WO2021027250A1 - 人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用 - Google Patents

人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

提供人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料、制备方法及应用，将NMDAR抗原包被于载体膜上制成抗NMDAR受体检测材料，人血清和脑脊液中的特异性NMDAR抗体会与抗原结合，利用碱性磷酸酶底物-配体反应进行显色，并在显色反应中加入封闭材料，可用通过肉眼观察直接判断检测样品中是否含有NMDAR抗体。该方法具有灵敏度高，操作简便，快速检测等优点，有助于抗NMDAR受体脑炎的识别和诊断。

Description

人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料、制备方法及应用 技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料、制备方法及应用。
背景技术
抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)边缘性脑炎(以下简称抗NMDAR脑炎)属于自身免疫性疾病，世界首例病例于2007年由Roberta Vitaliani等人发现，同年Josep Dalmau等人在该类病人的血清和脑脊液中检测到了抗NMDAR抗体，并将此作为诊断该类疾病的主要依据。
目前针对抗NMDAR脑炎的诊断手段包括询问病史、一般内科体征检查、X线与超声、神经影像学、血液检查和脑脊液检查等，其中以血液和脑脊液中NMDAR特异性抗体阳性为确诊的主要依据。90％以上的抗NMDAR脑炎患者体内可检测出靶向NMDAR亚基的IgG抗体。血液检查和脑脊液检查的具体方法包括免疫荧光、ELISA、免疫印迹、免疫组织化学等等，使用这些方法在临床检测上的累积灵敏度估计为60％-80％。Nuria Gresa-Arribas等人以250病例为研究对象，使用免疫组织化学和NMDAR过表达细胞实验来检测上述病人的血清样本，2种方法的检出率分别为91.6％和86.8％。Andrew McKeo等人采取免疫荧光法对467个病人的样本(包括血液和脑脊液)进行检测，结果显示有约12％的阳性样本未被检出。
因此，目前常用的检测手段，如免疫荧光、ELISA、免疫印迹、免疫组 化等，都有检测过程耗时较长，步骤繁琐，抗体需求量大，成本高，灵敏度不高等缺点，利用这些方法很难一次性对大批量样本同时检测或针对某一个样本进行反复检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种对NMDAR自身抗体进行检测的检测材料以及该材料的制备方法及应用，解决现有的检测方法检测耗时长、步骤繁琐、抗体需求量大、成本高、灵敏度低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，获取NMDAR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pShuttle-cmv质粒载体中，得到重组质粒载体pAdEasy-NMDAR1α；
步骤2：将重组质粒载体pAdEasy-NMDAR1α转染入293T细胞中，得到腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞；
步骤3：裂解pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞，去除pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞的核蛋白、DNA和胞浆蛋白，再加入复合提取液，4℃静置15～30min后在35～40℃水浴，直至出现分层；
其中，复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合或洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比1:1～2：1～2：1的比例混合；
步骤4：取分层后的沉淀，向沉淀中加入溶剂混匀，去除上清液，将所得沉淀固化在载体膜上，得到人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料；
其中，溶剂为10％PEG的无水乙醇溶液、10％PEG的丙酮溶液或10％PEG的异丙酮溶液。
具体的，所述的步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得NMDAR的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入pShuttle-cmv载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为pShuttle-NMDAR1α；
步骤1.3：对重组质粒pShuttle-NMDAR1α进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种与载体菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组载体pAdEasy-NMDAR1α。
优选的，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将pAdEasy-NMDAR1α转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V～2000V、25μF、200Ω。
