CN109734792A

CN109734792A - 人cntn1抗原、人cntn1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109734792A
Application number: CN201910043655.XA
Authority: CN
Inventors: 王颖; 张崇珍; 郝洪军
Original assignee: WUHAN EASYDIAGNOSIS BIOMEDICAINE CO Ltd
Current assignee: WUHAN EASYDIAGNOSIS BIOMEDICAINE CO Ltd
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: CN109734792B

Abstract

本发明提供了人CNTN1抗原、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。人CNTN1抗原包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，还提供了四种分别含有上述四种人CNTN1的抗原的检测试剂盒，以及一种同时含有上述四种人CNTN1抗原的检测试剂盒。该人CNTN1检测试剂盒，检测人血清中的CNTN1抗体，特异性强，反应灵敏度高，高通量、成本低，能够对慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)进行诊断，适于大规模推广应用。

Description

人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)是以周围神经近端慢性脱髓鞘为主要病变的自身免疫性运动感觉性周围神经病，属于慢性获得性脱髓鞘性多发性神经病(ADP)，是CADP最常见的一种类型，呈慢性进展或缓解-复发病程。近年来，结区/结旁区相关抗体是CIDP领域研究的热点。CNTN1(接触蛋白1)是位于郎飞氏结旁区的一种蛋白质，对于维持郎飞氏结旁的轴突胶质联结和保持郎飞氏结的神经信号跳跃性传导有重要作用。研究表明，30％的CIDP患者血清中的IgG抗体会与结区、结旁区结构结合，参与CIDP的病理生理机制。此外，结区/结旁区抗体阳性的患者具有特征性的临床表现和特殊的治疗选择。目前还没有人CNTN1抗体检测试剂盒的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种人CNTN1抗原及其制备方法、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒具有较高灵敏度和特异性，对慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)的检测有重要价值。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于一种人CNTN1抗原，包括以下任意一种片段或者四种片段：

片段1：CNTN1-39，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段2：CNTN1-322，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

片段3：CNTN1-609，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：CNTN1-809，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的之二在于提供人CNTN1抗原的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的4个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建4个重组表达质粒；

步骤2、将构建好的重组质粒转化分别进入表达菌，构建4个重组表达工程菌；

步骤3、CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的的诱导表达及纯化。

具体地，所述步骤1中所述4个片段的引物对分别为：

CNTN1-39-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

CNTN1-39-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

CNTN1-322-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

CNTN1-322-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

CNTN1-609-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

CNTN1-609-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

CNTN1-809-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

CNTN1-809-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

具体地，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O 38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA 1ul；Taq E 0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

具体地，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将4个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时。

具体地，所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mMNa₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

本发明的目的之三在于所述表达载体为4个，所述4个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示。

本发明的目的之四在于提供一种人CNTN1抗原的表达工程菌，该工程菌为4个，所述4个工程菌分别包含所述4个人CNTN1抗原的表达载体。

本发明的目的之五在于提供人CNTN1抗体检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：

(A)包被所述的人CNTN1抗原的ELISA酶标板；所述人CNTN1抗原包括CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809中的任意一种或者四种；

(B)标准阴性血清：CNTN1抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：CNTN1抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

其中，所述人CNTN1抗原中CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609和CNTN1-809片段的最优包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml和150ng/ml。

本发明的目的之六在于提供人CNTN1抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将所述的人CNTN1抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述人CNTN1抗原包括CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809中的任意一种或者四种；

(2)待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

(3)酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

(4)加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。

本发明的目的之七在于提供所述的ELISA检测试剂盒在诊断慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病中的应用。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供了人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及检测方法，首先制备得到人CNTN1抗原(CNTN1-39，CNTN1-322，CNTN1-609，CNTN1-809中任意一种或多种)，然后以人CNTN1抗原为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该试剂盒可以用于检测诊断慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP，特异性强，灵敏度高，稳定性好。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的构建的重组质粒的酶切图；其中，(A)为包含CNTN1-39的重组质粒的酶切图；(B)为包含CNTN1-322的重组质粒的酶切图；(C)为包含CNTN1-609的重组质粒的酶切图；(D)为包含CNTN1-809的重组质粒的酶切图；其中1泳道为未酶切的质粒，2泳道为经相应的内切酶酶切的条带；(E)为Marker条带图，该Marker为1Kb ladder；

