CN113774108A - 一种通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，首先以新冠病毒S蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备新冠病毒蛋白选择性吸附材料，用于富集环境中新冠病毒，对富集的新冠病毒进行分离培养、菌株鉴定确定新冠病毒的种类。本发明中选择性吸附S蛋白的MIP材料对新冠病毒S蛋白具有较高的吸附能力，吸附量达65‑120mg/g材料，可用于空气和水体等环境中新冠病毒的选择性吸附。选择性吸附核蛋白的MIP材料对新冠病毒S蛋白具有较快的吸附速率，一级动力学速率常数达0.00012‑0.0002mg/s，因此能在短时间吸附足够的新冠病毒用于后续的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种选择性吸附刺突糖蛋白(S蛋白)的功能材料的制备及其用于环境中具备侵染能力的活新冠病毒的检测方法；该功能材料利用分子印迹选择性识别模板的特性制备，能够通过选择性吸附环境中的新冠病毒S蛋白富集环境中具备侵染能力的活新冠病毒，对富集的新冠病毒进行分离培养，即可检测环境中侵染性新冠病毒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球的蔓延已经波及绝大多数国家和地区，感染人数达数千万，为公共健康和人类发展带来巨大灾难。除在人群中感染，在环境样品中检出新冠病毒的情况逐渐增加，环境中新冠病毒再次感染人群的案例也越来越多，已经成为新冠病毒传播的一种新的形式。因此，开展环境中新冠病毒的检测至关重要。
环境中新冠病毒一般具有浓度低、活性弱等特征，传统的核酸检测的方法很难有效检测，常出现假阴性，即便能够从核酸层面检出，也不一定是具有侵染能力的活体病毒。依靠抗原与抗体特异性结合的酶联免疫检测法能有效检测具有侵染能力的活体病毒，但该方法准确率受限，常出现假阳性，不适用于复杂的环境样本中新冠病毒的检测。病毒分离培养的方法能够也有效识别具备活性的新冠病毒，但该方法很难直接分离出环境中低浓度的新冠病毒。开发一种识别能力强、灵敏度高，适用于环境中新冠病毒检测的方法有着重要意义。
专利“一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法(CN202011210318.4)”公开了一种新冠病毒核酸检测试剂盒及检测方法，采用一步法逆转录PCR结合Taqman探针法，定性检测新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因特异性区域，以及一个非人源内标基因(SUC2基因)。如前所述，该方法很难检测出环境中低浓度的新冠病毒。专利“用于新冠病毒S蛋白快速检测的放免试剂盒及其制备方法(CN202110123203.X)”公开了一种新冠病毒S蛋白快速检测的放免试剂盒及其制备方法，该方法利用抗原-抗体特异性结合的原理制备，S蛋白具有一个受体结合域，能够与人类细胞中的血管紧张素I转换酶2(ACE2)受体相互作用，为本发明中选取新冠病毒S蛋白作为标记物提供了参考。
发明内容
本发明的目的在于制备一种选择性吸附刺突糖蛋白(S蛋白)的功能材料，并利用其检测环境中具备侵染能力的活新冠病毒。该材料对新冠病毒外层的S蛋白具有较高的吸附能力和特异性，能够有效富集环境中的新冠病毒，实现对环境中低浓度具备侵染能力的活体新冠病毒的特异性检测。本发明的技术方案为：首先以新冠病毒S蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备新冠病毒蛋白选择性吸附材料，用于富集环境中新冠病毒，对富集的新冠病毒进行分离培养、菌株鉴定确定新冠病毒的种类。
具体方案如下：
1)将包裹二氧化硅的纳米四氧化三铁磁珠(nFe3O4，粒径为10-50nm)溶于去离子水，超声分散为稳定悬浊液，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺盐酸盐(EDAC)振荡后用磁铁分离并清洗nFe3O4；nFe3O4和NHS的质量比在(4～10):1，nFe3O4和EDAC的质量比在(4～15):1；