优选的，所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。
本发明还公开上述制备方法制备的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料，该检测材料包括载体膜和固化在载体膜上的从pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞提取的膜蛋白-细胞膜复合物。
本发明还公开了上述人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料用于检测样品中的NMDAR抗体。
具体的，检测样品中的NMDAR抗体的检测过程具体包括：将待检测样品和封闭材料混合后孵育，孵育后加入到权利要求1至5任一项所述的抗 NMDAR自身抗体的检测材料中再次孵育，洗涤，然后加入AP标记羊抗人IgG二抗孵育后进行底物显色；
其中，封闭材料包括经过处理的载体膜和固化在处理后载体膜上的pAdEasy-293T细胞蛋白；所述的载体膜的处理过程为：将载体膜加入蔗糖与葡萄糖按照体积摩尔浓度比为1:1比例混合的混合试剂中，在100℃烘干20min或者37℃烘干8～16h。
本发明还公开了一种封闭材料的制备方法，包括：将载体膜加入蔗糖与葡萄糖按照体积摩尔浓度比为1:1比例混合的混合试剂中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h；然后将提取的pAdEasy-293T细胞蛋白固化再处理后的载体膜上，得到封闭材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明选用表达量高的腺病毒作为载体，利用腺病毒表达系统将NMDAR蛋白表达于293T细胞膜上；利用复合提取液提取NMDAR蛋白-细胞膜复合物，获得了浓度更高的NMDAR蛋白-细胞膜复合物，同时由于采用复合提取物提取蛋白，获得了结构更完整的NMDAR蛋白-细胞膜复合物。因此，用本发明的检测材料检测体液中NMDAR抗体，具有更高的灵敏性和特异性。
(2)目前用于NMDAR抗体的检测方法主要有间接免疫荧光法、流式细胞术、酶联免疫吸附法、蛋白质免疫印迹法。该方法中间接免疫荧光法与蛋白质免疫印迹法均有操作复杂，操作技巧强(需专业人士或有经验人士操作)，且检测时长较长(需两天)；酶联免疫吸附法与流式细胞术检测成本高，同时需要特殊设备及需要有经验人士操作。本发明的检测方法具有操作简单，不需要专业的设备辅助，且检测周期短(整个实验流程仅需1小时左右)。
(3)本发明在检测过程中单独制备了封闭材料，该封闭材料来源于与检测材料同源的对照细胞，将该封闭材料应用于NMDAR抗体的检测能有效的降低杂质蛋白带来的污染，增加检测灵敏度，强阳性血清稀释千倍以上，中等强度阳性血清稀释百倍以上倍，弱阳性血清稀释10倍以上，仍可检测出抗体。
附图说明
图1是本发明制备的检测材料用于检测样品时的显色反应检测过程。
图2是实施例1的提取物的检测结果图。
图3是实施例5的检测结果，其中，图3a为检测材料的示意图，其中A区域包被NMDAR细胞膜复合物，B区域包被对照细胞膜复合物；图3b为阳性判读结果；图3c为阴性判读结果；图3d为阴性判读结果。
图4是实施例5和对比例1获得的检测结果。
图5是实施例5和对比例2获得的检测结果。
图6是实施例5和对比例3获得的检测结果。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是以下实施例仅是本发明的较佳实施例，本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
本发明下列实施例中的pShuttle-cmv载体、pAdEasy载体购于Agilent公司，293T细胞购买于ATCC公司，所使用的载体膜如NC膜、PVDF膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜、玻璃纤维垫等均购买于MILLIPORE公司。
实施例1
步骤1，质粒构建：获取NMDAR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pShuttle-cmv质粒载体中，得到重组质粒载体 pAdEasy-NMDAR1α，测序正确后提取质粒进行后续实验，本实施例的质粒载体构建具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过PCR方法(也可选人工合成法)获得NMDAR的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入pShuttle-cmv载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为pShuttle-NMDAR1α；
步骤1.3：对重组质粒pShuttle-NMDAR1α进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种与载体菌种(辅助载体，具体为pAdEasy载体)扩大培养后进行质粒提取，得到重组载体pAdEasy-NMDAR1α。
在本实施例中，取pShuttle-cmv质粒的甘油菌种接种于氨苄青霉素抗性的3mL LB液体培养基，置37℃恒温培养箱，220r/min，过夜摇菌。第二日吸取菌液500μL保存菌种，剩余2.5mL菌液用质粒小提试剂盒提取，测浓度。
pShuttle-cmv载体酶切：50μL酶切体系，3μg载体，SalI、NotI酶各1μL，10x酶切Buffer 5μL，ddH 2O补齐至50μL，37℃水浴酶切2h。
