CN115808522A - 一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1‑Ab检测方法及试剂盒，所述的检测方法基于双色间接细胞免疫荧光法，通过转染细胞表达自带GFP荧光信号的抗原蛋白，并使用红色荧光二抗显示捕获的标本中的阳性抗体，在荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发下，依据Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质，包括重组质粒pSJMY‑CNTN1‑GFPc的构建、鉴定与扩增、验证pSJMY‑CNTN1‑GFPc质粒表达情况、转染细胞的固定与破膜和人CNTN1‑Ab的测定等步骤，所述试剂盒依据所述的抗体检测方法制得。本发明提出的检测方法显著提高抗体检测的特异性，基本保持了目的抗原蛋白的空间构象，最大程度还原了抗原抗体结合的自然状态、自身抗体可视化，观察直观，且可同时在细胞中定位抗原和抗体。
Description
技术领域
本发明涉及CNTN1-Ab测定技术领域，特别涉及一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒。
背景技术
慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)是一种包含复杂临床表型和病理生理机制的周围神经炎症性疾病，具有异质性。随着实验室检查的发展和CIDP疾病谱的扩大，多种针对朗飞氏的结构组分的自身抗体被检测并报道，如抗接触蛋白-1(CNTN1)抗体、抗神经束蛋白155(NF155)抗体、抗神经束蛋白140/186(NF140/186)抗体、抗接触蛋白相关蛋白-1(Caspr1)抗体等，这些抗体的发现有助于揭示CIDP的发病机制、寻找特异性的生物标志物并制定个体化治疗方案。CIDP的免疫发病机制尚不清楚，但目前研究显示多种自身抗体和CIDP的发病密切相关，特别是针对朗飞氏结的结构组分是CIDP患者自身抗体攻击的关键靶点，包括抗接触蛋白-1(contactin1，CNTN1)抗体、抗神经束蛋白155(neurofascin 155，NF155)抗体、抗神经束蛋白140/186(neurofascin 140/186，NF140/186)抗体、抗接触蛋白相关蛋白-1(contactin-associated protein，Caspr1)抗体等均与CIDP的特殊亚型相关，这些抗体属于IgG4亚型，是一种抗炎抗体，不激活补体或细胞介导的细胞毒性作用，但由于抗原的高亲和性，可导致轴胶质相互作用的中断。不同抗体表现出不同的免疫病理机制、临床表型和治疗反应，因此通过实验室检验来识别不同类型的抗体对于CIDP的发病机制、寻找特异性的生物标志物并制定个体化治疗方案具有重要意义。
CNTN1位于结旁区，是轴膜端细胞黏附分子之一，广泛表达于背根神经节，是隔离结区和近结旁区离子通道的重要组分。研究显示抗CNTN1抗体阳性CIDP患者的有髓纤维表现出副神经节破坏，光镜检查显示在没有炎症或水肿的情况下有髓纤维密度略有下降，偶见髓磷脂样卵形物。此外，电镜检查显示轴膜上的髓鞘末梢脱落，所有这些神经结构的病理改变一方面提示了抗CNTN1抗体的致病性；另一方面也显示了该抗体的作用靶点。随着研究的深入，现已确认基于上述病理改变而导致的共济失调是抗CNTN1抗体阳性CIDP患者的显著临床特征。
目前，针对人CNTN1-Ab的体外检测多采用酶联免疫方法(ELISA)，这种方法存在特异性、灵敏度较差的问题，尤其在检测结合力较弱的抗体时容易出现假阴性结果，近年来又发展有转染细胞法，这种方法检测的是膜抗原自身抗体，但是现有的转染细胞法为单色荧光，无法同时在细胞中定位抗原和抗体，抗体检测的特异性较差。为此，我们提出一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒，基于双色间接细胞免疫荧光法，通过转染细胞表达自带GFP荧光信号的抗原蛋白，并使用红色荧光二抗显示捕获的标本中的阳性抗体，在荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发下，依据Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒，所述的检测方法基于双色间接细胞免疫荧光法，通过转染细胞表达自带GFP荧光信号的抗原蛋白，并使用红色荧光二抗显示捕获的标本中的阳性抗体，在荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发下，依据Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质，所述的检测方法包括以下步骤：
步骤一，重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc的构建、鉴定与扩增
抽提人组织中的总RNA进行反转录获取cDNA，根据CNTN1的基因序列设计并合成上下游引物，将RT-PCR扩增产物CNTN1的前后两个片段分别与T载体进行TA克隆，将经PCR鉴定的大小位置正确的转化子接菌培养后提取质粒，限制性酶切及测序鉴定，挑选前、后片段测序均正确的转化子进行重组组合，将前后片段分别从T载体上切胶回收，插入到C端含有GFP绿色荧光标签的空载体pSJMY-GFPc、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，培养重组克隆成功的载体提取质粒，进一步通过目的基因PCR、限制性酶切、基因测序等方式对重组质粒进行鉴定，选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养板，37℃生长16h以后挑选单菌落扩大培养，使用质粒提取试剂盒说明书提取，获得重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc；
