CN109734795A

CN109734795A - 人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109734795A
Application number: CN201910043666.8A
Authority: CN
Inventors: 王颖; 张崇珍; 郝洪军
Original assignee: WUHAN EASYDIAGNOSIS BIOMEDICAINE CO Ltd
Current assignee: WUHAN EASYDIAGNOSIS BIOMEDICAINE CO Ltd
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: CN109734795B

Abstract

本发明提供了人Lrp4抗原、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。人Lrp4抗原包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，还提供了七种分别含有上述七种人Lrp4抗原的检测试剂盒，以及1种同时含有上述七种人Lrp4抗原的检测试剂盒。该人Lrp4检测试剂盒，检测人血清中的Lrp4抗体，特异性强，反应灵敏度高，高通量、成本低，能够对对重症肌无力病症进行诊断，适于大规模推广应用。

Description

人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

重症肌无力(Myastheniagravis，MG)，是常见的肌肉神经接头(neuromuscularjunction，NMJ)疾病。在大多数患者中，MG可能来自一个对乙酰胆碱受体(AChRs)的自身免疫反应，能够在80％-85％的MG患者中检测到AChRs的自身抗体。然而，AChR抗体在大约20％的MG患者中没有被检测到。有证据表明，这些“血清反应阴性”的患者可以产生对NMJ形成或保持非常关键的蛋白抗体。从运动神经元释放的聚蛋白，结合到低密度脂蛋白受体相关的蛋白4(LRP4)，激活受体酪氨酸激酶MuSK来指导NMJ的形成。大约40％-70％的血清反应阴性患者有MuSK自身抗体。其余6％-12％的MG患者对AChR和MuSK抗体具有双血清阴性反应。LRP4是一个低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员，是对MuSK激活、AChR聚集和NMJ形成非常关键的蛋白的受体。研究者指出，LRP4可能是双血清反应阴性患者中的一种自身抗体，这种抗体在2％-45％的双血清阴性MG患者中被检测到。根据美国国家健康研究所和重症肌无力基金会称，LRP4抗体被鉴定为自体免疫性疾病的第三个病因，这类疾病能对大约100000个人中的20个人产生影响，尤其是40岁以下的女性和超过60岁的男性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种人Lrp4抗原及其制备方法、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，该检测试剂盒能特异性检测人血清中的LRP4抗体，对重症肌无力有诊断意义，反应灵敏，成本低、适于大规模推广应用。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于一种人Lrp4抗原，包括以下任意一种片段或者七种片段：

片段1：Lrp4-26，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段2：Lrp4-266，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

片段3：Lrp4-431，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：Lrp4-598，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：Lrp4-805，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

片段6：Lrp4-1041，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

片段7：Lrp4-1381，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的目的之二在于提供人Lrp4抗原的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381的7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建7个重组表达质粒；

步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建7个重组表达工程菌；

步骤3、Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381的抗原片段的诱导表达及纯化。

具体地，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：

Lrp4-26-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

Lrp4-26-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

Lrp4-266-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

Lrp4-266-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

Lrp4-431-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

Lrp4-431-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

Lrp4-598-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

Lrp4-598-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

Lrp4-805-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

Lrp4-805-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

Lrp4-1041-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

Lrp4-1041-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

Lrp4-1381-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

Lrp4-1381-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

具体地，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O 38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA 1ul；Taq E 0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

具体地，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时。

具体地，所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mMNa₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M Nacl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

本发明的目的之三在于提供一种人Lrp4抗原的表达载体，所述表达载体为7个，所述7个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示。

本发明的目的之四在于提供一种人Lrp4抗原的表达工程菌，该工程菌为7个，所述7个工程菌分别包含所述7个人Lrp4抗原的表达载体。

本发明的目的之五在于提供人Lrp4抗体检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：

(A)包被有所述的人Lrp4抗原的ELISA酶标板；所述人Lrp4抗原包括Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381中的任意一种或者7种；

(B)标准阴性血清：Lrp4抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：Lrp4抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

其中，所述人Lrp4抗原中Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381的包被浓度分别为300ng/ml、250ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、和250ng/ml。

本发明的目的之六在于提供人Lrp4抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将所述的人Lrp4抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述人Lrp4抗原包括Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381中的任意一种或者7种；

