CN101616684A - 用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂用于治疗、减轻和诊断硬化蛋白相关病症，例如，骨质疏松症和硬化性狭窄，以及硬化蛋白相关病症，例如，癌症和心血管病症的用途。本发明还涉及硬化蛋白结合配偶体模拟物用于治疗、减轻和诊断硬化蛋白相关病症的用途。还提供鉴定硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用，以及导致的信号转导的调节剂的测定法。

Description

用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂
发明背景
骨质疏松症(OP)是系统性骨骼病症，其特征是骨量低以及骨组织的微结构退变，随之出现骨脆性升高并且容易发生骨折。据估计50岁龄的妇女在其绝经后有50％的机会发生骨质疏松性骨折。骨质疏松综合症是多方面的，包括原发性病症，如绝经后或年龄相关性OP，以及伴随疾病状态或药物治疗的继发性状况。低骨矿物质密度(BMD)对于OP来说是最重要的危险因素。它是在青春期由于骨获取峰值减弱或随着年龄增长骨流失而发生的。
骨再吸收加速或骨形成受损可以导致骨流失，这两种过程通常是在成年期伴随发生的。由于雌激素缺乏和骨再吸收加速导致快速骨流失是OP最常见的原因，但是所有早期绝经后妇女中仅有约四分之一的人有高度骨周转骨质疏松症。因而骨质疏松症主要是由遗传因素引发的。若干连锁分析已经鉴定出与骨周转增强或骨量低相关的基因，但是显而易见没有单个基因缺陷会导致，例如该疾病最常见的形式——绝经后OP(RalstonSH.(2003)Curr.Opin.Pharmacol.3(3)：286)。
目前在主要市场骨质疏松症的患者为50,900,000人，预计到2010升至55,800,000人，到2015升至61,500,000人。由于人口的老龄化，有稳定的增长。
目前对于OP治疗的大多数疗法是基于抑制骨再吸收以防止进一步的骨流失。对此的原因是骨再吸收(降解)细胞-破骨细胞-是骨特异性的高度特异化细胞，并且已经鉴定了其募集和激活的关键机制。破骨细胞是造血源的细胞并且由骨髓中的干细胞发育而来；成熟的功能性破骨细胞是多核细胞，并且位于这些特异化细胞能够再吸收的矿化骨表面上。
新的骨基质是由成骨细胞形成的，其起源自间叶细胞系。这些骨形成细胞具有三种推定的最终命运：它们进行凋亡(细胞死亡)，变成衬细胞(在矿化骨表面上的扁平细胞)，或者被捕获至骨基质中。被捕获的末期分化细胞称为骨细胞，它是最丰富的骨细胞。它们以规则的间隔被包埋在矿化骨基质内，并且通过称作树突的长细胞结构彼此相互联系，所述树突与相邻的骨细胞和在表面上的骨细胞通过缝隙连接相偶联。它们据认为是骨造型和再造的关键调节物，尽管根本的分子机制尚未充分了解。
尽管骨质疏松症由于骨量减少而被定义为骨折危险升高，但是目前已有的骨骨病症治疗还没有能够实质上增加成人骨密度的。目前的骨质疏松性治疗原则反而是抗再吸收的，能够将新脊椎骨折危险减少大约35到60％(Haeuselmann HJ，Rizzoli R(2003)Osteoporos.Int.；14：2；Chesnut CH，III，等(2004).J Bone Min Res；19(8))。髋骨骨折危险只是通过一种抗再吸收治疗原则来减小，导致骨折危险减小大约50％。能够提高成人骨密度、特别是处于骨量减少和骨质疏松症危险的腕骨，脊柱和髋骨中提高成人骨密度的药物代表了在该领域长期未得到满足的需求。因此，由于许多OP患者在诊断时已经有相当量的骨流失，需要开发这样的试剂，其通过刺激新的骨形成来增加骨量，并且其应该能够减少骨折危险超过50％。
相反，有多种骨骼病症与骨过度生长和骨矿物质密度(BMD)异常高相关联，其中骨形成和沉积超过了再吸收，潜在性地导致骨量和强度病理性地提高。例如，硬化性狭窄一种隐性性状病症，即使是在杂合的携带者中其也显示了骨量提高。同样地，患有Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)的患者通常具有宽、矮的外形，其特征是面部骨骼增大(例如，导致颚部突出和鼻梁增大)。类似的，Van Buchem病是一种常染色体隐性性状疾病，其特征是骨骼过度生长。这种疾病的特征为骨骼的厚度对称性提高，最常见的是颚骨增大，还有头骨、肋骨、长骨骨干，以及手和足部的管状骨增大，导致骨皮质密度提高。头骨厚度增加的临床后果包括面部神经瘫痪，引发听力丧失、视力问题、神经痛，以及非常罕见地，作为视神经萎缩的后果引发失明。
本发明旨在提供与骨矿物质密度(BMD)异常相关病症的组合物，治疗方法，和诊断方法。
发明概述
本发明提供了治疗、改善骨矿物质密度异常病症和/或硬化蛋白(sclerostin)相关病症的症状，以及保护免受该病的方法，包括施用包含硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂的组合物，所述调节剂为例如硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂。所述调节剂可以包括针对(i)硬化蛋白；(ii)硬化蛋白结合配偶体；(iii)由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用生成的新位点(例如，新生成的表位决定簇)，或(iv)包含任何上述物质的蛋白质复合体的抗体、抗体样支架、小分子、嵌合或融合蛋白、肽、模拟物、或抑制性核苷酸(例如，RNAi)。所述组合物包括本文所定义的“药物组合物”。“硬化蛋白相关病症，”骨矿物质密度异常病症”和“硬化蛋白结合配偶体”是本文进一步定义的术语。
作为非限制性实例，本发明提供通过施用硬化蛋白：ALPL、硬化蛋白：Frem2或硬化蛋白：LRP4相互作用的调节剂来治疗硬化蛋白相关病症(例如，骨质疏松症或硬化性狭窄)和/或骨矿物质密度异常病症的方法。
本发明进一步提供鉴定能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相互作用的变化。优选地所述方法包括以下步骤：a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；和b)在所述测试剂存在和缺失的情况下，测量硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的相互作用，其中：(i)相对于测试剂缺失情况下的相互作用，在测试剂存在情况下硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的减小，将测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂；并且其中：(ii)相对于测试剂缺失情况下的相互作用，在测试剂存在情况下相互作用的增加，将测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂。
作为非限制性实例，本发明提供鉴定能够调节硬化蛋白：LRP4相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP4的变化。在一个实施方案中，该测试剂直接或间接地结合LRP4并由此调节硬化蛋白：LRP4相互作用。在一个实施方案中，该测试剂为小分子。在另一个实施方案中，该测试剂为抑制性核苷酸。在又一个实施方案中，该测试剂为包含LRP4蛋白的融合蛋白。
硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用、硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质活性，和/或硬化蛋白途径活性的变化可以通过PCR，TaqmanPCR，噬菌体展示系统，凝胶电泳，酵母双杂交测定，报告基因测试，RNA印迹分析或蛋白质印迹分析，免疫组织化学，传统闪烁相机，γ相机，线性扫描器，PET扫描器，SPECT扫描器，MRI扫描器，NMR扫描器，或X射线机来测量。硬化蛋白、硬化蛋白结合配偶体蛋白质活性，和/或硬化蛋白途径活性的改变可以通过检测硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体之间相互作用变化，通过检测硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的表达或蛋白质水平的变化，通过检测硬化蛋白途径中一种或多种蛋白质的表达或蛋白质水平的变化，优选地通过检测Wnt信号途径的变化来测量。上述可以检测的细胞可以是骨、间充质、肾(例如，HEK)，或造血组织起源的，可以是培养的细胞，或者可以获自转基因生物或可以在转基因生物内。这种转基因生物包括，但不限于小鼠、大鼠、兔、绵羊、奶牛或灵长类动物。
本发明还提供鉴定能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂的方法，该方法包括测量在所述试剂存在时由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号反应，并且将它与在所述试剂缺失情况下由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号反应相比较。优选地，所述方法包括以下步骤：a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；和b)测量由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号或酶学反应，其中在测试剂存在时的反应与测试剂缺失时的反应相比有至少10％，20％或30％的变化表明该测试剂能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。优选地，在步骤b)中测量的信号反应是Wnt信号反应。
在测试剂存在时的信号反应与测试剂缺失时的反应相比有至少10％，20％或30％的提高表明该测试剂为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂。在测试剂存在时的信号反应与测试剂缺失时的反应相比有至少10％，20％或30％的降低表明该测试剂为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂。
作为非限制性实例，本发明提供鉴定能够调节硬化蛋白：LRP4相互作用的试剂的方法，该方法包括测量在所述试剂存在时由硬化蛋白：LRP4相互作用诱导的信号反应，并且将它与在所述试剂缺失时由硬化蛋白：LRP4相互作用诱导的信号反应相比较。在一个实施方案中，该测试剂直接或间接地结合LRP4并由此调节硬化蛋白：LRP4相互作用。在一个实施方案中，该测试剂为小分子。在另一个实施方案中，该测试剂为抑制性核苷酸。
另外，本发明提供了组合物，其包括根据上述方法鉴定的能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂。所述组合物包括本文所定义的“药物组合物”。
优选的能够调节硬化蛋白结合配偶体的试剂是特异性结合所述硬化蛋白结合配偶体的抗体或抗体样支架，或是包含所述抗体或所述抗体样支架的抗原结合部分的功能性蛋白质。
本发明还提供在受试者中诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症，或硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症的倾向的方法，其包括以下步骤：(a)测量所述受试者中的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用，和(b)将步骤(a)中的相互作用与健康个体的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用相比较，差异提示在所述受试者中有硬化蛋白相关病症或倾向。
作为非限制性实例，本发明提供了在受试者中诊断骨质疏松症或硬化性狭窄或其倾向的方法，包括(a)在所述受试者中测量硬化蛋白：LRP4结合，和(b)将步骤(a)中的结合与健康个体(即，没有患或倾向患硬化性狭窄的人)的硬化蛋白：LRP4结合相比较，差异提示在所述受试者中有骨质疏松症或硬化性狭窄或其倾向。
本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、类似或改进的功能效应，其中该方法包括测量候选模拟物与硬化蛋白的相互作用。优选地，所述方法包括：(a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下将硬化蛋白与候选模拟物相接触；和(b)测量模拟物与硬化蛋白的相互作用，其中对于本文所述各种硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体所观察到的相互作用的至少10％，20％或30％的相互作用即表明该候选模拟物为本发明的硬化蛋白结合配偶体的模拟物。
另外，本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、类似或改进的功能效应，其中该方法包括测量由硬化蛋白模拟物相互作用诱导的信号反应并且将它与由本文所述的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号反应相比较。优选地，所述方法包括：(a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下将硬化蛋白与候选模拟物相接触；和(b)测量由硬化蛋白模拟物相互作用诱导的信号反应，其中对于本文所述各种硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用所观察到的信号反应的至少10％，20％或30％的信号反应即表明该候选模拟物为本发明的硬化蛋白结合配偶体的模拟物。
作为非限制性实例，本发明提供鉴定LRP4模拟物的方法，所述LRP4模拟物在正常生理条件下与LRP4和硬化蛋白之间相互作用具有相同、类似或改进的功能效应。所述模拟物可以通过采用本文所述的方法进行鉴定。
本发明进一步提供能够调节蛋白质表达，例如，在哺乳动物细胞中降低硬化蛋白结合配偶体蛋白质表达的siRNA。
另外，本发明提供包含根据上述方法鉴定的硬化蛋白结合配偶体模拟物的组合物。所述组合物包括本文所定义的“药物组合物”。
本发明提供治疗、改善硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症的症状，以及保护免受该病的方法，包括施用包含硬化蛋白结合配偶体模拟物的组合物，该模拟物与硬化蛋白结合配偶体和本文所述的硬化蛋白的相互作用具有相同、类似或改进的功能效应。通过本文所述的方法(以及本文进一步的细节)可以容易地鉴定所述模拟物。在某些实施方案中，所述模拟物可以是针对所述硬化蛋白结合配偶体的抗体或抗体样支架或其片段(例如，抗LRP4抗体或片段)。
此外本发明提供在受试者中诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症或倾向的方法，其包括以下步骤：(a)获取在所述受试者中的硬化蛋白结合配偶体基因的核苷酸序列，和(b)将它与健康个体的序列相比较，其中各个硬化蛋白结合配偶体基因中的突变表明硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症或其倾向。
本发明还提供调节硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间相互作用的方法。作为非限制性实例，本发明包括调节硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间相互作用，以便调节硬化蛋白途径活性，或调节硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质水平的方法。
本发明并不限于本文所详述的硬化蛋白或任何硬化蛋白结合配偶体的天然序列。另外，本发明的方法和组合物包括本文所详述的硬化蛋白或任何硬化蛋白结合配偶体的衍生物和剪接变体。即使是在采用部分或片段时，这些部分或片段也可以具有改变的氨基酸序列。
本发明进一步提供包含硬化蛋白结合配偶体片段的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽特异性结合硬化蛋白结合配偶体，例如LRP4，或硬化蛋白。在一个实施方案中，所述可溶性多肽由LRP4的细胞外部分组成，优选地该多肽由SEQ ID NO 3组成(LRP4 aa 21-1763)。
