CN117660531A - 猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法及其在免疫荧光检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物安全领域，特别涉及猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法及其在免疫荧光检测中的应用，该方法从NCBI中选取保守的PHEV病毒的S蛋白，然后对S蛋白的序列进行真核表达密码子优化并构建到pcDNA3.4载体中，然后在293T细胞中瞬时转染PHEV的S蛋白质粒，获得表达S蛋白的转基因细胞；培养后将转基因细胞进行固定，再用PHEV的荧光抗体进行检测，一步法获得高转染，高表达，能被PHEV荧光抗体识别的阳性细胞，具有制备简单、时间短、产量高等优点。所制备的阳性细胞具有抗原活性，能够作为PHEV荧光抗体检测的阳性对照细胞，且方法简单、高效。

Description

猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法及其在 免疫荧光检测中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法及其在免疫荧光检测中的应用。
背景技术
生物制品由于产品的特殊性，需要根据细胞的特性、培养历史以及操作过程，对病毒安全性做出合理的评估和检测。历史上也曾发生多次由于病毒污染而引起的严重安全性事件，其中Genetech公司曾报道两次，以CHO细胞生产的生物产品，由于MMV污染造成的巨大经济损失事件。所以生物安全被监管机构高度重视，尤其是病毒的生物安全。
介于生物安全的重要性，国内外监管机构对生物制品的病毒安全性提出了相应的要求和规定，主要法规有《中国药典三部-生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》2020年版，FDA《Points to Consider in Manufacture and Testing ofMonoclonalAntibody Products for Human Use》，9CFR《Detection ofextraneousviruses by the fluorescent antibody technique》等。在细胞系构建、细胞建库过程或者生产过程中使用了动物源成分的，则需要开展针对性的病毒检测，如牛源性病毒和猪源性病毒检测等。其中对于猪源性病毒检测，美国要求参照9CFR，需要检测的病毒有PPV、TGEV、PAV、REO-3、PHEV、BVDV、PI3、RV。由于国家对病毒的严格管控，上述病毒中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)很难购买到。病毒检测从检测对象来分，可以分为核酸检测法和蛋白检测法。核酸检测法主要为PCR法，蛋白检测法主要为免疫法。这两个方法在检测时都需要阳性对照，核酸工业化成熟，通过合成很容易获得。但蛋白合成工艺复杂，抗原抗体配对复杂，较难获得。
免疫荧光检测是生物制品中法规规定的体外检测方法之一。免疫荧光检测法通过细胞培养方式来使原始病毒增殖，以提高检测的灵敏度，同时该方法可以确定蛋白的表达情况及病毒位置是否在细胞内，而PCR法无法确定病毒位置及蛋白的表达。免疫荧光法主要原理是带有荧光标记的抗体与特异的抗原结合，清洗未结合的抗体之后仍然检测到荧光，说明样本有特异性的病毒存在。用免疫荧光法开发和检测病毒时，需要对应的阳性对照来保证方法的开发及确保实验的有效性，这是检测时不可缺少的阳性对照组。上述病毒对应的荧光抗体都能在官方推荐的VMRD公司购买到，但由于病毒具有危害性，国家对病毒的管控严格，其中猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitisvirus，PHEV)较难购买。没有PHEV阳性对照就无法进行方法开发，检测阶段也无法判断检测的有效性。
VMRD是监管机构推荐的内外源病毒检测抗体供应商，该公司提供的抗体是根据病毒生产的特异性抗体，不提供具体的抗体和抗原靶位信息。在无抗原表位信息的情况下，需要分析病毒的蛋白结构，挑选可能成为抗原表位的蛋白进行表达，同时需要蛋白结构折叠正确，不能产生包涵体，筛选难度较大。这不但需要筛选到正确序列，还要有适当的表达系统使目的基因折叠出正确的蛋白三维结构。我们的系统通过细胞内表达病毒的部分蛋白筛选抗原，能快速筛选得到含有抗原的阳性细胞，得到的阳性细胞可实现免疫荧光方法开发，同时能为检测提供阳性对照。
发明内容
