CN112098660B - 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒。所述试剂盒包括：HEK293‑hACE2细胞、PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1、新型冠状病毒中和性抗体阳性标准品、阴性对照抗体样品和流式检测缓冲液。本发明还提供非诊断目的新型冠状病毒中和性抗体的检测方法。本发明以依赖HEK293‑hACE2细胞和荧光素标记的新冠病毒刺突糖蛋白（即PE‑S1）建立的新冠病毒中和性抗体检测方法，可在1‑2h内快速完成血清中新冠病毒中和性抗体的检测，具有特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简单，实验室要求低以及安全性高等特点。

Description

新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及细胞生物学和免疫检验技术领域，具体地说，涉及一种新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2 (2019-nCoV)是2019年新发现的一种病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。新冠病毒疫苗的研发正在如火如荼进行中。2020年8月初，全球已有165种疫苗处于试验阶段，其中26种已进入临床试验阶段，进入三期临床试验阶段的6种疫苗。疫苗的作用原理就是让免疫系统暴露于病毒成分之下，诱导机体的免疫系统产生针对冠状病毒的保护反应。新冠疫苗接种后，首先会引起机体两个方面免疫应答，一是机体产生能识别病毒颗粒并在某些情况下令其失活的抗体分子；二是产生能杀死被感染细胞并促进抗体产生等其他免疫应答的T细胞。迄今为止，大部分研究聚焦于血液中的“保护性抗体”上（即新冠病毒的中和性抗体），大多数疫苗志愿者所产生的此类强效抗体的水平与新冠康复者大致相当，而这些抗体可以让新病毒颗粒失去感染力。因此，疫苗志愿者血清中的中和性抗体的检测无论是在新冠疫苗评估中，还是抗病毒机制研究中都尤为重要。
新冠病毒感染过程是由其表面的刺突糖蛋白（SPIKE蛋白，S蛋白）与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）的相互识别开启的，所以目前几乎所有的新冠病毒疫苗都以S蛋白为靶点，通过表达S蛋白诱导人体免疫系统产生能够结合新冠病毒的保护性抗体，从而实现预防感染的目标。正是由于新冠病毒疫苗的设计都源于这一重要理论，疫苗接种后产生的中和性抗体也都是针对S1蛋白与ACE2结合的，因此有关中和性抗体检测方案的设计也基于该理论。常用的检测方法包括酶联免疫反应（ELISA）和病毒或假病毒感染实验。
尽管酶联免疫反应（ELISA）法操作简单且较为常见，但所用的蛋白都是通过重组表达获得的，受生产工艺的影响，重组表达获得的蛋白与天然状态下的蛋白还是有差异的，在定性检测中和抗体时往往会出现漏检，并且此方法仅是在分子水平的分析，无法全面评估中和抗体的活性。
活病毒感染实验是检测新冠病毒中和抗体的黄金试验标准，但是实验安全级别要求高，实验操作要求高，检测周期长。如果使用的是新冠活病毒，需要在生物安全三级防护实验室里处理，而且非常耗时，通常需要2~4天才能完成。如果使用的是假病毒的中和试验，也必须在生物安全二级实验室操作，实验周期一般也在2~4天。
因此，亟需建立一种快速评估新冠疫苗接种者体内中和性抗体的细胞水平的分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新型冠状病毒中和性抗体检测方法（含非诊断目的）。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：HEK293-hACE2细胞、PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1、新型冠状病毒中和性抗体阳性标准品、阴性对照抗体样品和流式检测缓冲液。
所述HEK293-hACE2细胞的构建方法包括：构建含人源ACE2基因的表达载体，转染HEK293细胞（优选PEI转染法），筛选（通过向培养基中加入嘌呤霉素进行抗性筛选以及亚克隆化）细胞膜表面表达人源ACE2蛋白的HEK293细胞。
优选地，所述HEK293-hACE2细胞的保藏编号为CGMCC NO. 20800。
所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1是通过PE标记的链霉亲和素与生物素化的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1反应而获得。
使用时，所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1的终浓度为0.3ug/ml。
使用时，所述HEK293-hACE2细胞的用量为每个待测样品对应2×105-5×105个细胞。所述新型冠状病毒中和性抗体阳性标准品为抗新型冠状病毒S1蛋白RBD段的人源中和性抗体（Anti-SARS-CoV-2 RBD Neutralizing Antibody, Human IgG1，Acrobiosystems,Cat. No. SAD-S35）。
所述阴性对照抗体样品为人源免疫球蛋白G亚型1 (Human IgG1 (N297A)Isotype Control, Acrobiosystems, Cat. No. DNP-MB273)。
所述流式检测缓冲液为含有0.5-2% BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4。
本发明中，hACE2基因序列参见GenBank Q9BYF1-1，新型冠状病毒刺突糖蛋白S1的氨基酸序列AA Val 16 - Arg 685 (Accession NO. QHD43416.1)。