2)将步骤1)中的nFe3O4溶于含市售新冠病毒S蛋白的缓冲溶液，2～8℃下充分振荡，加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，充分振荡后用磁铁分离，去离子水清洗得到负载S蛋白的nFe3O4；nFe3O4和新冠病毒S蛋白的质量比在(20～80):1；nFe3O4和Tris的质量比为(0.1～0.5):1；
3)将步骤2)中负载S蛋白的nFe3O4在PIPES溶液中重悬后，加入丙烯酰胺(AAM)、N,N’-dimethyl acrylamide(DMAA)和过硫酸盐，振荡3-6小时后通过磁铁分离，去离子水清洗得到负载未洗脱印迹的nFe3O4；nFe3O4和AAM的质量比在(0.5～2):1；nFe3O4和DMAA的质量比在(0.25～1):1；nFe3O4和过硫酸盐的质量比在(2～8):1。
4)将步骤3)中的负载未洗脱印迹的nFe3O4加入碱性次氯酸盐溶液振荡2-6h后充分清洗，干燥后得到新冠病毒蛋白印迹材料MIP；
5)将步骤4)中制备的MIP浸入待检测的环境样本中搅拌10-30min后用磁铁将MIP分离；随后将吸附了新冠病毒的MIP加入至细胞生长液，置37℃培养箱培养，获得新冠病毒侵染的阳性细胞；将细胞分离物提取核酸后，通过逆转录PCR的方法鉴定；另外对新冠病毒通过梯度培养的方法，4天初步观察CPE，7天判定结果，按Reed-Muench的方法测定病毒株效价；加入至环境样本中的MIP的浓度为10-100mg/L。
优选步骤1)：上述1)步骤中nFe3O4悬浊液的浓度优化为5-20mg/mL；
优选步骤2)：上述2)步骤中新冠病毒S蛋白浓度优化为200-300mg/L；缓冲溶液包括但不限于PIPES缓冲溶液或PBS缓冲溶液，浓度为0.01-1mol/L；过硫酸盐优化为过硫酸钠、过硫酸钾或过硫酸铵；
优选步骤3)：上述4)步骤中碱性次氯酸盐优化为碱性次氯酸钠或碱性次氯酸钾，浓度优化为0.5～2mol/L，pH优化为12-14；
优选步骤4)：上述5)步骤中环境样本优化为水、土壤或空气样本，其中土壤或空气样本需首先将样本浸入水中使新冠病毒转移到水相后测定。
本发明有益效果是：
本发明中选择性吸附S蛋白的MIP材料对新冠病毒S蛋白具有较高的吸附能力，吸附量达65-120mg/g材料，可用于空气和水体等环境中新冠病毒的选择性吸附。
本发明中选择性吸附核蛋白的MIP材料对新冠病毒S蛋白具有较快的吸附速率，一级动力学速率常数达0.00012-0.0002mg/s，因此能在短时间吸附足够的新冠病毒用于后续的检测。
附图说明
图1实施例1制备材料的透射电镜图，说明实施例1中制备的MIP产品的尺寸约为20nm；
图2实施例1制备材料的红外光谱图，说明实施例1制备的MIP产品官能团含有SI-O(1093CM-1)和C＝O(1690cm-1),说明产品被成功制备；
图3实施例1制备材料对新冠病毒S蛋白的吸附等温线拟合图，说明实施例1制备的MIP产品对S蛋白的吸附遵循Langmuir吸附等温模型，且产品对新冠病毒S蛋白的饱和吸附量为120mg/g材料；
图4实施例1制备材料对新冠病毒S蛋白的吸附一级动力学方程拟合图，说明实施例1制备的MIP产品对S蛋白的吸附遵循一级动力学模型，该产品对新冠病毒S蛋白的吸附速率为0.002mg/s。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：
1)取200mg市售nFe3O4(直径为20nm)置于50mL离心管加入20mL去离子水超声分散10min，加入5mL含NHS(34mg)和EDAC(26mg)的混合溶液，室温下振荡45min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
2)上一步处理得到的nFe3O4加入20mL含6mg新冠病毒S蛋白的PIPES缓冲溶液(缓冲溶液浓度为0.1mol/L)，4℃下振荡4h；随后加入10mL Tris溶液(含2g Tris)，室温下振荡30min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
3)将上一步得到的产物中在20mLPIPES溶液中重悬，加入200mgAAM、400mg DMAA振荡使其充分溶解。然后加入40mg过硫酸铵，室温下振荡4h。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