针对目前有些病毒荧光免疫检测时无法购买到阳性病毒的情况，本发明提供一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，该方法采用细胞内瞬时转染表达PHEV病毒不同蛋白的策略，筛选获得了病毒荧光抗体对应抗原，实现了特异性抗原阳性细胞的快速制备。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、猪血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白表达质粒的构建，并对其密码子进行真核表达优化，优化后的序列为SEQ ID NO：1；
S2、将含有S蛋白的pcDNA3.4质粒转染293T细胞；
S3、对转染S蛋白质粒的细胞进行固定；
S4、对固定的细胞进行免疫荧光检测。
本发明通过市售PHEV病毒荧光抗体筛选对应抗原，并挑选与抗体配对效果较好的蛋白作为阳性对照细胞进行免疫荧光开发或/和检测。
VMRD公司的PHEV荧光抗体无抗原表位信息，需要分析病毒的蛋白结构，选取可能成为抗原表位的蛋白序列进行表达，同时需要蛋白在表达时折叠出正确的三维结构以被抗体特异性地识别，抗原蛋白表达及筛选难度较大。本发明首先筛选了可以用于转染表达及成为抗原表位可能性较高的S蛋白，并对S蛋白的核酸序列进行真核表达密码子优化，其次通过质粒瞬转系统，将携带多抗原表位的PHEV的S蛋白作为目的蛋白进行转染表达，成功构建出VMRD公司PHEV荧光抗体能识别的特异性抗原，实现了无法获得病毒情况下阳性对照细胞的制备。
作为优选，S1中S蛋白表达质粒构建的具体方法是：
①从NCBI上获取较保守的PHEV病毒的S蛋白核酸序列，按真核生物表达体系的密码子进行优化，得到优化后的S蛋白，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
②将优化后的S蛋白构建到pcDNA3.4载体，构建成真核系统表达载体；
③将构建好的表达质粒转染大肠杆菌，挑取单克隆，验证后扩培，抽提质粒，获得的质粒经验证后用于后期细胞转染实验。
作为优选，S2中293T细胞转染的具体方法是：
①当293T细胞密度长到60％-70％时，吸去培养板中的上清液，更换2-4mL含有2％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养；
②转染体系500ul/孔，根据质粒浓度按照1μg/孔，吸取猪血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白质粒加入到装有无血清DMEM培养基的质粒管中，混匀；
③取出提前配制的15ug/mL的PEI溶液，使用无血清DMEM培养基进行5倍稀释，根据②中加入质粒总体积的3-4倍体积吸取PEI溶液至“PEI管”中，混匀；
④将稀释后的“PEI管”中液体滴加至“质粒管”中，混匀后静置，孵育20min；
⑤将孵育好的转染体系按照500ul/孔，滴加至培养孔中，混匀，放入37℃，5％CO2培养箱培养；
⑥转染后24h，取出培养箱中的培养板，向培养瓶中加入2mL含2％FBSDMEM培养液；
⑦转染后72h，取出培养箱中的培养板吸除上清并用PBS进行清洗后进行固定处理。
作为优选，S3、对转染目的基因的细胞进行固定具体步骤是：
①取出培养板，移除细胞培养基，用PBS润洗一次后加入80％丙酮1mL固定10min，干燥备用；
②向固定、自然干燥的带玻片的培养板中加入封闭液1mL，置37℃反应1h；
③弃去板孔内液体，用2mLPBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体。
作为优选，S4、固定细胞的免疫荧光检测具体步骤是：
①在培养板内加入PHEV荧光抗体，每孔0.2mL，然后将孔板放入带盖湿盒，37℃反应1h；
②用2mLPBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体，去除残余荧光抗体，然后置于荧光显微镜检查，确认病毒特异性荧光信号。
一种本发明所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原的制备方法在免疫荧光检测中的应用。本发明所制备的阳性细胞具有抗原活性，能够作为PHEV荧光抗体检测的阳性对照细胞，且方法简单、高效。