本发明还提供抗体或抗体样支架，或包含所述抗体或所述抗体样支架的抗原结合部分的功能性蛋白质，其中所述抗体或抗体样支架或功能性蛋白质特异性结合硬化蛋白结合配偶体。在一个实施方案中，所述抗体或抗体样支架或功能性蛋白质抑制硬化蛋白与所述硬化蛋白结合配偶体的结合。在另一个实施方案中，如在基于细胞的测试中测量到的，所述抗体或抗体样支架或功能性蛋白质调节Wnt信号途径。在一个相关实施方案中，所述抗体或抗体样支架或功能性蛋白质特异性结合LRP4或ALPL。
附图简述
图1显示抗LRP4siRNAs，以及它们击倒(knockdown)LRP4mRNA的能力。
图2显示LRP4mRNA击倒减弱了硬化蛋白在HEK293细胞中抑制supertopflash(STF)活性的能力。
图3显示在LRP4mRNA击倒后的硬化蛋白剂量反应研究。
图4a显示LRP4过表达对在Hek293细胞中Wnt1-诱导的supertopflash(STF)-Luc的影响；图4b显示LRP4过表达对硬化蛋白和Dkk1对于在Hek293细胞中Wnt1-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作用的影响；图4c显示LRP4和LRP5过表达对硬化蛋白和Dkk1对于在Hek293细胞中Wnt1-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作用的影响；图4d显示LRP4和LRP6过表达对硬化蛋白和Dkk1对于在Hek293细胞中Wnt1-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作用的影响。
图5a显示LRP4过表达对在C28a2细胞中Wnt1-诱导的supertopflash(STF)-Luc的影响；图5b显示LRP4过表达对硬化蛋白和Dkk1对于在C28a2细胞中Wnt1-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作用的影响。
图6显示硬化蛋白对在MC3T3细胞中GSK3β抑制剂诱导的碱性磷酸酶活性的影响。
图7显示硬化蛋白对在基于无细胞测试中的碱性磷酸酶活性的影响。
发明详述
在本说明书中，术语“治疗”包括治疗性或预防性治疗以及治愈性或疾病抑制性治疗，包括易感疾病(例如，易感硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症)的患者以及患病患者的治疗。此术语进一步包括对疾病进程的延缓治疗。
本文所用的“硬化蛋白结合配偶体”包括，但不限于下列蛋白质：多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体蛋白聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP4、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、碱性磷酸酶(ALPL)和IL-17受体。在一个实施方案中，LRP4和ALPL分别指具有SEQ ID NO：1和2的相应人LRP4和ALPL。
“硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用”意指本文所定义的硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间的直接或间接的相互作用。相互作用的非限制性例子包括直接的物理结合和间接的空间抑制。
本文所用的“硬化蛋白相关病症”包括这样的病症，其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康受试者异常和/或病理性地高，以及这样的病症，其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康受试者异常和/或病理性地低。以高BMD为特征的病症包括但不限于硬化性狭窄，Van Buchem病、骨骼过度生长病、和Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)。以低BMD和/或骨脆性为特征的病症包括但不限于原发和继发性的骨质疏松症、骨量减少、骨软化症、成骨不全(OI)、无血管性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙齿植入物和髋骨植入物)、由于其它病症造成的骨流失(例如，与HIV感染，癌症，或关节炎相关联的)。其它的“硬化蛋白相关病症”包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、关节炎、和溶骨性病变的形成和/或出现。
本文所用的“硬化蛋白相关病症”包括由硬化蛋白介导的或与硬化蛋白水平异常相关的或其特征为硬化蛋白水平异常的病症。这些病症包括癌症和骨质疏松性病症(例如，骨质疏松症或骨量减少)，其中一些与本文所定义的“硬化蛋白相关病症”相重叠。硬化蛋白相关癌症可以包括骨髓瘤(例如，伴随着溶骨性病变的多发性骨髓瘤)，乳腺癌，结肠癌，黑素瘤，肝细胞癌，上皮癌，食管癌，脑癌，肺癌，前列腺癌，或胰腺癌，以及其任何转移灶。
“硬化蛋白相关病症”还可以包括肾和心血管病症，其至少是由在肾和心血管中的硬化蛋白表达所引起的。所述病症包括但不限于肾脏病症，诸如肾小球病(例如，急性和慢性肾小球肾炎，急进性肾小球肾炎，肾病综合征，局灶增生性肾小球肾炎，与系统性疾病相关的肾小球损伤，如系统性红斑狼疮，古德帕斯丘综合征，多发性骨髓瘤，糖尿病，多囊肾病，瘤形成，镰状细胞病，和慢性炎性疾病)，管性疾病(例如，急性肾小管坏死和急性肾功能衰竭，多囊肾病，髓质海绵肾，髓质囊性病，肾原性糖尿病，和肾小管性酸中毒)，小管间质性疾病(例如，肾盂肾炎，药物和毒素诱导的小管间质性肾炎，高钙血症肾病，和低钾血症性肾病)，急进性肾衰竭，慢性肾衰竭，肾石病，痛风，脉管疾病(例如，高血压和肾硬化，微血管病性溶血性贫血，粥样硬化栓塞性肾病，弥漫性皮层坏死，和肾梗死)，或肿瘤(例如，肾细胞癌和肾胚细胞瘤)。
所述病症还包括但不限于心血管病症，诸如缺血性心脏病(例如，心绞痛，心肌梗塞，和慢性缺血性心脏病)，高血压性心脏病，肺原性心脏病，心脏瓣膜疾病(例如，风湿热和风湿性心脏病，心内膜炎，二尖瓣脱垂，和主动脉瓣狭窄)，先天性心脏病(例如，脉管和脉管闭塞性损伤，心房或心室间隔缺损，和动脉导管未闭)，或心肌病(例如，心肌炎，充血性心肌病，和肥厚性心肌病)。
本文所用的“治愈”意指通过治疗导致病症，例如，硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症的减轻，或进行性发作的减轻。
术语“预防”或“防止”意指阻抗硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症，例如，骨质疏松症，硬化性狭窄，或癌症的发病或复发。
本文所用的“调节”表示直接或间接控制或影响的能力，并且作为非限制性实例，可以备选地意指抑制或刺激，激动或拮抗，阻碍或促进，以及强化或弱化。
本文所用的“小有机分子”或“小分子”是有机化合物(或与无机化合物(例如，金属)相络合的有机化合物)，其具有小于3千道尔顿的分子量，优选小于1.5千道尔顿。
本文所用的“报告”基因可与术语“标记基因”相互交换使用，并且是易于检测和/或编码易于检测的基因产物如萤光素酶的核酸。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子，增强子，终止子，等等，其提供编码序列在宿主细胞中的表达。在真核细胞中，多聚腺苷化信号是控制序列。
“启动子序列”是在细胞中能够结合RNA聚合酶并且启动下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调控区。为了定义本发明，将启动子序列在其3’末端被转录起始位点结合并向上游(5’方向)延伸以包括最小数目的碱基或元件，所述碱基或元件是在背景之上以可检测的水平起始转录所必需的。在启动子序列内将会发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图来方便地定义)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列是在细胞中转录和翻译控制序列“控制下”的，其随后进行tRNA的剪切并翻译成由编码序列编码的蛋白质。
用语“可药用的”是指在向人给药时，在生理学上可耐受的并且通常不会产生不希望的反应，如心嘈，头晕等等的分子实体以及组合物。优选地，本文所用的术语“可药用的”意指联邦或州政府的监管机构所批准的或者在美国药典或其它一般公认的药典中的所列举适用于动物，更特别是适用于人。
术语“载体”是指与所述化合物一起施用的稀释剂、佐剂，赋形剂或载体。这类药物载体可以是无菌液体，如水和和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选采用水或水性盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液作为载体，特别是对于注射性溶液。合适的药物载体在由E.W.Martin所著“Remington′sPharmaceutical Sciences”中有描述。
用语“治疗有效量”和“有效量”在这里用来指足够使宿主的活性、功能和反应的临床上显著缺陷降低至少约15％，优选地至少50％，更优选地至少90％，最优选地完全阻止所述缺陷的量。备选地，治疗有效量足以引起宿主中临床上显著病情/症状的改善。
根据本发明，“试剂”指所有可以用来制备药物或诊断组合物的物质，或者可以是化合物，核酸(包括抑制性核酸如shRNA、RNAi，等等)、抗体、抗体样支架、小分子、多肽、片段、同种型、变体，或可以独立用于这些目的的其它物质。
“衍生物”指包含亲本蛋白质或多肽的氨基酸序列的化合物、蛋白质或多肽，所述氨基酸序列已经通过导入氨基酸残基取代、缺失或添加而进行改变，或是核酸或核苷酸，所述核酸或核苷酸已经通过导入核苷酸取代或缺失，添加或突变而进行修饰。衍生的核酸，核苷酸，蛋白质或多肽与亲本多肽具有类似或相同的功能。
“抑制剂”或“拮抗剂”指硬化蛋白和/或硬化蛋白结合配偶体活性，或相关蛋白质或途径(例如，BMP，Wnt，等等)的活性的抑制性分子，包括利用本文所述的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体筛选方法鉴定的那些。抑制剂和拮抗剂可以是通过一种途径来减小、阻抑，或阻止信号传递和/或阻止蛋白质相互作用和复合体形成的试剂。
根据本发明，“模拟物”包括，但不限于多肽，肽，脂类，碳水化合物，核苷酸，小有机分子，和抗体或其抗原结合片段。模拟物可以用来反映(提高)目标蛋白质，肽，或多肽(例如，硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体)的活性，以便于例如，复制、激动，或加强硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的作用。
候选模拟物可以是天然或合成的化合物，包括，例如，合成性小分子，包含在动物、植物、细菌或真菌细胞中的化合物，以及用于这些细胞的条件培养基。模拟物化合物可以利用下面描述的方法来确定。模拟物可以基于主题蛋白质，肽，多肽的关键残基的知识来生成，其可以模仿正常多肽功能。模拟物在其设计后可以具有与多肽，肽，或蛋白质相同、类似或提高的功能效应。
本文所用的术语“双链RNA”或“dsRNA”指核糖核酸分子复合体，具有双螺旋结构，其包含如上所定义的两个反向平行并且基本上互补的核酸链。形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是分离的RNA分子。对于分离的RNA分子来说，这样的siRNA在文献中通常被称作siRNA(“短干扰RNA”)。当两条链是一个较大分子的部分，并因此在形成双链体结构的一条链的3’端与另一条链的5’端之间通过核苷酸连续链连接时，连接RNA链被称作“发夹环”，“短发夹RNA，”或“shRNA”。当在形成双链体结构的一条链的3’端与另一条链的5’端之间通过核苷酸连续链之外的方式共价连接时，连接结构被称作“连接体”。RNA链可以具有相同或不同的核苷酸数目。碱基对的最大数目是siRNA中最短链中的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构以外，siRNA可以包含一个或多个核苷酸突出端。此外，本说明书中所用的“siRNA”可以包括对核糖核苷酸所进行的化学修饰，包括在多个核苷酸上的实质性修饰，并且包括本文所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。为了本说明书和权利要求书的目的，当用于siRNA型分子时，任何这种修饰都被“siRNA”所包括。
本文所用的“核苷酸突出端”指未配对的核苷酸，当siRNA的一条链的3’端延伸超过另一条链的5’链时，所述核苷酸从siRNA的双链体结构中突出出来，或者反之亦然。“平的”或“平末端”意指在siRNA的该末端没有未配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出端。“平末端的”siRNA是这样的siRNA，在其全长上都是双链的，即，在分子任一末端上都没有核苷酸突出端。为了清楚，在确定siRNA是否具有突出端或是平末端时，未考虑缀合到siRNA的3’末端或5’末端上的化学帽或非核苷酸化学部分。
术语“反义链”指siRNA的链，其包括与靶序列基本上互补的区域。本文所用的术语“互补区”指在反义链上这样的区，其与一种序列，例如，本文所定义的靶序列基本互补。当互补区与靶序列并不完全互补时，错配大多在末端区被容许，并且，如果存在的话，一般是在末端区，例如，在5’和/或3’末端的6，5，4，3，或2个核苷酸内。
本文所用的术语“有义链”指siRNA的链，其包括与反义链的区基本上互补的区。
“导入细胞中”，当用在siRNA上时，如本领域技术人员所理解的，意指促进向细胞内的摄取或吸收。siRNA的吸收或摄取可以通过独立扩散或主动细胞过程，或通过辅助试剂或装置而发生。这一术语的意义并不限于体外细胞；siRNA还可以“导入细胞中”，其中该细胞是活体生物的部分。在这种情况下，导入细胞中将包括向生物的递送。例如，对于体内递送来说，可以将siRNA注射入组织部位中或全身施用。体外导入细胞中的方法包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂转染。
在本文中术语“沉默”和“抑制其表达”就它们指SOST基因(即，编码硬化蛋白的基因)，编码硬化蛋白结合配偶体的基因(例如，编码多功能蛋白聚糖(CSPG2)，FREM2，肌原纤蛋白2(FBN2)，C6orf93，多配体聚糖-4(Sdc4)，聚集蛋白(AGRN)，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)，LRP2，LRP4，LRP6，SLIT2，生腱蛋白C，TRIM26，TRIM41，磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，碱性磷酸酶(ALPL)和IL-17受体的基因)，或任何参与硬化蛋白，BMP，或Wnt信号途径的基因而言，这里指所述基因的表达的至少部分抑制，如通过由所述基因转录的mRNA量减少显示，所述mRNA可以分离自第一种细胞或细胞群，其中所述基因转录并且已经进行了处理从而使所述基因的表达与第二种细胞或细胞群相比受到抑制，所述第二种细胞或细胞群与第一种细胞或细胞群基本相同但是其未进行过如此处理(对照细胞)。抑制的程度通常按照
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或者，抑制的程度可以通过一种参数减小的方式来给出，所述参数与SOST基因、编码硬化蛋白结合配偶体的基因、或任何参与硬化蛋白，BMP，或Wnt信号途径转录的基因功能连接，例如细胞分泌的由所述基因编码的蛋白质的量，或展现某一表型的细胞的数目。理论上，可以通过任何合适的测定法测定组成型表达或通过基因组工程表达靶标的细胞中SOST基因、编码硬化蛋白结合配偶体的基因、或任何参与硬化蛋白、BMP或Wnt信号途径的基因的沉默。不过，当需要参照以便测定给定siRNA是否在一定程度上抑制SOST基因，编码硬化蛋白结合配偶体的基因，或任何参与硬化蛋白，BMP，或Wnt信号途径的基因的表达，并因此被本发明所包括时，下面实施例中所提供的测定法将作为这种参照。