4)上一步的产物加入5mL 1moL/L的碱性次氯酸钠溶液(pH＝14)，室温下振荡6h。振荡后溶液离心后弃上清液，用2mL去离子水用磁铁分离后清洗3次。随后将产物置于烘箱干燥，得到新冠病毒S蛋白印迹产品MIP。
5)将步骤4)中制备的MIP取100mg浸入待检测的1L污水样本中搅拌30min后用磁铁将MIP分离；随后将吸附了新冠病毒的MIP加入至细胞生长液，置37℃培养箱培养，获得新冠病毒侵染的阳性细胞；将细胞分离物提取核酸后，通过逆转录PCR的方法鉴定；另外对新冠病毒通过梯度培养的方法，4天初步观察CPE，7天判定结果，按Reed-Muench的方法测定病毒株效价。
该实施例中MIP产品的尺寸约为20nm，丙烯酰胺的质量占比为25％；产品(MIP)对新冠病毒S蛋白的饱和吸附量为120mg/g材料；该产品对新冠病毒S蛋白的吸附速率为0.0002mg/s。该方法成功分离出新冠病毒，而直接用分离培养方法未分理出新冠病毒。
实施例2：
1)取150mg市售nFe3O4(直径为10nm)置于50mL离心管加入7.5mL去离子水超声分散，加入5mL含NHS(37.5mg)和EDAC(37.5mg)的混合溶液，室温下振荡45min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
2)上一步的产物加入37.5mL含7.5mg新冠病毒N蛋白的PBS缓冲溶液(缓冲溶液浓度为1mol/L)，6℃下振荡4h；随后加入10mL Tris溶液(含15mg Tris)，室温下振荡30min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
3)将得到的产物在20mL PIPES溶液中重悬，加入300mgAAM、600mg DMAA振荡使其充分溶解。然后加入75mg过硫酸铵，室温下振荡3h。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
4)上一步的产物加入5mL 0.5moL/L的碱性次氯酸钾溶液(pH＝12)，室温下振荡2h。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。随后将沉淀置于烘箱干燥，得到新冠病毒S蛋白印迹产品MIP。
5)将步骤4)中制备的MIP取5mg浸入待检测的500mL粪便施肥的土壤浸出液中搅拌10min后用磁铁将MIP分离；随后将吸附了新冠病毒的MIP加入至细胞生长液，置37℃培养箱培养，获得新冠病毒侵染的阳性细胞；将细胞分离物提取核酸后，通过逆转录PCR的方法鉴定；另外对新冠病毒通过梯度培养的方法，4天初步观察CPE，7天判定结果，按Reed-Muench的方法测定病毒株效价。
该产品的直径为10nm，丙烯酰胺的质量占比25％，该产品对新冠病毒S蛋白的吸附量和吸附速率分别为85mg/g材料和0.00012mg/s。该方法成功分离出新冠病毒，而直接用分离培养方法未分理出新冠病毒。
实施例3：
1)取100mg市售nFe3O4(直径为50nm)置于50mL离心管加入20mL去离子水超声分散10min，加入5mL含NHS(10mg)和EDAC(6.8mg)的混合溶液，室温下振荡45min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
2)上一步的产物加入41.7mL含1.25mg新冠病毒S蛋白的PIPES缓冲溶液(缓冲溶液浓度为0.01mol/L)，3℃下振荡4h；随后加入10mL mL Tris溶液(含0.2g Tris)，室温下振荡30min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
3)将得到的产物在10mLPIPES溶液中重悬，加入50mgAAM、100mg DMAA振荡使其充分溶解。然后加入12.5mg过硫酸钠，室温下振荡3h。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，沉淀用10mL去离子水离心清洗3次。