第二方面，本发明提供非诊断目的的新型冠状病毒中和性抗体检测方法，包括：向反应管中加入2×105-5×105个HEK293-hACE2细胞，加入50ul PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1和50ul稀释后的待测样品，于4℃孵育0.5h；用流式检测缓冲液洗涤3次后，加入200ulPBS重悬细胞，进行流式检测。
前述的方法，所述HEK293-hACE2细胞的用量为每个待测样品对应2×105-5×105个细胞。
前述的方法，所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1的终浓度为0.3ug/ml。
本发明检测原理如下：在HEK293细胞膜表面过表达人源ACE2蛋白，PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1能够与ACE2受体蛋白结合，进而将细胞标记上荧光素PE，而新冠病毒中和性抗体（包含在新冠病毒中和性抗体标准液或待测样品中）通过特异性识别新冠病毒刺突糖蛋白S1可阻断上述二者的结合。阻断效果与新冠病毒保护性抗体的浓度和亲和力呈负相关，即新冠病毒中和抗体浓度越高，中和活性越强，细胞表面的PE荧光信号就越弱。
本发明所用HEK293-hACE2细胞是通过基因工程构建的稳定细胞株，与非洲绿猴肾细胞（VERO E6细胞）这类内源性表达ACE2的天然细胞株相比，HEK293-hACE2细胞膜上的ACE2表达量更高，与新冠病毒刺突糖蛋白S1结合信号更强，检测窗口大，更适合于新冠病毒中和性抗体的检测（图2）。
本发明所用PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1是通过PE标记的链霉亲和素与生物素化的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1反应得到的四聚体，与细胞结合后产生的检测信号比使用单一的新冠病毒刺突糖蛋白S1更强，因此在进行新冠病毒中和性抗体检测中，PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1的用量更少，并且使用PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1进行检测，操作步骤少，检测时间短。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明以依赖HEK293-hACE2细胞和PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1建立的新冠病毒中和性抗体检测方法，可在1-2h内快速完成血清中新冠病毒中和性抗体的检测，具有特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简单，实验室要求低以及安全性高等特点。
本发明提供的快速评估新冠疫苗接种者体内中和性抗体的细胞水平的分析方法，是对现有新冠病毒中和性抗体检测技术的有益补充，一方面可弥补酶联免疫反应（ELISA）分子水平检测方法的不足，另一方面克服活病毒感染实验的安全级别要求高，实验操作要求高，检测周期长等缺点。为快速准确地评估新冠病毒疫苗的功能活性具有重要意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中抗人ACE2抗体鉴定亚克隆细胞株。
图2为本发明较佳实施例中新冠病毒刺突糖蛋白鉴定亚克隆细胞株。
图3为本发明较佳实施例中PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1结合活性验证。
图4为本发明较佳实施例中PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1结合活性对比。
图5为本发明较佳实施例中新冠病毒中和性抗体的检测条件优化。
图6为本发明较佳实施例中新冠病毒中和抗体检测标准曲线。
具体实施方式
本发明提供的新冠病毒的中和性抗体的检测方法中使用的主要生物材料及试剂包括：PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1、HEK293-hACE2细胞、新冠病毒中和性抗体标准品、阴性对照抗体样品、流式检测缓冲液和PBS缓冲液。
本发明提供了新冠病毒的保护性抗体的检测方法，包括：提前复苏HEK293-hACE2细胞，培养并调整细胞状态，备用；胰酶消化后收集细胞，进行细胞计数，重悬细胞后并分装于1.5ml离心管内或96孔U型板孔内；每管分别加入新冠病毒中和性抗体标准液或待测样品各50μL，以及50μL PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1的工作液，4℃孵育0.5小时；离心弃上清液，流式检测缓冲液洗涤3次；加入PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测平均荧光强度值（激发光波长为488nm或561nm）；使用流式分析软件对检测数据进行分析，绘制检测曲线。
进一步地，本发明通过构建含人源ACE2基因的表达载体（PB-hACE2表达载体），在转染试剂PEI辅助下转染HEK293细胞，并向培养基中加入嘌呤霉素进行抗性筛选和亚克隆化，最终获得细胞膜表面高表达人源ACE2蛋白的HEK293细胞（HEK293-hACE2）。