例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制SOST基因、编码硬化蛋白结合配偶体的基因、或任何参与硬化蛋白，BMP，或Wnt信号途径的基因的表达至少大约20％，25％，35％，或50％。在某些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸至少抑制所述基因大约60％，70％，或80％。在某些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸至少抑制所述基因大约85％，90％，或95％。
术语“结合”指一种组分(例如，硬化蛋白)与另一种组分(例如，硬化蛋白结合配偶体)的物理结合。测量结合可以得到数值如解离常数，结合常数，结合率或解离率。
本文所用的术语“允许结合的条件”指例如，温度，盐浓度，pH和蛋白质浓度的条件，在这种条件下将出现结合。精确的结合条件将取决于测定的性质，例如，测定是否使用纯蛋白或仅仅是部分纯化的蛋白质。结合温度可以从15℃到37℃变化，但是优选地将介于室温和大约30℃之间。在结合反应中硬化蛋白的浓度也将变化，但是将优选地为大约10pM到10nM(例如，在利用放射性标记组分的反应中)。
本文所用的术语结合是“特异性的”，如果它以1mM或更小的Kd发生的话，一般是100nM到10pM。例如，如果Kd为100nM，50nM，10nM，1nM，950pM，900pM，850pM，800pM，750pM，700pM，650pM，600pM，550pM，500pM，450pM，350pM，300pM，250pM，200pM，150pM，100pM，75pM，50pM，25pM，10pM或更小，则结合是特异性的。
本发明涉及硬化蛋白的蛋白质结合剂的发现(本文称作“硬化蛋白结合配偶体”)。当结合到(或者是与其相互作用)所述硬化蛋白结合配偶体上时，硬化蛋白能够抑制骨沉积，并且在所述结合或相互作用缺失时，骨沉积的抑制作用部分缩减或提高，其取决于所述结合配偶体是否作为硬化蛋白作用的阳性介体或抑制剂起作用。本领域已知硬化蛋白调节其它蛋白质和信号途径。例如，研究已经显示硬化蛋白能够作为骨形态发生蛋白(BMP)信号传递的环境依赖型拮抗剂。另外，硬化蛋白还能够作为Wingless/INT(Wnt)信号途径的抑制剂，可能是通过结合LRP5和LRP6Wnt共同受体。硬化蛋白调节成人骨形成的能力可以通过Wnt信号抑制来实现，这一理论被与硬化蛋白功能丧失突变和LRP5功能获得突变相关的人骨过度生长病症的高度表型重叠所支持。
由于本领域已知硬化蛋白调节其它蛋白质和信号途径，硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节同样可以影响，或者对其它蛋白质和信号途径(例如，Wnt和BMP)发挥作用。因此硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节(例如，通过本发明的方法和组合物)可以导致硬化蛋白水平变化，或提高或降低骨密度，并且可以分别影响硬化蛋白相关病症，或骨矿物质密度异常病症的治疗。这在本文的实施例部分阐明。
尽管在过去的研究中其它因素已经通过Wnt和BMP信号途径牵涉到骨沉积，但本文所详述的(以及在本发明中所体现的)发现是关键性的，因为它们揭示了通过硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用调节这些途径。换句话说，硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用是关键性的以便激活或抑制硬化蛋白，由此能够实现其生物学活性(例如，抑制骨沉积)。
例如，如本文所述，肌原纤蛋白2是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。这种相互作用可以诱导硬化蛋白再折叠成更加稳定的构像，和/或可以起始肌原纤蛋白-2和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。同样地，肌原纤蛋白2和硬化蛋白之间的相互作用可以起始肌原纤蛋白-2和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。通过NMR 15N-硬化蛋白制品显示只有25％的结构，可能是由于硬化蛋白在结合配体如肌原纤蛋白2上折叠造成的。
这些发现产生了本发明的方法和组合物，其可以治疗、预防和诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症等。例如，特征为骨矿物质密度异常低的病症(例如，骨质疏松症)可以通过调节(例如，破坏)硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用来进行预防、治疗或改善。
例如，破坏硬化蛋白：肌原纤蛋白2相互作用(例如，通过使用抗肌原纤蛋白2抗体或抑制性核苷酸)可以用来预防，治疗，或改善骨质疏松症。或者，特征为骨矿物质密度异常高的病症(例如，硬化性狭窄)可以通过调节(例如，增强或激动)硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用，或通过施用与肌原纤蛋白2结合硬化蛋白具有相同或类似功能效应的肌原纤蛋白2模拟物来进行预防，治疗，或改善。例如，以此方式激动硬化蛋白：肌原纤蛋白2相互作用(例如，通过提供肌原纤蛋白2模拟物)以便增强硬化蛋白作用，可以用来预防，治疗，或改善硬化性狭窄。
另外，在许多情况下，硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间的相互作用可以起始硬化蛋白结合配偶体和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此形成硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。同样地，硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用可以起始硬化蛋白结合配偶体和Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的关系。
例如，硬化蛋白和聚集蛋白之间的相互作用可以起始聚集蛋白和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此形成硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。同样的，硬化蛋白-聚集蛋白相互作用可以起始聚集蛋白和Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的关系。
硬化蛋白/SOST
硬化蛋白，由SOST基因编码的蛋白质，是骨细胞分泌的骨形成的有效负调节剂(Swiss-Prot检索号Q9BQB4)。由于硬化蛋白在其半胱氨酸结节结构上与TGF-β拮抗剂的DAN家族的相似性，硬化蛋白最初仅被假定为一种骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂(Brunkow等(2001)Am J Hum Genet，68：577-589)；但是，它直接与BMP体内相互作用的能力一直是推测性的。
硬化蛋白或SOST表达的缺失导致骨形成失控，例如，硬化性狭窄(Brunkow等(2001)Am J Hum Genet.；68(3)：577)。患硬化性狭窄的患者终生要忍受骨过度生长的折磨，导致骨量和强度提高。这种隐性疾病的杂合携带者也表现出骨量增多(Gardner等2005 J Clin Endocrinol Metab.90(12)：6392)。这种表型可以在SOST缺陷型小鼠中重复出现并且其过度表达导致骨质减少(Loots等2005(Genome Res.200515(7)：928)。另外，已经发现Van Buchem病-硬化性狭窄的一种表型副本-是由SOST误调控引起的，所述误调控是由远程骨增强子的基因组缺失所造成的(Loots等2005(Genome Res.200515(7)：928).)。最后，研究显示骨形成过程中SOST通过骨增强子被副甲状腺激素下调-唯一临床确认的骨形成理论(Keller，Kneissel 2005，Bone.200537(2)：148)。因此硬化蛋白作用的抑制将导致骨质疏松症的理想治疗。
尽管还不清楚硬化蛋白是如何精确地发挥其骨形成负调节剂的作用，但是研究显示硬化蛋白抑制骨形态发生蛋白(BMP)和Wingless/INT(WNT)信号转导，二者对于骨形成都是关键性的。硬化蛋白能够作为BMP信号转导的环境依赖型拮抗剂。另外，硬化蛋白还可以作为Wnt信号途径的抑制剂，可能是通过在尚未鉴定的辅因子存在情况下结合Lrp5和Lrp6(Semenov MV，He X.J Biol Chem.2006；281(50)：3827)Wnt共同受体。硬化蛋白可能通过Wnt信号转导抑制来影响成人骨形成的假说被与硬化蛋白功能丧失突变和LRP5功能获得突变相关的人骨过度生长病症的高度表型重叠所支持。
硬化蛋白可能在出生后的一生中具有其它作用。硬化性狭窄患者身材异乎寻常地高(Van Hul等(2001)European Journal of Radiology 40198)，提示硬化蛋白在软骨生物学中的推定作用。另外硬化蛋白在肾中表达，暗示它可能在此器官中发挥尚未表征的作用(Balemans等2001Hum MolGenet.10(5)：537，Balemans and Van Hul(2002)Developmental Biology 250，231)。最后它已经显示在心血管系统中至少在胚胎发育期间表达(vanBezooijen等(2006)Dev Dyn.2006；236(2)：606)。
多功能蛋白聚糖(CSPG2)
多功能蛋白聚糖(Versican)是包括聚集蛋白聚糖，神经蛋白聚糖和短小蛋白聚糖的lectican家族成员。它是大的硫酸软骨素蛋白聚糖。它的N末端球形结构域(G1)结合糖胺聚糖乙酰透明质酸，并且其羧基末端球形结构域(G3)由两个EGF样结构域，一个凝集素样结构域，和一个补体调控蛋白质样结构域组成。已知多功能蛋白聚糖的四种剪接变体(V0-V4)(Wight，TN(2002)Curr.Opin.Cell Biol.；14(5)：617-23)。多功能蛋白聚糖V0和V1是由ADAMTS1和4(聚集蛋白聚糖酶-1)剪切的(Sandy，等(2001)J.Biol.Chem.；276(16)：13372-8)(Russell，等(2003)J.Biol.Chem.；278(43)：42330-9)而多功能蛋白聚糖V2是由ADAMTS4剪切的(Westling，等(2004)Biochem.J.；377(Pt.3)：787-95)。
多功能蛋白聚糖具有广泛的组织分布。Nakamura等在发育中的下颌骨和后肢中研究多功能蛋白聚糖的表达。基于他们的结果，他们提出下列结论。多功能蛋白聚糖在成骨细胞分化之前表达并且在膜内骨化期间位于类骨质中。在软骨内骨化中，多功能蛋白聚糖在骨膜细胞中表达，所述骨膜细胞覆盖在钙化软骨表面上的活性生骨区。此后，骨进行了两种类型的骨化，随后进行骨发育的共同连续过程。骨基质延伸并且形成富含多功能蛋白聚糖的编织骨。在成骨细胞，在限制性的骨细胞群以及在骨基质中检测到多功能蛋白聚糖mRNA和蛋白质。当编织骨改变成板层骨时，在骨基质中的多功能蛋白聚糖表达减少。ADAMTS1，4和5的时间和空间mRNA表达模式与多功能蛋白聚糖相当。他们假设成骨细胞和骨细胞可能通过分泌ADAMTS参与多功能蛋白聚糖的生产和降解(Nakamura，等(2005)J.Histochem.Cytochem.；53(12)：1553-62)。最后，多功能蛋白聚糖和BMP信号转导被联系在一起，如这样的事实所示，即BMP-2将大鼠椎间盘细胞中多功能蛋白聚糖基因表达减半(Li，等(2004)J.Spinal Disord.Tech.；17(5)：423-8)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞培养物上清液级分中，多功能蛋白聚糖(CSPG，IPI00009802.1)已经被鉴定为结合配偶体。据认为多功能蛋白聚糖是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白再折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。硬化蛋白：多功能蛋白聚糖相互作用还作为硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。
FREM 2
由my基因(myelencephalic blebs基因)编码的Frem2，是一种被提议的ECM组分，与Fras1和Frem1相关(Fras1相关的细胞外基质)并且据认为与海胆ECM3蛋白同源。它的预测蛋白质排列由下列组成：N末端信号肽后接13个串联排列的硫酸软骨素蛋白聚糖结构域(CSPG)，5个串联排列的CALXβ结构域，1个跨膜螺旋和一个具有共有PDZ相互作用基序的短的细胞质尾部。
在起泡突变体(myUcI)和两个弗雷泽综合征个体中已经检测到Frem2的错义突变，所述弗雷泽综合征是一种多系统畸形，通常包括隐眼，皮肤性并指(趾)，耳朵畸形，肾发育不全和先天性心脏缺陷。有趣的是，myUcI小鼠表现出皮肤性并指(趾)，偶而伴随多骨并指(趾)和多指畸形。导致氨基酸取代E1972K的核苷酸转换5914G-＞A，已经在两个不相关的家族中被鉴定出来。这种突变在五个连续CALXβ结构域的第二个中出现并且取代了在所有已知CALXβ结构域中保守的残基。序列相似性检索显示CALXβ与钙黏着蛋白结构域相关，已知所述钙黏着蛋白结构域在连续结构域之间的负电荷口袋中插入钙离子。序列到结构的比对已经显示Glu1972位于CALXβ结构域2和3交界处的Ca2+结合口袋中并且对应于直接参与Ca2+配位的保守性位置。这提示在CALXβ-钙黏着蛋白基序中的钙结合对于FREM2的正常功能是重要的(Jadeja S，等(2005)Nat.Genet.；37(5)：520-5)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞膜纯化级分中，Frem2(IPI00180707.7)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。据认为Frem2是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是由至少硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白再折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。
肌原纤蛋白2(FBN2)
糖蛋白肌原纤蛋白-1和2是细胞外钙结合微纤维的主要结构成分，平均直径为10nm。肌原纤蛋白共有保守性多结构域结构，具有高度氨基酸序列同源性。肌原纤蛋白-2由47个EGF样结构域组成，独特的C和N末端结构域和小的富含甘氨酸的结构域，这47个EGF样结构域中43个具有共有钙结合序列，被包含8个半胱氨酸的模块中断，其也在休眠TGF-β1结合蛋白质(LTBP)中发现。肌原纤蛋白-2优选位于弹性组织中，如弹性软骨和主动脉的血管中膜层(Putnam，等(1995)Nat.Genet.；11(4)：456-8)。在骨中，肌原纤蛋白-2mRNA，与肌原纤蛋白-1一起，由源自近端大腿骨的人小梁骨并且由原始培养物中的成熟骨来源的人成骨细胞丰富地表达(Kitahama，等(2000)Bone；27(1)：61-7)。
肌原纤蛋白-2突变导致先天性挛缩性细长指(CCA)，一种常染色体显性病症，其特征是细长指，蜘蛛脚样指，脊柱侧凸，多发性先天性挛缩和外耳异常。CCA在表型上类似于马方综合征，其由肌原纤蛋白-1突变导致，但是并不影响主动脉和眼睛。在两名CCA患者中，FBN2错义突变在单独的EGF样重复中引发不同半胱氨酸残基的取代(Putnam，等1995)。无肌原纤蛋白-2的鼠以双侧并指(趾)的形式表现出四肢形状缺陷，主要是由于缺陷型间叶细胞分化所造成的。并指(趾)与紊乱的基质相关联，但是与正常BMP基因表达相关。对于无效Fbn2和BMP7等位基因的小鼠双杂合子表现出两种失效合子的组合的足趾表型(并指(趾)和多指畸形)(Arteaga-Solis，等(2001)J.Cell Biol.；154(2)：275-81)。由于多指畸形是纯合子的特征，而非杂合的BMP-7无效小鼠的特征，并且由于杂合型肌原纤蛋白-2小鼠是正常的，双杂合型小鼠的表型提示在四肢生长过程中富含肌原纤蛋白-2的微纤维和BMP-7信号转导之间的功能性相互作用。