4)上一步的产品加入5mL 2moL/L的碱性次氯酸钾溶液(pH＝13)，室温下振荡8h。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。随后将沉淀置于烘箱干燥，得到新冠病毒S蛋白印迹产品MIP。
5)将步骤4)中制备的MIP取25mg浸入待检测的500mL某气溶胶浸渍的水溶液中搅拌20min后用磁铁将MIP分离；随后将吸附了新冠病毒的MIP加入至细胞生长液，置37℃培养箱培养，获得新冠病毒侵染的阳性细胞；将细胞分离物提取核酸后，通过逆转录PCR的方法鉴定；另外对新冠病毒通过梯度培养的方法，4天初步观察CPE，7天判定结果，按Reed-Muench的方法测定病毒株效价。
该产品的直径为30nm，丙烯酰胺的质量占比20％，该产品对新冠病毒N蛋白的吸附量和吸附速率分别为65mg/g材料和0.00014mg/s。该方法成功分离出新冠病毒，而直接用分离培养方法未分理出新冠病毒。
实施例4：
1)取200mg市售nFe3O4(直径为20nm)置于50mL离心管加入20mL去离子水超声分散10min，加入5mL含NHS(25mg)和EDAC(16.7mg)的混合溶液，室温下振荡45min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
2)上一步的沉淀加入20mL含4mg新冠病毒S蛋白的PBS缓冲溶液(缓冲溶液浓度为0.5mol/L)，4℃下振荡4h；随后加入5mL Tris溶液(含800mg Tris)，室温下振荡30min。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
3)将得到的产物在20mL PIPES溶液中重悬，加入150mgAAM、300mg NNMBA振荡使其充分溶解。然后加入50mg过硫酸钠，室温下振荡3h。振荡后用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。
4)上一步的产品加入5mL 0.8moL/L的碱性次氯酸钠溶液(pH＝14)，室温下振荡6h。振荡后溶液用磁铁分离后弃上清液，用10mL去离子水离心清洗3次。随后将沉淀置于烘箱干燥，得到新冠病毒蛋白印迹产品MIP。
5)将步骤4)中制备的MIP 80mg浸入1L某污水溶液中搅拌30min后离心将MIP分离；随后将离心获得的MIP加入至市售RNA提取试剂盒提取RNA；将提取的RNA通过市售逆转录PCR试剂盒扩增，检测新冠病毒的含量。
6)将步骤4)中制备的MIP取18mg浸入待检测的600mL某污水溶液中搅拌20min后用磁铁将MIP分离；随后将吸附了新冠病毒的MIP加入至细胞生长液，置37℃培养箱培养，获得新冠病毒侵染的阳性细胞；将细胞分离物提取核酸后，通过逆转录PCR的方法鉴定；另外对新冠病毒通过梯度培养的方法，4天初步观察CPE，7天判定结果，按Reed-Muench的方法测定病毒株效价。
该产品的直径为20nm，丙烯酰胺的质量占比25％，该产品对新冠病毒N蛋白的吸附量和吸附速率分别为109mg/g材料和0.00018mg/s。该方法成功分离出新冠病毒，而直接用分离培养方法未分理出新冠病毒。
Claims (8)
1.一种通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：首先利用分子印迹选择性识别模板的特性，制备了一种新冠病毒S蛋白选择性吸附材料，进而利用此材料富集环境中具备侵染能力的新冠病毒，对富集的新冠病毒进行分离培养，即可检测环境中侵染性新冠病毒；该新冠病毒S蛋白选择性吸附材料以新冠病毒S蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备得到。
2.根据权利要求1所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：制备的新冠病毒S蛋白选择性吸附材料的结构为内外两层，内层为具有磁性的纳米四氧化三铁，外层为聚丙烯酰胺聚合层，聚丙烯酰胺聚合层中镶嵌有病毒S蛋白印迹；制备的材料的直径为10-50nm，丙烯酰胺的质量占比为15％～30％；制备的材料对新冠病毒的吸附量达65-120g/g材料，吸附动力学速率常数达0.00012-0.0002mg/s。
