CN108931513B - 体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外检测MUSK‑Ab和LRP4‑Ab的方法及试剂盒。该方法包括以下步骤：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒和/或pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒；向转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液洗涤之后添加牛血清白蛋白和TritonX‑100进行封闭、通透2～3h；取待测血清，添加封闭、通透后的pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞中，24～28℃下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，24～28℃下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录。所使用试剂均为常规试剂，不需要依赖价格昂贵的试剂盒，检测成本较低。
Description
技术领域
本发明属于MUSK-Ab和LRP4-Ab测定技术领域，具体涉及一种体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒。
背景技术
重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是一种细胞依赖的、补体参与的神经肌肉接头处的自身免疫性疾病。其发病率约为1/4000-5000，所有年龄组均可受累，有两个发病高峰，女性发病高峰为20-40岁，男性发病高峰为50-70岁，临床特点包括肌肉无力和易疲劳，肌无力症状在活动后加重，休息或睡眠后缓解。早期易累及颅神经，眼外肌受累最常见，眼睑下垂和复视是常见主诉。约15％MG患者伴有胸腺瘤，70％MG患者伴有胸腺增生。MG患者血清中可以检测到多种自身抗体，约85％MG患者血清中乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)阳性，称为血清反应阳性MG(SPMG)，若MG患者血清种未检测到AChR-Ab的，则称为血清反应阴性MG(SNMG)，在此类患者血清中可以通常可存在其它类型抗体如肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)。低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)是近年来发现的新的MG自身抗体，可与上述两种自身抗体同时存在，或单独致病。因此，这三种抗体联合检测将大幅提高MG诊断的灵敏度和特异性，对重症肌无力的诊断、治疗以及预后具有重要指导意义。
目前，AChR-Ab、MuSK-Ab两种MG自身抗体检测，主要采用价格昂贵的试剂，包括英国RSR公司和德国欧蒙公司的产品。采用的方法是放射性免疫技术(RIA)和/或酶联免疫方法(ELISA)。放射性免疫技术(RIA)灵敏度高，试验周期较短，但试剂的有效期短，约为1个月，不适合像中国这样一个地域辽阔国家的，而且还存在放射性污染。酶联免疫方法(ELISA)有效期长，灵敏度高和特异性强，但因为使用强酸终止液污染环境，此外酶联免疫方法因为需要依赖价格昂贵的试剂盒使得测试成本较高。
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体或抗原作为探针检查细胞内或组织内的相应抗原或抗体。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织或细胞，从而确定抗原或抗体的性质和定位。现有技术中没有采用细胞免疫荧光法测定MuSK-Ab的技术方案。如果要准确诊断MG，需对影响MG的多个抗体，包括LRP4-Ab和MuSK-Ab等进行联合检测。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种体外检测MUSK-Ab的方法，该方法可准确测出血清中是否存在MUSK-Ab，且检测成本较低。
本发明的第二个目的是提供一种体外检测LRP4-Ab的方法，该方法可准确、测出血清中是否存在LRP4-Ab，且检测成本较低。
本发明的第三个目的是提供一种体外检测MUSK-Ab的试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种体外检测LRP4-Ab的试剂盒。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，包括以下步骤：
1)细胞转染重组质粒：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒和/或pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒，得到转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；
2)转染细胞的固定与保存：向步骤2)中的转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤之后添加牛血清白和TritonX-100进行封闭、通透2～3h，得到封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；
3)免疫荧光测定：取待测血清，添加至步骤2)中的封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞中，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温下孵育45min～2h，所述室温是指18～25℃，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录。
进一步地，所述细胞转染重组质粒过程中使用转染试剂进行转染，转染后置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24～60h，之后检测转染效果，挑选转染成功的细胞。