步骤二，验证pSJMY-CNTN1-GFPc质粒表达情况
将生长期HEK293T细胞用1mL PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1000-1500rpm离心3-5min后弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液并计数，按1.1×105个/cm2密度将细胞分别种至6/24/48孔板中，放至37℃、5％ CO2培养箱中培养24h，准备灭菌的4ml的EP管，分别加入80/20/10μL/孔无血清的DMEM培养液，按转染试剂与质粒的体积重量比为3：1的比例加入TurboFectin8.0转染试剂，静置5min，按0.8/0.2/0.1μg/孔的比例分别加入重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc，轻轻混匀，静置至少30min后将准备好的转染试剂和重组质粒的混合液按80/20/10μL/孔加入6孔板相应的培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至37℃，5％ CO2培养箱中培养48h，在荧光显微镜下观察转染效果，并使用CNTN1抗体进行WB验证；
步骤三，转染细胞的固定与破膜
弃去pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤之后，采用4％甲醛溶液在4℃冰箱中固定15-30min，弃去4％甲醛溶液，使用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤三次，每次5min；含有5％牛血清白蛋白和0.5％TritonX-100的PBS溶液在室温下封闭、通透3h，或者在4℃下过夜封闭、通透，获得处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞；
步骤四，人CNTN1-Ab的测定
取待测血清，以1：10的稀释浓度添加至处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中，室温下孵育30min，PBS洗涤之后加入Alexa Fluor TM标记的羊抗人IgG，室温下孵育30min，PBS洗涤三次，每次五分钟，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录，并根据图像中Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质。
进一步的，所述步骤一中反转录获取cDNA的具体方法为：按TRNzol Universal总RNA提取试剂说明书抽提人组织中的总RNA，将其溶于20微升DEPC水中，总RNA提取后以紫外分光光度计测定A260/A280比值，测得该比值稳定于1.8～2.0范围时，检测总RNA浓度，并按PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit提供操作说明书进行反转录获取cDNA，所得cDNA于-20℃保存。
进一步的，所述步骤一中上下游引物的序列如下：
上游引物序列：5’-ATTGCGATCGCCATGTGGTTGCTGGTCA-3’
下游引物序列：5’-CGTACGCGTGAATTCCAAGTAGACAAGG-3’。
进一步的，所述步骤一中重组克隆成功的判定方法为：以上下游引物对转化子进行菌落扩增，如能扩出全长片段，即认为重组克隆成功。
进一步的，所述步骤四中抗体阳性的判定依据为：当Merge后细胞表面成黄色时，判定为抗体阳性，否则为阴性。
进一步的，所述试剂盒依据所述的抗体检测方法制得。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提出的CNTN1-Ab检测方法与传统ELISA和单色细胞免疫荧光法相比较，基本保持了目的抗原蛋白的空间构象，最大程度还原了抗原抗体结合的自然状态；
(2)本发明提出的CNTN1-Ab检测方法与传统ELISA和单色细胞免疫荧光法相比较，自身抗体可视化，观察直观，如患者自身抗体阳性，则在荧光显微镜下可见到发出的荧光信号；
(3)本发明提出的CNTN1-Ab检测方法与传统ELISA和单色细胞免疫荧光法相比较，可同时在细胞中定位抗原和抗体，只有两者位置重合才能判为阳性，显著提高了抗体检测的特异性。
附图说明
图1为本发明一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本发明的限制，为了更好地说明本发明的具体实施方式，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸。
实施例1
如图1所示，一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒，检测方法基于双色间接细胞免疫荧光法，通过转染细胞表达自带GFP荧光信号的抗原蛋白，并使用红色荧光二抗显示捕获的标本中的阳性抗体，在荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发下，依据Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质，检测方法包括以下步骤：