图2为本发明实施例2提供的CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809片段的纯化产物电泳图。

具体实施方式

实施例1构建重组表达质粒以及工程菌

1、接触蛋白是免疫球蛋白超家族中的一个亚群,其成员包括CNTN1、CNTN2、CNTN3、CNTN4、CNTN5和CNTN6。接触蛋白CNTN1是第一个被识别的接触蛋白成员,基因位于染色体12q11-q12区域,分子量为135kDa,其结构由6个Ig样的区域,4个Ⅲ型纤维连接蛋白样(fibronectin typeⅢ-like,FNⅢ-like)片段和以锚定的方式连接在细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)组成。全长1018个氨基酸，其中氨基末端有20个氨基酸组成的信号肽序列。本研究对CNTN1蛋白的氨基酸序列经过包括亲水性、表面可及性等分析，并结合其空间构象和各个结构域的修饰特点，将成熟的CNTN1蛋白分成了4个片段以分别获取。

2、PCR扩增人CNTN1抗原基因

1、将4个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物(带上酶切位点)PCR扩增，设计PCR引物如表1所示，下划线的部分是限制性核酸内切酶位点。

表1

2、运用PCR扩增体系如表2所示，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,45S,→57℃,150S,→72℃,90S)×32→72℃,10min。扩增产物用于后续酶切酶连。

表2

4、PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，酶切，酶连，分别将4个DNA片段连接进PET-28a表达载体构建重组表达质粒。重组质粒跑胶酶切图见说明书附图1。

5、将构建好的重组质粒转化BL21(DE3)菌，构建重组菌，重组菌的测序结果表明该4个重组菌构建成功。

实施例2抗原的表达及纯化

1、用构建成的重组蛋白表达工程菌进行诱导表达实验。将4个重组菌分别接种于600ml的LB培养液(成分：10g氯化钠/升、10g蛋白胨/升和5g酵母浸膏/升)，37度200RPM摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4小时。离心，收菌，准备纯化。

2、纯化选择的填料是GE的Ni Sepharose(货号是17-0729-10)，根据其说明书分别配制如下溶液：

上样缓冲液A：0.5M NaCl+20mM Na₂HPO₃+10mM咪唑。

结合缓冲液B：0.5M NaCl+20mM Na₂HPO₃+20mM咪唑

洗脱缓冲液C：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑；

以及用于纯化包涵体的溶液：

纯化包涵体抗原的上样缓冲液a：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑、8M尿素；

结合缓冲液b：0.5MNaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑、8M尿素；

洗脱缓冲液c：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、300mM咪唑、8M尿素。

3、将4种离心收集的细菌用上样缓冲液A分散均匀，超声(250W，超3s，间隔3s，全程20min)、第一次离心(12000RPM，15min，4℃)，得到含较高浓度的目的抗原的上清溶液。包涵体抗原需将第一次离心的沉淀用上样缓冲液a再分散均匀，再超声(250W，超3s，间隔3s，全程20min)、再离心(12000RPM，15min，4℃)，弃掉沉淀，得到含较高浓度的目的抗原的溶液。将该4种目的蛋白的溶液对填料柱分别进行上样、洗涤、洗脱，分别得到4个目的蛋白。纯化好的包涵体抗原需复性，采用与待复性包涵体抗原同体积的含不同尿素浓度(4.5M、3.5M、2.5M、1.5M、0.5M、0M)的复性缓冲液继续透析复性，每种复性缓冲液透析4小时。

可溶性抗原(CNTN1-609)和复性完的包涵体抗原(CNTN1-39、CNTN1-322和CNTN1-809)，进行12％浓度凝胶的SDS-PAGE电泳，检测四个目的蛋白纯度分别为：93.1％，95.6％，94.3％，和96.1％。见说明书附图2。每种抗原测定浓度后储存备用。