S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

S4、加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。

本发明的目的之七在于提供所述的检测试剂盒在诊断重症肌无力(MG)疾病中的应用。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供了人Lrp4抗体检测试剂盒及检测方法，首先制备得到人Lrp4抗原(Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381)，然后以人Lrp4抗原为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该试剂盒可以用于检测诊断对重症肌无力(MG)疾病，特异性强，灵敏度高，稳定性好。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的构建的重组质粒的酶切图；其中，(A)为包含Lrp4-26的重组质粒的酶切图；(B)为包含Lrp4-266的重组质粒的酶切图；(C)为包含Lrp4-431的重组质粒的酶切图；(D)为包含Lrp4-598的重组质粒的酶切图；(E)为包含Lrp4-805的重组质粒的酶切图；(F)为包含Lrp4-1041的重组质粒的酶切图；(G)为包含Lrp4-1381的重组质粒的酶切图；其中1泳道为未酶切的质粒，2泳道为经相应的内切酶酶切的条带；(H)为Marker条带图，该Marker为1Kb ladder；

图2为本发明实施例2提供的Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381片段的纯化产物电泳图。

具体实施方式

实施例1构建重组表达质粒以及工程菌

1、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)是一种膜蛋白，它有个较大的胞外域，该胞外域包含多种低密度脂蛋白重复序列及表皮生长因子样和β-繁殖体样重复序列；LRP4还有个跨膜域及没有可识别催化位点的短C端区域。它在多种组织中都有表达，包括肌肉和神经组织，并且在四肢、外胚层器官、肺和肾的发育形成过程中发挥重要作用。在成人骨骼肌中，LRP4在突触核中也有表达。

成熟的Lrp4蛋白由1885个氨基酸组成。本研究对Lrp4蛋白的氨基酸序列经过包括亲水性、表面可及性等分析，并结合其空间构象和各个结构域的修饰特点，选择成熟的Lrp4蛋白的7个区域的片段以分别获取，Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381。

2、PCR扩增人Lrp4抗原基因

1、将7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物(带上酶切位点)PCR扩增，设计PCR引物如表1所示，下划线的部分是限制性核酸内切酶位点。

表1

2、运用PCR扩增体系如表2所示，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,45S,→57℃,150S,→72℃,90S)×32→72℃,10min。扩增产物用于后续酶切酶连。

表2

4、PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，酶切，酶连，分别将7个DNA片段连接进PET-28a表达载体构建重组表达质粒。重组质粒跑胶酶切图见说明书附图1。

5、将构建好的重组质粒转化BL21(DE3)菌，构建重组菌，重组菌的测序后结果验证本实施例的重组质粒构建成功。

实施例2抗原的表达及纯化

1、用构建成的重组蛋白表达工程菌进行诱导表达实验。将7个重组菌分别接种于600ml的LB培养液(成分：10g氯化钠/升、10g蛋白胨/升和5g酵母浸膏/升)，37度200RPM摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4小时。离心，收菌，准备纯化。

2、纯化选择的填料是GE的Ni Sepharose(货号是17-0729-10)，根据其说明书分别配制如下溶液：

上样缓冲液A：0.5M NaCl+20mM Na₂HPO₃+10mM咪唑。

结合缓冲液B：0.5M NaCl+20mM Na₂HPO₃+20mM咪唑

洗脱缓冲液C：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑；

以及用于纯化包涵体的溶液：

纯化包涵体抗原的上样缓冲液a：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑、8M尿素；

结合缓冲液b：0.5MNaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑、8M尿素；

洗脱缓冲液c：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、300mM咪唑、8M尿素。

3、将7种离心收集的细菌用上样缓冲液A分散均匀，超声(250W，超3s，间隔3s，全程20min)、第一次离心(12000RPM，15min，4℃)，得到含较高浓度的目的抗原的上清溶液。包涵体抗原需将第一次离心的沉淀用上样缓冲液a再分散均匀，再超声(250W，超3s，间隔3s，全程20min)、再离心(12000RPM，15min，4℃)，弃掉沉淀，得到含较高浓度的目的抗原的溶液。将该7种目的蛋白的溶液对填料柱分别进行上样、洗涤、洗脱，分别得到7个目的蛋白。纯化好的包涵体抗原需复性，采用与待复性包涵体抗原同体积的含不同尿素浓度(4.5M、3.5M、2.5M、1.5M、0.5M、0M)的复性缓冲液继续透析复性，每种复性缓冲液透析4小时。

可溶性抗原(Lrp4-609)和复性完的包涵体抗原(Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381)，进行12％浓度凝胶的SDS-PAGE电泳，检测七个目的蛋白纯度分别为：93.6％，94.7％，93.1％，94.6％，94.2％，94.9％，和95.2％。见说明书附图2。每种抗原测定浓度后储存备用。

实施例3人Lrp4抗体检测试剂盒及使用方法

1、包被酶标板

(1)包被液：NaCl 8.5g,Na₂HPO₄·12H₂O 30.8g，KH₂PO₄2.2g,加ddH₂O至1000ml，调PH至7.4。

(2)包被用洗液：NaCl 8.0g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH₂O至1000ml，调至PH7.4。

