えば、Ｎ末端ドメインのセグメント）に対する特異性を有する可変領域、または１つのドメイン内の異なる領域に結合することが可能な可変領域を、各領域が別々のエピトープまたは１つのドメイン内の異なる領域に同時に結合することを可能にする構造的足場上で対合させる。一実施例では、二重特異性体のために、１つのドメインに対する特異性を有する結合体由来の重鎖可変領域（ＶＨ）を、第２のドメインに対する特異性を有する一連の結合体由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）で組み換えて、元のＶＨと、そのＶＨについての元の特異性を乱さずに対合させることが可能な非コグネイトＶＬパートナーを同定する。このように、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１−ＶＬ１およびＶＨ２−ＶＬ１）で構成される二重特異性体を生成することができる。単一のＶＬセグメントの使用により、二重特異性体を生成するために使用されるクローニング、発現、および精製プロセスにおける系の複雑さが低下し、それにより、単純化され、かつ効率が上昇する（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９およびＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照されたい）。
あるいは、１つ超のドメイン、および、これだけに限定されないが、例えば、第２の種々の抗インフルエンザＨＡ抗体などの第２の標的に結合する抗体を、本明細書に記載されている技法または当業者に公知の他の技法を使用して二重特異性形式に調製することができる。別個の領域に結合する抗体可変領域を、例えばインフルエンザウイルス上の関連する部位に結合する可変領域と連結して、単一の結合性分子内に二重抗原特異性を付与することができる。この性質の適切に設計された二重特異性体は二重の機能を果たす。細胞外ドメインに対する特異性を有する可変領域を、細胞外ドメインの外部に対する特異性を有する可変領域と組み合わせ、各可変領域が別々の抗原に結合することを可能にすることを可能にする構造的足場上で対合させる。
本発明に関して使用することができる例示的な二重特異性抗体形式は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を伴い、ここで、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸により互いと異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差異により、二重特異性抗体のプロテインＡへの結合が、アミノ酸の差異がない二重特異性抗体と比較して低減する。一実施形態では、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるとＨ４３５Ｒ）などの、プロテインＡへの結合を低減または消滅させる突然変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＹ４３６Ｆ）をさらに含んでよい。第２のＣＨ３に見いだすことができるさらなる改変としては、ＩｇＧ１抗体の場合では、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合では、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびに、ＩｇＧ４抗体の場合では、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体形式の変形は本発明の範囲内に入るものと企図される。
本発明に関して使用することができる他の例示的な二重特異性形式としては、限定することなく、例えば、ｓｃＦｖに基づくまたはダイアボディ二重特異性形式、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合物、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブイントゥホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性形式が挙げられる（前述の形式の概説については、例えば、Kleinら、２０１２年、mAbs、４巻：６号、１〜１１頁、およびそこに
引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体は、例えば、既定の組成、結合価および幾何学的形状を有する多量体複合体に自己集合する部位特異的な抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成するために直交性の化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用する場合には、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築することもできる（例えば、Kazaneら、J. Am. Chem. Soc.［Epub:２０１２年１２月４日］を参照
されたい）。
治療的投与および製剤
本発明は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物は、移行、送達、耐容性などの改善をもたらすために製剤に組み入れられた適切な担体、賦形剤、および他の薬剤と共に投与する。多数の適切な製剤は、全ての薬剤学者に公知の処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PAにおいて見いだすことができる。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス剤、油剤、脂質、小胞を含有する脂質（陽イオン性または陰イオン性）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型乳剤、カーボワックス乳剤（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル剤、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Powellら、「Compendium of excipients for parenteral formulations」、PDA（１９９８年）J Pharm Sci Technol、５２巻：２３８〜３１１頁も参照されたい。
抗体の用量は、投与を受ける対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変動し得る。本発明の抗体を、成体患者における疾患または障害を処置するため、またはそのような疾患を防止するために使用する場合、本発明の抗体を、通常は体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約６０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、または約２０ｍｇ〜約５０ｍｇの単回用量で投与することが有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および持続時間を調整することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも約０．１ｍｇ〜約５０００ｍｇ、約１〜約２０００ｍｇ、約５〜約１０００ｍｇ、または約１０〜約５００ｍｇ、〜約１００ｍｇ、または〜約５０ｍｇの初回用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、初回用量の後に、第２のまたは複数のその後の抗体またはその抗原結合性断片の用量を、初回用量とほぼ同じかまたはそれ未満であってよい量で投与することができ、ここで、その後の用量は、少なくとも１日〜３日；少なくとも１週間、少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；少なくとも８週間；少なくとも９週間；少なくとも１０週間；少なくとも１２週間；または少なくとも１４週間の間をあける。
様々な送達系が公知であり、それらを使用して本発明の医薬組成物を投与することができる。例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルへの封入、ウイルス突然変異体を発現させることが可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Wuら、（１９８７年）J. Biol. Chem.、２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照されたい）。導入の方法としては、これだけに限定されないが、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が挙げられる。組成物は、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与することができ、また、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的なものであっても局所的なものであってもよい。医薬組成物は、小胞、特にリポソームとして送達することもできる（例えば、Langer（１９９０年）Science、２４９巻：１５２７〜１５３３頁を参照されたい）。