实施例3人CNTN1抗体检测试剂盒及使用方法

1、包被酶标板

(1)包被液：NaCl 8.5g,Na₂HPO₄·12H₂O 30.8g，KH₂PO₄2.2g,加ddH₂O至1000ml，调PH至7.4。

(2)包被用洗液：NaCl 8.0g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH₂O至1000ml，调至PH7.4。

(3)包被方法：将4个CNTN1抗原片段分别用0.1M PBS(PH7.4)包被缓冲液进行包被在酶标板孔内，4度过夜，其中CNTN1-39，CNTN1-322、CNTN1-609和CNTN1-809的包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml和150ng/ml。96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去包被液，包被用洗液洗板3次。

2、封闭：

(1)包被用封闭液：Na₂HPO₄·12H₂O 3.582g，NaH₂PO₄·2H₂O1.561g，NaCl 9.0g，BSA20g，木糖10g，调pH至7.2，定容至1000ml。

(2)封闭操作：空干包被用洗液，用1.5％BSA封闭液37度封闭2小时，或者置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥密封备用。

3、阴阳性血清的孵育(一抗孵育)

将待检测的血清按10-100倍稀释，分别加入4种抗原的板条内(每种抗原有经过优化的特定的血清稀释倍数)，并加入阳性对照和阴性对照，37度孵育1小时，用洗涤液进行洗板，所述洗涤液的配方如下：

洗涤液(0.15M)：NaCl 8.0g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH₂O至1000ml，调至PH7.4。

操作：待检血清用PBS液作血清稀释液，按1:400倍的比例稀释，加入包被板孔中，100μL/孔。直接吸取标准阳性血清或标准阴性血清加入包被板孔中，100μL/孔。置酶标板于37℃，30min。

4、酶标二抗的孵育

加入一定浓度的辣根过氧化物酶标记的二抗(抗人IGG、IGM和IGA)，向酶标板孔中加入100μL/孔，置37℃，15min，洗板。

5、显色：

加入底物液A50μL，底物液B 50μL，轻摇混合，37℃反应15min。

(1)底物溶液A：醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml、蒸馏水加至500ml

(2)底物溶液B：取0.2g TMB溶于20mlDMSO中、乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、蒸馏水加至500ml。

6、终止：

终止液：2mol/L H₂SO₄。

显色结束后每孔加入50ul终止液进行终止。

7、读板：

用酶标仪测量OD450值。

需要说明的是，血清经4种抗原的板条检测，其中任何一种板条的OD450值达到阳性值时，则判定该血清对CNTN1是阳性，对该抗原片段成阳性。该血清个体体内存在对CNTN1以及该CNTN1片段的抗体。这4种抗原制备成的4种检测试剂盒可以分开使用也可以组合使用。

本发明提供的人CNTN1抗体检测试剂盒也可用于制备免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。

实施例4人CNTN1抗体检测试剂盒的应用

一、应用

1、本研究对613份神经系统自身免疫性疾病患者血清按照实施例3进行了检测，这613份血清来自于慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP、格林巴利GBS和重症肌无力MG等患者，其中慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP患者血清已在医院经临床检测验证是CIDP抗体阳性的血清，本研究也同批检测了300份正常人血清样本。

2、实验结果如下表(仅列出CNTN1-809抗体检测试剂盒的60份样本数据)，本次检测结果显示，CNTN1-809抗体检测试剂盒在CIDP阳性患者血清的阳性率达85％，在MG患者血清的阳性率达30％，在正常人血清的阳性率达15％，临界值为0.48。

表3-样本数据检测结果

3、N1-322、CNTN1-39、CNTN1-609检测也表明在CNTN1阳性患者血清的阳性比例是正常人的3倍以上。结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

表4-检测结果统计分析表

注：检测数据用SPSS17.0统计分析软件的One-WayANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b,c)的组之间差异显著(P<0.05)。