一种本发明所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原在制备预防和/或治疗猪血凝性脑脊髓炎病毒药物或检测猪血凝性脑脊髓炎病毒试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过将PHEV病毒的S蛋白构建成表达质粒，然后将含S蛋白的表达质粒转染293T细胞。培养3天后，将细胞进行固定并用PHEV荧光抗体进行检测，转染质粒组别的检测结果为阳性，未转染质粒组别的结果为阴性。结果说明表达的抗原与抗体有特异地对应关系；
2、在无抗原信息条件下，通过上述方法转染细胞能够快速表达被PHEV荧光抗体识别的抗原蛋白，此方法简单、高效。
附图说明
图1是PHEV病毒S蛋白表达的质粒图谱；
图2是PHEV病毒N蛋白表达的质粒图谱；
图3是PHEV病毒HE蛋白表达的质粒图谱；
图4是应用PHEV荧光抗体方法检测表达的S、N和HE蛋白的抗原性；其中，a是PHEV荧光抗体检测转染了S蛋白的293T细胞明视野；b是PHEV荧光抗体检测转染了S蛋白的293T细胞荧光视野；c是PHEV荧光抗体检测转染N蛋白的293T细胞明视野；d是PHEV荧光抗体检测转染N蛋白的293T细胞荧光视野；e是PHEV荧光抗体检测转染HE蛋白的293T细胞明视野；F是PHEV荧光抗体检测转染HE蛋白的293T细胞荧光视野；g是PHEV荧光抗体检测未转染的293T细胞明视野；h是PHEV荧光抗体检测未转染的293T细胞荧光视野；
图5是应用PHEV荧光抗体方法进行检测。其中，a是PHEV荧光抗体检测转染了S蛋白的293T细胞明视野；b是PHEV荧光抗体检测转染了S蛋白的293T细胞荧光视野；c是PHEV荧光抗体检测细胞上清明视野；d是PHEV荧光抗体检测细胞上清荧光视野；e是PHEV荧光抗体检测空细胞明视野；f是PHEV荧光抗体检测空细胞荧光视野。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
DMEM培养基，购自Gibco；
PEI溶液，购自Invitrogen；
PHEV荧光抗体，购自VMRD。
实施例一：
一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的筛选方法，该方法具体步骤如下(以6孔板培养为例)：
1.表达载体的构建
1.1从NCBI上获取较保守的PHEV病毒的核酸序列，通过预测PHEV病毒各个蛋白成为抗原表位的可能性，选取概率较高的N、HE、S蛋白作为预选蛋白进行测试。1.2从NCBI上获取的保守的S、N、HE核酸序列按真核生物表达体系的密码子进行优化。
优化后的S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；优化后的N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；优化后的HE蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
1.3将优化后的S、N、HE蛋白的核酸序列分别构建到pcDNA3.4载体，构成独立的3个真核系统表达载体，具体见图1、图2、图3。
1.4将构建好的表达质粒转染大肠杆菌，挑取单克隆，验证后扩培，之后抽提质粒，获得的质粒经验证后用于后期细胞转染实验。
2.细胞准备及铺板
2.1.取提前准备的293T细胞，显微镜下观察，当细胞密度在90％-100％时进行传代。
2.2.将细胞用5-7mL，pH7.210 mM的PBS缓冲液洗涤2次，洗涤后加入5mL 0.25％胰酶进行消化，待细胞消化后，经1200rpm/2min进行离心，弃去上清，加入5mLpH7.210mM PBS缓冲液重悬细胞，重复离心，弃上清。
2.3.向培养瓶中加入含有10％FBS的DMEM培养基，将上述细胞悬液稀释到5E5cells/ml，取2ml加到6孔板中，放37℃，5％CO2培养箱中培养24h左右。
3.转染
3.1.当细胞密度长到60％-70％时，吸去6孔板中的上清液，更换2-4mL含有2％FBS的DMEM培养基，放37℃，5％CO2培养箱中待用。
3.2.转染体系500ul/孔，根据质粒浓度按照1μg/孔，吸取N、HE、S蛋白质粒分别加入到装有无血清DMEM培养基的质粒管中，混匀。
3.3.PEI稀释：取出提前配制的15ug/mL的PEI溶液，使用无血清DMEM培养基进行5倍稀释，根据3.2中加入质粒总体积的3-4倍体积吸取PEI工作液至“PEI管”中，混匀。
3.4.将稀释后的“PEI管”中液体分别滴加至“质粒管”中，混匀后静置，孵育20min。3.5.将孵育好的转染体系按照500ul/孔，滴加至培养孔中，混匀，放入37℃，5％CO2培养箱培养。
3.6.转染后24h，取出培养箱中的培养板，向培养瓶中加入2mL含2％FBSDMEM培养液。
3.7.转染后72h，取出培养箱中的培养板吸除上清并用PBS进行清洗后进行固定处理。