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用も本明細書において企図される。抗体とコンジュゲートしたナノ粒子は治療への適用および診断への適用のどちらにも使用することができる。抗体とコンジュゲートしたナノ粒子ならびに調製および使用の方法は、参照により本明細書に組み込まれるArruebo, M.ら、２００９年（「Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications」、J. Nanomat.２００９巻、文献番号
４３９３８９、２４頁、doi: 10.1155/2009/439389）により詳細に記載されている。ウ
イルス感染細胞を標的とするために、ナノ粒子を開発し、医薬組成物中に含有される抗体とコンジュゲートすることができる。薬物送達用のナノ粒子は、例えば、そのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ８２５７７４０、またはＵＳ８２４６９９５にも記載されている。
ある特定の状況では、医薬組成物を制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に置くことができ、したがって、全身用量のほんの一部のみが必要になる。
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内および筋肉内への注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射用調製物は、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、上記の抗体またはその塩を、注射用に従来使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に溶解させるか、懸濁させるか、または乳化することによって調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理的食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含有する等張性溶液などがあり、これらは、例えばアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性物質［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加生成物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用されており、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用することができる。したがって調製された注射剤は、適切なアンプル中に充填することが好ましい。
本発明の医薬組成物は、標準の針およびシリンジを用いて皮下または静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関しては、ペン型送達デバイスが本発明の医薬組成物の送達において容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは、再使用可能であっても使い捨てであってもよい。再使用可能なペン型送達デバイスでは、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジが利用される。カートリッジ中の医薬組成物が全て投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。次いで、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジは用いられない。その代わりに、使い捨てペン型送達デバイスにはデバイス内のレザバー中に保持された医薬組成物が充填される。レザバー中の医薬組成物が無くなったら、デバイス全体を廃棄する。
多数の再使用可能なペン型送達デバイスおよび自動注射器型送達デバイスが本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、これらに確実には限定されないが、ほんの一部挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）がある。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達デバイスの例としては、これらに確実には限定されないが、ほんの一部挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ， Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）がある。
上記の経口使用または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量の剤形に調製することが有利である。そのような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、ピル剤、カプセル剤、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される抗体の量は、一般に、単位用量中、剤形当たり約５〜約５０００ｍｇである。抗体は、特に注射の形態では約５〜約５００ｍｇ含有されることが好ましく、他の剤形に関しては約１０〜約２５０ｍｇ含有されることが好ましい。
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、インフルエンザウイルス感染に関連する疾患または障害または状態を治療および／もしくは防止するため、ならびに／または、そのような疾患、障害または状態に付随する少なくとも１つの症状を好転させるために有用である。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる重症かつ急性の呼吸器感染に罹患している対象を処置するために有用である。一部の実施形態では、本発明の抗体は、宿主におけるウイルス力価を低下させることまたはウイルス負荷量を減少させることにおいて有用である。一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、インフルエンザウイルスに感染している患者に、治療用量で投与することができる。
本発明の１つまたは複数の抗体は、疾患または障害の症状または状態の１つまたは複数を軽減もしくは防止するため、またはその重症度を低下させるために投与することができる。抗体は、これだけに限定されないが、発熱、咳、咽頭炎、頭痛、体の痛み、疲労、極度の消耗、息切れ、気管支炎、肺炎、および死亡を含む、インフルエンザウイルス感染の少なくとも１つの症状を好転させるためまたはその重症度を低下させるために使用することができる。
本明細書では、本発明の１つまたは複数の抗体を、免疫無防備状態の個体、高齢の成人（６５歳を超える）、２歳未満の小児、医療従事者、インフルエンザウイルス感染に罹患している患者の極めて近くにいる家族構成員、および病歴（例えば、肺感染症、心疾患または糖尿病のリスクの上昇）を有する患者などの、インフルエンザウイルス感染が発生するリスクがある対象に予防的に使用することも企図される。
本発明のさらなる実施形態では、本抗体を、インフルエンザウイルス感染に罹患している患者を処置するための医薬組成物を調製するために使用する。本発明の別の実施形態では、本抗体を、インフルエンザウイルス感染を処置するまたは好転させるために有用な当業者に公知の任意の他の薬剤または任意の他の治療と共に、補助治療として使用する。
組み合わせ治療
組み合わせ治療は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体、および、本発明の抗体または発明の抗体の生物学的に活性な断片と有利に組み合わせられる任意の追加的な治療剤を含む。本発明の抗体は、インフルエンザウイルスの処置に使用される１つまたは複数の薬物または薬剤（例えば、抗ウイルス剤）と相乗的に組み合わせることができる。
例えば例示的な抗ウイルス剤としては、例えば、ワクチン、ノイラミニダーゼ阻害剤またはヌクレオシド類似体が挙げられる。本発明の抗体と組み合わせて使用することができる他の例示的な抗ウイルス剤としては、例えば、ジドブジン、ガンシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ホスカルネット、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン（remantidine）、サクイナビル、インジ
ナビル、リトナビル、アルファ−インターフェロンおよび他のインターフェロン、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））ラニナミビル、ペラミビル）、またはリマンタジンを挙げることができる。
他の例示的な抗ウイルス薬としては、これだけに限定されないが、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤およびＭ２イオンチャネル阻害剤が挙げられる。一実施形態では、Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、アマンタジンまたはリマンタジンである。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスに感染している患者におけるウイルス負荷量を減少させるため、または感染の１つまたは複数の症状を好転させるために、第２の治療剤と組み合わせることができる。