进一步地，将步骤2)中所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞在3～5℃条件下保存3～4周后进行免疫荧光测定。
进一步地，对转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞进行固定的温度是3～5℃，封闭和通透的温度为35～38℃。
体外检测MUSK-Ab的试剂盒，包括封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞，所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞由权利要求1的步骤2)中所述的转染细胞的固定与保存制备所得。
体外检测LRP4-Ab的试剂盒，包括封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞，所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞由权利要求1的步骤2)中所述的转染细胞的固定与保存制备所得。
转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和人肌肉特异性酪氨酸激酶蛋白(MuSK蛋白)，转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4蛋白)。MuSK蛋白能与待测血清中的抗MuSK抗体特异性结合，LRP4蛋白能与待测血清中的LRP4抗体特异性结合。如果待测血清为阳性，则待测血清中的MuSK-Ab和LRP4-Ab能与Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，即Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG结合。在荧光显微镜的激发光下，用蓝色激发光激发GFP发绿色荧光，用绿色激发光激发Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG发红色荧光，当两者Merge后呈黄色。如果待测血清为阴性，待测血清中不存在MuSK-Ab和LRP4-Ab，则只能看到蓝色激发光激发GFP发绿色荧光而不能看到红色荧光。
本发明的有益效果：
本发明的体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，包括细胞转染重组质粒、转染细胞的固定与保存以及免疫荧光测定等步骤，所使用试剂均为常规试剂，不需要依赖价格昂贵的试剂盒，检测成本较低。使用的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒和pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒可直接购买或自行构建。此外，转染细胞通过封闭和通透进行固定后，可保存3到4周，保存时间较长，可长期使用，不需要随时制备转染细胞，节省成本，节约检测时间。本发明的体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，可用于测定血清中的MuSK-Ab和LRP4-Ab，是对血清反应阴性MG的一种补充，便于准确全面的诊断重症肌无力。
附图说明
图1A为pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒图谱；
图1B为pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒图谱；
图2C为转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞荧光照片；
图2D为阳性血清与转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞共孵育荧光照片；
图2E为图2C与图2D Merge后重叠图(MuSK抗体阳性Merge后呈黄色)；
图2F为转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞荧光照片(对照用)；
图2G为阴性血清与转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞共孵育荧光照片；
图2H为图2F与图2G Merge后重叠图(MuSK抗体阴性Merge后仍呈绿色)；
图3I为转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的293T细胞荧光照片；
图3J为阳性血清与转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的293T细胞共孵育荧光照片；
图3K为图3I与图3J Merge后重叠图(LRP4抗体阳性Merge后呈黄色)；
图3L为转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的293T细胞荧光照片(对照用)；
图3M为阴性血清与转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的293T细胞共孵育荧光照片；
图3N为图3L与图3M Merge后重叠图(LRP4抗体阴性Merge后仍呈绿色)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例的体外检测MUSK-Ab的方法包括以下步骤：
1、质粒的扩增与提取
如图1所示，pCMV6-AC-GFP-MuSK质粒(RG212253)和pCMV6-AC-GFP-LRP4质粒(RG217609)购自OriGene公司。