进一步地，制备灵敏度高、检测信号强的PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1：该蛋白本质上是一个PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1的四聚体，是首先通过Avitag单点酶标标记技术结合HEK293真核表达系统获得生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1，再与PE标记的链霉亲和素按4:1的摩尔比混合获得的。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 HEK293-hACE2细胞的制备与鉴定
一、实验材料
1. 主要试剂：
HEK293细胞 (Thermofisher, Cat. No. A14528 )；嘌呤霉素 (生工生物工程(上海)股份有限公司, Cat. No. PJ593-25mg)；胎牛血清FBS (CellMax, Cat. No.SA212.02)；DMEM培养基 (Hyclone, Cat. No. SH30022.01)；0.25%胰酶（0.25%Trypsin-EDTA，Gibco, Cat. No. 25200-056)；线性的聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, Linear,Polysciences，Cat. No. 23966）；PB-hACE2表达载体（由Acrobiosystems分子构建部门提供）；台盼蓝染色液（Trypan Blue Solution, 0.4%，Thermofisher, Cat. No. 15250061）；新冠病毒刺突糖蛋白S1（SARS-CoV-2 (COVID-19) S1 protein, Mouse IgG2a Fc Tag ，Acrobiosystems, Cat. No. S1N-C5257)；阴性对照蛋白（人表皮生长因子受体2蛋白HumanHer2 Protein, Mouse IgG2a Fc Tag，Acrobiosystems, Cat. No. HE2-H5255）；PE标记的抗小鼠IgG2a抗体（PE anti-mouse IgG2a antibody，Biolegend, Cat. No. 407108)；抗人源ACE2的兔多克隆抗体（Anti-ACE2 rabbit polyclonal antibody，Abcam，Cat. No.ab189168)；兔源同型对照抗体（Rabbit IgG, polyclonal-Isotype Control ，Abcam，Cat.No. ab171870)；PE标记山羊抗兔IgG抗体（Goat anti-Rabbit IgG(H+L)-PE，北京四正柏生物科技有限公司, Cat. No. SPP102-100U）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA,Sigma-Aldrich, Cat. No. SRE0098-100G）；磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，Hyclone, Cat.No. SH30256.01)。
2. 主要耗材与仪器：
6孔细胞培养板（TrueLine, Cat. No. TR5003）；15ml无菌离心管（TrueLine,Cat. No. TR2010）；细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 150466）；二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific, Thermo 3111）；LUNA II全自动计数仪（LUNA,Luna Ⅱ）；超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，DL-CJ-2ND）；湘仪低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司, L-550）；倒置显微镜（OLYMPUS, CKX53）；流式细胞仪（BDFACSCelesta™ flow cytometer）。
3. 溶液配制：
PEI工作液：将50mg的PEI（Polysciences，Cat. No. 23966）粉末溶于45mL ddH2O中，用HCL调pH<2.0，搅拌至PEI全溶，用NaOH调pH至7.0，加入ddH2O定容至体积50mL，0.22um过滤器过滤除菌，分装成每管1.0mL，-80℃冻存备用。
流式检测缓冲液：称取2g BSA蛋白，加入80ml磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液），搅拌完全溶解后补加PBS缓冲液定容至100ml，0.22um过滤器过滤除菌，备用。其中，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH7.4。
二、HEK293细胞转染
转染实验前一天，用含10% FBS的DMEM完全培养基将HEK293细胞以1.0×106细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养基体积为3ml/孔，37℃培养过夜；转染当日，配制转染复合物，将PEI与PB-hACE2表达载体按质量比为3:1混合后室温静置15min；弃去旧培养基，用PBS清洗细胞2次，换入2.7mL预热的无血清DMEM培养基，用移液枪吸取300ul转染复合物，逐滴均匀加入至细胞培养液中，轻轻摇动6孔板混匀(DNA用量为0.6ug/mL)；将转染后的细胞置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育；孵育4h后，更换为含10% FBS的DMEM完全培养基，继续孵育20h左右；加入含有嘌呤霉素（嘌呤霉素设置3个浓度梯度，分别为20ug/mL, 40ug/mL和60ug/mL）和10% FBS的DMEM筛选培养基，替换掉旧培养基，培养2-3天后观察细胞生长状态；在嘌呤霉素筛选条件下，当孔内存活的细胞继续生长至孔内覆盖面积达到80-90%时传代培养扩增，取一部分细胞冻存保种，另取一部分细胞并进行亚克隆化。