酶切产物回收，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，按照凝胶回收试剂盒说明书进行载体片段回收。
目的基因与载体片段连接：20μL连接体系，50ng pShuttle-cmv载体，200ng NMDAR基因片段，T4连接酶1μL，ddH 2O补齐至20μL，16℃连接过夜。
将上述连接产物质粒分别转化入大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，涂布于氨苄青霉素固体LB培养板，37℃过夜，第二日挑取5个菌株，接种于氨苄青霉素(25ug/ml)液体LB培养基，37℃过夜培养。次日，各管吸取500μL菌液，-20℃保存，剩余菌液质粒小提，酶切鉴定正确的菌株送测序再次鉴 定。测序鉴定正确的菌株留取菌种，-80℃保存。
测序正确的带有目的基因菌种及载体菌种扩大培养进行质粒大提，测浓度。最终得到重组载体pAdEasy-NMDAR1α。
步骤2，腺病毒的扩增及感染：
将重组质粒载体pAdEasy-NMDAR1α转染入293T细胞中，得到腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞，同时，该步骤还同时设置有对照组pAdEasy质粒(PS)的扩增及感染，具体包括以下步骤：
步骤2.1，293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞融合至90％按1:5传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
腺病毒扩增和收集：待T-25培养瓶中293T细胞长至培养皿底面积50％～70％，更换无血清DMEM高糖培养基继续培养2h，取步骤1得到的pAdEasy-NMDAR1α重组载体和pAdEasy载体(PS)总量4μg，PEI 12μg，按着PEI转染方法分别转染pAdEasy-NMDAR1α重组载体和pAdEasy载体，6h后更换新鲜培养液，12h后再次更换培养基，转染7～10天后收集细胞培养液，低温离心，用2mL无菌PBS重悬沉淀，得到重悬液；
其中，转染方法还可以使用lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转(电转选用低场强0.4cm电转杯，电转条件1500V～2000V、25μF、200Ω)。
取10ul重悬液，加入1ul Protease K(裂解液，对细胞进行裂解)，55℃水浴消化1h，再100℃金属浴5min；取1ul裂解后的重悬液进行PCR鉴定，鉴定无误后进行腺病毒大量扩增；
2.2，腺病毒的大量扩增：于T-75培养瓶中培养293细胞，待细胞汇合度达到90％时，取少量上述重悬液加入293细胞中；3～4天后，当50％的细胞开 始变成圆球状时，收集细胞和培养液于50ml离心管中，500g室温离心，弃上清。沉淀中加入8ml无菌PBS重悬，反复冻融4次，7000g，4℃，5min，取上清，即得到包含腺病毒pAdEasy-NMDAR1α的上清液，命名为PSN病毒上清(包含腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T)和对照PS病毒上清(包含腺病毒pAdEasy-293T)，分装至1.5ml EP管中，-20℃保存备用。
2.3，腺病毒感染：于10cm培养瓶中培养293T细胞，待细胞汇合度达到50％～60％时，取2ml PSN病毒上清和20ul PS病毒上清，加入293T细胞培养液中，分别得到PSN病毒和PS病毒感染的293T细胞，命名为PSN(腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T)细胞和PS(pAdEasy-293T)细胞；12h后换液，48h后收集细胞，准备下一步提取蛋白。
其中，2.1～2.3中293细胞和293T细胞的培养过程为：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，将293细胞培养加入高糖培养基中，待细胞融合至90％按1:5传代，置37℃，5％CO 2的细胞培养箱中培养。
步骤3：提取腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞的膜蛋白-细胞膜复合物，具体包括以下步骤：
3.1，弃细胞培养液，用0.85％NaCl清洗细胞1～2次，加入1ml裂解液(0.85％NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1×PI)。用细胞刮板刮下PSN细胞，收集细胞至2mL EP管中，针头吹打10次，500g，4℃，3min，收集上清至新的2mL EP管中。
上清中加入复合提取液，4℃静置15～30min后在37℃水浴，直至出现分层；其中，本实施例中的复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合的混合液。
3.2，取分层后沉淀，在冰水环境中静置，向沉淀中加入10％PEG的无水乙醇混匀(也可以是10％PEG的丙酮溶液或10％PEG的异丙酮溶液)；4℃静置3min，去除上清液，得到沉淀，在沉淀中加入体积重悬液(10mM Tris-HCl，0.05％NP40，2×PI)，使其溶解，旋涡混匀后加入10％的甘油，-20℃保存，备用。如图2所示为利用NMDAR抗体，通过Western Blot技术在103KD处出现明确条带，说明提取的样品包含NMDAR蛋白。