将pCMV6-AC-GFP-MuSK质粒、pCMV6-AC-GFP-LRP4质粒以及pCMV6-AC-GFP质粒转化至大肠杆菌DH5α(感受态细胞)，用菌液涂布含氨苄青霉素的LB固体培养板。过夜培养，待阳性长出，挑取若干个阳性单菌落进行扩大培养，按照天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒的操作说明提取质粒，得到pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒、pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒以及pCMV6-AC-GFP质粒。采用PCR或限制性酶切初步鉴定pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒、pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒以及pCMV6-AC-GFP质粒，并通过基因测序对重组质粒进行鉴定。大肠杆菌DH5α由郑州大学生物工程系细胞生物学研究室馈赠。
2、293T细胞的培养
(1)将生长期293T细胞用PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1500rpm离心3min。293T细胞株由郑州大学生物工程系细胞生物学研究室馈赠。胰蛋白酶购自OXOID公司。
(2)弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液。DMEM培养基购自赛默飞世尔公司。
(3)24孔细胞培养板每孔(2.0-4.0)×104细胞数计算所需细胞悬液，将细胞悬液与培养基混匀，得到细胞悬液与培养基的混合物，取500μL细胞悬液与培养基的混合物，添加至24孔细胞培养板中，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
3、细胞转染重组质粒
(1)准备灭菌的1.5ml的EP管，加入20μL/孔无血清的DMEM培养液，按0.6μL/孔的比例加入OriGene公司的TurboFectin8.0转染试剂，静置5min。
(2)在EP管中按0.2μg/孔的比例加入pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒，轻轻混匀，静置30min，同时按同样的操作转染pCMV6-AC-GFP质粒作为对照。
(3)将EP管中的转染试剂和重组质粒的混合液，按20μL/孔加入具有293T细胞的24孔细胞培养板培养孔中，轻轻晃动24孔细胞培养板使其混合均匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h，在荧光显微镜下观察转染效果。转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和人肌肉特异性酪氨酸激酶蛋白(MuSK蛋白)。
由图2C、图2F可见，293T细胞成功转染了pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒，可表达绿色荧光蛋白。
4、转染细胞的固定与保存
(1)用移液器将培养48h后的转染细胞的培养上清轻轻移除，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤1次。
(2)每孔加300μL的4％的多聚甲醛，置于4℃冰箱固定30min，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤2次，每次5min。
(3)每孔加300μL含有0.5％TritonX-100的5％的BSA，置于37℃恒温水浴锅中3h进行封闭和通透，封闭和通透后可直接进行免疫荧光，也可置于4℃冰箱过夜备用。封闭和通透后的转染细胞放置在4℃冰箱内可保存3-4周。
5、免疫荧光测定血清中MuSK-Ab
(1)待测血清包括阳性血清和阴性血清，按1:10用BSA稀释待测血清，吸取200μL稀释后的待测血清加入到转染有重组质粒pCMV6-AC-GFP-MuSK的293T细胞中，并用PBS设空白对照孔，室温孵育1h。待测血清中的阳性血清来源于河南省(郑州大学)医药科学研究院神经免疫学研究室利用商品化的ELLSA试剂盒(抗MuSK抗体检测试剂盒，德国欧蒙医学实验诊断股份公司)筛选出的强阳性血清。
(2)弃去每孔的液体，用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤3次，每次3min。
(3)加入200μL的1:1500稀释的Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温孵育1h。Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG购自Invitrogen公司。上述室温是指18～25℃。
(4)重复步骤(2)。
(5)每孔加入200μL的0.01M、pH7.4的PBS防止细胞干燥，使用荧光显微镜观察并拍照记录结果，激发光波长分别为蓝光(420-490nm)和绿光(535-550nm)，产生绿色荧光和红色荧光，它们Merge后呈现黄色判断为阳性。荧光显微镜购自日本尼康公司。
本实施例的体外检测MUSK-Ab的试剂盒，包括上述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞。
实施例2
本实施例的体外检测MUSK-Ab的方法包括以下步骤：
1、质粒的扩增与提取方法与实施例中的一致，此处不再赘述。
2、293T细胞的培养
(1)将生长期293T细胞用PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1500rpm离心3min。
(2)弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液。
(3)48孔细胞培养板每孔(1.3-1.5)×104细胞数计算所需细胞悬液，将细胞悬液与培养基比例混匀，得到细胞悬液与培养基的混合物，取250μL细胞悬液与培养基的混合物，添加至48孔细胞培养板中，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
3、细胞转染重组质粒