二、4种ELISA检测试剂盒的技术指标

1、临界值：按照实施例3进行检测患者血清和正常人血清，确定了试验有效性的判定方法、临界值(CUT OFF)的计算方法、样品阴阳性判定方法。

(1)CNTN1-809：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.56；阴性对照平均值≤0.33；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.15；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.48)为CNTN1-809抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.48)为CNTN1-809抗体阳性。

(2)CNTN1-39：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.56；阴性对照平均值≤0.22；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.15＝0.37；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.37)为CNTN1-39抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.37)为CNTN1-39抗体阳性。

(3)CNTN1-322：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.56；阴性对照平均值≤0.25；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.15＝0.40；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.40)为CNTN1-322抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者为(0.40)CNTN1-322抗体阳性。

(4)CNTN1-609：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.56；阴性对照平均值≤0.21；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.15＝0.36；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.36)为CNTN1-609抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者为(0.36)CNTN1-609抗体阳性。

2、特异性：除阳性血清外，其他检测样品均为阴性。这些数据表明，本发明提供的试剂盒与其他血清抗体之间不存在交叉反应。

3、灵敏性：阳性血清12800倍稀释能检出(即1μL血清加到12800μL样品稀释液中，取其中100μL加入样品检测孔)能检出。

4、稳定性：将试剂盒置于37℃不少于2天与4℃存放的试剂盒同步检测20份样品，其符合率为100％。

5、精密度：取浓度呈梯度的4种血清标本，分别稀释，分别同批测定10次，批内变异系数为均低于4％；同样4份血清，隔天再测定10次，变异均低于5％；符合试剂盒精密度要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉明德生物科技股份有限公司

<120> 人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 人CNTN1(CNTN1-39)

<400> 1

Phe Gly Pro Ile Phe Glu Glu Gln Pro Ile Asn Thr Ile Tyr Pro Glu

1 5 10 15

Glu Ser Leu Glu Gly Lys Val Ser Leu Asn Cys Arg Ala Arg Ala Ser

20 25 30

Pro Phe Pro Val Tyr Lys Trp Arg Met Asn Asn Gly Asp Val Asp Leu

35 40 45

Thr Ser Asp Arg Tyr Ser Met Val Gly Gly Asn Leu Val Ile Asn Asn

50 55 60

Pro Asp Lys Gln Lys Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Tyr Gly Met Val Arg Ser Thr Glu Ala Thr Leu Ser Phe Gly Tyr

85 90 95

Leu Asp Pro Phe Pro Pro Glu Glu Arg Pro Glu Val Arg Val Lys Glu

100 105 110

Gly Lys Gly Met Val Leu Leu Cys Asp Pro Pro Tyr His Phe Pro Asp

115 120 125

Asp Leu Ser Tyr Arg Trp Leu Leu Asn Glu Phe Pro Val Phe Ile Thr

130 135 140

Met Asp Lys Arg Arg Phe Val Ser Gln Thr Asn Gly Asn Leu Tyr Ile

145 150 155 160

Ala Asn Val Glu Ala Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Ser Cys Phe Val Ser

165 170 175

Ser Pro Ser Ile Thr Lys Ser Val Phe Ser Lys Phe Ile Pro Leu Ile

180 185 190

Pro Ile Pro Glu Arg Thr Thr Lys Pro Tyr Pro Ala Asp Ile Val Val

195 200 205

Gln Phe Lys Asp Val Tyr Ala Leu Met Gly Gln Asn Val Thr Leu Glu

210 215 220

Cys Phe Ala Leu Gly Asn Pro Val Pro Asp Ile Arg Trp Arg Lys Val

225 230 235 240

Leu Glu Pro Met Pro Ser Thr Ala Glu Ile Ser Thr Ser Gly Ala Val

245 250 255

Leu Lys Ile Phe Asn Ile Gln Leu Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Glu Cys

260 265 270

Glu Ala Glu Asn Ile Arg Gly Lys Asp Lys His Gln Ala Arg Ile Tyr

275 280 285

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> 人CNTN1(CNTN1-322)

<400> 2

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35 40 45

Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Arg Leu Tyr Asp Val Thr Phe Glu Asn