本発明の抗体は、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬）、充血除去薬、抗ヒスタミン薬、抗感染薬、インフルエンザウイルスに対する異なる抗体、抗ウイルス薬、ＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）またはＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）などのインフルエンザウイルスに対するワクチン、抗酸化剤などの栄養補助食品、またはインフルエンザウイルス感染を処置するための任意の他の緩和療法と組み合わせて使用することができる。
ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、インフルエンザに対する別の抗体である。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、インフルエンザ赤血球凝集素に対する別の抗体である。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、ノイラミニダーゼまたはマトリックスタンパク質２の四量体外部ドメイン（Ｍ２ｅタンパク質）などの異なるインフルエンザタンパク質に対する別の抗体である。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、宿主膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）などの異なるタンパク質に対する抗体である。第２の抗体は、ウイルスの異なる亜型または株に由来する１つまたは複数の異なるインフルエンザウイルスタンパク質に特異的なものであってよい。本発明では、インフルエンザウイルスに対して広範な中和活性または阻害活性を有する抗体の組合せ（「カクテル」）の使用が企図される。一部の実施形態では、インフルエンザウイルスの、選択圧力の結果としての迅速な突然変異に起因してエスケープする能力を低下させるために、競合しない抗体を組み合わせ、それを必要とする対象に投与することができる。一部の実施形態では、組合せを構成する抗体は、ＨＡタンパク質上の別個の重複しないエピトープに結合する。組合せを構成する抗体は、ウイルスの宿主細胞への付着および／または侵入および／または宿主細胞との融合を遮断し得る。抗体は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７またはＨ１８を含むグループ１のＡ型インフルエンザ亜型の任意の１つまたは複数から選択される赤血球凝集素と相互作用し得、単独で、または上記の薬剤の任意の１つまたは複数と組み合わせて使用すると、これだけに限定されないが、以下：Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６およびＨ１６Ｎ３を含むグループ１インフルエンザ亜型の任意の１つまたは複数を中和し得る。
本発明では、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体の組合せの使用も企図されており、ここで、組合せは、交差競合しない１つまたは複数の抗体；一部の実施形態では、組合せは、広範な中和活性を有する第１の抗体を、狭いスペクトルの分離株に対する活性を有し、第１の抗体と交差競合しない第２の抗体と共に含む。
本明細書で使用される場合、「組み合わせて」という用語は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体を投与する前、それと同時に、またはその後に、追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）を投与することができることを意味する。「組み合わせて」という用語は、抗インフルエンザＨＡ抗体および第２の治療剤の逐次的投与または同時的投与も包含する。
追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体を投与する前に対象に投与することができる。例えば、第１の構成成分を、第２の構成成分の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満前に投与に投与する場合、第１の構成成分が第２の構成成分「の前に」投与されるとみなすことができる。他の実施形態では、追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体を投与した後に対象に投与することができる。例えば、第１の構成成分を、第２の構成成分を投与した１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与する場合、第１の構成成分は、第２の構成成分「の後に」投与されるとみなされる。さらに他の実施形態では、追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体を投与するのと同時に対象に投与することができる。「同時に」投与するとは、本発明の目的に関して、例えば、抗インフルエンザＨＡ抗体および追加的な治療的に活性な構成成分を、単一の剤形として対象に投与すること、または、別々の剤形として互いから約３０分またはそれ未満以内に対象に投与することを含む。別々の剤形として投与する場合、各剤形は、同じ経路で投与することができる（例えば、抗インフルエンザＨＡ抗体と追加的な治療的に活性な構成成分の両方を静脈内に投与することができるなど）。あるいは、各剤形は、異なる経路によって投与することができる（例えば、抗インフルエンザＨＡ抗体を静脈内に投与することができ、追加的な治療的に活性な構成成分を経口的に投与することができる）。いずれにしても、構成成分を単一の剤形として同じ経路によって投与すること、別々の剤形として同じ経路によって投与すること、または、別々の剤形として異なる経路によって投与することは、全て、本開示の目的に関して、「同時に投与すること」とみなされる。本開示の目的に関して、抗インフルエンザＨＡ抗体を追加的な治療的に活性な構成成分を投与した「前に」、それと「同時に」またはその「後に」（これらの用語は本明細書において上で定義されている）投与することは、抗インフルエンザＨＡ抗体を、追加的な治療的に活性な構成成分「と組み合わせて」投与することとみなされる。
本発明は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体と、本明細書の他の箇所に記載の追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）のうちの１つまたは複数を共に製剤化した医薬組成物を包含する。
投与レジメン
ある特定の実施形態によると、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体（または抗インフルエンザＨＡ抗体と本明細書で言及されている追加的な治療的に活性な薬剤のいずれかとの組合せを含む医薬組成物）の単回用量を、それを必要とする対象に投与することができる。本発明のある特定の実施形態によると、抗インフルエンザＨＡ抗体（または抗インフルエンザＨＡ抗体と本明細書で言及されている追加的な治療的に活性な薬剤のいずれかとの組合せを含む医薬組成物）の複数回用量を、対象に既定の時間経過にわたり投与することができる。本発明のこの態様による方法は、対象に本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体の複数回用量を逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与すること」とは、抗インフルエンザＨＡ抗体の各用量を、対象に、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間または数カ月）を空けた異なる日に投与することを意味する。本発明は、患者に、抗インフルエンザＨＡ抗体の単一の初回用量、その後に、抗インフルエンザＨＡ抗体の１つまたは複数の二次用量、および任意選択で、その後に抗インフルエンザＨＡ抗体の１つまたは複数の三次用量を逐次的に投与することを含む方法を包含する。
「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」という用語は、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体の投与の時間的な順序を指す。したがって、「初回用量」とは、処置レジメンの開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」とも称される）、「二次用量」とは、初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量、および三次用量は全て、同じ量の抗インフルエンザＨＡ抗体を含有し得るが、一般には、投与の頻度に関して互いと異なり得る。しかし、ある特定の実施形態では、初回用量、二次用量および／または三次用量に含有される抗インフルエンザＨＡ抗体の量は、処置の過程中、互いに変動する（例えば、必要に応じて上方または下方に調整する）。ある特定の実施形態では、２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の用量を処置レジメンの開始時に「ローディング用量」として投与し、続いて、その後の用量をより低い頻度で投与する（例えば、「維持用量」）。