(1)准备灭菌的1.5ml的EP管，加入10μL/孔无血清的DMEM培养液，按0.3μL/孔的比例加入OriGene公司的TurboFectin8.0转染试剂，静置5min。
(2)在EP管中按0.1μg/孔的比例分别加入重组质粒pCMV6-AC-GFP-MuSK，轻轻混匀，静置30min，同时按同样的操作转染pCMV6-AC-GFP质粒作为对照。
(3)将EP管中的转染试剂和重组质粒的混合液按10μL/孔加入具有293T细胞的48孔细胞培养板培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至35℃，5％CO2培养箱中培养24h，在荧光显微镜下观察转染效果。转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和人肌肉特异性酪氨酸激酶蛋白(MuSK蛋白)。
4、转染细胞的固定与保存
(1)用移液器将培养48h后的转染细胞的培养上清轻轻移除，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤1次。
(2)每孔加100μL的4％的多聚甲醛置于3℃冰箱固定30min，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤3次，每次3min。
(3)每孔加100μL含有0.5％TritonX-100的5％的BSA，置于38℃恒温水浴锅中3h进行封闭和通透，封闭和通透后可直接进行免疫荧光，也可置于3℃冰箱过夜备用。封闭和通透后的转染细胞放置在3℃冰箱内可保存3-4周。
5、免疫荧光测定血清中MuSK-Ab
(1)待测血清包括阳性血清和阴性血清，按1:10用BSA稀释待测血清，吸取100μL稀释后的待测血清加入到转染有重组质粒pCMV6-AC-GFP-MuSK的293T细胞中，并用PBS设空白对照孔，室温孵育2h。阳性血清来源于河南省(郑州大学)医药科学研究院神经免疫学研究室利用商品化的ELLSA试剂盒(抗MuSK抗体检测试剂盒，德国欧蒙医学实验诊断股份公司)筛选出的强阳性血清。
(2)弃去每孔的液体，用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤2次，每次5min。
(3)加入100μL的1:1000稀释的Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温孵育2h。上述室温是指18～25℃。
(4)重复步骤(2)。
(5)每孔加入50μL的0.01M、pH7.4的PBS防止细胞干燥，用荧光显微镜观察并拍照记录结果，激发光波长分别为蓝光(420-490nm)和绿光(535-550nm)。产生绿色荧光和红色荧光，它们Merge后呈现黄色判断为阳性。仅产生绿色荧光，且Merge后呈现绿色判断为阴性。
本实施例的体外检测MUSK-Ab的试剂盒，包括上述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞。
实施例3
本实施例的体外检测LRP4-Ab的方法包括以下步骤：
1、如图1所示，pCMV6-AC-GFP-LRP4质粒(RG217609)购自OriGene公司。
将pCMV6-AC-GFP-LRP4质粒以及pCMV6-AC-GFP质粒转化至大肠杆菌DH5α(感受态细胞)，用菌液涂布含氨苄青霉素的LB固体培养板。过夜培养，待阳性长出，挑取若干个阳性单菌落进行扩大培养，按照天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒的操作说明提取质粒，得到pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒以及pCMV6-AC-GFP质粒。采用PCR或限制性酶切初步鉴定pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒以及pCMV6-AC-GFP质粒，并通过基因测序对重组质粒进行鉴定。大肠杆菌DH5α由郑州大学生物工程系细胞生物学研究室馈赠。
2、293T细胞的培养
(1)将生长期293T细胞用PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1500rpm离心3min。
(2)弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液。
(3)24孔细胞培养板每孔(2.0-4.0)×104细胞数计算所需细胞悬液，将细胞悬液与培养基混匀，得到细胞悬液与培养基的混合物，取250μL细胞悬液与培养基的混合物，添加至48孔细胞培养板中，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
3、细胞转染重组质粒
(1)准备灭菌的1.5ml的EP管，加入10μL/孔无血清的DMEM培养液，按0.3μL/孔的比例加入OriGene公司的TurboFectin8.0转染试剂，静置5min。
(2)在EP管中按0.1μg/孔的比例加入pCMV6-AC-GFP-LRP4，轻轻混匀，静置15-30min，同时按同样的操作转染pCMV6-AC-GFP质粒作为对照。
(3)将EP管中的转染试剂和重组质粒的混合液按10μL/孔加入具有293T细胞的48孔细胞培养板培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至38℃，5％CO2培养箱中培养48h，在荧光显微镜下观察转染效果。转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4蛋白)。
由图3I、图3L可见，293T细胞成功转染了pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒，可表达绿色荧光蛋白。
4、转染细胞的固定与保存
(1)用移液器将培养48h后的转染细胞的培养上清轻轻移除，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤1次。
(2)每孔加100μL的4％的多聚甲醛置于4℃冰箱固定15min，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤3次，每次3min。