肌原纤蛋白-2可以在发育生物的细胞间空间提供排列形态发生信息的结构支架。这一功能可以通过直接结合失活生长因子(如对于休眠TGF-β复合体来说)，间接地通过与其它基质组分(如蛋白聚糖)相互作用，或通过两种机制的结合来实现(Arteaga-Solis，同上)。近来，显示在肌原纤蛋白-1无效小鼠中，BMP-7与肌原纤蛋白-2共同定位(Gregory，等(2005)J.Biol.Chem.；280(30)：27970-80)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞的膜纯化级分中，肌原纤蛋白2前体(FBN2，IPI00019439.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。肌原纤蛋白2被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。这种结合可以诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象，并且可以起始肌原纤蛋白-2和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此形成硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。同样的，硬化蛋白-肌原纤蛋白2相互作用可以起始肌原纤蛋白-2和Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。
C6orf93
C6orf93是一种假想蛋白，也叫作LTV1同源物(酿酒酵母(S.cerevisiae))。在人中，2002年在NIH MGC项目框架中首次对它进行描述(Strausberg，等(2002)PNAS；99(26)：16899-903)。在酿酒酵母中，低温活性蛋白质LTV1编码非必需的，非核糖体蛋白质。缺少LTV1和YAR1的菌株对各种环境胁迫，像渗透和氧化胁迫，低温和高温以及某些蛋白质合成抑制剂的存在表现出超敏性，揭示出核糖体生物发生因素与环境胁迫敏感性之间的未知联系(Loar，等(2004)Genetics.；168(4)：1877-89)。Ltv1与小核糖体亚基输出因子Yrb2的基因在遗传上相互作用，提示Ltv1作为若干可能的衔接蛋白之一，所述衔接蛋白将核输出机器与小亚基联系起来(Seiser，等(2006)Genetics.；174(2)：679-691)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293和UMR106细胞膜纯化级分中，C6orf93(IPI0053032.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。C6orf93被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。硬化蛋白：C6orf93相互作用可以诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)，起始C6orf93和BMP或Wnt信号转导之间的功能性相互作用，并且作为硬化蛋白和这些途径之间的联系。硬化蛋白：C6orf93相互作用还涉及骨细胞对环境胁迫的敏感性。
多配体聚糖-4(Sdc4)
多配体聚糖(Syndecan)-1到-4是单通内在膜组分，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员。每种多配体聚糖都具有短的细胞质结构域，单跨越跨膜结构域和具有3到5个糖胺聚糖链的附着位点的细胞外结构域，让它们可以直接将细胞周围环境与细胞内部连接起来。多配体聚糖-4，也叫做双栖蛋白聚糖或抗凝蛋白聚糖，是一个独特的成员，因为它具有激活细胞内信号级联并在哺乳动物细胞中形成黏着斑位点的能力。它通过其糖胺聚糖链结合纤连蛋白，激活PKCα和小GTP酶RhoA，并与整联蛋白一起稳定黏着斑位点(Tkachenko E，等(2005)Circ.Res.；96(5)：488-500)。在爪蟾中，纤连蛋白调控多配体聚糖-4将Dsh转位至质膜上的能力，其是激活非常规Wnt信号转导的标志(Munoz R，等(2006)Nat.Cell Biol.；8(5)：492-500)。
多配体聚糖-4在若干细胞型中广泛表达，包括原代大鼠颅顶成骨细胞，在这里其mRNA表达被FGF2处理所上调。这种上调并非像放线酮处理后多配体聚糖-4mRNA减少那样的立即反应。成骨细胞增殖和矿化，以及ERK激活，也被FGF2所增强，但是却被抗多配体聚糖-4抗体预处理特异性减弱(Song SJ，等(2007)J.Cell Biochem.；100(2)：402-411)。在C2C12细胞中，多配体聚糖-2和-3被BMP-2所上调(Gutierrez J，等(2006)J.CellPhysiol.；206(1)：58-67)，但是多配体聚糖-3在软骨发生过程中是BMP-2信号转导的负调节剂(Fisher MC，等(2006)Matrix Biol.；25(1)：27-39)。在果蝇(Drosophila)中，多配体聚糖位于发育中的轴突，在遗传上和物理上与SLIT和Robo相互作用并通过SLIT/Robo信号转导促进轴突和肌管导向(Johnson KG，等(2004)Curr.Biol.；14(6)：499-504)(Steigemann P，等(2004)Curr.Biol.；14(3)：225-30)。最后，当接种多配体聚糖-4抗体时，多配体聚糖-4可以在激活的B淋巴细胞中诱导丝足样结构(Yamashita Y，等(1999)J.Immunol.；162(10)：5940-8)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的大鼠骨肉瘤UMR106细胞培养物上清液级分中，多配体聚糖-4(sdc4，IPI00199629.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。多配体聚糖被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体(本文定义为“硬化蛋白结合配偶体”)，或是至少由硬化蛋白，SLIT，和多配体聚糖-4组成的多复合体的部分。这种结合可以调节骨细胞树突样过程的起始，或诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象并因此调节硬化蛋白作用。另外，多配体聚糖-4可以作为硬化蛋白和Wnt和/或BMP信号转导之间的联系。
SLIT2
SLLIT2是一种分泌型蛋白质，其在细胞迁移中作为分子导向杆，并且其功能是通过与间接同源受体的相互作用来介导的。它在脊髓中表达并且参与早期体轴形成和神经管的细胞模式发育。
与硬化蛋白在结构上相关的Gremlin和Dan，与Slit1和Slit2蛋白在物理上和功能上相互作用并由此作为单核细胞趋化性的抑制剂(Chen等(2004)J Immunol.；173(10)：5914)。另外Slit蛋白是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和性配体(Ronca等(2001)J Biol Chem.276(31)：29141)，其在本发明所述的实验中也被鉴定为硬化蛋白相互作用配偶体。另外也在本发明中描述过的多配体聚糖，通过slit/robo信号转导促进轴突和肌管导向(Johnson KG，等(2004)Curr.Biol.14(6)：499-504)(Steigemann P，等(2004)Curr.Biol.14(3)：225-30)。
在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞膜级分中，SLIT2(IPI00006288.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。SLIT2被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体(本文定义为“硬化蛋白结合配偶体”)，或是至少由硬化蛋白，SLIT，可能有多配体聚糖-4和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1组成的多复合体的部分。这种结合可以调节骨细胞树突样过程的起始，或诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象并因此调节硬化蛋白作用。另外，SLIT2可以作为硬化蛋白和Wnt和/或BMP信号转导之间的联系。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(Gpc1)
磷脂酰肌醇蛋白聚糖调节细胞外蛋白质配体与其作为共同受体的受体的接触。已知它们调节Wnt信号转导(Capurro等(2005)，CancerRes.；65(14)：6245)和BMP信号转导[例如通过与BMP拮抗剂相互作用(Paine-Saunders等(2000)Dev Biol.；225(1)：179)]。例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖3中的突变导致与骨过度生长相关联的各种综合征。例如，Simpson-Golabi-Behmel过度生长综合征(Pilia等(1996)，NatGenet.12(3)：241)是丧失Gpc3对Wnt信号转导控制的结果((Song等(2005)；Biol Chem 280(3)：2116))。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖由成骨细胞的细胞表达并被提议为骨重塑的潜在调节剂(Sheu等(2002)J Bone Miner Res.17(5)：915)。
另外磷脂酰肌醇蛋白聚糖1结合SLIT(Ronca等(2001)J Biol Chem.276(31)：29141)，其也在本发明中被描述为硬化蛋白相互作用配偶体。
在串联亲和纯化结合测定的成骨细胞UMR106细胞培养物上清液级分中，Gpc1(IPI00137336.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。Gpc1被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体(本文定义为“硬化蛋白结合配偶体”)，或是至少由硬化蛋白，Gpc1，并且可能地多配体聚糖-4和SLIT2组成的多复合体的部分。这种结合可以调节骨细胞树突样过程的起始，或诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象并因此调节硬化蛋白作用。另外，磷脂酰肌醇蛋白聚糖1可以作为硬化蛋白和Wnt和/或BMP信号转导之间的联系。
聚集蛋白(AGRN)
聚集蛋白是一种大的细胞外基质硫酸肝素蛋白聚糖，分子量大约600kDa(200kDa蛋白质核心)。备选的信使RNA剪接产生同种型，其编码剪切的信号序列，后接氨基末端聚集蛋白结构域，产生聚集蛋白(NtA-聚集蛋白)的分泌形式，以及同种型，其包含较短的氨基末端与内部未剪切的信号肽，将蛋白质转变成II型跨膜蛋白质(TM-聚集蛋白)。两种同种型都是差别表达的：NtA-聚集蛋白在大多数包含基片的组织中广泛表达而TM-聚集蛋白优先在中枢神经系统中表达(Burgess，等(2000)J.Cell Biol.；151(1)：41-52)(Neumann，等(2001)Mol.Cell Neurosci.；17(1)：208-25)。近来，据显示聚集蛋白在小鼠软骨细胞中表达并定位于生长板(Hausser等(2007)Histochem Cell Biol.；127：363)。NtA-聚集蛋白缺陷型小鼠已经提供证据，证明聚集蛋白在骨骼肌的神经肌肉连接处的突触后发育中对于乙酰胆碱受体的聚积是必需的(Gautam，等(1996)Cell.；85(4)：525-35)。这一能力需要肌肉特异性受体酪氨酸激酶MuSK，如通过聚集蛋白和MuSK缺陷型小鼠表型的相似性所证明(DeChiara，等(1996)Cell.；85(4)：501-12)。聚集蛋白在大鼠骨骼肌细胞中的过表达诱导丝足的形成(Uhm，等(2001)J.Neurosci.；21(24)：9678-89)。抗体-诱导的内源性TM-聚集蛋白的聚簇导致沿着中枢和外周神经元的丝足样过程的形成增多(Annies，等(2006)Mol.Cell Neurosci.；31(3)：515-24)。在海马神经元培养物中TM-聚集蛋白的过表达和通过TM-聚集蛋白siRNA的下调提示TM-聚集蛋白正向调节发育中的神经突上丝足的数目，这种调节是通过其对于丝足的起始和稳定化作用来实现的(McCroskery，等(2006)Mol.Cell Neurosci.；33(1)：15-28)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞培养物上清液级分中，聚集蛋白(IPI00374563.2)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。聚集蛋白被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够调节骨细胞丝足样过程的起始和稳定，或诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。
丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)
丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(Serpine)2编码丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，也称作蛋白酶连接蛋白I(PN-1)或神经胶质来源的连接蛋白前体(PI7)。它是43kDa的分泌型蛋白质，丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)超家族的成员并且已经被描述为由星形胶质细胞、平滑肌、内皮细胞，和成纤维细胞合成(Scott，等(1985)J.Biol.Chem.；260(11)：7029-34)(Rosenblatt，等(1987)Brain  Res.；415(1)：40-8)(Festoff，等(1991)J.Cell Physiol.；147(1)：76-86)(Bouton，等(2003)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.；23(1)：142-7)。它是凝血酶和尿纤溶酶原激活物(uPA)的强抑制剂并且，为纤溶酶和胰蛋白酶的强度较小但仍然有效的抑制剂(Scott，等(1985)DNACell Biol.；22(2)：95-105)。凝血酶-PN-1复合体的有效分解代谢是一种协同机制，其需要LRP-1和肝素：首先凝血酶-PN-1复合体被肝素浓集到细胞表面，随后在被细胞降解前被LRP-1内化(Knauer，等(1997)J.Biol.Chem.；272(46)：29039-45，Scott，等(2003)DNA Cell Biol.；22(2)：95-105)。
在小鼠胚胎成纤维细胞中，N-1复合体的选择性内化作用是由多配体聚糖-1介导的，并激活Ras-ERK信号转导途径。游离的PN-1也可以被内化(Li，等(2006)J.Cell Biochem.；99(3)：936-51)。PN-1调节脉管平滑肌细胞附着，铺展和迁移(Richard，等(2006)J.Thromb.Haemost.；4(2)：322-8)。在人骨骼肌中PN-1表达被损伤相关因子像TNFα、TGFβ和IL-1上调(Mbebi，等(1999)J.Cell Physiol.；179(3)：305-14)。PN-1也已被报告通过抑制凝血酶参与神经突延伸(Farmer，等(1990)Dev.Neurosci.；12(2)：73-80)。最后，在NIH3T3细胞中，PN-1被显示为Prx2的靶基因，已知所述Prx2是正确的骨骼形成所必需的(Scott，等(2003)DNA Cell Biol.；22(2)：95-105)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106细胞培养物上清液级分中，PN-1(IPI00203479.3)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。PN-1被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。硬化蛋白：PN-1相互作用还参与骨细胞生长或硬化蛋白内化和降解。