本発明のある特定の例示的な実施形態では、二次用量および／または三次用量のそれぞれを、直前の用量の１〜４８時間後（例えば、１時間後、１時間半後、２時間後、２時間半後、３時間後、３時間半後、４時間後、４時間半後、５時間後、５時間半後、６時間後、６時間半後、７時間後、７時間半後、８時間後、８時間半後、９時間後、９時間半後、１０時間後、１０時間半後、１１時間後、１１時間半後、１２時間後、１２時間半後、１３時間後、１３時間半後、１４時間後、１４時間半後、１５時間後、１５時間半後、１６時間後、１６時間半後、１７時間後、１７時間半後、１８時間後、１８時間半後、１９時間後、１９時間半後、２０時間後、２０時間半後、２１時間後、２１時間半後、２２時間後、２２時間半後、２３時間後、２３時間半後、２４時間後、２４時間半後、２５時間後、２５時間半後、２６時間後、２６時間半後、またはそれ超）に投与する。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、多数回の投与の連続において、連続内の、間に用量を挟まずすぐ次の用量の投与前に患者に投与される抗インフルエンザＨＡ抗体の用量を意味する。
本発明のこの態様による方法は、患者に、抗インフルエンザＨＡ抗体の二次用量および／または三次用量を任意の数で投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみを患者に投与する。他の実施形態では、２またはそれ超（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ超）の二次用量を患者に投与する。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみを患者に投与する。他の実施形態では、２またはそれ超の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ超）の三次用量を患者に投与する。
本発明のある特定の実施形態では、二次用量および／または三次用量を患者に投与する頻度は、処置レジメンの経過にわたって変動し得る。投与の頻度は、処置の過程中に、臨床検査後に個々の患者の必要性に応じて医師が調整することもできる。
抗体の診断への使用
本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体は、例えば、診断目的で、試料中のインフルエンザＨＡを検出および／または測定するために使用することができる。一部の実施形態では、ウイルス感染などの疾患または障害を検出するためのアッセイにおける、本発明の１つまたは複数の抗体の使用が企図される。インフルエンザＨＡの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を、本発明の抗インフルエンザＨＡ抗体と接触させることを含み、ここで、抗インフルエンザＨＡ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識するか、または、インフルエンザＨＡを患者試料から選択的に単離するための捕捉用リガンドとして使用する。あるいは、標識されていない抗インフルエンザＨＡ抗体を、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断への適用に使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンなどの蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であってよい。試料中のインフルエンザＨＡを検出または測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明によるインフルエンザＨＡ診断アッセイにおいて使用することができる試料としては、正常な状態または病態の下にある、患者から得られる、インフルエンザＨＡまたはその断片を検出可能な分量で含有する任意の組織または流体試料が挙げられる。一般に、ベースラインまたは標準のインフルエンザＨＡのレベルを最初に確立するために、健康な患者（例えば、インフルエンザに関連する疾患を患っていない患者）から得られる特定の試料中のインフルエンザＨＡのレベルを測定する。次いで、このベースラインのインフルエンザＨＡのレベルを、インフルエンザＨＡに関連する状態、またはそのような状態に付随する症状を有する疑いがある個体から得られる試料で測定されたインフルエンザＨＡのレベルと比較することができる。
インフルエンザＨＡに特異的な抗体は、追加的な標識または部分を含有しなくてもよく、Ｎ末端またはＣ末端の標識または部分を含有してもよい。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（もしあれば）の位置により、ペプチドを結合させる表面に対するペプチドの方向を決定することができる。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合には、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように向き付けられる。
以下の実施例は、当業者に本発明の方法および組成物の実施および使用の仕方についての完全な開示および記載を提供するために提示するものであり、発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気または大気付近の圧力である。
（実施例１）
インフルエンザＨＡに対するヒト抗体の生成
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて、インフルエンザＨＡに対するヒト抗体を生成した。マウスを、インフルエンザワクチン組成物を用いて免疫し、その後、５つの異なる組換え赤血球凝集素タンパク質の、それぞれ１：１の比率での混合物で構成される追加免疫用量を用いて免疫した。追加免疫に含まれる５つの組換え赤血球凝集素タンパク質は、Ｈ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に由来する赤血球凝集素、Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５に由来する赤血球凝集素、Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１に由来する赤血球凝集素、Ｈ７ Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３に由来する赤血球凝集素およびＨ９ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９８８に由来する赤血球凝集素（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３００６）であった。抗体免疫応答をＡ型インフルエンザＨＡ特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が実現されたら、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合してそれらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択してインフルエンザＨＡ特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法および上記の様々な免疫原を使用して、いくつかのキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。このように生成した例示的な抗体を、Ｈ１Ｈ１１８２０Ｎ、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ、Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２、Ｈ２Ｍ１１８３０Ｎ、Ｈ１Ｈ１１８３０Ｎ２、Ｈ１Ｈ１１９０３ＮおよびＨ１Ｈ１４５７１Ｎと名付けた。
抗インフルエンザＨＡ抗体はまた、米国特許第７５８２２９８号に記載の通り、抗原陽性マウスＢ細胞から、骨髄腫細胞との融合を行わずに直接にも単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗インフルエンザＨＡ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。このように生成した例示的な抗体を、Ｈ１Ｈ１１７２３Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７１１Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７１７Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７２４Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７２７Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７３０Ｐ、Ｈ１Ｈ１１７３１Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７３４Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７３６Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７４２Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７４４Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７４５Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７４７Ｐ２、Ｈ１Ｈ１１７４８Ｐ２と名付けた。