4.固定
4.1.取出培养板，移除细胞培养基，用PBS润洗一次后加入80％丙酮1mL固定10min，干燥备用。
4.2.向固定、自然干燥的带玻片的培养板中加入封闭液1mL，置37℃反应1h。4.3.弃去板孔内液体，用2mLPBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体。
5.免疫荧光检测
5.1.在所有培养板内加入PHEV荧光抗体，每孔0.2mL，然后将培养板放入带盖湿盒，37℃反应1h。
5.2.用2mLPBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体，去除残余荧光抗体，然后置于荧光显微镜检查，选择绿色荧光通道，在高倍镜200×倍以上确认病毒特异性荧光信号。
结果如图4所示，转染了PHEV病毒N和HE蛋白质粒的组别，在PHEV荧光抗体处理后无明显荧光信号。转染S蛋白质粒组别在PHEV荧光抗体处理后能检测到明显的荧光信号，未转染质粒的空白细胞组不能检测到荧光信号。上述结果说明通过抗原靶位预测、密码子优化、瞬时表达、固定、检测的流程能快速筛选到高质量的PHEV荧光抗体对应抗原，并成功获得表达抗原的细胞。
实施例二：
一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的阳性细胞在检测中的应用，该方法具体步骤如下(以6孔板培养为例)：
1.样本处理
1.1.检测的组别设定：阳性对照组、阴性对照组、供试品组。
1.2.供试品为细胞样本，对细胞进行计数后稀释成≥1×107/mL活细胞悬液，然后冻融2次，最后一次冻融结束后进行低速离心(1000rpm，10min)以去除多余的细胞碎片，上清用于后期检测。
2.阴性对照、供试品的接种和培养
2.1.取出提前一天准备的293T细胞，分别在显微镜下进行镜检观察，确认细胞状态正常后进行实验。
2.2.细胞上清液，用一次性无菌抽吸管分别移除待接种细胞培养瓶中的培养基后，取准备好的供试品，分别接种1mL供试品至1瓶293T细胞中，然后向每瓶细胞中添加对应的细胞培养基12mL，然后放置37℃，5％CO2培养箱继续培养21天，每7天传一次代。
3.阳性对照的接种和培养
3.1.取提前准备的293T细胞，显微镜下观察，当细胞密度在90％-100％时进行传代。
3.2.将细胞用5-7mL，pH7.210 mM的PBS缓冲液洗涤2次，洗涤后加入5mL 0.25％胰酶进行消化，待细胞消化后，经1200rpm/2min进行离心，弃去上清，加入5mLpH7.210mM PBS缓冲液重悬细胞，重复离心，弃上清。
3.3.向培养瓶中加入含有10％FBS的DMEM培养基，将上述细胞悬液稀释到5E5cells/ml，取2ml加到6孔板中，放37℃，5％CO2培养箱中培养24h左右。
3.4.当细胞密度长到60％-70％时，吸去6孔板中的上清液，更换2-4mL含有2％FBS的DMEM培养基，放37℃，5％CO2培养箱中待用。
3.5.转染体系500ul/孔，根据质粒浓度按照1μg/孔，吸取PHEV病毒S蛋白的质粒加入到装有无血清DMEM培养基的质粒管中，混匀。
3.6.PEI稀释：取出提前配制的15ug/mL的PEI溶液，使用无血清DMEM培养基进行5倍稀释，根据3.5中加入质粒总体积的3-4倍体积吸取PEI工作液至“PEI管”中，混匀。
3.7.将稀释后的“PEI管”中液体滴加至“质粒管”中，混匀后静置，孵育20min。
3.8.将孵育好的转染体系按照500ul/孔，滴加至培养孔中，混匀，放入37℃，5％CO2培养箱培养。
3.9.转染后24h，取出培养箱中的培养板，向培养瓶中加入2mL含2％FBSDMEM培养液。
3.10.转染后72h，取出培养箱中的培养板吸除上清并用PBS进行清洗，清洗后添加培养基跟其它组别一起培养到21天，中间跟阴性组和供试品组一起传代3次。
4.固定
4.1.取出六孔板，移除细胞培养基，用PBS润洗一次后加入80％丙酮1mL固定10min，固定结束后弃去液体，自然干燥备用。
4.2.向固定、自然干燥的带玻片的培养板中加入封闭液1mL，置37℃作用1h。4.3.弃去板孔内液体，用2mLPBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体。
5.免疫荧光检测
5.1.在所有板孔内加入工作浓度的PHEV荧光抗体，每孔0.2mL，然后将孔板放入带盖湿盒，37℃反应1h。
5.2.用2mLPBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体，去除残余荧光抗体，然后置于荧光显微镜检查，选择绿色荧光通道，在高倍镜200×倍以上确认病毒特异性荧光信号。