步骤一，重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc的构建、鉴定与扩增
抽提人组织中的总RNA进行反转录获取cDNA，根据CNTN1的基因序列设计并合成上下游引物，将RT-PCR扩增产物CNTN1的前后两个片段分别与T载体进行TA克隆，将经PCR鉴定的大小位置正确的转化子接菌培养后提取质粒，限制性酶切及测序鉴定，挑选前、后片段测序均正确的转化子进行重组组合，将前后片段分别从T载体上切胶回收，插入到C端含有GFP绿色荧光标签的空载体pSJMY-GFPc、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，培养重组克隆成功的载体提取质粒，进一步通过目的基因PCR、限制性酶切、基因测序等方式对重组质粒进行鉴定，选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养板，37℃生长16h以后挑选单菌落扩大培养，使用质粒提取试剂盒说明书提取，获得重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc；
步骤二，验证pSJMY-CNTN1-GFPc质粒表达情况
将生长期HEK293T细胞用1mL PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1000-1500rpm离心3-5min后弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液并计数，按1.1×105个/cm2密度将细胞分别种至6/24/48孔板中，放至37℃、5％ CO2培养箱中培养24h，准备灭菌的4ml的EP管，分别加入80/20/10μL/孔无血清的DMEM培养液，按转染试剂与质粒的体积重量比为3：1的比例加入TurboFectin8.0转染试剂，静置5min，按0.8/0.2/0.1μg/孔的比例分别加入重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc，轻轻混匀，静置至少30min后将准备好的转染试剂和重组质粒的混合液按80/20/10μL/孔加入6孔板相应的培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至37℃，5％ CO2培养箱中培养48h，在荧光显微镜下观察转染效果，并使用CNTN1抗体进行WB验证；
步骤三，转染细胞的固定与破膜
弃去pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤之后，采用4％甲醛溶液在4℃冰箱中固定15-30min，弃去4％甲醛溶液，使用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤三次，每次5min；含有5％牛血清白蛋白和0.5％TritonX-100的PBS溶液在室温下封闭、通透3h，或者在4℃下过夜封闭、通透，获得处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞；
步骤四，人CNTN1-Ab的测定
取待测血清，以1：10的稀释浓度添加至处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中，室温下孵育30min，PBS洗涤之后加入Alexa Fluor TM标记的羊抗人IgG，室温下孵育30min，PBS洗涤三次，每次五分钟，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录，并根据图像中Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质。
步骤一中反转录获取cDNA的具体方法为：按TRNzol Universal总RNA提取试剂说明书抽提人组织中的总RNA，将其溶于20微升DEPC水中，总RNA提取后以紫外分光光度计测定A260/A280比值，测得该比值稳定于1.8～2.0范围时，检测总RNA浓度，并按PrimeScriptII 1st Strand cDNASynthesis Kit提供操作说明书进行反转录获取cDNA，所得cDNA于-20℃保存。
步骤一中上下游引物的序列如下：
上游引物序列：5’-ATTGCGATCGCCATGTGGTTGCTGGTCA-3’
下游引物序列：5’-CGTACGCGTGAATTCCAAGTAGACAAGG-3’。
步骤一中重组克隆成功的判定方法为：以上下游引物对转化子进行菌落扩增，如能扩出全长片段，即认为重组克隆成功。
步骤四中抗体阳性的判定依据为：当Merge后细胞表面成黄色时，判定为抗体阳性，否则为阴性。
试剂盒依据抗体检测方法制得。
通过采用上述技术方案：人CNTN1-Ab检测方法具体实施步骤为：
一、重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc的构建、鉴定与扩增
1、总RNA提取及cDNA合成
按TRNzol Universal总RNA提取试剂说明书抽提人组织中的总RNA，将其溶于20微升DEPC水中；总RNA提取后以紫外分光光度计测定A260/A280比值，测得该比值稳定于1.8～2.0，检测总RNA浓度。反转录操作按PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit提供操作说明书进行，所得cDNA于-20℃保存。