步骤4，取稀释至合适浓度的膜蛋白-细胞膜复合物，取0.8μL，使用移液枪以圆形印记将其点在载体(载体一般选择NC膜)上，于37℃烘箱中烘烤10min，即可得到人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料，于4℃密封保存。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：步骤3.1中的复合提取液为洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比为1:1:1:1的比例混合的混合液。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：步骤3.1中的复合提取液为洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比为1:2:2:1的比例混合的混合液。
在将上述实施例中制备的抗NMDAR自身抗体检测材料用于检测样品中的NMDAR抗体时，本发明首先制备了一种新的封闭材料。由于人血清和脑脊液中存在的某些蛋白，在检测过程中会和抗原进行非特异性结合干扰检测结果，本发明使用一种封闭材料对检测样本进行封闭，实施效果发现可显著降低样本背景，以下给出本发明的封闭材料制备的具体实施例。
实施例4
本实施例公开了一种封闭材料的制备方法，具体包括：
1)将玻璃纤维垫裁成0.5cm×0.5cm的小正方形块，每小块玻璃纤维垫上点15μL 1.9M蔗糖和1.9M葡萄糖的混合液，在100℃烤20min烘干处理，备用；
本发明中封闭材料制备时的载体膜选择硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板，本实施例中使用玻璃纤维垫作为载体膜。
2)PS(pAdEasy-293T)细胞蛋白的提取：刮板刮取上述实施例步骤2.3中获得的PS细胞，将PS细胞收集于15ml离心管中，1000rpm，5min，室温，弃上清。沉淀加入1mL1×PBS(或生理盐水)，吹打混匀将液体转移至1.5ml EP管中，700g，5min，室温，弃上清。加入1/2细胞团块体积的封闭蛋白提取液(1.25％脱氧胆酸钠，0.25％Triton X-100，0.75％CHAPS，20mM NaCl，2×PI)，吹打混匀将液体转移至2ml EP管中，涡旋震荡数秒后，静置数分钟直至管中有明显团块生成。补加1/2细胞团块体积0.8％NaCl，吹打，4000g，5min，收集上清，弃沉淀。上清与1/4体积25％BSA混合，即为PS细胞蛋白液。
3)在每小块经1)处理过的玻璃纤维垫上点12μL PS细胞蛋白液，75℃烤20min，得到封闭材料，4℃放置备用。
封闭材质为玻璃纤维，将对照细胞的蛋白通过高温烘干固定在封闭材料上，使用时加入到血清或脑脊液稀释液中，蛋白可释放到液体中对检测样本中的干扰抗原发生反应，从而达到封闭效果。
实施例5
将实施例1至实施例3制备的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料用于检测样品中的NMDAR抗体，具体的，检测样品中的NMDAR抗体的检测过程包括：
1)将上述实施例步骤4中获得的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料置于24孔板中，包被膜蛋白抗原的一面朝上。
2)血清封闭：待检测样品(血清，血浆或者脑脊液)按1:250，用工作液(1×PBS，0.5％Triton X-100，0.04％EDTA)稀释后，每250μL稀释血清中加入一片实施例4制备的封闭材料，室温静置2min后，涡旋震荡数秒，再室温静置5min。
3)血清孵育：将封闭好的血清加入含有膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的24孔板中，250μL/孔，将24孔板置于水平摇床(频率约为20次/min)，室温孵育25min。
4)洗涤：去除孔内的血清孵育液，加入工作液，500μL/孔，置于摇床(频率约为40次/min)，室温3min，弃去孔内工作液，重复清洗共3次。
5)二抗孵育：去除孔内的工作液，加入1:1000稀释的AP标记羊抗人IgG抗体，300μL/孔。置于摇床(频率约为20次/min)，室温孵育25min。
6)洗涤：去除孔内的二抗孵育液，加入洗涤液(0.8％NaCl，0.5％Triton X-100)，500μL/孔，置于摇床(频率约为40次/min)，室温3min，弃去孔内洗涤液。重复洗涤共3次。
7)显色：去除孔内的洗涤液后，加入底物稀释液(底物:反应缓冲液＝1:49)300μL/孔，室温避光静置2-5分钟，获得显色结果。
8)终止显色：弃去孔内的底物稀释液，并用蒸馏水漂洗本发明的检测材料1-2次，将其取出晾干或37℃-45℃烘干，分析结果。
其中，显色反应检测过程示意图如图1所示。图3所示为本实施例中的检测结果，其中，图3a为本发明制备的人体抗NMDAR自身抗体检测材料的示意图，其中A区域包被NMDAR细胞膜复合物；B区域包被对照细胞膜复合物，作为阴性对照；图3b为阳性判读结果；图3c为阴性判读结果；图3d为阴性判读结果。
阳性结果判读：本发明制备的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的膜蛋白抗原包被区呈现明显的色斑，形状近似圆形，浅蓝灰色至深蓝黑色，颜色较其周边区域及阴性对照区深(如图3b所示)。
阴性结果判读：本发明制备的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的膜蛋白抗原包被区颜色浅于阴性对照区(如图3c所示)，或等同于阴性对照区(如图3d所示)等，判定为阴性结果。