この実施例の方法に従って生成した例示的な抗体の生物学的性質を下記の実施例に詳細に記載する。
（実施例２）
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
表１は、本発明の選択された抗インフルエンザＨＡ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。
本明細書では、抗体は、一般に以下の命名法に従って称される：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ１Ｈ」、「Ｈ２Ｍ」など）、その後に数字の識別子（例えば、表１または２に示されている通り、「１１７２３」、「１１８３０」など）、その後に「Ｐ」、「Ｐ２」、「Ｎ」、Ｎ２、または「Ｂ」の接尾辞。したがって、この命名法に従って、本明細書では、抗体を、例えば、「Ｈ１Ｈ１１７２３Ｐ」、「Ｈ２Ｍ１１８３０Ｎ」などと称することができる。本明細書で使用される抗体の名称におけるＨ１ＨおよびＨ２Ｍ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１ Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２ Ｆｃ（ａまたはｂアイソタイプ）を有する（抗体の名称の最初の「Ｈ」によって示される通り、可変領域は全て完全にヒト可変領域である）。当業者には理解される通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体を、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができるが（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）、いずれにしても、表１、２、１２または１３に示されている数字の識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含める）は同じままになり、抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一であるかまたは実質的に類似したものになることが予測される。
比較用抗体
抗インフルエンザＨＡ抗体対照を比較目的で以下の実施例の一部に含めた。アイソタイプを一致させた陰性対照も実施例において使用した。１つの抗インフルエンザＨＡ比較用抗体は、本明細書では「対照Ｉ ｍＡｂ」と称され、ＷＯ２００８／０２８９４６において配列番号６５（ＨＣ）および配列番号９１（ＬＣ）として記載されている重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列および軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を有する抗インフルエンザＨＡ抗体であり、ＣＲ６２６１とも称される。ＷＯ２００８／０２８９４６に示されている通り、このＣＲ６２６１抗体は、それぞれ配列番号１、２および３で示される重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）アミノ酸配列（ＨＣＤＲ１、２および３）と、それぞれ配列番号１３、１４および１５で示される軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）アミノ酸配列（ＬＣＤＲ１、２および３）を有する。
（実施例３）
モノクローナル抗インフルエンザＨＡ抗体のＯｃｔｅｔ結合親和性および動力学定数
選択された精製抗ＨＡモノクローナル抗体へのインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、リアルタイムバイオレイヤー干渉計に基づくバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ）アッセイを使用して決定した。抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）捕捉体（ｃａｐｔｕｒｅ）または抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）捕捉体のいずれかでコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーを使用して、それぞれマウスＦｃ（ＡｂＰＩＤ接頭辞Ｈ１Ｍ、Ｈ２ａＭ、Ｈ２ｂＭ）またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＡｂＰＩＤ接頭辞Ｈ１Ｈ）を伴って発現させた抗ＨＡモノクローナル抗体を捕捉した。全ての結合試験をＨＢＳ−ＥＴ
Ｏｃｔｅｔ速度論緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性物質Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中、２５℃、プレートを１０００ｒｐｍのスピードで振とうさせながら実施した。抗体が捕捉されたＯｃｔｅｔバイオセンサーを、種々の濃度の多様なＨＡ株（３００ｎＭ〜１１．１１ｎＭ）を含有するウェル中に７分間浸漬し、その後、抗体が結合したＨＡタンパク質をＯｃｔｅｔ速度論緩衝液中で１０分にわたって解離させる。バイオセンサーは、異なるステップの間には必ずＯｃｔｅｔ速度論緩衝液で洗浄した。速度論的な会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線あてはめソフトウェアを使用してデータを処理し、１：１結合モデルにあてはめることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を反応速度定数から以下の通り算出した：
様々なグループ１株のＨＡに対する種々の抗ＨＡモノクローナル抗体結合についての結合速度論パラメータを表３に示す。さらに、同じ抗体について、グループ２赤血球凝集素への結合についての結合パラメータを決定したが、グループ２ ＨＡへの結合は認められなかった（データは示していない）。
（実施例４）
ＨＡ Ｏｃｔｅｔ交差競合
種々の抗インフルエンザＨＡモノクローナル抗体のパネル間の結合競合を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイを使用して決定した。実験全体を、２５℃において、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性物質Ｔｗｅｅｎ−２０、および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＨＢＳ−ＥＴ Ｏｃｔｅｔ緩衝液）中、プレートを１０００ｒｐｍのスピードで振とうしながら実施した。２つの抗体が、ＨＡ上のそれらのそれぞれのエピトープへの結合について互いと競合することができるかどうかを評価するために、プレミックスアッセイ形式を採用した。グループ１株のＨＡタンパク質の１つ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して種々の抗ＨＡモノクローナル抗体間の交差競合を試験した。これを実現するために、１００ｎＭのＨＡ試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をまず１μＭ濃度の種々の抗ＨＡモノクローナル抗体（以後ｍＡｂ−２と称する）と少なくとも２時間にわたって予備混合した後に、結合競合アッセイを実行した。抗マウスＦｃポリクローナル抗体（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、＃１８−５０８８；以後ＡＭＣと称する）または抗ヒトＦｃポリクローナル抗体（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、＃１８−５０６０；以後ＡＨＣと称する）のいずれかでコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーをまず、個々の抗ＨＡモノクローナル抗体の２０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェル中に３分間浸して、それぞれマウスＦｃまたはヒトＦｃを伴って発現させた抗ＨＡモノクローナル抗体（以後ｍＡｂ−１と称する）を捕捉した。捕捉ステップ後、Ｏｃｔｅｔバイオセンサー上の占有されていない抗マウスＦｃポリクローナル抗体および抗ヒトＦｃポリクローナル抗体を、異なるＦｃ（ヒトＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａおよびマウスＩｇＧ２ｂ）伴って発現させた無関連のモノクローナル抗体の混合物の１μＭ溶液を含有するウェルに３分間浸すことによって飽和させた。最後に、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを、１００ｎＭのＨＡと１μＭ濃度のｍＡｂ−２を予備混合した試料を含有するウェル中に５分間浸漬した。各サイクルの最後に、結合したＨＡとｍＡｂ−２の予め形成された複合体と一緒に捕捉された抗ＨＡモノクローナル抗体を、２０ｍＭのＨ３ＰＯ４への浸漬（ｄｉｐ）、その後ＨＢＳ−ＥＴ Ｏｃｔｅｔ緩衝液への浸漬を交互に２０秒、３回を使用して再生させた。実験の全てのステップの間にバイオセンサーをＨＢＳ−ＥＴ