低密度脂蛋白受体相关蛋白2(LRP2，巨蛋白)
低密度脂蛋白受体家族是一类高度保守的细胞表面受体，在物质运输，大分子从细胞表面的内化以及细胞信号转导中具有广泛功能。巨蛋白是一种多配体的上皮内吞作用受体，其在成人肾和回肠中被充分表征，在所述成人肾和回肠中它们形成对于蛋白质、脂类和维生素吸收所必需的复合体。它还在雄性和雌性生殖道的上皮细胞衬里特定区的顶部表面上和在精囊(大鼠)中表达，在精囊中它作为精囊的内吞作用受体。巨蛋白敲除小鼠出现维生素D缺陷和骨疾病，这是由于肾中的近端小管不能从肾小球滤液中捕获DBP/25-(OH)D3复合体造成的(Willnow等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8460)。以相同的方式，肾特异性的巨蛋白敲除小鼠具有严重的血浆维生素D缺陷、低血钙症和严重的骨疾病，像完全巨蛋白敲除小鼠一样(Leheste等(2003)FASEB J.17(2)：247)。它们的骨骼特征是骨矿物质含量减少，类骨质表面增多，并且缺乏矿化活性。这些特征与作为维生素D缺乏引起的骨软化是一致的，表明巨蛋白途径对于系统性钙动态平衡和骨代谢是非常重要的。
在串联亲和纯化结合测定的人胚肾Hek293膜纯化和上清液级分中，LRP2(IPI00024292.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。LRP2被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。硬化蛋白在肾中表达(Balemans and Van Hul(2002)DevelopmentalBiology 250，231)。因此，LRP2在肾调节中可以与硬化蛋白相互作用，尽管此外的作用尚未被表征。另外LRP2能够参与骨中的硬化蛋白内化以及随后的降解，调节其作用。
低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4，也叫做Megf7)
Megf7是低密度脂蛋白受体家族的一员。LRP4缺陷型小鼠表现出前后肢的多趾畸形。并指(趾)也是硬化蛋白水平异常的典型特征(在硬化性狭窄患者中硬化蛋白的缺失和小鼠中硬化蛋白的过表达都导致并指(趾))。LRP4和硬化蛋白蛋白质都在顶端外胚层嵴(AER)形成中发挥作用并在胚龄9.5天时表达。另外，硬化蛋白和LRP4都可以拮抗常规Wnt信号转导(Johnson EB，等(2005)Hum Mol Genet.14(22)：3523)(Simon-Chazottes D，等(2006)Genomics 87(5)：673)(Loots GG，等(2005)Genome Res.15(7)：928-35)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106和Hek293细胞的细胞膜级分中，LRP4(IPI00306851.3)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。LRP4被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。另外，已经显示LRP4在其作为Wnt信号转导抑制剂时作为硬化蛋白作用的增强剂。
低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)
LRP6通过与Frizzled一起作为Wnt.LRP6高亲和性结合DKK1的共同受体，是Wnt/β联蛋白信号途径所必需的。这种与DKK1的相互作用阻抑了LRP6介导的Wnt/β联蛋白信号转导。近来已经显示硬化蛋白样的DKK1在体外作为LRP6的结合配偶体并由此抑制Wnt信号转导(Semenov等(2005)J Biol Chem.280(29)：26770)。
在串联亲和纯化结合测定的Hek293和成骨细胞UMR106细胞培养物膜级分中，LRP6(IPI00000203.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。这些发现提示硬化蛋白在体内通过LRP6相互作用发挥其部分作用。这也强调了来自串联亲和纯化结合测定实验的发现的相关性，因此可视作阳性对照。
生腱蛋白C
生腱蛋白C是240kDa的大的多聚体细胞外基质蛋白，包括七残基重复序列，EGF样序列，纤连蛋白III型结构域，和与血纤蛋白原共有的C末端球形结构域。生腱蛋白主要是由结缔组织中的细胞合成的(Chiquet-Ehrismann R(2004)Int.J.Biochem.Cell Biol.；36(6)：986)。它们被分类为附着调节蛋白质是因为，与其它细胞外基质蛋白质相反，生腱蛋白只促进弱细胞附着并且细胞平铺受限(Orend G and Chiquet-EhrismannR(2000)Exp.Cell Res.；261(1)：104)。
生腱蛋白C可以影响若干细胞内信号分子，像FAK，RhoA，cGMP依赖型蛋白质激酶和14-3-3tau。它还可以直接结合并激活EGF受体(Chiquet-Ehrismann R and Tucker RP(2004)Int.J.Biochem.Cell Biol.；36(6)：1085)。生腱蛋白C支持培养的成骨细胞样细胞的分化(Mackie EJand Ramsey S(1996)J.Cell Sci.；109(Pt 6)：1597)。在大鼠尺骨中，免疫组化检测显示只有响应负荷形成的新骨内的骨细胞才对生腱蛋白C强烈染色。最近被包埋的骨细胞，即离骨膜表面较近的骨细胞未被染色(Webb CM，等(1997)J.Bone Miner.Res.；12(1)：52)。生腱蛋白C影响整联蛋白和多配体蛋白聚糖信号转导(Huang W，等(2001)Cancer Res.；61(23)：8586)。
在高血压患者中，生腱蛋白C响应于突变的BMPR2而被诱导(Ihida-Stansbury K，等(2006)Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol.；291(4)：L694)。在高密度的鸡肢芽细胞培养物中生腱蛋白C表达被Wnt7a所抑制(Stott NS，Jiang TX and Chuong CM(1999)J.Cell Physiol.；180(3)：314)，而在鸡胚成纤维细胞中，TGFb诱导生腱蛋白表达。(PearsonCA，等(1988)EMBO J.；7(10)：2977)。生腱蛋白C通过与整联蛋白α7β1相互作用提高大鼠小脑颗粒神经元的神经突生长(Mercado ML，等(2004)J.Neurosci.；24(1)：238)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106细胞培养物上清液级分中，生腱蛋白C(IPI00403938.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。生腱蛋白C被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。这种相互作用诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象，和/或起始生腱蛋白C和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和BMP信号转导之间的的联系。同样的，生腱蛋白C和硬化蛋白之间的相互作用起始生腱蛋白C和Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。另外，它参与骨细胞生长或这些机制的结合。
三联基序(TRIM)蛋白质(TRIM26，TRIM41)
三联基序(TRIM)蛋白质家族是RING(“真正令人感兴趣的新基因”)蛋白的扩展家族，也叫做RBCC蛋白，因为它们包含RBCC基序，其包括RING结构域，一个或两个B-盒和预测的卷曲螺旋区。TRIM/RBCC蛋白质涉及广泛的生物学过程，包括细胞增殖，分化，发育，瘤形成和凋亡。RING结构域的存在及其与泛素化作用的强烈关联提示这个蛋白家族在泛素化过程中发挥作用(Meroni G，等(2005)Bioessays.27(11)：1147)(NisoleS，等(2005)Nat.Rev.Microbiol.3(10)：799)。
如本文进一步详述的，TRIM26(IPI00010948.2)已经在串联亲和纯化结合测定的Hek293膜级分中，TRIM41(IPI00414021.1)已经在串联亲和纯化结合测定的Hek293和UMR106膜级分中被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。据认为TRIM26和TRIM41是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白降解。TRIM与LRP2一起可以参与硬化蛋白内化作用和随后的降解。
IL-17受体
IL-17A的受体(IL17RA)是大约130kDa的单通跨膜蛋白质，并且具有不同寻常的大细胞质尾部。尽管IL-17A细胞因子只由T细胞表达，但其受体是广泛表达的。因此，IL-17可以对许多种细胞作用以触发炎症效应物的表达。大多数这些效应物已经显示通过促进破骨细胞发生或发挥骨保护性作用而对骨代谢具有影响(Gaffen SL(2004)Arthritis Res.Ther.；6(6)：240)。
大多数IL-17-诱导的基因趋于是骨再吸收性的。例如，已经显示IL-6对于雌激素介导的骨流失是一种贡献因素(Jilka RL，等(1992)Science.；257(5066)：88)。在过表达IL-17的小鼠中，骨侵蚀是由RANKL介导的(Lubberts E，等(2003)J.Immunol.；170(5)：2655)。IL-17并不参与骨动态平衡的生理调节，这是由于与野生型同窝出生的小鼠相比，IL-17-/-小鼠不存在骨矿物质密度，骨骼发育以及骨再吸收和骨形成参数的差异。但是，在炎性骨破坏的LPS-诱导模型中，与野生型小鼠相比，在IL-17-/-小鼠中骨再吸收的水平弱得多并且破骨细胞形成被显著减弱，提示Th17细胞参与T细胞介导的破骨细胞发生。
IL-17介导的RANKL和炎性细胞因子，如TNFα和IL-1的导入，已经被提示参与该过程(Sato K，等(2006)J.Exp.Med.；203(12)：2673)。IL-17还是嗜中性粒细胞募集和激活的强诱导剂，大部分是由于其促进趋化因子分泌的能力所致。据认为嗜中性粒细胞在慢性炎症过程中促进骨破坏。但是，在牙周疾病诱导的骨流失中嗜中性粒细胞一般被认为是骨保护性的(Kantarci A，Oyaizu Z and Van Dyke TE(2003)J.Periodontol.；74(1)：66)。对于IL-17RA的信号转导知之甚少。涉及的途径可能包括NF-KB途径，参与C/EBP磷酸化作用的C/EBP家族以及MAPK和GSK3β，ERK1和2，JNK，p38和PI-3K/Akt(Gaffen SL，等(2006)Vitam.Horm.；74：255-82.：255)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293膜级分中，IL-17RA(IPI00304993.3)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。IL-17RA，或IL-17RB，IL-17RC，IL-17RD和IL-17RE被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象，和/或起始IL-17受体和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。同样的，IL-17受体和硬化蛋白之间相互作用起始IL-17受体和Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。另外，它参与骨细胞生长或这些机制的组合。
碱性磷酸酶(ALPL)
在大多数哺乳动物中，有四种不同的同工酶：胎盘，胎盘样，肠和组织非特异性(肝/骨/肾，ALPL)的。碱性磷酸酶肝/骨/肾(ALPL)的缺陷是婴儿低磷酸酯酶症的病因，这是一种遗传代谢性骨疾病，特征是骨骼矿化缺陷，提示ALPL在骨骼矿化中发挥作用(Fedde KN等(1999)JBMR14(12)：2015-2026)。
ALPL是骨形成标记。在骨生成过程中，在骨原细胞中并未检测到碱性磷酸酶。它的表达在前成骨细胞集落的增殖能力丧失以及节结形成起始时开始。从那时起表达就一直得到维持(Liu等(1994)Devel Biol.166：220-234)。已经描述过几种BMP在成骨细胞样细胞中诱导碱性磷酸酶(Cheng H等(2003)J Bone Joint Surg Am.85：1544-1552)。此外，Rawadi G等(2003)表明BMP-2通过Wnt自分泌环控制碱性磷酸酶表达(JBMR18(10)：1842-1853)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106细胞培养物上清液级分中，ALPL(IPI00327143.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。ALPL被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。另外，已经显示SOST在基于无细胞的测定中直接抑制ALPL酶活性。
筛选测定
本发明提供鉴定调节剂的方法(本文也称作“筛选测定”)，所述调节剂例如，候选或测试化合物或试剂(抗体，抗体样支架，小分子，融合蛋白，肽，模拟物，或抑制性核苷酸(例如，RNAi))，其结合硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体，或相关复合体的蛋白质成员，并且对例如，硬化蛋白表达或活性具有刺激性或抑制性作用。
所述方法包括用于鉴定能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的候选或测试化合物或试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体的相互作用变化。优选地所述方法包括以下步骤：a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在或缺失时，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；和b)在所述测试剂存在或缺失时测量硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的相互作用，其中(i)与测试剂缺失时的相互作用相比，在测试剂存在时的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的减弱，将该测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂，并且其中(ii)与测试剂缺失时的相互作用相比，在测试剂存在时的相互作用的增强，将该测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂。
在硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的拮抗剂，抑制剂，负调节剂，或负调控剂的情况下，发生硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的抑制。拮抗剂具有减弱或完全阻抑硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的结合的作用。与拮抗剂缺失时的结合相比，在拮抗剂存在时，拮抗剂可以将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体的结合减弱至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或减弱任何两个前述数值之间的范围中的量。优选地，拮抗剂将所述结合减弱至少10％。结合可以通过，例如利用本文所述的生物化学和/或生物物理方法测量结合常数来进行测定。
在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：Frem2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合Frem2的变化。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：多功能蛋白聚糖(CSPG2)相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合Versi的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：肌原纤蛋白2(FBN2)相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合肌原纤蛋白2的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：C6orf93相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合C6orf93的变化。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：多配体聚糖-4(Sdc4)相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合多配体聚糖-4的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：聚集蛋白(AGRN)相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合聚集蛋白的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2的变化。
在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：SLIT2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合SLIT2的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：磷脂酰肌醇蛋白聚糖1相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：LRP2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP2的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：LRP4相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP4的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：LRP6相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP6的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：生腱蛋白C相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合生腱蛋白C的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：TRIM26相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合TRIM26的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：TRIM41相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合TRIM41的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：IL17-R相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合IL17-R的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：ALPL相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合ALPL的变化。
候选或测试化合物或试剂可以是针对(i)硬化蛋白；(ii)硬化蛋白结合配偶体；(iii)硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用生成的新位点(例如，新生成的表位决定簇)，或(iv)包含任何上述物质的蛋白质复合体的抗体，抗体样支架，小分子，融合蛋白，肽，模拟物，或抑制性核苷酸(例如，RNAi)。
硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用，硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质活性，和/或硬化蛋白途径活性的变化可以通过PCR，TaqmanPCR，噬菌体展示系统，凝胶电泳，报告基因测定，酶母双杂交测定，RNA印迹或蛋白质印迹分析，免疫组化，常规闪烁照相机，γ相机，直线扫描器，PET扫描器，SPECT扫描器，MRI扫描器，NMR扫描器，或X射线机来测量。所述变化还可以通过使用选自标记位移，表面等离振子共振，荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)，荧光猝灭，和荧光偏振来测量。
硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质活性和/或硬化蛋白途径活性的改变可以通过检测硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体之间相互作用的变化，通过检测硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体水平的变化，或通过检测硬化蛋白途径中一种或多种蛋白质水平的变化来检测。上面描述可以检测的细胞可以是骨、间质、肾细胞(例如，HEK)，或造血来源的，可以是经培养的细胞，或可以获自或可以在转基因生物内。这些转基因生物包括，但不限于小鼠、大鼠、兔、绵羊、奶牛或灵长类动物。
对于涉及硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用变化的筛选实验，可以在提高浓度的候选试剂存在或缺失时，将表达硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的细胞在结合缓冲液中与标记的硬化蛋白结合配偶体一起温育。为了验证和校准该测定，可以使用提高浓度的未标记硬化蛋白结合配偶体来进行对照竞争反应。温育后，进行洗涤步骤以去除未结合的硬化蛋白结合配偶体。对于给定的标记(例如，闪烁计数，荧光，抗体染料等等)根据需要来测量结合的、标记的硬化蛋白结合配偶体。在候选试剂存在时，结合的标记硬化蛋白结合配偶体的量减少至少10％(例如，至少20％，30％，40％，50％，或60％)提示结合被候选试剂置换了。
在本文所述的这个或其它测定中，如果候选试剂在1mM或更低的浓度置换了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，优选至少10％的标记的硬化蛋白结合配偶体(亚饱和硬化蛋白结合配偶体剂量)，则候选试剂被认为是特异性结合的。当然，硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的角色可以转换；熟练技术人员可以修改该方法，在多种浓度候选试剂存在时将硬化蛋白应用到硬化蛋白结合配偶体以测定硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的变化。
通过表面等离子振子共振(SPR)可以监测硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的变化。表面等离子振子共振测定可以用作一种定量方法，以便通过测量两个分子之间的结合，该测量是通过来自水相的硬化蛋白结合配偶体与固定在传感器上的硬化蛋白的结合或者结合的丧失引发固定的传感器附近质量的改变实现的。该质量的改变被测量为注射或除去硬化蛋白结合配偶体或候选试剂后相对于时间的共振单位并且使用Biacore生物传感器(Biacore AB)测量。根据Salamon等人(Salamon等人，1996，Biophys J.71：283-294；Salamon等人，2001，Biophys.J.80：1557-1567；Salamon等人，1999，Trends Biochem.Sci.24：213-219，每一篇都被并入本文作为参考)描述的方法，可以将硬化蛋白固定在传感器芯片(例如，研究级CM5芯片，BiacoreAB)上。Sarrio等人阐明SPR可用于检测配体与固定在芯片上的液体层中的GPCR A(1)腺苷受体的结合(Sarrio等人，2000，Mol.Cell.Biol.20：5164-5174，被并入本文作为参考)。本领域技术人员使用Sarrio等人报导的条件作为起点可以微调SPR测定中硬化蛋白结合配偶体结合硬化蛋白的条件。
SPR可以以至少两种方法测定结合抑制剂。首先，硬化蛋白结合配偶体可以预结合到固定的硬化蛋白上，然后注射浓度为0.1nM到1μM的候选试剂。可以定量所结合的硬化蛋白结合配偶体的置换，从而可以检测抑制剂结合。备选地，芯片结合的硬化蛋白可以与候选试剂预孵育并用硬化蛋白结合配偶体刺激。与没有预接触抑制剂的芯片上的结合相比，接触了抑制剂的硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的差异将表明在抑制剂存在下硬化蛋白结合配偶体的结合或置换。在任一测定中，相对于不存在候选试剂时结合的硬化蛋白结合配偶体的量，存在候选试剂时结合的硬化蛋白结合配偶体的量降低10％或以上(例如，20％，30％，40％，50％，60％)表明该候选试剂抑制硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体的相互作用。尽管上面是将硬化蛋白固定，但技术人员可以容易地修改该方法，从而使硬化蛋白结合配偶体成为被固定的组分。
检测硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的抑制的另一种方法使用荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种量子力学现象，如果荧光供体(D)的发射光谱与荧光受体(A)的激发光谱重叠，在相互非常接近的荧光供体(D)和荧光受体(A)(通常相隔＜100埃)间发生FRET。待试验的分子，例如，硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白被供体和受体荧光团的互补对标记。尽管被硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用紧密结合，但是当硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白不结合时，供体荧光团的激发所发出的荧光将与应答该激发波长所发生的荧光具有不同的波长，从而通过测量每个波长下发射强度就可以定量结合的和未结合的分子。用于标记硬化蛋白的供体荧光团是本领域中熟知的。特别感兴趣的是A.Victoria GFP的变体，它们已知为Cyan FP(CFP，供体(D))和Yellow FP(YFP，受体(A))。作为实例，可以将YFP变体与硬化蛋白制成融合蛋白。用于表达GFP变体为融合物的载体(Clontech)以及荧光团标记的硬化蛋白结合配偶体化合物(MolecularProbes)是本领域中公知的。
将候选试剂加入标记的硬化蛋白结合配偶体和YFP-硬化蛋白的混合物将导致能量转移的抑制，这可以通过例如，相对于没有候选试剂的样品YFP荧光的降低来证明。在使用FRET检测硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的测定中，相对于没有候选试剂的样品，含有候选试剂的样品中受体波长下的荧光发射强度降低10％或更大(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明该候选试剂抑制硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。相反，相对于没有候选试剂的样品，含有候选试剂的样品中受体波长下的荧光发射强度提高10％或更大(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明该候选试剂诱导构象变化并增强硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。
FRET的一种变型使用荧光猝灭来监测分子相互作用。相互作用对中的一个分子可以用荧光团标记，并且另一个分子用当与其靠近并列时猝灭所述荧光团的荧光的分子标记。当激发时荧光的变化表明在标记荧光团的分子：猝灭剂对的缔合中的变化。通常，标记的硬化蛋白的荧光中的增加是携带猝灭剂的硬化蛋白结合配偶体分子已被置换的指示。当然，当硬化蛋白结合配偶体被荧光标记并且硬化蛋白带有淬灭剂时，将产生类似的效果。对于猝灭检测，相对于没有候选试剂的样品，在包含候选试剂的样品中荧光发射强度增加10％或更多(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明所述候选试剂抑制硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。相反，相对于没有候选试剂的样品，在包含候选试剂的样品中荧光发射强度减少10％或更多(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明所述候选试剂诱导构象变化并增强硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。
除了表面等离振子共振和FRET方法之外，荧光偏振检测可用于量化结合。对于荧光-标记的分子的荧光偏振值取决于旋光相关时间(rotationalcorrelation time)或转动速率(tumbling rate)。复合体，诸如由硬化蛋白与荧光标记的硬化蛋白结合配偶体缔合形成的那些，具有比未复合的、标记的硬化蛋白结合配偶体更高的偏振值。如果候选试剂破坏或抑制硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体的相互作用，那么，相对于没有候选试剂的混合物，包含硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的候选试剂导致荧光偏振的减少。荧光偏振非常适用于鉴定破坏复合体形成的小分子。相对于缺少候选试剂的样品中的荧光偏振，在包含所述候选试剂的样品中的荧光偏振减少10％或更多(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明所述候选试剂抑制硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。