(3)包被方法：将7个Lrp4抗原片段分别用0.1M PBS(PH7.4)包被缓冲液进行包被在酶标板孔内，4度过夜，其中Lrp4-25，Lrp4-344、Lrp4-530、Lrp4-824和Lrp4-1048的包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、150ng/ml和250ng/ml。96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去包被液，包被用洗液洗板3次。

2、封闭

(1)包被用封闭液：Na₂HPO₄·12H₂O 3.582g，NaH₂PO₄·2H₂O1.561g，NaCl 9.0g，BSA20g，木糖10g，调pH至7.2，定容至1000ml。

(2)封闭操作：空干包被用洗液，用1.5％BSA封闭液37度封闭2小时，或者置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥密封备用。

3、阴阳性血清的孵育(一抗孵育)

将待检测的血清按10-100倍稀释，分别加入7种抗原的板条内(每种抗原有经过优化的特定的血清稀释倍数)，并加入阳性对照和阴性对照，37度孵育1小时，用洗涤液进行洗板，所述洗涤液的配方如下：

洗涤液(0.15M)：NaCl 8.0g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH₂O至1000ml，调至PH7.4。

操作：待检血清用PBS液作血清稀释液，按1:400倍的比例稀释，加入包被板孔中，100μL/孔。直接吸取标准阳性血清或标准阴性血清加入包被板孔中，100μL/孔。置酶标板于37℃，30min。

4、酶标二抗的孵育

加入一定浓度的辣根过氧化物酶标记的二抗(抗人IGG、IGM和IGA)，向酶标板孔中加入100μL/孔，置37℃，15min，洗板。

5、显色

加入底物液A50μL，底物液B 50μL，轻摇混合，37℃反应15min。

(1)底物溶液A：醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml、蒸馏水加至500ml

(2)底物溶液B：取0.2g TMB溶于20mlDMSO中、乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、蒸馏水加至500ml。

6、终止：

终止液：2mol/L H₂SO₄。

显色结束后每孔加入50ul终止液进行终止。

7、读板：

用酶标仪测量OD450值。

需要说明的是，血清经7种抗原的板条检测，其中任何一种板条的OD450值达到阳性值时，则判定该血清对Lrp4是阳性，对该抗原片段成阳性。该血清个体体内存在对Lrp4以及该Lrp4片段的抗体。这7种抗原制备成的7种检测试剂盒可以分开使用也可以组合使用。

本发明提供的人Lrp4抗体检测试剂盒也可用于制备免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。

实施例4人Lrp4抗体检测试剂盒的应用

一、应用

1、本研究对613份神经系统自身免疫性疾病患者血清按照实施例3进行了检测，这613份血清来自于慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP、格林巴利GBS和重症肌无力MG等患者，其中慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP患者血清已在医院经临床检测验证是CIDP抗体阳性的血清，本研究也同批检测了300份正常人血清样本。

2、实验结果如下表(仅列出60份样本数据)，本次检测结果显示，Lrp4-1635抗体检测试剂盒。在MG患者血清的阳性率达25％，在CIDP阳性患者血清的阳性率达10％，在正常人血清的阳性率达5％，临界值为0.49。

表3-样本数据检测结果

4、此外，Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-1041和Lrp4-1381制备的试剂盒的检测结果也表明在MG患者血清的阳性比例是正常人的3倍以上。结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

表4-检测结果统计分析表

注：检测数据用SPSS17.0统计分析软件的One-WayANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b,c)的组之间差异显著(P<0.05)。

二、7种ELISA检测试剂盒的技术指标

1、临界值：按照实施例3进行检测患者血清和正常人血清，确定了试验有效性的判定方法、临界值(CUT OFF)的计算方法、样品阴阳性判定方法。

(1)Lrp4-26：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.54；阴性对照平均值≤0.27；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.39；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.39)为Lrp4-26抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.39)为Lrp4-26抗体阳性。

(2)Lrp4-266：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.54；阴性对照平均值≤0.26；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.38；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.38)为Lrp4-266抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.38)为Lrp4-266抗体阳性。

(3)Lrp4-431：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.54；阴性对照平均值≤0.24；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.36；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.36)为Lrp4-431抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.36)为Lrp4-431抗体阳性。

(4)Lrp4-598：

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.36；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.36)为Lrp4-598抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.36)为Lrp4-598抗体阳性。

(5)Lrp4-805：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.54；阴性对照平均值≤0.35；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.47；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.47)为Lrp4-805抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者为(0.47)Lrp4-805抗体阳性。

(6)Lrp4-1041：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.54；阴性对照平均值≤0.29；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.41；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.41)为Lrp4-1041抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.41)为Lrp4-1041抗体阳性。

(7)Lrp4-1381：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.54；阴性对照平均值≤0.25；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.12＝0.47；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.47)为Lrp4-1381抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.47)为Lrp4-1381抗体阳性。