2、获取CNTN1目的基因
从NCBI网站上查找并下载分析CNTN1序列，设计相应合适的上下游引物，送公司合成。
引物序列如下：
上游引物序列：5’-ATTGCGATCGCCATGTGGTTGCTGGTCA-3’
下游引物序列：5’-CGTACGCGTGAATTCCAAGTAGACAAGG-3’
将RT-PCR扩增产物CNTN1的前后两个片段分别与T载体进行TA克隆，转化后挑取部分转化子菌落PCR鉴定，将大小位置正确的转化子接菌，培养，提取质粒，限制性酶切及测序鉴定。
3.重组表达载体的构建与鉴定
挑选前、后片段测序均正确的转化子进行重组组合，将前后片段分别从T载体上切胶回收，插入到C端含有GFP绿色荧光标签的空载体pSJMY-GFPc、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。以上下游引物对转化子进行菌落扩增，如能扩出全长片段，即认为重组克隆成功。之后培养，提取质粒，进一步通过目的基因PCR、限制性酶切、基因测序等方式对重组质粒进行鉴定。选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌等工作。
4、pSJMY-CNTN1-GFPc质粒的扩增与提取
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养板，37℃生长16h以后挑选单菌落扩大培养，使用质粒提取试剂盒说明书提取质粒，命名为pSJMY-CNTN1-GFPc质粒。
二、验证pSJMY-CNTN1-GFPc质粒表达情况
1、细胞培养
1)将生长期HEK293T细胞用1mL PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1000-1500rpm离心3-5min；
2)弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液并计数。
3)按1.1×105个/cm2密度将细胞种至6/24/48孔板中，放至37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
2.细胞转染
1)准备灭菌的4ml的EP管，加入80/20/10μL/孔无血清的DMEM培养液，按质粒：转染试剂的重量体积比为1:3的比例加入OriGene公司的TurboFectin8.0转染试剂，静置5min；
2)按0.8/0.2/0.1μg/孔的比例分别加入重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc，轻轻混匀，静置至少30min；
3)将准备好的转染试剂和重组质粒的混合液按80/20/10μL/孔加入6孔板相应的培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至37℃，5％ CO2培养箱中培养48h，在荧光显微镜下观察转染效果，并使用CNTN1抗体进行WB验证。
三、转染细胞的固定与破膜
弃去pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤之后，采用4％甲醛溶液在4℃冰箱中固定15-30min。弃去4％甲醛溶液，使用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻洗涤三次，每次5min；含有5％牛血清白蛋白和0.5％TritonX-100的PBS溶液在室温下封闭、通透3h，或者在4℃下过夜封闭、通透，获得处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞。
四、人CNTN1-Ab的测定
取待测血清，以1：10的稀释浓度添加至破膜后的转染细胞中，室温下孵育30min，PBS洗涤之后加入Alexa Fluor TM标记的羊抗人IgG(荧光二抗)，室温下孵育30min，PBS洗涤三次，每次五分钟，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录，当Merge后细胞表面成黄色时，判定为抗体阳性，否则为阴性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法，所述的检测方法基于双色间接细胞免疫荧光法，通过转染细胞表达自带GFP荧光信号的抗原蛋白，并使用红色荧光二抗显示捕获的标本中的阳性抗体，在荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发下，依据Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
步骤一，重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc的构建、鉴定与扩增；
步骤二，验证pSJMY-CNTN1-GFPc质粒表达情况；
1)细胞培养
1.1)将生长期HEK293T细胞用1mL PBS缓冲液洗涤一次，用胰蛋白酶消化并在显微镜下观察，待细胞变圆后用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其呈单个细胞，然后收集细胞悬液以1000-1500rpm离心3-5min；
1.2)弃上清，然后以1ml的含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬，制成细胞悬液并计数；