另外，实施例2和实施例3制备的检测材料用于检测时，检测效果与图实施例1的效果。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：步骤3.1中所使用的提取液为10mmol/L CHAPS。
检测过程同实施例5，检测结果如图4所示。
分别对三个已经明确为NMDAR阳性的血清(1号，2号，3号)进行检测，结果见图4，实施例5组均能正确检出阳性结果，然而对比例1组三个阳性血清均未能检测阳性结果。说明本发明方法中的复合提取液能获得更好的检测效果。
对比例2
本对比例的检测材料的制备同实施例1，血清的检测过程与实施例5的区别在于：检测过程中不加入实施例4制备的封闭材料，不进行实施例5中的“2)血清封闭”步骤。
两种不同的制备方法分别对三个已经明确为NMDAR阳性的血清(1号，2号，3号)进行检测，结果见图5。实施例5组均能正确检出阳性结果，然而对比例2组三个阳性血清中仅仅3号血清检测出了阳性信号，且整体检测背景较高。说明本发明方法中的封闭材料的使用能获得更好的检测效果。
对比例3
本对比例按照申请号201710175642.9的方法进行检测材料制备以及血清样品检测，具体步骤为：
1)通过人工合成获取NMDAR的CDS序列，并在目的基因两端加设NotI/NheI酶切位点；
2)将带有酶切位点的两种目的基因分别插入pCI-neo质粒载体中，插入位点为NotI/NheI，得到带有目的基因的质粒，命名为NMDAR；按PEI转染试剂转染方法转染培养好的HEK293细胞，得到表达NMDAR基因的HEK293/pCI-neo-NMDAR细胞。
3)通过离心去除HEK293/pCI-neo-NMDAR细胞的细胞核，然后加入5～20mmol/L的CHAPS去垢剂，4℃作用30～60分钟，再离心去除未溶解部分，上清即为可溶性的NMDAR-细胞膜复合物
4)用1×TBS缓冲液稀释NMDAR-细胞膜复合物，配制成NMDAR-细胞膜复合物的稀释液，NMDAR-细胞膜复合物的稀释液中NMDAR的浓度为0.1～1mg/mL，然后用划膜仪将NMDAR-细胞膜复合物的稀释液按圆形或线性印迹在载体上，然后放入37℃烘箱内烘干，再使用固定液固定10～20分钟， 其中固定液为质量分数为4％多聚甲醛、冰甲醇或体积分数为95％的乙醇；然后用PBS缓冲液洗去固定液，最后用质量分数为1％的BSA封闭液于室温条件下封闭1小时或4℃封闭16～20小时，沥干封闭液并用双蒸水清洗干净，在20～28℃下晾干，即得到人体抗NMDAR自身抗体检测材料，于-20℃密封保存待用；
5)用于检测样品中的NMDAR抗体，具体检测过程为：
制备的人体抗NMDAR自身抗体检测材料置于12孔板，包被NMDAR抗原的一面朝上；
血清孵育：检测样品按1:500稀释后加至孔内，1mL/孔。将12孔板置于水平摇床(频率约为30次/分钟)，室温孵育40分钟。
洗涤：去除孔内的血清孵育液，加入洗涤液，1mL/孔，置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温3-5分钟，弃去孔内的洗涤液。重复清洗共3次。
二抗孵育：去除孔内的洗涤液，加入1:100稀释的AP标记羊抗人IgG抗体，1mL/孔。置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温孵育30分钟。
洗涤：去除孔内的二抗孵育液，加入洗涤液，1mL/孔，置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温3～5分钟，弃去孔内洗涤液。重复洗涤共3次。
显色：去除孔内的洗涤液后，加入底物的稀释液(底物:反应缓冲液＝1:49)，1mL/孔。室温避光静置2～5分钟，可每隔1分钟查看一次。
终止显色：弃去孔内的底物稀释液，并用蒸馏水漂洗本发明的检测材料1～2次，将其取出晾干或37℃～45℃烘干，分析结果。
两种不同的制备方法分别对三个已经明确为NMDAR阳性的血清(1号，2号，3号)进行检测，结果见图6，实施例5组均能正确检出阳性结果，然而对比例3组三个阳性血清均未能检测阳性结果。

Claims (8)

  1. 人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
    步骤1，获取NMDAR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pShuttle-cmv质粒载体中，得到重组质粒载体pAdEasy-NMDAR1α；
    步骤2：将重组质粒载体pAdEasy-NMDAR1α转染入293T细胞中，得到腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞；
    步骤3：裂解pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞，去除pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞的核蛋白、DNA和胞浆蛋白，再加入复合提取液，4℃静置15～30min后在35～40℃水浴，直至出现分层；
    其中，复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合或洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比1:1～2：1～2：1的比例混合；
    步骤4：取分层后的沉淀，向沉淀中加入溶剂混匀，去除上清液，将所得沉淀固化在载体膜上，得到人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料；