50 55 60

Ala Gly Met Tyr Gln Cys Ile Ala Glu Asn Thr Tyr Gly Ala Ile Tyr

65 70 75 80

Ala Asn Ala Glu Leu Lys Ile Leu Ala Leu Ala Pro Thr Phe Glu Met

85 90 95

Asn Pro Met Lys Lys Lys Ile Leu Ala Ala Lys Gly Gly Arg Val Ile

100 105 110

Ile Glu Cys Lys Pro Lys Ala Ala Pro Lys Pro Lys Phe Ser Trp Ser

115 120 125

Lys Gly Thr Glu Trp Leu Val Asn Ser Ser Arg Ile Leu Ile Trp Glu

130 135 140

Asp Gly Ser Leu Glu Ile Asn Asn Ile Thr Arg Asn Asp Gly Gly Ile

145 150 155 160

Tyr Thr Cys Phe Ala Glu Asn Asn Arg Gly Lys Ala Asn Ser Thr Gly

165 170 175

Thr Leu Val Ile Thr Asp Pro Thr Arg Ile Ile Leu Ala Pro Ile Asn

180 185 190

Ala Asp Ile Thr Val Gly Glu Asn Ala Thr Met Gln Cys Ala Ala Ser

195 200 205

Phe Asp Pro Ala Leu Asp Leu Thr Phe Val Trp Ser Phe Asn Gly Tyr

210 215 220

Val Ile Asp Phe Asn Lys Glu Asn Ile His Tyr Gln Arg Asn Phe Met

225 230 235 240

Leu Asp Ser Asn Gly Glu Leu Leu Ile Arg Asn Ala Gln Leu Lys His

245 250 255

Ala Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Gln Thr Ile Val Asp Asn Ser Ser

260 265 270

Ala Ser Ala Asp Leu Val Val Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Gly

275 280 285

<210> 3

<211> 211

<212> PRT

<213> 人CNTN1(CNTN1-609)

<400> 3

Gly Pro Pro Gly Gly Leu Arg Ile Glu Asp Ile Arg Ala Thr Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Thr Trp Ser Arg Gly Ser Asp Asn His Ser Pro Ile Ser Lys

20 25 30

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35 40 45

Lys Thr Asp Pro Pro Ile Ile Glu Gly Asn Met Glu Ala Ala Arg Ala

50 55 60

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Gly Arg Tyr Val His Lys Asp Glu Thr Met Ser Pro Ser Thr Ala Phe

165 170 175

Gln Val Lys Val Lys Ala Phe Asn Asn Lys Gly Asp Gly Pro Tyr Ser

180 185 190

Leu Val Ala Val Ile Asn Ser Ala Gln Asp Ala Pro Ser Glu Ala Pro

195 200 205

Thr Glu Val

210

<210> 4

<211> 208

<212> PRT

<213> 人CNTN1(CNTN1-809)