(3)每孔加100μL含有0.5％TritonX-100的5％的BSA，置于37℃恒温水浴锅中3h进行封闭和通透，封闭和通透后可直接进行免疫荧光，也可置于4℃冰箱过夜备用。封闭和通透后的转染细胞放置在4℃冰箱内可保存3-4周。
5、免疫荧光测定血清中LRP4-Ab
(1)待测血清包括阳性血清和阴性血清，按1:10用BSA稀释待测血清，吸取100μL稀释后的待测血清加入到转染有pCMV6-AC-GFP-LRP4的293T细胞中，并用PBS设空白对照孔，室温孵育45min。阳性血清来源于河南省(郑州大学)医药科学研究院神经免疫学研究室利用商品化的ELLSA试剂盒(抗MuSK抗体检测试剂盒，德国欧蒙医学实验诊断股份公司)筛选出的强阳性血清。
(2)弃去每孔的液体，用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤2次，每次5min。
(3)加入100μL的1:1000稀释的Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温孵育45min。上述室温是指18～25℃。
(4)重复步骤(2)。
(5)每孔加入50μL的0.01M、pH7.4的PBS防止细胞干燥，用荧光显微镜观察并拍照记录结果，激发光波长分别为蓝光(420-490nm)和绿光(535-550nm)。产生绿色荧光和红色荧光，它们Merge后呈现黄色判断为阳性。仅产生绿色荧光，且Merge后呈现绿色判断为阴性。
本实施例的体外检测LRP4-Ab的试剂盒，包括上述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞。
实施例4
本实施例的体外检测LRP4-Ab的方法包括以下步骤：
1、质粒的扩增与提取方法与实施例3中的一致，此处不再赘述。
2、293T细胞的培养
(1)将生长期293T细胞用PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1500rpm离心3min。
(2)弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液。
(3)48孔细胞培养板每孔(1.3-1.5)×104细胞数计算所需细胞悬液，将细胞悬液与培养基比例混匀，得到细胞悬液与培养基的混合物，取250μL细胞悬液与培养基的混合物，添加至48孔细胞培养板中，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
3、细胞转染重组质粒
(1)准备灭菌的1.5ml的EP管，各加入10μL/孔无血清的DMEM培养液，按0.3μL/孔的比例加入OriGene公司的3转染试剂，静置5min。
(2)在EP管中按0.1μg/孔的比例加入pCMV6-AC-GFP-LRP4，轻轻混匀，静置15-30min，同时按同样的操作转染pCMV6-AC-GFP质粒作为对照。
(3)将EP管中的转染试剂和重组质粒的混合液按10μL/孔加入具有293T细胞的48孔细胞培养板培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至37℃，5％CO2培养箱中培养60h，在荧光显微镜下观察转染效果。转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4蛋白)。
4、转染细胞的固定与保存
(1)用移液器将培养48h后的转染细胞的培养上清轻轻移除，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤1次。
(2)每孔加100μL的4％的多聚甲醛置于5℃冰箱固定20min，然后用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤3次，每次3min。
(3)每孔加100μL含有0.5％TritonX-100的5％的BSA，置于37℃恒温水浴锅中3h进行封闭和通透，封闭和通透后可直接进行免疫荧光，也可置于5℃冰箱过夜备用。封闭和通透后的转染细胞放置在5℃冰箱内可保存3-4周。
5、免疫荧光测定血清中LRP4-Ab
(1)待测血清包括阳性血清和阴性血清，按1:10用BSA稀释待测血清，吸取100μL稀释后的待测血清加入到转染有pCMV6-AC-GFP-LRP4的293T细胞中，并用PBS设空白对照孔，室温下孵育1h。阳性血清来源于河南省(郑州大学)医药科学研究院神经免疫学研究室利用商品化的ELLSA试剂盒(抗MuSK抗体检测试剂盒，德国欧蒙医学实验诊断股份公司)筛选出的强阳性血清。
(2)弃去每孔的液体，用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液进行洗涤2次，每次5min。
(3)加入100μL的1:1000稀释的Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温下孵育1h。上述室温是指18～25℃。
(4)重复步骤(2)。
(5)每孔加入50μL的0.01M、pH7.4的PBS防止细胞干燥，用荧光显微镜观察并拍照记录结果，激发光波长分别为蓝光(420-490nm)和绿光(535-550nm)。产生绿色荧光和红色荧光，它们Merge后呈现黄色判断为阳性。仅产生绿色荧光，且Merge后呈现绿色判断为阴性。
本实施例的体外检测LRP4-Ab的试剂盒，包括上述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞。
设置阳性对照、阴性对照与空白对照。阳性对照包括抗MuSK阳性血清和抗MuSK阳性血清，阴性对照为抗MuSK阴性血清和抗MuSK阴性血清，空白对照为转染pCMV6-AC-GFP质粒的293T细胞。
测试结果如图2和3所示。
对测试结果进行评估。根据红色荧光与绿色荧光重叠出现频率和强度进行评分，评分标准如表1所示。
表1评分标准
阳性标准为评分≥1，每次评分由两人观看，评分误差不超过0.5。阳性结果需要复检，两次测试结果的评分相同。