三、细胞株亚克隆化
胰酶消化并收集药筛获得的细胞，进行细胞计数后，取100个细胞重悬于10ml含有20ug/ml嘌呤霉素和10% FBS DMEM筛选培养基内，混匀后接种96孔细胞培养板内，置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养；7天后，显微镜观察每孔单克隆细胞生长情况，待细胞长满至孔内面积80-90%时，选取10个孔内只有单克隆的细胞团，转移至6孔板内培养，进行流式检测。
四、流式鉴定
ACE2抗体鉴定：胰酶消化并收集亚克隆化的细胞株，进行细胞计数后，分装于1.5ml离心管内，2×105细胞/管；用流式检测缓冲液将Anti-ACE2 rabbit polyclonalantibody按厂家说明书推荐的1:10比例稀释，取100ul抗体稀释液加入待测细胞管内，吹打混匀，于4℃孵育0.5h；用流式检测缓冲液洗涤细胞1次，加入Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，PE（1:100稀释），每管（孔）100ul，于4℃避光孵育0.5h；洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管内，进行流式检测；保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCS Express 6 Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析。HEK293细胞作为阴性对照细胞，与上述亚克隆细胞株同步处理。
新冠病毒刺突糖蛋白结合鉴定：胰酶消化并收集亚克隆化的细胞，进行细胞计数后，分装于1.5ml离心管内，2×105细胞/管；用流式检测缓冲液将SARS-CoV-2 (COVID-19)S1 protein, Mouse IgG2a Fc Tag和阴性对照蛋白稀释至10ug/ml，取100ul稀释液加入待测细胞管内，吹打混匀，于4℃孵育0.5h；用流式检测缓冲液洗涤细胞1次，加入PE anti-mouse IgG2a antibody (1:100稀释)，每管（孔）100ul，于4℃避光孵育0.5h；洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管内，进行流式检测；保存FCS格式文件拷贝装备DeNovo Software-FCS Express 6 Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析。未转染质粒的HEK293细胞作为此实验中的阴性对照细胞株。非洲绿猴肾细胞（VeroE6）内源性表达ACE2，并且被作为新冠病毒感染实验的首选细胞株，因此在本实施例中作为对照组细胞，与亚克隆化的细胞株同样进行上述处理。HEK293细胞作为阴性对照细胞，与上述亚克隆细胞株同步处理。
五、实验结果
共获得4株膜表达hACE2的亚克隆细胞株，克隆号分别是HEK293-hACE2-1、HEK293-hACE2-2、HEK293-hACE2-9和HEK293-hACE2-10。这4株亚克隆细胞株在ACE2抗体检测和新冠病毒刺突糖蛋白检测实验中阳性率均达到99%，且与新冠病毒刺突糖蛋白S1结合信号均较Vero E6细胞强（表1，图1和图2）。其中HEK293-hACE2-9克隆与新冠病毒刺突糖蛋白S1结合信号最强，被确定为本发明中方法建立所用的细胞株，命名为HEK293-hACE2，其为人胚胎肾细胞HEK293，HEK293-hACE2现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO. 20800，保藏日期2020年10月13日。
Figure 954615DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1制备与鉴定
一、实验材料
1. 主要试剂：
生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1（Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) S1protein, His,Avitag™ (MALS verified)，Acrobiosystems, Cat. No. S1N-C82E8）；PE标记的链霉亲和素（PE-Streptavidin，Jackson，Cat. No. 016-110-084)；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma-Aldrich, Cat. No. SRE0098-100G）；D-(+)-海藻糖二水合物（Sigma-Aldrich, Cat. No. T9531-10G）；磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，Hyclone,Cat. No. SH30256.01)。
2. 主要耗材与仪器：