<400> 4

Ala Pro Thr Glu Val Gly Val Lys Val Leu Ser Ser Ser Glu Ile Ser

1 5 10 15

Val His Trp Glu His Val Leu Glu Lys Ile Val Glu Ser Tyr Gln Ile

20 25 30

Arg Tyr Trp Ala Ala His Asp Lys Glu Glu Ala Ala Asn Arg Val Gln

35 40 45

Val Thr Ser Gln Glu Tyr Ser Ala Arg Leu Glu Asn Leu Leu Pro Asp

50 55 60

Thr Gln Tyr Phe Ile Glu Val Gly Ala Cys Asn Ser Ala Gly Cys Gly

65 70 75 80

Pro Pro Ser Asp Met Ile Glu Ala Phe Thr Lys Lys Ala Pro Pro Ser

85 90 95

Gln Pro Pro Arg Ile Ile Ser Ser Val Arg Ser Gly Ser Arg Tyr Ile

100 105 110

Ile Thr Trp Asp His Val Val Ala Leu Ser Asn Glu Ser Thr Val Thr

115 120 125

Gly Tyr Lys Val Leu Tyr Arg Pro Asp Gly Gln His Asp Gly Lys Leu

130 135 140

Tyr Ser Thr His Lys His Ser Ile Glu Val Pro Ile Pro Arg Asp Gly

145 150 155 160

Glu Tyr Val Val Glu Val Arg Ala His Ser Asp Gly Gly Asp Gly Val

165 170 175

Val Ser Gln Val Lys Ile Ser Gly Ala Pro Thr Leu Ser Pro Ser Leu

180 185 190

Leu Gly Leu Leu Leu Pro Ala Phe Gly Ile Leu Val Tyr Leu Glu Phe

195 200 205

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacggatcct ttggaccaat ttttgaag 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agctcgagtc attgaacata aattcttg 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacggatccc aagcaagaat ttatgttc 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agctcgagta gtaattcccc attggaatc 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacggatccg gccctccagg tggtctgag 29

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctcgagta cttctgttgg ggcttcac 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacggatcca gtgaagcccc aacagaag 28

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agctcgagtc agaattccaa gtagacaag 29

<210> 13

<211> 873

<212> DNA

<213> 人CNTN1(CNTN1-39)

<400> 13

tttggaccaa tttttgaaga gcagccaatc aataccattt atccagagga atcactggaa 60

ggaaaagtct cactcaactg tagggcacga gccagccctt tcccggttta caaatggaga 120

atgaataatg gggacgttga tctcacaagt gatcgataca gtatggtagg aggaaacctt 180

gttatcaaca accctgacaa acagaaagat gctggaatat actactgttt agcatctaat 240

aactacggga tggtcagaag cactgaagca accctgagct ttggatatct tgatcctttc 300

ccacctgagg aacgtcctga ggtcagagta aaagaaggga aaggaatggt gcttctctgt 360

gaccccccat accattttcc agatgatctt agctatcgct ggcttctaaa tgaatttcct 420

gtatttatca caatggataa acggcgattt gtgtctcaga caaatggcaa tctctacatt 480

gcaaatgttg aggcttccga caaaggcaat tattcctgct ttgtttccag tccttctatt 540

acaaagagcg tgttcagcaa attcatccca ctcattccaa tacctgaacg aacaacaaaa 600

ccatatcctg ctgatattgt agttcagttc aaggatgtat atgcattgat gggccaaaat 660

gtgaccttag aatgttttgc acttggaaat cctgttccgg atatccgatg gcggaaggtt 720

ctagaaccaa tgccaagcac tgctgagatt agcacctctg gggctgttct taagatcttc 780

aatattcagc tagaagatga aggcatctat gaatgtgagg ctgagaacat tagaggaaag 840

gataaacatc aagcaagaat ttatgttcaa tga 873

<210> 14

<211> 867

<212> DNA

<213> 人CNTN1(CNTN1-322)

<400> 14

caagcaagaa tttatgttca agcattccct gagtgggtag aacacatcaa tgacacagag 60

gtggacatag gcagtgatct ctactggcct tgtgtggcca caggaaagcc catccctaca 120

atccgatggt tgaaaaatgg atatgcgtat cataaagggg aattaagact gtatgatgtg 180

acttttgaaa atgccggaat gtatcagtgc atagctgaaa acacatatgg agccatttat 240

gcaaatgctg agttgaagat cttggcgttg gctccaactt ttgaaatgaa tcctatgaag 300

aaaaagatcc tggctgctaa aggtggaagg gtgataattg aatgcaaacc taaagctgca 360

ccgaaaccaa agttttcatg gagtaaaggg acagagtggc ttgtcaatag cagcagaata 420

ctcatttggg aagatggtag cttggaaatc aacaacatta caaggaatga tggaggtatc 480

tatacatgct ttgcagaaaa taacagaggg aaagctaata gcactggaac ccttgttatc 540

acagatccta cgcgaattat attggcccca attaatgccg atatcacagt tggagaaaac 600

gccaccatgc agtgtgctgc gtcctttgat cctgccttgg atctcacatt tgtttggtcc 660

ttcaatggct atgtgatcga ttttaacaaa gagaatattc actaccagag gaattttatg 720

ctggattcca atggggaatt actaatccga aatgcgcagc tgaaacatgc tggaagatac 780

acatgcactg cccagacaat tgtggacaat tcttcagctt cagctgacct tgtagtgaga 840

ggccctccag gccctccagg tggttaa 867

<210> 15

<211> 636

<212> DNA

<213> 人CNTN1(CNTN1-609)