3.根据权利要求1或2所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于具体步骤如下：
1)将包裹二氧化硅的纳米四氧化三铁磁珠nFe3O4，粒径为10-50nm，溶于去离子水，超声分散为稳定悬浊液，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和碳二亚胺盐酸盐EDAC振荡后用磁铁分离并清洗nFe3O4；nFe3O4和NHS的质量比在(4～10):1，nFe3O4和EDAC的质量比在(4～15):1；
2)将步骤1)中的nFe3O4溶于含市售新冠病毒S蛋白的缓冲溶液，2～8℃下充分振荡，加入三羟甲基氨基甲烷Tris溶液，充分振荡后用磁铁分离，去离子水清洗得到负载S蛋白的nFe3O4；nFe3O4和新冠病毒S蛋白的质量比在(20～80):1；nFe3O4和Tris的质量比为(0.1～0.5):1；
3)将步骤2)中负载S蛋白的nFe3O4在PIPES溶液中重悬后，加入丙烯酰胺AAM、N,N’-dimethyl acrylamide和过硫酸盐，振荡3-6小时后通过磁铁分离，去离子水清洗得到负载未洗脱印迹的nFe3O4；nFe3O4和AAM的质量比在(0.5～2):1；nFe3O4和N,N’-dimethylacrylamide的质量比在(0.25～1):1；nFe3O4和过硫酸盐的质量比在(2～8):1；
4)将步骤3)中的负载未洗脱印迹的nFe3O4加入碱性次氯酸盐溶液振荡2-6h后充分清洗，干燥后得到新冠病毒蛋白印迹材料MIP；
5)将步骤4)中制备的MIP浸入待检测的环境样本中搅拌10-30min后用磁铁将MIP分离；随后将吸附了新冠病毒的MIP加入至细胞生长液，置37℃培养箱培养，获得新冠病毒侵染的阳性细胞；将细胞分离物提取核酸后，通过逆转录PCR的方法鉴定；另外对新冠病毒通过梯度培养的方法，4天初步观察CPE，7天判定结果，按Reed-Muench的方法测定病毒株效价；加入至环境样本中的MIP的浓度为10-100mg/L。
4.根据权利要求3所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：步骤1)中的nFe3O4悬浊液的浓度为5-20mg/mL。
5.根据权利要求3所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：步骤2)中的缓冲溶液为任何能使蛋白质稳定存在的溶液，包括但不限于PIPES缓冲溶液或PBS缓冲溶液，浓度为0.01-1mol/L；新冠病毒S蛋白的浓度为200-300mg/L。
6.根据权利要求3所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：步骤3)中过硫酸盐为过硫酸钠、过硫酸钾或过硫酸铵。
7.根据权利要求3所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：步骤4)中的碱性次氯酸盐为碱性次氯酸钠或碱性次氯酸钾，浓度为0.5～2mol/L，pH值为12-14。
8.根据权利要求3所述的通过选择性吸附刺突糖蛋白富集并检测侵染性新冠病毒的方法，其特征在于：步骤5)中环境样本为水、土壤或空气样本，其中土壤或空气样本需首先将样本浸入水中使新冠病毒转移到水相后测定。
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Citations (3)
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| CN113049831A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-29 | 北京博晖创新生物技术股份有限公司 | 检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN113072710A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-06 | 佛山湘潭大学绿色智造研究院 | 一种气体响应型共振光分子印迹传感器及其制备方法 |
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