Ｏｃｔｅｔ緩衝液で洗浄した。実験の経過全体にわたってリアルタイム結合応答をモニターし、全てのステップの終了時に結合応答を記録した。分析中、占有されていない捕捉表面への抗ＨＡモノクローナル抗体の非特異的な結合に起因して引き起こされる自己間バックグラウンド結合シグナル（ｍＡｂ−１＝ｍＡｂ−２の場合）をカラム全体から差し引き、交差競合表を作成した（表４）。ＨＡとｍＡｂ−２の予め形成された複合体へのｍＡｂ−１結合の応答を比較し、種々の抗ＨＡモノクローナル抗体の競合／非競合挙動を決定した。
表４に示されている通り、左側の欄はＡＨＣ Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを使用して捕捉されるｍＡｂ１抗体を示し、右側の欄はｍＡｂ１抗体と交差競合する抗体（ｍＡｂ２）を示す。
（実施例４）
選択されたグループ１特異的Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素モノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多様なグループ１株にわたってＡ型インフルエンザの強力な中和を示す
細胞生存能力マイクロ中和アッセイ
モノクローナル抗体を、幅広さおよび効力を評価するためにマイクロ中和アッセイで試験した。簡単に述べると、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり細胞６．０×１０３個でプレーティングした。バックグラウンド対照ウェルとしてウイルス希釈物のみを添加した。細胞を５％ＣＯ２、３７℃で４〜５時間インキュベートした。モノクローナル抗体をウイルス希釈物中に４倍の最終濃度で希釈した。抗体を２連で１：３希釈した。ウイルスを氷上で解凍し、適切な所定の濃度まで希釈した。希釈したウイルスを希釈したｍＡｂに添加した。ｍＡｂ−ウイルス混合物をすぐにＭＤＣＫ細胞に移し、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間インキュベートした。ウイルス対照および非感染細胞対照ウェルも含めた。４日目に、プレートを１２００ＲＰＭで３分間遠心分離した。ＣｅｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質１００μＬを使用して細胞を溶解させ、発光（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してＡＴＰ放出を測定した。非感染対照に対してパーセント生存能力を決定した。非線形４ＰＬ回帰を使用して生存能力値を解析して、ＩＣ５０値を決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
ｍＡｂは、様々なＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、およびＨ１６Ｎ３株を含む広範囲のグループ１のＡ型インフルエンザウイルスに対して効力を示した（表５）。ＩＣ５０値は、Ｈ２ａＭ１１８２９Ｎについては１．６８ｎＭから４８ｎＭまでにわたり、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐについては２．４７ｎＭから１２９．５ｎＭまでにわたった。
（実施例５）
選択されたグループ１特異的Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素モノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡ型インフルエンザの強力な中和を示す
例示的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐをｉｎ ｖｉｔｒｏマイクロ中和アッセイのために選択した。簡単に述べると、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をプレーティングし、翌日に８０〜１００％集密度が実現されるように一晩インキュベートした。モノクローナル抗体をウイルス感染培地（ＶＩＭ）中に５０μｇ／ｍＬまで希釈し、３連または４連で１：２希釈した。Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４またはＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９をＶＩＭ中に希釈し、希釈した抗体を添加し、１時間インキュベートした。次いで、試料をＭＤＣＫに移し、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上清５０μＬを新しい９６ウェルプレートに移した。希釈したシチメンチョウまたはウマ赤血球を上清に添加し、室温で３０分または６０分インキュベートした。赤血球凝集力価を、赤血球凝集を完全に阻害した最後の希釈度の逆数として記録した。
例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐは、Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９の強力な中和を示す（表６）。例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９ＰについてのＨ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４の中和に関する平均ＩＣ９０値は平均で６２．５０ｎＭおよび２６．０５ｎＭ（それぞれ）であった。
（実施例６）
Ａ型インフルエンザ特異的モノクローナル抗体を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるインフルエンザ感染細胞の補体依存性細胞傷害
例示的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐをｉｎ ｖｉｔｒｏ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイのために選択した。簡単に述べると、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を２４時間プレーティングした後、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４を、ＭＯＩを３として感染させた。２０〜２５時間インキュベートした後、細胞を収集し、ＣＤＣアッセイ培地に１ｍＬ当たり細胞１×１０６個の濃度で再懸濁させた。希釈した標的細胞（２０μＬ）を３８４ウェルプレートの各ウェルに添加した。モノクローナル抗体をＣＤＣアッセイ培地中に最終的な出発濃度の３倍まで希釈し、次いで、３連または４連で１：２希釈した。ＣＤＣアッセイ培地を、ｍＡｂを受けない各ウェルに添加した。プレートを室温、約５００ｒｐｍで約２分振とうした。正常なヒト血清補体（ＮＨＳＣ）をＣＤＣアッセイ培地中、最終濃度（１５％）の３倍に調製し、２０μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、この時に溶解試薬、緩衝液および基質を室温にした。溶解試薬を、ジギトニンをＣＤＣアッセイ培地中に希釈することによって調製し、この試薬５μＬを最大溶解対照ウェルに添加して最大シグナル対照を確立した。基質と緩衝液を混ぜ合わせ、２０μＬを全ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でシグナルを検出した。パーセント特異的溶解を（（ｍＡｂ＋ＮＨＳＣによる溶解）−（ＮＨＳＣのみによる溶解））／（（ジギトニン最大溶解）−（ＮＨＳＣのみによる溶解））×１００として算出した。８点応答曲線にわたる４パラメータ非線形回帰によって解析を完了した（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ）。データを個々の試験±標準偏差についてプロットし、データを全ての試験±平均の標準誤差の平均として示した。
例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐは、感染細胞の強力な補体媒介性溶解を示す。３つのランダムに選択した試験について表７に示す。例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐについての平均ＥＣ５０値は、それぞれ、平均で４１．８８ｎＭ（±１３．０８ＳＥＭ）、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐについては４３．２５ｎＭ（±３．８３ＳＥＭ）であった。
（実施例７）
選択されたグループ１特異的Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素モノクローナル抗体はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡ型インフルエンザ感染の強力な中和を示す
単回用量予防的マウスモデル
例示的なモノクローナル抗体Ｈ２ａＭ１１８２９Ｎ、Ｈ１Ｈ１１７２９ＰおよびＨ２ａ１４５７１Ｎを、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用したｉｎ ｖｉｖｏ保護試験のために選択した。簡単に述べると、およそ６週齢の雌マウス（およそ１７．５±０．５ｇ）に、−１日目に、１ｍｇ／ｋｇのＨ２ａＭ１１８２９Ｎ、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ、Ｈ２ａ１４５７１Ｎ、またはマウスまたはヒトアイソタイプ（陰性対照）抗体を皮下注射（ＳＣ）した。実験当たり群当たり５匹のマウスを含めた。注射の２４時間後（０日目）に、マウスを、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４を用い、生理食塩水２０μＬ中１０×ＭＬＤ５０（８００プラーク形成単位；ＰＦＵ）を鼻腔内に（ＩＮ）用いて攻撃した。