另一种检测系统是生物发光共振能量转移(BRET)，其使用包含生物发光萤光素酶和荧光受体的融合蛋白之间的光转移。一般地，将一个分子的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用对融合到萤光素酶(例如Renilla萤光素酶(Rluc))上，在萤光素酶底物(例如DeepBlueC)存在时，所述萤光素酶是发射～395nm波长光的供体。相互作用对的另一个分子融合到受体荧光蛋白质上，其可以吸收来自供体的光，并在不同的波长下发射光。荧光蛋白质的例子为GFP(绿色荧光蛋白)，其在～510nm发光。向供体融合的硬化蛋白结合配偶体和受体融合的硬化蛋白的混合物添加候选试剂将导致能量转移的抑制，其通过相对于没有候选试剂的样品，受体荧光的减弱来证明。在使用BRET检测硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的测定中，相对于没有所述候选试剂的样品，在包含候选试剂的样品中受体波长下荧光发射强度10％或更多的减少(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明所述候选试剂抑制硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。相反地，相对于没有所述候选试剂的样品，在包含候选试剂的样品中受体波长下荧光发射强度10％或更多的提高(例如等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)，表明所述候选试剂诱导构象变化并增强硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。
应当理解本文所述的任何结合测定都能以硬化蛋白的非硬化蛋白结合配偶体配体(例如，激动剂，拮抗剂，等等)来实施，所述非硬化蛋白结合配偶体配体例如，如本文所述鉴定的小分子或硬化蛋白结合配偶体模拟物，包括但不限于任何天然或合成性肽，多肽，抗体或其抗原结合片段，脂类，碳水化合物，和小有机分子。
所述的任何结合测定都可以用于检测样品，例如组织样品中抑制剂的存在，所述抑制剂结合硬化蛋白，或影响硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的结合。对此，在样品存在或缺失的情况下将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体反应，并根据所用结合测定的需要来测量结合。硬化蛋白结合配偶体结合的10％或更多(例如，等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)的减少表明样品包含调节硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的抑制剂。所述的FRET和BRET结合测定也可以用于测定样品，例如组织样品中增强剂的存在，所述增强剂结合硬化蛋白，或影响硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的结合。对此，在样品存在或缺失的情况下将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体反应，并根据所用结合测定的需要来测量结合。硬化蛋白结合配偶体结合的10％或更多(例如，等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)的提高表明样品包含调节硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的增强剂。
所述的任何结合测定都可以用于测定化合物文库中抑制剂的存在。所述的FRET和BRET结合测定也可以用于测定化合物文库中增强剂的存在。这些使用，例如高通量筛选的筛选技术是本领域所公知的。
本发明还提供鉴定能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂的方法，该方法包括在所述试剂存在时测量由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答，并将它与在所述试剂缺失时由硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答相比较。优选地所述方法包括以下步骤：a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；和b)测量硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答，其中与缺失测试剂时的反应相比，存在测试剂时应答至少10％的变化表明该测试剂被鉴定为能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。
与缺失测试剂时的应答相比，存在测试剂时信号应答提高至少10％将该测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂。与缺失测试剂时的应答相比，存在测试剂时信号应答降低至少10％将该测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂。
与缺失调节剂时的信号转导相比，在调节剂存在时，硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂(例如，通过本发明的方法所鉴定的那些)可以将硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答改变至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或改变任何两个前述数值之间的范围的量。优选地，调节剂将所述信号改变至少10％。改变可以是提高或降低，这取决于监测的活性。信号可以通过本领域公知的方法进行测定，例如，通过利用下面所述的报告基因构建体来测量信号水平。
本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：Frem2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：Frem2相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：Frem2相互作用诱导的信号应答相比较。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：多功能蛋白聚糖相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：多功能蛋白聚糖相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：多功能蛋白聚糖相互作用诱导的信号应答相比较。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：肌原纤蛋白2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：肌原纤蛋白2相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：肌原纤蛋白2相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：C6orf93相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：C6orf93相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：C6orf93相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：多配体聚糖-4相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：多配体聚糖-4相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：多配体聚糖-4相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：聚集蛋白相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：聚集蛋白相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：聚集蛋白相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2相互作用诱导的信号应答相比较。
在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：LRP2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：LRP2相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：LRP2相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：LRP4相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：LRP4相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：LRP4相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：LRP6相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：LRP6相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：LRP6诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：磷脂酰肌醇蛋白聚糖1相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：磷脂酰肌醇蛋白聚糖1相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：磷脂酰肌醇蛋白聚糖1相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：SLIT2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：SLIT2相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：SLIT2相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：生腱蛋白C相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：生腱蛋白C相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：生腱蛋白C相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：IL17-R相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：IL17-R相互作用诱导的信号转导，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：IL17-R相互作用诱导的信号转导相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：TRIM26相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：TRIM26相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：TRIM26相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：TRIM41相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：TRIM41相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：TRIM41相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白：ALPL相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白：ALPL相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白：ALPL相互作用诱导的信号应答相比较。
信号应答优选为Wnt和/或BMP途径的反应，其中抑制剂将会引发Wnt和/或BMP途径活性的提高。信号转导可以通过例如使用报告基因构建体测量信号水平来进行测定。例如，可以将展示硬化蛋白结合配偶体或硬化蛋白的合适哺乳动物细胞用报告基因构建体来转染，所述构建体包含对Wnt和/或BMP响应的启动子。当硬化蛋白结合硬化蛋白结合配偶体时，抑制Wnt和/或BMP途径，报告蛋白的表达受到抑制，其减弱可以例如通过免疫测定，荧光，光测量等等来进行测量，测量方式取决于报告蛋白的性质。在候选试剂存在或缺失时测量表达。
作为测量Wnt信号的基于细胞的测定法的特定例子，报告基因构建体可以是包含十个TCF-结合位点，驱动荧火虫萤光素酶的表达的Wnt/β-联蛋白依赖型SuperTOPFlash(STF)萤光素酶报告基因载体。这与Wnt表达载体(如小鼠Wnt1的表达构建体)和Renilla表达载体(SV40驱动，用于归一化)一起可以转染入Hek293细胞或任何其它合适的细胞系。转染的细胞导致STF萤光素酶报告基因的激活，这种激活可以被硬化蛋白所阻抑。
本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、相似或改进的功能效应，其中该方法包括测量候选模拟物与硬化蛋白的相互作用。优选地，所述方法包括：a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下，将硬化蛋白与候选模拟物接触；和b)测量模拟物与硬化蛋白的相互作用，其中该相互作用为对于本文所述多种硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的至少10％，将候选模拟物鉴定为本发明的硬化蛋白结合配偶体模拟物。
另外，本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、相似或改进的功能效应，其中该方法包括测量由硬化蛋白-模拟物相互作用诱导的信号应答，并将它与硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答相比较。优选地，所述方法包括：a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下，将硬化蛋白与候选模拟物接触；和b)测量由硬化蛋白-模拟物相互作用诱导的信号应答，其中对于本文所述各种硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用所观察到信号应答的至少10％的信号应答，将候选模拟物鉴定为本发明的硬化蛋白结合配偶体模拟物。
作为非限制性实例，本发明提供鉴定Frem2或LRP4模拟物的方法，在正常生理条件下所述模拟物具有与Frem2或LRP4和硬化蛋白之间的相互作用相同、相似或改进的功能效应。
硬化蛋白结合配偶体模拟物是与具有硬化蛋白结合配偶体结合硬化蛋白相同、相似或改进的功能效应的化合物。它可以是这样的化合物，其包含官能团的排列，经常具有额外的疏水或带电基团以模仿天然硬化蛋白结合配偶体结构的结合区的活性构象。要理解硬化蛋白结合配偶体模拟物也可以包括天然硬化蛋白结合配偶体或其衍生物。
根据本发明的一个方面，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体对硬化蛋白结合的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或是任何两个上述值之间的范围中的值。优选地，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体对硬化蛋白结合活性的至少20％。
根据本发明的一个方面，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体信号转导活性的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或是任何两个上述值之间的范围中的值。优选地，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体信号转导活性的至少20％。