图2C和图2F为转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒48h后的293T细胞，胞膜一侧出现一团聚集的绿色荧光，出现相对集中的绿色荧光，胞膜其他区域也出现绿色荧光，但相对较弱，表示质粒转染成功。
图2D和图2G分别为分别为抗MuSK阳性血清与转染细胞共孵育、抗MuSK阴性血清与转染细胞共孵育，抗MuSK阳性血清和转染细胞共孵育后胞膜出现红色荧光，抗MuSK阴性血清和转染细胞共孵育后胞膜不显色。
图2E和图2H分别为Merge后重叠图，抗MuSK阳性血清Merge后呈黄色，抗MuSK阴性血清Merge后仍呈绿色。
图3I和图3L为转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒48h后的293T细胞，靠近胞膜内侧出现相对集中的绿色荧光，胞膜上荧光较亮，且均匀分布，表示质粒转染成功。
图3J和图3M分别为分别为抗LRP4阳性血清与转染细胞共孵育、抗LRP4阴性血清与转染细胞共孵育，抗LRP4阳性血清和转染细胞共孵育后胞膜出现红色荧光，抗LRP4阴性血清和转染细胞共孵育后胞膜不显色。
图3K和图3N分别为Merge后重叠图，抗LRP4阳性血清Merge后呈黄色，抗LRP4阴性血清Merge后仍呈绿色。
由图2和图3可见，细胞免疫荧光法可准确测定血清中的抗MuSK抗体和抗LRP4抗体是阴性或阳性，从而便于全面、准确的诊断重症肌无力。
Claims (5)
1.体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)细胞转染重组质粒：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒和/或pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒，得到转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；
2)转染细胞的固定与保存：向步骤2)中的转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液洗涤之后添加牛血清白蛋白和TritonX-100进行封闭、通透2～3h，得到封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；
3)免疫荧光测定：将步骤2)中所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞在3～5℃条件下保存3～4周后进行免疫荧光测定；取待测血清，添加至封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞中，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录；拍照时拍摄转染重组质粒的293T细胞荧光照片以及待测血清与转染重组质粒的293T细胞共孵育荧光照片，将转染重组质粒的293T细胞荧光照片以及待测血清与转染重组质粒的293T细胞共孵育荧光照片Merge后，根据Merge后呈现的颜色判断待测血清是阳性或阴性。
2.根据权利要求1所述的体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，其特征在于，所述细胞转染重组质粒过程中使用转染试剂进行转染，转染后置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24～60h，之后检测转染效果，挑选转染成功的细胞。
3.根据权利要求1所述的体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，其特征在于，对转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞进行固定的温度是3～5℃，封闭和通透的温度为35～38℃。
4.体外检测MUSK-Ab的试剂盒，其特征在于，包括封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞，所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞由权利要求1的步骤2)中所述的转染细胞的固定与保存制备所得。
5.体外检测LRP4-Ab的试剂盒，其特征在于，包括封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞，所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞由权利要求1的步骤2)中所述的转染细胞的固定与保存制备所得。
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| MuSK荧光蛋白的制备及rapsyn基因多态性在重症肌无力的研究;金权鑫;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20160115(第1期);第E070-60页 * |
| 微小隐孢子虫P23 基因真核表达质粒在HeLa 细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测;游艳敏 等;《中国兽医科学》;20180120;第48卷(第5期);第566-573页 * |
| 抗PLA2R抗体检测方法的建立及在膜性肾病中的应用;王武涛;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20150415(第4期);第E067-15页 * |
| 重症肌无力患者胸腺组织抗原处理与提呈相关基因表达的研究;梁玉 等;《中华实用诊断与治疗杂志》;20150331;第29卷(第3期);第223-225页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108931513A (zh) | 2018-12-04 |
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