细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 150466）；15ml无菌离心管（TrueLine, Cat.No. TR2010）；50ml无菌离心管（TrueLine, Cat.No. TR2012）；移液器（瑞宁RAININ）；西林瓶（肖特新康药品包装有限公司，中硼260）；冻干机（Telstar, lyobeta5PS）；旋涡混匀器（江苏康健医疗用品有限公司，XH-B型）；超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司, Cat. No. DL-CJ-2ND）。二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific,Thermo 3111）；LUNA II全自动计数仪（LUNA, Luna Ⅱ）；湘仪低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司, L-550）；倒置显微镜（OLYMPUS, CKX53）；流式细胞仪（BD FACSCelesta™ flowcytometer）。
3. 试剂配制：
5% BSA-PBS母液：称取5g牛血清白蛋白(BSA)，加入80ml磷酸盐缓冲液，搅拌完全溶解后补加PBS缓冲液定容至100ml，0.22um过滤器过滤除菌，备用。其中，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH7.4。
30% Trehalose母液：称取33.15g D-(+)-海藻糖二水合物，加入80ml ddH2O，加热搅拌完全溶解后补加ddH2O定容至100ml，温度降至室温经0.22um过滤器过滤除菌，备用。
二、PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1的制备
配制生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1（Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19)S1 protein, His, Avi tag）蛋白溶液，向蛋白溶液中缓慢滴加相应体积的PE-Streptavidin溶液、相应体积的5% BSA-PBS母液和30% Trehalose-PBS母液，轻轻混匀，再补加PBS缓冲液，至使生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1的终浓度为9ug/ml, BSA终浓度为0.5%，Trehalose的终浓度为10%。生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1与PE-Streptavidin的最终摩尔比为4:1；混合静置于37℃充分反应30min，获得SARS-CoV-2 (COVID-19) S1protein-PE四聚体偶联物，即PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1；分装于西林瓶内，50ul/瓶，放置冻干机内冻干成干粉状态，压盖贴标签后-80℃冰箱保存备用。
三、流式鉴定
胰酶消化并收集实施例1制备的HEK293-hACE2细胞，进行细胞计数后，分装于1.5ml离心管内，2×105细胞/管，备用。
使用PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1：用流式检测缓冲液将PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1稀释一系列浓度梯度：0.01ug/ml, 0.03ug/ml, 0.1ug/ml, 0.3ug/ml 1ug/ml和3ug/ml，吸取100ul稀释后样品加入待测细胞管内，吹打混匀，于4℃孵育0.5h；用流式检测缓冲液洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管内，进行流式检测。
使用生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1：用流式检测缓冲液将生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1稀释同样的浓度梯度：0.01ug/ml, 0.03ug/ml, 0.1ug/ml, 0.3ug/ml1ug/ml和3ug/ml，吸取100ul稀释后样品加入待测细胞管内，吹打混匀，于4℃孵育0.5h；洗涤3次后，加入100ul流式检测缓冲液稀释的PE标记的链霉亲和素(按厂家说明书推荐的1:200比例稀释)；用流式检测缓冲液洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管内，进行流式检测。
保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCS Express 6 Flow ResearchEdition 流式分析软件的电脑上，进行数据分析。
四、实验结果
流式检测结果表明通过上述方法制备的PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1能够与HEK293-hACE2细胞结合，且成浓度依赖性；而与野生型HEK293细胞未检测到结合，这说明PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1是特异性性识别HEK293-hACE2细胞膜表面的ACE2蛋白（表2和图3）。
流式检测结果显示，与常规方法(先加入生物素化的新冠病毒刺突糖蛋白S1，洗涤后加入PE标记的链霉亲和素)相比，相同的蛋白使用浓度，使用PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1的检测信号更强（表2和图4）。
根据上述流式检测结果，在建立新冠病毒的中和性抗体的流式检测方法过程中，初步确定使用1ug/ml，0.3ug/ml和0.1ug/ml PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1进行方法优化。
Figure 576352DEST_PATH_IMAGE002
实施例3 新冠病毒的中和性抗体的流式检测方法建立
一、实验材料