1.3)按1.1×105个/cm2密度将细胞分别种至6/24/48孔板中，放至37℃、5％CO2培养箱中培养24h，
2)细胞转染
2.1)准备灭菌的4ml的EP管，分别加入80/20/10μL/孔无血清的DMEM培养液，按转染试剂与质粒的体积重量比为3：1的比例加入TurboFectin8.0转染试剂，静置5min；
2.2)按0.8/0.2/0.1μg/孔的比例分别加入重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc，轻轻混匀，静置至少30min；
2.3)将准备好的转染试剂和重组质粒的混合液按80/20/10μL/孔加入6孔板相应的培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，放至37℃，5％CO2培养箱中培养48h，在荧光显微镜下观察转染效果，并使用CNTN1抗体进行WB验证；
步骤三，转染细胞的固定与破膜；
弃去pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤之后，采用4％甲醛溶液在4℃冰箱中固定15-30min，弃去4％甲醛溶液，使用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤三次，每次5min；含有5％牛血清白蛋白和0.5％TritonX-100的PBS溶液在室温下封闭、通透3h，或者在4℃下过夜封闭、通透，获得处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞；
步骤四，人CNTN1-Ab的测定；
取待测血清，以1：10的稀释浓度添加至处理后的pSJMY-CNTN1-GFPc质粒转染细胞中，室温下孵育30min，PBS洗涤之后加入Alexa Fluor TM标记的羊抗人IgG，室温下孵育30min，PBS洗涤三次，每次五分钟，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录，并根据图像中Merge后细胞表面的颜色判定抗体性质。
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法，其特征在于：所述步骤一中，
1)抽提人组织中的总RNA进行反转录获取cDNA；
2)根据CNTN1的基因序列设计并合成上下游引物，将RT-PCR扩增产物CNTN1的前后两个片段分别与T载体进行TA克隆，将经PCR鉴定的大小位置正确的转化子接菌培养后提取质粒，限制性酶切及测序鉴定；
3)挑选前、后片段测序均正确的转化子进行重组组合，将前后片段分别从T载体上切胶回收，插入到C端含有GFP绿色荧光标签的空载体pSJMY-GFPc、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，培养重组克隆成功的载体提取质粒，进一步通过目的基因PCR、限制性酶切、基因测序的方式对重组质粒进行鉴定，选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌；
4)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养板，37℃生长16h以后挑选单菌落扩大培养，使用质粒提取试剂盒说明书提取，获得重组质粒pSJMY-CNTN1-GFPc。
3.根据权利要求2所述的一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法，其特征在于：所述步骤一中，反转录获取cDNA的具体方法为：按TRNzol Universal总RNA提取试剂说明书抽提人组织中的总RNA，将其溶于20微升DEPC水中，总RNA提取后以紫外分光光度计测定A260/A280比值，测得该比值稳定于1.8～2.0范围时，检测总RNA浓度，并按PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit提供操作说明书进行反转录获取cDNA，所得cDNA于-20℃保存。
4.根据权利要求2所述的一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法，其特征在于：所述步骤一中上下游引物的序列如下：
上游引物序列：5’-ATTGCGATCGCCATGTGGTTGCTGGTCA-3’下游引物序列：5’-CGTACGCGTGAATTCCAAGTAGACAAGG-3’。
5.根据权利要求2所述的一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法，其特征在于：所述步骤一中重组克隆成功的判定方法为：以上下游引物对转化子进行菌落扩增，如能扩出全长片段，即认为重组克隆成功。
6.根据权利要求1所述的一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法，其特征在于：所述步骤四中抗体阳性的判定依据为：当Merge后细胞表面成黄色时，判定为抗体阳性，否则为阴性。
7.一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab试剂盒，其特征在于：所述试剂盒依据权利要求1-6任一所述的一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法制得。
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