2、特异性：除阳性血清外，其他检测样品均为阴性。这些数据表明，本发明提供的试剂盒与其他血清抗体之间不存在交叉反应。

3、灵敏性：阳性血清12800倍稀释能检出(即1μL血清加到12800μL样品稀释液中，取其中100μL加入样品检测孔)能检出。

4、稳定性：将试剂盒置于37℃不少于2天与4℃存放的试剂盒同步检测20份样品，其符合率为100％。

5、精密度：取浓度呈梯度的7种血清标本，分别稀释，分别同批测定10次，批内变异系数为均低于4％；同样7份血清，隔天再测定10次，变异均低于5％；符合试剂盒精密度要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉明德生物科技股份有限公司

<120> 人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-26)

<400> 1

Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala Val Ser Ala Leu Gly Glu

1 5 10 15

Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys

20 25 30

Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile Leu Pro Thr Cys Ser Pro

35 40 45

Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys Ile Arg Arg Ser Trp Val

50 55 60

Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp Ser Asp Glu Gln Asp Cys

65 70 75 80

Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe Pro Cys Gln Asn Gly Tyr

85 90 95

Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp

100 105 110

Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met Arg Lys Cys Ser Asp Lys Glu Phe

115 120 125

Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile Ala Glu His Trp Tyr Cys Asp Gly

130 135 140

Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys Pro Ser Ala

145 150 155 160

Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu Glu Glu Phe Gln Cys Ala Tyr Gly

165 170 175

Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His Cys Asp Gly Asp Asp Asp Cys Gly

180 185 190

Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys Ser Ser His Gln Pro Cys Arg Ser

195 200 205

Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys Ile Asn Ala Gly Trp Arg

210 215 220

Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu Arg Asn Cys

225 230 235 240

Thr Thr Ser

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-266)

<400> 2

Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala Val Ser Ala Leu Gly Glu

1 5 10 15

Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys

20 25 30

Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile Leu Pro Thr Cys Ser Pro

35 40 45

Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys Ile Arg Arg Ser Trp Val

50 55 60

Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp Ser Asp Glu Gln Asp Cys

65 70 75 80

Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe Pro Cys Gln Asn Gly Tyr

85 90 95

Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp

100 105 110

Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met Arg Lys Cys Ser Asp Lys Glu Phe

115 120 125

Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile Ala Glu His Trp Tyr Cys Asp Gly

130 135 140

Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys Pro Ser Ala

145 150 155 160

Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu Glu Glu Phe Gln Cys Ala Tyr Gly

165 170 175

Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His Cys Asp Gly Asp Asp Asp Cys Gly

180 185 190

Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys Ser Ser His Gln Pro Cys Arg Ser

195 200 205

Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys Ile Asn Ala Gly Trp Arg

210 215 220

Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu Arg Asn Cys

225 230 235 240

Thr Thr Ser

<210> 3

<211> 170

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-431)

<400> 3

Arg Ser Cys Lys Ala Leu Gly Pro Glu Pro Val Leu Leu Phe Ala Asn

1 5 10 15

Arg Ile Asp Ile Arg Gln Val Leu Pro His Arg Ser Glu Tyr Thr Leu

20 25 30

Leu Leu Asn Asn Leu Glu Asn Ala Ile Ala Leu Asp Phe His His Arg

35 40 45

Arg Glu Leu Val Phe Trp Ser Asp Val Thr Leu Asp Arg Ile Leu Arg

50 55 60

Ala Asn Leu Asn Gly Ser Asn Val Glu Glu Val Val Ser Thr Gly Leu

65 70 75 80

Glu Ser Pro Gly Gly Leu Ala Val Asp Trp Val His Asp Lys Leu Tyr

85 90 95

Trp Thr Asp Ser Gly Thr Ser Arg Ile Glu Val Ala Asn Leu Asp Gly

100 105 110

Ala His Arg Lys Val Leu Leu Trp Gln Asn Leu Glu Lys Pro Arg Ala

115 120 125

Ile Ala Leu His Pro Met Glu Gly Thr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gly

130 135 140

Asn Thr Pro Arg Ile Glu Ala Ser Ser Met Asp Gly Ser Gly Arg Arg

145 150 155 160

Ile Ile Ala Asp Thr His Leu Phe Trp Pro

165 170

<210> 4

<211> 208

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-598)

<400> 4

Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Gly Arg Arg Met Tyr Trp Val Asp

1 5 10 15

Ala Lys His His Val Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser His Arg