マウスを毎日計量し、出発時の体重の２０％超が失われたら屠殺した。
例示的な抗体Ｈ２ａＭ１１８２９Ｎ、Ｈ１Ｈ１１７２９ＰおよびＨ２ａ１４５７１Ｎは、１ｍｇ／ｋｇでｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡ型インフルエンザ感染の強力な中和を示す。
用量反応予防的マウスモデル
例示的なモノクローナル抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐを、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した予防的ｉｎ ｖｉｖｏ保護試験のために選択した。簡単に述べると、６週齢の雌マウス（およそ１７．５±０．５ｇ）に、−１日目に、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇもしくは０．０５ｍｇ／ｋｇ、または２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇもしくは０．０５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ抗体をＳＣ注射した。実験当たり群当たり５匹のマウスを含めた。担体タンパク質（無関連のｈＩｇＧ１ ｍＡｂ）を全ての用量のｍＡｂに１ｍｇ／ｍＬで添加した。注射の２４時間後（０日目）に、マウスを、生理食塩水２０μＬ中１０×ＭＬＤ５０（８００プラーク形成単位；ＰＦＵ）のＨ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４または生理食塩水２０μＬ中５×ＭＬＤ５０（５，０００ＰＦＵ）のＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９を鼻腔内に用いて攻撃した。マウスを毎日計量し、出発時の体重の２０％超が失われたら屠殺した。
Ｈ１＿ＰＲ３４を用いて攻撃した場合、例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐは、１ｍｇ／ｋｇでｉｎ ｖｉｖｏにおけるインフルエンザＡ感染の強力な中和を示す。０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇでは、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐにより、それぞれ１００％および４０％の生存が示される（表８、９および１０）。Ｈ１＿ＣＡ０９を用いて攻撃した場合、例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐは、２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇでｉｎ ｖｉｖｏにおけるインフルエンザＡ感染の強力な中和を示し、０．０５ｍｇ／ｋｇで６０％生存が示される（表８、９および１０）。
用量反応治療マウスモデル
例示的なモノクローナル抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９ＰをＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した治療的ｉｎ ｖｉｖｏ保護試験のために選択した。簡単に述べると、６週齢の雌マウス（およそ１７．５±０．５ｇ）を、生理食塩水２０μＬ中１０×ＭＬＤ５０（８００プラーク形成単位；ＰＦＵ）のＨ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４または生理食塩水２０μＬ中５×ＭＬＤ５０（５，０００ＰＦＵ）のＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９を鼻腔内に用いて感染させた。感染後３日目、４日目もしくは５日目（Ｈ１＿ＰＲ３４の場合）、または感染後１日目、２日目もしくは３日目（Ｈ１＿ＣＡ０９の場合）に、別々の群の５匹のマウスに、１５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２またはＨ１Ｈ１１７２９抗体をＩＶ注射した。マウスを毎日計量し、出発時の体重の＞２％超が失われたら屠殺した。
歴史的なＨ１Ｎ１ウイルス株と現代のＨ１Ｎ１ウイルス株のどちらを用いて攻撃した場合でも、例示的な抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２およびＨ１Ｈ１１７２９Ｐはｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡ型インフルエンザ感染の強力な中和を示す（表１１）。
（実施例８）
選択されたグループ１特異的Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素モノクローナル抗体はＨ５免疫原を用いた免疫後に生成される。
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいてＡ型インフルエンザＨＡに対する追加的なヒト抗体を生成した。ナイーブマウスを４群に分けた。群１および２を、三価インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）２０１３−２０１４製剤（ＮＤＣ３３３２−１１０−１０）を用いて免疫した。群３および４は免疫しないままにした。およそ４週間後に、群１および群３に、５０μｇのＨ５ ＤＮＡ（Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５をコードするＶＲＣ９１２３）を筋肉内注射し（Ledgerwoodら、（２０１１年）Lancet Infect. Dis.、１１巻：９１６〜９２４頁；Khuranaら、（２０１３年）J. Infect. Dis.、２０８巻：４１３〜４１７頁；Ledgerwoodら、（２０
１３年）J. Infect. Dis.、２０８巻：４１８〜４２２頁を参照されたい）、群２およ
び群４には、５μｇのＨ５一価インフルエンザワクチン（ＭＩＶ；Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５を含有するＶＲＣ３１０）を筋肉内注射した（Ledgerwoodら、（２０１１年）Lancet Infect. Dis.、１１巻：９１６〜９２４頁、Khuranaら、（２０１３年）J. Infect. Dis.、２０８巻：４１３〜４１７頁；Ledgerwoodら、（２０１３
年）J. Infect. Dis.、２０８巻：４１８〜４２２頁を参照されたい）。およそ４週間
後、４群全てを、５μｇのＨ５一価インフルエンザワクチン（ＭＩＶ；Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５を含有するＶＲＣ３１０）を用いて免疫した。
抗Ａ型インフルエンザＨＡ抗体を、米国特許第７５８２２９８号に記載の通り、Ｔ４ファージフィブリチン（フォールドン（ｆｏｌｄｏｎ））陽性マウスＢ細胞由来のカルボキシ末端三量体形成ドメインを含有する、受容体結合性部位（ＲＢＳ）を突然変異させた、ａｖｉタグを付けたＨ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５および／またはＨ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９から、骨髄腫細胞との融合を行わずに直接単離した。この方法を使用して、いくつかの追加的な完全ヒト抗Ａ型インフルエンザＨＡ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。このように生成した例示的な抗体は、下の表１２（アミノ酸配列識別子）および表１３（核酸配列識別子）に見いだすことができる。試料を、受容体結合性部位（ＲＢＳ）を突然変異させた、フォールドン、ａｖｉタグを付けたＨ５およびＨ１への結合についてＬｕｍｉｎｅｘによって評価した。予測通り、全てではないが、１６の試料がＨ５タンパク質に１５，０００超の蛍光強度（ＭＦＩ）で結合した。しかし、ほとんどの場合に、Ｈ１タンパク質にも結合した試料がＨ５への結合も高かった（すなわち、１５，０００ＭＦＩ超）。２つの群のモノクローナル抗体が観察された；Ｈ１に１５，０００ＭＦＩ超で結合したもの（２０の試料）およびＨ５に５０００ＭＦＩ超で結合したもの（４４の試料）。
（実施例９）
Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐは、マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、比較用抗体（対照Ｉ ｍＡｂ）と比較して優れた薬物動態プロファイルを有する
マウスおよび非ヒト霊長類においてＨ１Ｈ１１７２９Ｐの薬物動態プロファイルを比較用抗体と比較するための試験を行った。本明細書では対照Ｉ ｍＡｂと称される１つの抗インフルエンザＨＡ比較用抗体は、ＷＯ２００８／０２８９４６において配列番号６５（ＨＣ）および配列番号９１（ＬＣ）として記載されている重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列および軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を有する抗インフルエンザＨＡ抗体であり、ＷＯ２００８／０２８９４６ではＣＲ６２６１とも称されている。