结果如图5所示，转染了PHEV病毒S蛋白质粒组别在PHEV荧光抗体后处理后能检测到明显的荧光信号，阴性对照和供试品组别都未检测到荧光信号。上述结果说明在检测时，在阳性对照成立的前提下，能很好地证明实验的有效性，可以正确评判整个实验流程和方法的准确性，提高了阴性结果的可信度。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的一种快速制备的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原阳性对照细胞在免疫荧光检测中的应用进行了详细介绍。本文应用了具体个例对发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
S1、猪血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白表达质粒的构建，并对其密码子进行真核表达优化；
S2、将含有S蛋白的质粒转染293T细胞；
S3、对转染S蛋白质粒的细胞进行固定；
S4、对固定的细胞进行免疫荧光检测。
2.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于S1中S蛋白表达质粒构建的具体方法是：
①从NCBI上获取较保守的PHEV病毒的S蛋白核酸序列，按真核生物表达体系的密码子进行优化，得到优化后的S蛋白，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
②将优化后的S蛋白构建到pcDNA3.4载体，构建成真核系统表达载体；
③将构建好的表达质粒转染大肠杆菌，挑取单克隆，验证后扩培，抽提质粒，获得的质粒经验证后用于后期细胞转染实验。
3.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于S2中293T细胞转染的具体方法是：
①当293T细胞密度长到60％-70％时，吸去培养板中的上清液，更换2-4mL含有2％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养；
②转染体系500ul/孔，根据质粒浓度按照1μg/孔，吸取猪血凝性脑脊髓炎病毒S蛋白表达质粒加入到装有无血清DMEM培养基的质粒管中，混匀；
③取出提前配制的15ug/mL的PEI溶液，使用无血清DMEM培养基进行5倍稀释，根据②中加入质粒总体积的3-4倍体积吸取PEI溶液至“PEI管”中，混匀；
④将稀释后的“PEI管”中液体滴加至“质粒管”中，混匀后静置，孵育20min；
⑤将孵育好的转染体系按照500ul/孔，滴加至培养孔中，混匀，放入37℃，5％CO2培养箱培养；
⑥转染后24h，取出培养箱中的培养板，向培养瓶中加入2mL含2％FBSDMEM培养液；
⑦转染后72h，取出培养箱中的培养板吸除上清并用PBS进行清洗后进行固定处理。
4.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法，其特征在于S3、对转染目的基因的细胞进行固定具体步骤是：
①取出培养板，移除细胞培养基，用PBS润洗一次后加入80％丙酮1mL固定10min，干燥备用；
②向固定、自然干燥的带玻片的培养板中加入封闭液1mL，置37℃反应1h；
③弃去培养板内液体，用2mL PBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体。
5.根据权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原的制备方法，其特征在于S4、固定细胞的免疫荧光检测具体步骤是：
①在培养板内加入PHEV荧光抗体，每孔0.2mL，然后将孔板放入带盖湿盒，37℃反应1h；
②用2mL PBS洗涤3次，每次静置1min-3min后，倾去液体，去除残余荧光抗体，然后置于荧光显微镜检查，确认病毒特异性荧光信号。
6.一种权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光抗体对应抗原的制备方法在免疫荧光检测中的应用。
7.一种权利要求1所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原在制备预防和/或治疗猪血凝性脑脊髓炎病毒药物或检测猪血凝性脑脊髓炎病毒试剂中的应用。
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