    其中，溶剂为10％PEG的无水乙醇溶液、10％PEG的丙酮溶液或10％PEG的异丙酮溶液。
  2. 如权利要求1所述的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤1具体包括以下步骤：
    步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得NMDAR的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
    步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入pShuttle-cmv载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为pShuttle-NMDAR1α；
    步骤1.3：对重组质粒pShuttle-NMDAR1α进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种与载体菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组载体pAdEasy-NMDAR1α。
  3. 如权利要求1所述的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将pAdEasy-NMDAR1α转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V～2000V、25μF、200Ω。
  4. 如权利要求1所述的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。
  5. 权利要求1至4任一项所述的制备方法制备的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料，其特征在于，该检测材料包括载体膜和固化在载体膜上的从pAdEasy-NMDAR1α-293T细胞提取的膜蛋白-细胞膜复合物。
  6. 将权利要求1至5任一项所述的人体液中抗NMDAR自身抗体的检测材料用于检测样品中的NMDAR抗体。
  7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，检测样品中的NMDAR抗体的检测过程具体包括：将待检测样品和封闭材料混合后孵育，孵育后加入到权利要求1至5任一项所述的抗NMDAR自身抗体的检测材料中再次孵育，洗涤，然后加入AP标记羊抗人IgG二抗孵育后进行底物显色；
    其中，封闭材料包括经过处理的载体膜和固化在处理后载体膜上的pAdEasy-293T细胞蛋白；所述的载体膜的处理过程为：将载体膜加入蔗糖与 葡萄糖按照体积摩尔浓度比为1:1比例混合的混合试剂中，在100℃烘干20min或者37℃烘干8～16h。
  8. 一种权利要求7所述的封闭材料的制备方法，其特征在于，包括：将载体膜加入蔗糖与葡萄糖按照体积摩尔浓度比为1:1比例混合的混合试剂中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h；然后将提取的pAdEasy-293T细胞蛋白固化再处理后的载体膜上，得到封闭材料。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114957446A (zh) * 2022-05-31 2022-08-30 陕西脉元生物科技有限公司 与nmdar脑炎患者中的自身抗体结合的nmdar突变体及其构建方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110606887A (zh) * 2019-08-12 2019-12-24 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用
CN112326971A (zh) * 2020-10-20 2021-02-05 成都海默云因医学检验实验室有限公司 一种用于nmdar抗体定量检测的新方法及试剂盒
WO2022206585A1 (zh) * 2021-03-29 2022-10-06 广州市妇女儿童医疗中心 诊断先天性巨结肠的抗体标志物及其应用
CN114957444B (zh) * 2022-05-31 2023-09-19 陕西脉元生物科技有限公司 一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008073984A2 (en) * 2006-12-12 2008-06-19 Cis Biotech, Inc. Nmdar biomarkers for diagnosing and treating cerebral ischemia
CN103282776A (zh) * 2010-12-06 2013-09-04 欧蒙医学诊断技术有限公司 用于诊断过程的抗nmda受体自身抗体的检测方法
CN104628810A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种细胞膜蛋白质富集纯化方法
CN107022548A (zh) * 2017-03-22 2017-08-08 陕西脉元生物科技有限公司 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN108603885A (zh) * 2015-11-17 2018-09-28 科罗拉多大学评议会公司 诊断或评估哺乳动物中的疾病或紊乱的新型多重分析