20 25 30

Lys Ala Val Ile Ser Gln Gly Leu Pro His Pro Phe Ala Ile Thr Val

35 40 45

Phe Glu Asp Ser Leu Tyr Trp Thr Asp Trp His Thr Lys Ser Ile Asn

50 55 60

Ser Ala Asn Lys Phe Thr Gly Lys Asn Gln Glu Ile Ile Arg Asn Lys

65 70 75 80

Leu His Phe Pro Met Asp Ile His Thr Leu His Pro Gln Arg Gln Pro

85 90 95

Ala Gly Lys Asn Arg Cys Gly Asp Asn Asn Gly Gly Cys Thr His Leu

100 105 110

Cys Leu Pro Ser Gly Gln Asn Tyr Thr Cys Ala Cys Pro Thr Gly Phe

115 120 125

Arg Lys Ile Ser Ser His Ala Cys Ala Gln Ser Leu Asp Lys Phe Leu

130 135 140

Leu Phe Ala Arg Arg Met Asp Ile Arg Arg Ile Ser Phe Asp Thr Glu

145 150 155 160

Asp Leu Ser Asp Asp Val Ile Pro Leu Ala Asp Val Arg Ser Ala Val

165 170 175

Ala Leu Asp Trp Asp Ser Arg Asp Asp His Val Tyr Trp Thr Asp Val

180 185 190

Ser Thr Asp Thr Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asp Gly Thr Gly Gln Glu

195 200 205

<210> 5

<211> 239

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-805)

<400> 5

Thr Gly Gln Glu Val Val Val Asp Thr Ser Leu Glu Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Leu Ala Ile Asp Trp Val Thr Asn Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ala Gly

20 25 30

Thr Asp Arg Ile Glu Val Ala Asn Thr Asp Gly Ser Met Arg Thr Val

35 40 45

Leu Ile Trp Glu Asn Leu Asp Arg Pro Arg Asp Ile Val Val Glu Pro

50 55 60

Met Gly Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Ala Ser Pro Lys Ile

65 70 75 80

Glu Arg Ala Gly Met Asp Ala Ser Gly Arg Gln Val Ile Ile Ser Ser

85 90 95

Asn Leu Thr Trp Pro Asn Gly Leu Ala Ile Asp Tyr Gly Ser Gln Arg

100 105 110

Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Gly Met Lys Thr Ile Glu Phe Ala Gly Leu

115 120 125

Asp Gly Ser Lys Arg Lys Val Leu Ile Gly Ser Gln Leu Pro His Pro

130 135 140

Phe Gly Leu Thr Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln

145 150 155 160

Thr Lys Ser Ile Gln Ser Ala Asp Arg Leu Thr Gly Leu Asp Arg Glu

165 170 175

Thr Leu Gln Glu Asn Leu Glu Asn Leu Met Asp Ile His Val Phe His

180 185 190

Arg Arg Arg Pro Pro Val Ser Thr Pro Cys Ala Met Glu Asn Gly Gly

195 200 205

Cys Ser His Leu Cys Leu Arg Ser Pro Asn Pro Ser Gly Phe Ser Cys

210 215 220

Thr Cys Pro Thr Gly Ile Asn Leu Leu Ser Asp Gly Lys Thr Cys

225 230 235

<210> 6

<211> 340

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-1041)

<400> 6

Lys Thr Cys Ser Pro Gly Met Asn Ser Phe Leu Ile Phe Ala Arg Arg

1 5 10 15

Ile Asp Ile Arg Met Val Ser Leu Asp Ile Pro Tyr Phe Ala Asp Val

20 25 30

Val Val Pro Ile Asn Ile Thr Met Lys Asn Thr Ile Ala Ile Gly Val

35 40 45

Asp Pro Gln Glu Gly Lys Val Tyr Trp Ser Asp Ser Thr Leu His Arg

50 55 60

Ile Ser Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Gln His Glu Asp Ile Ile Thr

65 70 75 80

Thr Gly Leu Gln Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Ala Ile Gly Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Gly Asn

100 105 110

Leu Asp Gly Ser Met Arg Lys Val Leu Val Trp Gln Asn Leu Asp Ser

115 120 125

Pro Arg Ala Ile Val Leu Tyr His Glu Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr

130 135 140

Asp Trp Gly Glu Asn Ala Lys Leu Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser

145 150 155 160

Asp Arg Ala Val Leu Ile Asn Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu

165 170 175

Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala His Thr

180 185 190

Glu Arg Ile Glu Ala Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg His Thr Leu

195 200 205

Val Ser Pro Val Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Asp Ser Tyr

210 215 220

Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile His Arg Ala Asp Lys

225 230 235 240

Gly Thr Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg Ser Asn Leu Pro Gly Leu

245 250 255

Met Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala Gln Pro Leu Gly Phe Asn Lys

260 265 270

Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Pro Arg Pro

275 280 285

Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys Pro Thr Gly Ile Gln Leu Lys Gly Asp