マウスＰＫ実験およびＮＨＰ ＰＫ実験のどちらについても、循環薬物レベルを、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用した全体的なヒト抗体分析によって決定した。簡単に述べると、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を９６ウェルプレートにコーティングして血清中の試験ヒト抗体を捕捉し、次いで、プレートに結合した抗体を、西洋ワサビおよびＴＭＢ基質とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を使用して検出した。血清試料は、６用量の段階希釈物、および、それぞれの抗体の標準品の１２用量の段階希釈物であった。血清中の薬物抗体濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成した標準品曲線に基づいて算出した。
Ａ．マウス試験
野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＨ１Ｈ１１７２９Ｐの薬物動態評価を行った。Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐおよび対照Ｉ ｍＡｂを、マウス５匹からなる別々の群にそれぞれ１ｍｇ／ｋｇの用量でＳＣ投与した。抗体を注射する１日前の血液採取（前血液採取）に加えて、注射の６時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、７日後、１１日後、１４日後、２２日後、および３０日後に血液採取した。採取血液から血清画分を分離し、分析を行うまで−８０℃で凍結しておいた。
結果：
表１４に示されている通り、ＷＴマウスにおけるＨ１Ｈ１１７２９Ｐの半減期は１１．１日であり、対照Ｉ ｍＡｂの半減期は５．６７日であり、これにより、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐの性質が比較用抗体と比較して有利であることが実証される。
Ｂ．カニクイザルＮＨＰ
Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐおよび対照Ｉ ｍＡｂの薬物動態クリアランス速度の評価を３〜５歳の雌カニクイザルにおいて行った。サルを、Ａ型インフルエンザ抗体およびＢ型インフルエンザ抗体についてプレスクリーニングし、陰性であることが見いだされた。抗体を３匹の動物において試験し、３ｍｇ／ｋｇ（体積２ｍＬ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｍＬ）の用量で皮下投与した。血液試料を、投薬前、ならびに注射の１時間後、４時間後、８時間後、および１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、１０日後、１４日後、１８日後、２１日後、２４日後、２８日後、３５日後、４２日後、４９日後、５６日後、６３日後、７０日後、８４日後、および９８日後に採取した。血清を全血から分離し、分析するまで−８０℃で凍結しておいた。循環薬物濃度を、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用した全体的なヒト抗体分析によって決定した。血清中の薬物抗体濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成した標準品曲線に基づいて算出した。
結果：
表１５に示されている通り、サルにおけるＨ１Ｈ１１７２９Ｐの半減期は１３．４日であり、対照Ｉ ｍＡｂの半減期は８．０５日であり、これにより、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐの性質が比較用抗体と比較して有利であることが実証される。
（実施例１０）
Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐにより、マウスにおける致死的なインフルエンザウイルス感染が有効に処置される
ヒトにおけるインフルエンザウイルス感染を処置または防止するための改善された標準治療の実質的なまだ対処されていない必要性がある。現在利用可能なのは、２つのクラスの薬物：アダマンタンおよびノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡＩ）のみである。アダマンタン（アマンタジンおよびリマンタジン）は薬物耐性株の急速な出現を伴っていたことから、これらは、もはやインフルエンザの処置に推奨されるものではない。オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））のようなＮＡＩは、インフルエンザの処置および予防のための最先端の薬物であるが、それらの有効性の範囲は限定的である。ＮＡＩについては、抗ウイルス薬を症状が発症してから４８時間以内に投与すれば、治療的状況において発熱および疾病症状の持続時間が約１日短縮されることが示されているが、４８時間後に投与した場合の有効性に関する臨床的証拠はわずかである。
重症インフルエンザの処置におけるＨ１Ｈ１１７２９Ｐのｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を評価するために、以下の目的で実験を行った：
試験１：Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐの単回用量の有効性を、１日２回、５日間もたらされる臨床的な標準治療薬であるオセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））と比較して評価すること。
試験２：オセルタミビルと組み合わせて投与したＨ１Ｈ１１７２９Ｐの有効性を決定すること。
これらの試験に使用した株には、歴史的な［Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）］Ａ型インフルエンザウイルスグループ１分離株が含まれた。全ての実験を６週齢の野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）雌マウスにおいて実施した。マウスを、８００プラーク形成単位（ＰＦＵ）と同等である１０×マウスＬＤ５０（ＭＬＤ５０）のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）を用いて攻撃した。処置モデルでは、感染後（ｐ．ｉ．）０日目に、マウスを、鼻腔内に（ＩＮ）攻撃し、感染後の特定の日（例えば、１日目、２日目、３日目、４日目または５日目）に、固定用量のｍＡｂを静脈内に（ＩＶ）を与えた。オセルタミビルを製造者の説明書に従って再懸濁させ、マウスに１２時間ごとに（すなわち、１日２回；ＢＩＤ）５日間、経口胃管栄養によって投薬し、第１の用量を感染後２日目または３日目に投与した。マウスをｐ．ｉ．１４日目まで毎日計量し、観察し、出発時の体重の２０％が失われたら屠殺した。結果はパーセント生存で報告している。
第１の実験では、感染後４８時間に開始した（すなわち治療的投与）、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐの単回用量（１５ｍｇ／ｋｇ）または１日２回（５日間レジメン）の２５ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇのオセルタミビルのいずれかの有効性を試験して、マウスモデルにおけるこの時点での効果を評価した。５ｍｇ／ｋｇのオセルタミビルを受けたマウスは全て６日目までに死亡し、一方、２５ｍｇ／ｋｇの用量では、生存が４０％まで改善された。対照的に、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐを受けたマウスは全て生存した（図１および表１６）。
次の実験では、感染後７２時間に開始して、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐをオセルタミビルと組み合わせて試験した。２５ｍｇ／ｋｇのオセルタミビルを用いた処置で生存したマウスはおよそ２０％のみであったが、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐの１５ｍｇ／ｋｇおよび７ｍｇ／ｋｇの単回用量では、生存がそれぞれ６０％および３６％であった。処置を組み合わせた場合、相加効果が観察された：７ｍｇ／ｋｇの単回用量のＨ１Ｈ１１７２９Ｐとオセルタミビルのレジメンの組み合わせでは、６０％生存が示され、１５ｍｇ／ｋｇの単回用量のＨ１Ｈ１１７２９Ｐとオセルタミビルのレジメンの組み合わせでは、８７％生存がもたらされた（図２および表１７）。
要約すると、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐは、重症の歴史的なインフルエンザ株に感染したマウスの処置においてロバストな有効性を示し、実際、感染後４８時間におけるオセルタミビルよりも高い有効性を示した。さらに、Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐは、オセルタミビルと組み合わせて投与した場合に相加的な有効性を示した。

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  1. 本明細書に記載の発明。
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