PE标记的新冠病毒刺突糖蛋白S1；HEK293-hACE2细胞；新冠病毒中和性抗体标准品，即Anti-SARS-CoV-2 RBD Neutralizing Antibody, Human IgG1（Acrobiosystems,Cat. No. SAD-S35）；阴性对照抗体样品，即Human IgG1 (N297A) Isotype Control(Acrobiosystems, Cat. No. DNP-MB273)；正常人血清（Abbkine, Cat. No. BMS0060）；流式检测缓冲液；PBS缓冲液。
超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司, Cat. No. DL-CJ-2ND）。二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific, Thermo 3111）；LUNA II全自动计数仪（LUNA, LunaⅡ）；湘仪低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司, L-550）；倒置显微镜（OLYMPUS, CKX53）；流式细胞仪（BD FACSCelesta™ flow cytometer）。
二、新冠病毒中和性抗体的流式检测方法的建立
收集HEK293-hACE2细胞，进行细胞计数后，分装于1.5ml离心管内或96孔U型孔板内，2×105细胞/管；用流式检测缓冲液分别将PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1稀释至1ug/ml, 0.3ug/ml和0.1ug/ml；用流式检测缓冲液将新冠病毒中和性抗体标准品和阴性对照抗体均稀释8个浓度梯度：0ug/ml, 0.156ug/ml, 0.312ug/ml, 0.625ug/ml,1.25ug/ml,2.5ug/ml, 5ug/ml和10ug/ml。上述抗体稀释液和PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1稀释稀释液各吸取50ul，混匀加入含有细胞的离心管内或孔内，于4℃孵育0.5h；洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，进行流式检测；保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCSExpress 6 Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析；GraphPadPrism5 绘制4参数拟合曲线。
实验结果见表3，本实施例中阴性对照抗体组均不能阻断结合信号，检测结果均为阴性；而新冠病毒中和性抗体标准品均检测到阻断信号。
本实施例优化了PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1使用浓度，绘制平均荧光强度(MFI)与抗体浓度的拟合曲线，如图5所示。从拟合曲线的拟合优度R2和检测灵敏度IC50角度评估，将PE标记的冠病毒刺突糖蛋白S1的最终使用浓度确定为0.3ug/ml，进行该方法的后续验证实验。新冠病毒中和抗体检测的拟合曲线图见图6，曲线的四参数拟合方程如下：
y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D
式中，曲线上渐近线估值A=41.31，曲线的斜率B=-3.32，最大结合一半时对应的剂量C=0.5953，曲线下渐近线估值D=2887，R2=0.999。
Figure 182913DEST_PATH_IMAGE003
三、检测方法的专属性验证
在稀释样品的流式检测缓冲液中添加不同量的正常人血清配制含有不同比例人血清基质的稀释液，分别用这些稀释液去配制新冠病毒中和性抗体标准品和阴性对照抗体样品的检测样品，检测样本中人血清最终比例梯度分别为0, 10%, 20%和50%。然后再按照上述建立的方法进行流式检测操作，验证不同基质对检测结果的干扰。可接受标准为：与对照组（流式检测缓冲液组）的检测数据进行比较，IC50值的RSD值≤20.0%。
不同基质的检测结果见表4，将含有10%、20%和50%人血清实验数据分别与不添加人血清的实验组数据进行比较，计算IC50之间的RSD值，均≤20.0%，证明该检测方法不受人血清成分感染，专属性强，可用于人血清样本检测。
Figure 769753DEST_PATH_IMAGE004
四、检测方法精密度验证
1. 重复性和中间精密度
由一名操作人员同时独立配制3份新冠病毒中和抗体标准液的检测样品，每份8个浓度梯度，进行检测；另一名操作人员完全重复该检测实验；两名操作人员的检测实验在不同日期完成，并且使用的是不同代次的HEK293-hACE2细胞，共获得6组检测数据。对检测数据进行统计分析，可接受标准为：6组检测数据的IC50值的RSD值均≤20.0%。
检测结果见表5，检测数据Date-1, Date-2, Date-3为一名操作人员在同一天从3组独立实验中获得的3组检测数据，检测实验所用的HEK293-hACE2细胞为相同代次；Date-4, Date-5, Date-6为另一名操作人员在另一天完成的3分独立的检测数据，此3组数据所用HEK293-hACE2细胞为相同代次，但是与Date-1, Date-2, Date-3所用细胞为不同代次。由该6组数据计算IC50值的RSD值为11%，小于20.0%，证明该检测方法有重复性和中间精密度良好。
Figure 209568DEST_PATH_IMAGE005
2. 重现性
重现性验证设计：分别由北京百普赛斯生物科技有限公司不同部门（细胞分析研发部门和产品质量控制部门）的2名操作人员同时独立进行检测实验。计算2名操作人员实验数据之间的精密度。可接受标准：2组检测数据的IC50值的RSD值均≤20.0%。