290 295 300

Gly Lys Thr Cys Asp Pro Ser Pro Glu Thr Tyr Leu Leu Phe Ser Ser

305 310 315 320

Arg Gly Ser Ile Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asp His Thr Asp

325 330 335

Val His Val Pro

340

<210> 7

<211> 345

<212> PRT

<213> 人Lrp4(Lrp4-1381)

<400> 7

Val Pro Glu Leu Asn Asn Val Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val Asp

1 5 10 15

Gly Lys Val Tyr Tyr Thr Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg Arg Ala

20 25 30

Asp Leu Asn Gly Ser Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg Gly Leu Lys

35 40 45

Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp

50 55 60

Thr Asp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser Arg Leu Asp Gly Ser

65 70 75 80

Cys Arg Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile

85 90 95

Ala Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr Asp Trp Gly His

100 105 110

Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Glu Arg Lys Val

115 120 125

Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr

130 135 140

Asp Thr Arg Arg Ile Tyr Trp Val Asp Ala His Leu Asp Arg Ile Glu

145 150 155 160

Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Leu Arg Gln Val Leu Val Ser His Val

165 170 175

Ser His Pro Phe Ala Leu Thr Gln Gln Asp Arg Trp Ile Tyr Trp Thr

180 185 190

Asp Trp Gln Thr Lys Ser Ile Gln Arg Val Asp Lys Tyr Ser Gly Arg

195 200 205

Asn Lys Glu Thr Val Leu Ala Asn Val Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile

210 215 220

Val Val Ser Pro Gln Arg Gln Thr Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn

225 230 235 240

Asn Gly Gly Cys Thr His Leu Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe Val

245 250 255

Cys Ala Cys Pro Asp Glu Pro Asp Ser Arg Pro Cys Ser Leu Val Pro

260 265 270

Gly Leu Val Pro Pro Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser Glu Lys Ser

275 280 285

Pro Val Leu Pro Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr Thr

290 295 300

Arg Thr Arg Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly Arg Cys Ser Glu Arg

305 310 315 320

Asp Ala Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser Asn Asp Ala Val Pro Ala

325 330 335

Ala Pro Gly Glu Gly Leu His Ile Ser

340 345

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacggatccg cttgtggtcg cagccatttc 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agctcgagtt agctggtggt acagttg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacggatcca ccaccagcat gtgcacc 27

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agctcgagtt atttgcagct acggcg 26

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacggatccc gcagctgcaa ggctctg 27

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agctcgagtt agggccagaa gagatg 26

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacggatcct tttggccgaa tggtttaac 29

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agctcgagtt agccggtacc atcccat 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacggatcca ccggtcaaga agtggtg 27

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agctcgagtt aacaagtttt accatcgc 28

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacggatcca agacctgctc accaggc 27

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agctcgagtt aagggacatg cacatc 26

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacggatccg ttcctgagct caacaatg 28

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agctcgagtt agctgatatg aagtcc 26

<210> 22

<211> 732

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-26)

<400> 22

gcttgtggtc ggagccactt cacatgtgca gtgagtgctc ttggagagtg tacctgcatc 60

cctgcccagt ggcagtgtga tggagacaat gactgcgggg accacagcga tgaggatgga 120

tgtatactac ctacctgttc ccctcttgac tttcactgtg acaatggcaa gtgcatccgc 180

cgctcctggg tgtgtgacgg ggacaacgac tgtgaggatg actcggatga gcaggactgt 240

cccccccggg agtgtgagga ggacgagttt ccctgccaga atggctactg catccggagt 300

ctgtggcact gcgatggtga caatgactgt ggcgacaaca gcgatgagca gtgtgacatg 360

cgcaagtgct ccgacaagga gttccgctgt agtgacggaa gctgcattgc tgagcattgg 420

tactgcgacg gtgacaccga ctgcaaagat ggctccgatg aggagaactg tccctcagca 480

gtgccagcgc ccccctgcaa cctggaggag ttccagtgtg cctatggacg ctgcatcctc 540

gacatctacc actgcgatgg cgacgatgac tgtggagact ggtcagacga gtctgactgc 600

tcctcccacc agccctgccg ctctggggag ttcatgtgtg acagtggcct gtgcatcaat 660

gcaggctggc gctgcgatgg tgacgcggac tgtgatgacc agtctgatga gcgcaactgc 720

accacctcct aa 732

<210> 23

<211> 510

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-266)