CN110606887A (zh) * 2019-08-12 2019-12-24 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2805972A1 (en) * 2013-05-21 2014-11-26 PAION Deutschland GmbH Novel antibody useful in neurological or neurodegenerative disorders
CN107556380B (zh) * 2017-09-04 2020-07-10 肇庆大华农生物药品有限公司 一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008073984A2 (en) * 2006-12-12 2008-06-19 Cis Biotech, Inc. Nmdar biomarkers for diagnosing and treating cerebral ischemia
CN103282776A (zh) * 2010-12-06 2013-09-04 欧蒙医学诊断技术有限公司 用于诊断过程的抗nmda受体自身抗体的检测方法
CN104628810A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种细胞膜蛋白质富集纯化方法
CN108603885A (zh) * 2015-11-17 2018-09-28 科罗拉多大学评议会公司 诊断或评估哺乳动物中的疾病或紊乱的新型多重分析
CN107022548A (zh) * 2017-03-22 2017-08-08 陕西脉元生物科技有限公司 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN110606887A (zh) * 2019-08-12 2019-12-24 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中抗nmdar自身抗体的检测材料、制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAO DING, LI WEI, SHI LEMING, LI QUANZHEN: "Expression, purification and immunoreactivity characterization of extracellular antigenic domains of NMDAR1 protein", SHENGWU GONGCHENG XUEBAO = CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ZHONGGUO KEXUEYUAN WEISHENGWU YANJIUSUO, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES, INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, CN, vol. 33, no. 12, 25 December 2017 (2017-12-25), CN, pages 1979 - 1988, XP055779899, ISSN: 1000-3061, DOI: 10.13345/j.cjb.170422 *
SHARMA RASHMI, AL-SALEEM FETWEH H., PULIGEDDA RAMA DEVUDU, RATTELLE AMY, LYNCH DAVID R., DESSAIN SCOTT K.: "Membrane-bound and soluble forms of an NMDA receptor extracellular domain retain epitopes targeted in auto-immune encephalitis", BMC BIOTECHNOLOGY, vol. 18, no. 1, 1 December 2018 (2018-12-01), XP055779896, DOI: 10.1186/s12896-018-0450-1 *
SONG ZHAOHUI; LIU LEI; WANG RUIJIN; XU CHUNLING; ZHANG SHANCHAO; DAI FEIFEI; GUO JING; WANG JIAWEI: "Study on the clinical detection of anti-NMDA receptor antibodies", 2013 SHANDONG NEUROLOGY ACADEMIC CONFERENCE AND CHINA NEUROIMMUNOLOGY CONGRESS; 2013-09-07, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 194, XP009526025 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114957446A (zh) * 2022-05-31 2022-08-30 陕西脉元生物科技有限公司 与nmdar脑炎患者中的自身抗体结合的nmdar突变体及其构建方法
CN114957446B (zh) * 2022-05-31 2023-09-15 陕西脉元生物科技有限公司 与nmdar脑炎患者中的自身抗体结合的nmdar突变体及其构建方法

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