检测结果见表6，由2组检测数据计算所得IC50的RSD值6%，小于20.0%，证明该检测方法可以重现。
Figure 540055DEST_PATH_IMAGE006
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：HEK293-hACE2细胞、PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1、新型冠状病毒中和性抗体阳性标准品、阴性对照抗体样品和流式检测缓冲液；
所述HEK293-hACE2细胞的构建方法包括：构建含人源ACE2基因的表达载体，转染HEK293细胞，筛选细胞膜表面表达人源ACE2蛋白的HEK293细胞；所述HEK293-hACE2细胞的保藏编号为CGMCC NO. 20800。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，使用时，所述HEK293-hACE2细胞的用量为每个待测样品对应2×105-5×105个细胞。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1是通过PE标记的链霉亲和素与生物素化的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1反应而获得。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，使用时，所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1的终浓度为0.3ug/ml。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒中和性抗体阳性标准品为抗新型冠状病毒S1蛋白RBD段的人源中和性抗体。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照抗体样品为Human IgG1N297A Isotype Control。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述流式检测缓冲液为含有0.5-2% BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4。
8.非诊断目的的新型冠状病毒中和性抗体检测方法，其特征在于，包括：向反应管中加入2×105-5×105个HEK293-hACE2细胞，加入50ul PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1和50ul稀释后的待测样品，于4℃孵育0.5h；用流式检测缓冲液洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，进行流式检测；
其中，所述HEK293-hACE2细胞、所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1来自权利要求1-7中任一项所述的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述HEK293-hACE2细胞的用量为每个待测样品对应2×105-5×105个细胞；和/或
所述PE标记的新型冠状病毒刺突糖蛋白S1的终浓度为0.3ug/ml。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021254476A1 (zh) * 2020-06-19 2021-12-23 南京金斯瑞生物科技有限公司 检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的磁微粒化学发光试剂盒及其应用
CN112255420B (zh) * 2020-12-23 2021-03-05 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 利用bli技术检测新型冠状病毒中和性抗体的方法
CN113215307A (zh) * 2020-12-23 2021-08-06 中科基因生物科技(江苏)有限公司 新型冠状病毒检测试剂
CN112946261A (zh) * 2021-01-14 2021-06-11 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院) 一种基于三聚体s蛋白rbd-ace2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒
CN113774108A (zh) * 2021-07-27 2021-12-10 罗义 一种通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法
CN113721032B (zh) * 2021-09-02 2024-03-19 山东莱博生物科技有限公司 一种新型冠状病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用
CN114231497B (zh) * 2022-02-24 2022-05-20 广州伯尼兹生物科技有限公司 一株表达SARS-CoV-2 S1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及中和活性抗体

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111166768A (zh) * 2020-03-03 2020-05-19 南通大学 过表达ace2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用及其制备方法