<400> 23

accacctcca tgtgtacggc agaacagttc cgctgtcact caggccgctg tgtccgcctg 60

tcctggcgct gtgatgggga ggacgactgt gcagacaaca gcgatgaaga gaactgtgag 120

aatacaggaa gcccccaatg tgccttggac cagttcctgt gttggaatgg gcgctgcatt 180

gggcagagga agctgtgcaa cggggtcaac gactgtggtg acaacagcga cgaaagccca 240

cagcagaatt gccggccccg gacgggtgag gagaactgca atgttaacaa cggtggctgt 300

gcccagaagt gccagatggt gcggggggca gtgcagtgta cctgccacac aggctaccgg 360

ctcacagagg atgggcacac gtgccaagat gtgaatgaat gtgccgagga ggggtattgc 420

agccagggct gcaccaacag cgaaggggct ttccaatgct ggtgtgaaac aggctatgaa 480

ctacggcccg accggcgcag ctgcaagtga 510

<210> 24

<211> 513

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-431)

<400> 24

cgcagctgca aggctctggg gccagagcct gtgctgctgt tcgccaatcg catcgacatc 60

cggcaggtgc tgccacaccg ctctgagtac acactgctgc ttaacaacct ggagaatgcc 120

attgcccttg atttccacca ccgccgcgag cttgtcttct ggtcagatgt caccctggac 180

cggatcctcc gtgccaacct caacggcagc aacgtggagg aggttgtgtc tactgggctg 240

gagagcccag ggggcctggc tgtggattgg gtccatgaca aactctactg gaccgactca 300

ggcacctcga ggattgaggt ggccaatctg gatggggccc accggaaagt gttgctgtgg 360

cagaacctgg agaagccccg ggccattgcc ttgcatccca tggagggtac catttactgg 420

acagactggg gcaacacccc ccgtattgag gcctccagca tggatggctc tggacgccgc 480

atcattgccg atacccatct cttctggccc tga 513

<210> 25

<211> 630

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-598)

<400> 25

ttctggccca atggcctcac catcgactat gccgggcgcc gtatgtactg ggtggatgct 60

aagcaccatg tcatcgagag ggccaatctg gatgggagtc accgtaaggc tgtcattagc 120

cagggcctcc cgcatccctt cgccatcaca gtgtttgaag acagcctgta ctggacagac 180

tggcacacca agagcatcaa tagcgctaac aaatttacgg ggaagaacca ggaaatcatt 240

cgcaacaaac tccacttccc tatggacatc cacaccttgc acccccagcg ccaacctgca 300

gggaaaaacc gctgtgggga caacaacgga ggctgcacgc acctgtgtct gcccagtggc 360

cagaactaca cctgtgcctg ccccactggc ttccgcaaga tcagcagcca cgcctgtgcc 420

cagagtcttg acaagttcct gctttttgcc cgaaggatgg acatccgtcg aatcagcttt 480

gacacagagg acctgtctga tgatgtcatc ccactggctg acgtgcgcag tgctgtggcc 540

cttgactggg actcccggga tgaccacgtg tactggacag atgtcagcac tgataccatc 600

agcagggcca agtgggatgg aacaggatga 630

<210> 26

<211> 720

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-805)

<400> 26

acaggacagg aggtggtagt ggataccagt ttggagagcc cagctggcct ggccattgat 60

tgggtcacca acaaactgta ctggacagat gcaggtacag accggattga agtagccaac 120

acagatggca gcatgagaac agtactcatc tgggagaacc ttgatcgtcc tcgggacatc 180

gtggtggaac ccatgggcgg gtacatgtat tggactgact ggggtgcgag ccccaagatt 240

gaacgagctg gcatggatgc ctcaggccgc caagtcatta tctcttctaa tctgacctgg 300

cctaatgggt tagctattga ttatgggtcc cagcgtctat actgggctga cgccggcatg 360

aagacaattg aatttgctgg actggatggc agtaagagga aggtgctgat tggaagccag 420

ctcccccacc catttgggct gaccctctat ggagagcgca tctattggac tgactggcag 480

accaagagca tacagagcgc tgaccggctg acagggctgg accgggagac tctgcaggag 540

aacctggaaa acctaatgga catccatgtc ttccaccgcc gccggccccc agtgtctaca 600

ccatgtgcta tggagaatgg cggctgtagc cacctgtgtc ttaggtcccc aaatccaagc 660

ggattcagct gtacctgccc cacaggcatc aacctgctgt ctgatggcaa gacctgctaa 720

<210> 27

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-1041)