<400> 15

ggccctccag gtggtctgag aatagaagac attagagcca cttctgtggc acttacttgg 60

agccgtggtt cagacaatca tagtcctatt tctaaataca ctatccagac caagactatt 120

ctttcagatg actggaaaga tgcaaagaca gatcccccaa ttattgaagg aaatatggag 180

gcagcaagag cagtggactt aatcccatgg atggagtatg aattccgcgt ggtagcaacc 240

aatacactgg gtagaggaga gcccagtata ccatctaaca gaattaaaac agacggtgct 300

gcaccaaatg tggctccttc agatgtagga ggtggaggtg gaagaaacag agagctgacc 360

ataacatggg cgcctttgtc aagagaatac cactatggca acaattttgg ttacatagtg 420

gcatttaagc catttgatgg agaagaatgg aaaaaagtca cagttactaa tcctgatact 480

ggccgatatg tccataaaga tgaaaccatg agcccttcca ctgcatttca agttaaagtc 540

aaggccttca acaacaaagg agatggacct tacagcctag tagcagtcat taattcagca 600

caagacgctc ccagtgaagc cccaacagaa gtataa 636

<210> 16

<211> 633

<212> DNA

<213> 人CNTN1(CNTN1-809)

<400> 16

agtgaagccc caacagaagt aggtgtaaaa gtcttatcat cttctgagat atctgttcat 60

tgggaacatg ttttagaaaa aatagtggaa agctatcaga ttcggtattg ggctgcccat 120

gacaaagaag aagctgcaaa cagagttcaa gtcaccagcc aagagtactc ggccaggctc 180

gagaaccttc tgccagacac ccagtatttt atagaagtcg gggcctgcaa tagtgcaggg 240

tgtggacctc caagtgacat gattgaggct ttcaccaaga aagcacctcc tagccagcct 300

ccaaggatca tcagttcagt aaggtctggt tcacgctata taatcacctg ggatcatgtc 360

gttgcactat caaatgaatc tacagtgacg ggatataagg tactctacag acctgatggc 420

cagcatgatg gcaagctgta ttcaactcac aaacactcca tagaagtccc aatccccaga 480

gatggagaat acgttgtgga ggttcgcgcg cacagtgatg gaggagatgg agtggtgtct 540

caagtcaaaa tttcaggtgc acccacccta tccccaagtc ttctcggctt actgctgcct 600

gcctttggca tccttgtcta cttggaattc tga 633

Claims

1.一种人CNTN1抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者四种片段：

片段1：CNTN1-39，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段2：CNTN1-322，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

片段3：CNTN1-609，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：CNTN1-809，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述的人CNTN1抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建4个重组表达工程菌；

步骤3、CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的抗原片段的诱导表达及纯化。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述4个片段的引物对分别为：

CNTN1-39-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

CNTN1-39-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

CNTN1-322-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

CNTN1-322-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

CNTN1-609-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

CNTN1-609-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

CNTN1-809-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

CNTN1-809-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA 1ul；Taq E 0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将4个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时；

所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M Nacl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

6.一种人CNTN1抗原的表达载体，其特征在于，所述表达载体为4个，所述4个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16所示。

7.一种人CNTN1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

(A)包被有权利要求1所述的人CNTN1抗原的ELISA酶标板；所述人CNTN1抗原包括CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809中的任意一种或者四种；

(B)标准阴性血清：CNTN1抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：CNTN1抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

8.如权利要求7所述的人CNTN1抗体检测试剂盒，其特征在于，人CNTN1抗原中CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609和CNTN1-809的包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml和150ng/ml。

9.一种人CNTN1抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

S1制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人CNTN1抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；

S2待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

S3酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

S4加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。

10.权利要求7所述的检测试剂盒在诊断慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病中的应用。