CN111273016A (zh) * 2020-02-26 2020-06-12 浙江诺迦生物科技有限公司 一种基于s蛋白配体与ace2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒
CN111285933A (zh) * 2020-03-09 2020-06-16 四川省人民医院 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
CN111426824A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 广东药科大学附属第一医院 一种胶体金试纸及其制备方法和应用
CN111454372A (zh) * 2020-05-08 2020-07-28 温州启星生物技术有限公司 分泌超级il15的nkg2d-ace2 car-nk细胞的构建及其应用
CN111505286A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111518772A (zh) * 2020-04-21 2020-08-11 厦门诺康得生物科技有限公司 一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用
CN111518773A (zh) * 2020-05-09 2020-08-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用
CN111549064A (zh) * 2020-04-01 2020-08-18 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 应用腺病毒转导制备能够表达人源ace2转基因非人动物的方法，及所得动物的应用
US10787501B1 (en) * 2020-04-02 2020-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN111781354A (zh) * 2020-09-04 2020-10-16 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111273016A (zh) * 2020-02-26 2020-06-12 浙江诺迦生物科技有限公司 一种基于s蛋白配体与ace2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒
CN111166768A (zh) * 2020-03-03 2020-05-19 南通大学 过表达ace2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用及其制备方法
CN111285933A (zh) * 2020-03-09 2020-06-16 四川省人民医院 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
CN111426824A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 广东药科大学附属第一医院 一种胶体金试纸及其制备方法和应用
CN111549064A (zh) * 2020-04-01 2020-08-18 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 应用腺病毒转导制备能够表达人源ace2转基因非人动物的方法，及所得动物的应用
US10787501B1 (en) * 2020-04-02 2020-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN111518772A (zh) * 2020-04-21 2020-08-11 厦门诺康得生物科技有限公司 一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用
CN111505286A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111454372A (zh) * 2020-05-08 2020-07-28 温州启星生物技术有限公司 分泌超级il15的nkg2d-ace2 car-nk细胞的构建及其应用
CN111518773A (zh) * 2020-05-09 2020-08-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用
CN111781354A (zh) * 2020-09-04 2020-10-16 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
10 种新型冠状病毒抗体检测试剂盒效果评价;刘威 等;《国际药学研究杂志》;20200930;第47卷(第9期);第716-721页 *
Establishment and validation of a drug-target microarray for SARS-CoV-2;Peng Chen 等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20200721;第530卷;第4-9页 *
Virus-Receptor Interactions of Glycosylated SARS-CoV-2 Spike and Human ACE2 Receptor;Peng Zhao 等;《Cell Host & Microbe》;20201007;第28卷;第586-601页 *

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