<400> 27

aagacctgct caccaggcat gaacagtttc ctcatcttcg ccaggaggat agacattcgc 60

atggtctccc tggacatccc ttattttgct gatgtggtgg taccaatcaa cattaccatg 120

aagaacacca ttgccattgg agtagacccc caggaaggaa aggtgtactg gtctgacagc 180

acactgcaca ggatcagtcg tgccaatctg gatggctcac agcatgagga catcatcacc 240

acagggctac agaccacaga tgggctcgcg gttgatgcca ttggccggaa agtatactgg 300

acagacacgg gaacaaaccg gattgaagtg ggcaacctgg acgggtccat gcggaaagtg 360

ttggtgtggc agaaccttga cagtccccgg gccatcgtac tgtaccatga gatggggttt 420

atgtactgga cagactgggg ggagaatgcc aagttagagc ggtccggaat ggatggctca 480

gaccgcgcgg tgctcatcaa caacaaccta ggatggccca atggactgac tgtggacaag 540

gccagctccc aactgctatg ggccgatgcc cacaccgagc gaattgaggc tgctgacctg 600

aatggtgcca atcggcatac attggtgtca ccggtgcagc acccatatgg cctcaccctg 660

ctcgactcct atatctactg gactgactgg cagactcgga gcatccaccg tgctgacaag 720

ggtactggca gcaatgtcat cctcgtgagg tccaacctgc caggcctcat ggacatgcag 780

gctgtggacc gggcacagcc actaggtttt aacaagtgcg gctcgagaaa tggcggctgc 840

tcccacctct gcttgcctcg gccttctggc ttctcctgtg cctgccccac tggcatccag 900

ctgaagggag atgggaagac ctgtgatccc tctcctgaga cctacctgct cttctccagc 960

cgtggctcca tccggcgtat ctcactggac accagtgacc acaccgatgt gcatgtccct 1020

tga 1023

<210> 28

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人Lrp4(Lrp4-1381)

<400> 28

gttcctgagc tcaacaatgt catctccctg gactatgaca gcgtggatgg aaaggtctat 60

tacacagatg tgttcctgga tgttatcagg cgagcagacc tgaacggcag caacatggag 120

acagtgatcg ggcgagggct gaagaccact gacgggctgg cagtggactg ggtggccagg 180

aacctgtact ggacagacac aggtcgaaat accattgagg cgtccaggct ggatggttcc 240

tgccgcaaag tactgatcaa caatagcctg gatgagcccc gggccattgc tgttttcccc 300

aggaaggggt acctcttctg gacagactgg ggccacattg ccaagatcga acgggcaaac 360

ttggatggtt ctgagcggaa ggtcctcatc aacacagacc tgggttggcc caatggcctt 420

accctggact atgatacccg caggatctac tgggtggatg cgcatctgga ccggatcgag 480

agtgctgacc tcaatgggaa actgcggcag gtcttggtca gccatgtgtc ccaccccttt 540

gccctcacac agcaagacag gtggatctac tggacagact ggcagaccaa gtcaatccag 600

cgtgttgaca aatactcagg ccggaacaag gagacagtgc tggcaaatgt ggaaggactc 660

atggatatca tcgtggtttc ccctcagcgg cagacaggga ccaatgcctg tggtgtgaac 720

aatggtggct gcacccacct ctgctttgcc agagcctcgg acttcgtatg tgcctgtcct 780

gacgaacctg atagccggcc ctgctccctt gtgcctggcc tggtaccacc agctcctagg 840

gctactggca tgagtgaaaa gagcccagtg ctacccaaca caccacctac caccttgtat 900

tcttcaacca cccggacccg cacgtctctg gaggaggtgg aaggaagatg ctctgaaagg 960

gatgccaggc tgggcctctg tgcacgttcc aatgacgctg ttcctgctgc tccaggggaa 1020

ggacttcata tcagctga 1038

Claims

1.一种人Lrp4抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者七种片段：

片段1：Lrp4-26，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段2：Lrp4-266，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

片段3：Lrp4-431，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：Lrp4-598，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：Lrp4-805，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

片段6：Lrp4-1041，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

片段7：Lrp4-1381，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.一种权利要求1所述的人Lrp4抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：

Lrp4-26-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

Lrp4-26-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

Lrp4-266-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

Lrp4-266-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

Lrp4-431-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

Lrp4-431-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

Lrp4-598-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

Lrp4-598-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

Lrp4-805-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

Lrp4-805-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

Lrp4-1041-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

Lrp4-1041-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

Lrp4-1381-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

Lrp4-1381-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；Taq E 0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时；

所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M Nacl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

6.一种人Lrp4抗原的表达载体，其特征在于，所述表达载体为7个，所述7个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示。

7.一种人Lrp4抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

(A)包被有权利要求1所述的人Lrp4抗原的ELISA酶标板；所述人Lrp4抗原包括Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381中的任意一种或者7种；

(B)标准阴性血清：Lrp4抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：Lrp4抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

8.如权利要求7所述的人Lrp4抗体检测试剂盒，其特征在于，所述人Lrp4抗原中Lrp4-26、Lrp4-266、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381的包被浓度分别为300ng/ml、250ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、和250ng/ml。

9.一种人Lrp4抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人Lrp4抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；

10.权利要求7所述的检测试剂盒在诊断重症肌无力疾病中的应用。