可以通过本文对于其它测定所述的方法，如SPR和FRET进行模拟物与硬化蛋白的相互作用的信号转导活性的测量。
根据本发明的一个实施方案，可以通过这样的方法来鉴定模拟物，其包括以下步骤：a)将硬化蛋白与候选模拟物接触；和b)测量由硬化蛋白-模拟物相互作用诱导的信号应答，其中对于硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用所测量的信号应答的至少10％(例如，等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)的信号应答，表明该候选模拟物被鉴定为本发明的硬化蛋白结合配偶体模拟物。
信号应答优选为Wnt和/或BMP途径的应答，其中与非刺激性状态相比，模拟物将会引发Wnt和/或BMP途径活性的降低。信号应答可以通过例如使用上述的报告基因构建体测量信号转导水平来进行测定。当硬化蛋白结合硬化蛋白结合配偶体模拟物时，抑制Wnt和/或BMP途径，报告蛋白的表达受到抑制，其减弱可以例如通过免疫测定，荧光，光测量等等来进行测量，测量方式取决于报告蛋白的性质。对于硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用也可以测量所述表达。
所述的任何结合测定都可以用于检测样品，例如组织样品中结合硬化蛋白的模拟物的存在。对此，在样品存在或缺失的情况下将硬化蛋白进行反应，并根据所用结合测定的需要来测量信号转导。硬化蛋白信号转导的10％或更多(例如，等于或大于20％，30％，40％，50％，60％)的提高表明样品包含结合硬化蛋白的模拟物。
所述的任何结合测定都可以用于测定化合物文库中模拟物的存在。这些使用，例如高通量筛选的筛选技术是本领域所公知的。
此外本发明提供用于在受试者中诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症的病症或倾向的方法，其包括下列步骤：(a)获得所述受试者中硬化蛋白结合配偶体基因的核苷酸序列，和(b)将它与健康受试者的核苷酸序列比较，其中在各个硬化蛋白结合配偶体基因中的突变表明硬化蛋白相关病症或其倾向。
在受试者中SOST或编码硬化蛋白结合配偶体的基因的突变可以是与骨量异常相关病症发展的预测子，和/或可以用于做诊断。这种突变改变硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间的相互作用，例如，与健康受试者相比，引起结合和信号转导的提高或降低。
本发明的一个实施方案是用于诊断与骨量异常相关的病症的病症或倾向的方法，其包括下列步骤：获得所述受试者中SOST或编码硬化蛋白结合配偶体的基因的DNA核苷酸序列，并将它与健康受试者的核苷酸序列比较，其中在各个硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的基因中的突变表明与骨量异常相关病症或其倾向。
本发明的另一个实施方案是用于诊断受试者中与骨量异常相关的病症或病症倾向的方法，其包括下列步骤：获得所述受试者中SOST或编码硬化蛋白结合配偶体的基因的DNA核苷酸序列，并将它与健康受试者的核苷酸序列比较，其中与健康受试者相比，分别改变与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体结合的突变的存在表明与骨量异常相关病症或其倾向。
突变可以存在于基因的非翻译部分(例如，在内含子、控制序列、启动子中)，因为这些也导致所表达蛋白质的功能异常。这些突变可以是单核苷酸多态性(SNPs)。
突变可以具有降低硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间的相互作用的效应。与健康受试者相比，所述结合可以比健康受试者相比中观察到的结合低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，和优选地至少20％。当观察到结合降低时，对于提高硬化蛋白作用的硬化蛋白结合配偶体来说，就可以诊断或预测与低骨量相关的病症。相反，对于减弱硬化蛋白作用的硬化蛋白结合配偶体来说，当观察到结合的减弱时，就可以诊断或预测与高骨量相关的病症。
突变可以具有提高Wnt和/或BMP途径的信号应答的作用。与健康受试者相比，信号应答可以比健康受试者中观察到的应答高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，优选地至少20％。当观察到应答的提高时，就可以诊断或预测与高骨量相关的病症。
或者，突变可以具有提高硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白之间相互作用的效应。与健康受试者相比，结合可以比健康受试者中观察到的结合高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，优选地至少20％。当观察到结合提高时，对于提高硬化蛋白作用的硬化蛋白结合配偶体来说，就可以诊断或预测与低骨量相关的病症。相反，对于减弱硬化蛋白作用的硬化蛋白结合配偶体来说，当观察到结合的减弱时，就可以诊断或预测与高骨量相关的病症。
突变可以具有减弱Wnt和/或BMP途径的信号应答的作用。与健康受试者相比，信号转导可以比健康受试者中观察到的应答低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，优选地至少20％。当观察到应答减弱时，就可以诊断或预测与低骨量相关的病症。
结合和信号转导测定是技术人员的常规实践，并且在上文描述过。特定基因的测序方法是公知的，并在例如，Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)中描述。
候选试剂和化合物
本发明的或本发明采用的候选或测试化合物或试剂可以使用本领域已知的组合文库方法中的多种方法来获得，包括：生物文库；空间可寻址的平行固相或溶液相文库；需要去卷曲的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；以及用亲和层析选择的合成文库方法。生物学文库方法限于肽文库，而其他四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam等(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
分子文库的合成方法的例子在本领域下述文献中可以查找到，例如：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等(1994).J.Med.Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.37：1233。
化合物文库可存在溶液中(例如，Houghten(1992)Biotochniques13：412)，或存在于小珠(Lam(1991)Nature 354：82)、芯片(Fodor(1993)Nature 364：555)、细菌(Ladner USP 5,223,409)、孢子(Ladner USP 409)、质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：1865)或噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249：386)；(Devlin(1990)Science 249：404)；(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：6378)；(Flici(1991)J.Mol.Biol.222：301)；(Lader同上)。
一个实施方案中，测定是基于细胞的测定，包括将表达硬化蛋白结合配偶体的细胞与候选或测试化合物或试剂接触，并测定测试化合物调节(例如刺激或抑制)所述硬化蛋白结合配偶体的活性的能力。可以通过，例如测定候选或测试化合物或试剂调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的能力来实现测定测试化合物调节硬化蛋白结合配偶体的能力。
通过测定直接结合可以实现测定候选或测试化合物或试剂调节硬化蛋白结合配偶体的能力。这些测定可以例如，通过将硬化蛋白结合配偶体蛋白质与放射性同位素或酶标记偶联，从而可以通过检测复合体中标记的蛋白质测定蛋白质与候选或测试化合物或试剂的结合来实现。例如，分子，例如，蛋白质可以用125I，35S，14C，或3H直接或间接标记，并通过放射发射直接的计数，或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可以用酶标记分子，例如，用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，或萤光素酶标记，并通过测定合适的底物转化为产物来检测酶标记。
测定候选或测试化合物或试剂调节硬化蛋白结合配偶体(或硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用)的能力也属于本发明的范围，其中任何相互作用物均未标记。例如，在任何相互作用物均未标记的情况下，可以采用微量生理测定计来检测测试化合物与硬化蛋白结合配偶体的相互作用(McConnell等(1992)Science 257：1906)。本文所用的“微量生理测定计”(例如，Cytosenosor)是一种分析仪器，它使用光可寻址的电势传感器(LAPS)测定细胞使其环境酸化的速度。该酸化速度的变化可作为化合物与受体之间相互作用的指示剂。
在又一个实施方案中，本发明的测定是无细胞测定，其中蛋白质或其生物活性部分与候选或测试化合物或试剂(例如，或一种化合物，测试其调节硬化蛋白结合配偶体，或调节由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用产生的信号转导的能力)相接触，并测定测试化合物结合硬化蛋白结合配偶体，或其生物活性部分的能力。可以如上所述直接或间接地测定测试化合物与硬化蛋白结合配偶体蛋白质的结合。
这种测定可以使用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术来实现。Sjolander等，1991Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等，1995Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705。本文所用的“BIA”是一种实时研究生物特异性相互作用的技术，未对任何相互作用物进行标记(例如BIAcore)。表面等离振子共振(SPR)的光学现象改变可以用作生物分子间实时反应的指示。
在本发明以上测定方法的又一个实施方案中，可能希望固定硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体以促进蛋白质的复合形式与非复合形式相分离，以及适应测定的自动化。测试化合物与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的结合可以在任何适于包含反应物的容器中完成。这种容器的例子包括微量滴定板、试管、和微量离心管。在一个实施例方案中，可以提供添加了一种结构域的融合蛋白，所述结构域使蛋白质结合在基质上。例如谷胱甘肽S-转移酶/激酶融合蛋白，或谷胱甘肽S-转移酶/靶融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Sigma Chemical，St.Lousis，Mo)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后与测试化合物，或测试化合物和非吸附的硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质混合，将混合物在诱导复合体形成的条件下(例如在生理条件的盐浓度和pH下)温育。温育后，洗涤珠或微量滴定板的孔，以除去未结合的组分，在小珠的情况下基质是固定的，如以上所述，例如直接或间接测定复合体。或者，可将复合体与基质解离，并用标准技术测定结合水平。
其他将蛋白固定在基质上的技术也用在本发明的筛选测定中。例如，硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体可以利用与生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合而固定化。生物素化的硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质或靶分子可以用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备，并固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。或者，与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质或靶分子反应的抗体可以衍生化在该滴定板的孔上，并通过抗体缀合将未结合的硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质捕获在孔中。除了上述GST-固定化复合体的方法之外，检测这种复合体的方法还包括利用抗体与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质或靶分子反应进行复合体的免疫检测。
本发明的再一方面，在双杂交测定或三杂交测定法(参见例如美国专利号5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72：223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques14：920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 8：1693-1696；和Brent WO 94/10300)中硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质可用作“饵蛋白”，以鉴定结合硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质的其它蛋白质。这些硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体-结合蛋白质也有可能参与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质的信号的放大。
双杂交系统是基于大多数转录因子的模块特性，大多数转录因子由独立的DNA结合结构域和活化结构域组成。简而言之，所述测定利用两种不同DNA构建体。在一个构建体中，编码硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)的DNA结合结构域的基因融合。在另一个构建体中，使编码未鉴定蛋白(“捕获物”或“样品”)的来自自DNA序列文库的DNA序列与编码已知转录因子的活化结构域的基因融合。如果“饵”和“捕获”蛋白能够在体内相互作用形成激酶依赖性复合体，则所述转录因子的DNA结合和活化结构域紧密靠近。这种密切靠近使得与转录调节位点有效连接的报道基因(例如LacZ)响应转录因子发生转录。可检测报道基因的表达，分离含有功能性转录因子的细胞集落，用其获得编码与该蛋白相互作用的硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质的克隆基因。
本发明进一步涉及通过上述筛选测定鉴定的新试剂。因此，在合适的动物模型中进一步使用根据本文所述鉴定出来的试剂在本发明的范围内。例如，可以将根据本文所述鉴定的试剂(例如能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂)用在动物模型中以测定用这种试剂治疗的效力、毒性，或副作用。或者，可以将根据本文所述鉴定的试剂用在动物模型中以测定这种试剂的作用机制。另外，本发明涉及通过上述筛选测定鉴定的新试剂用于本文所述治疗中的用途。
药物组合物
本文所述的组合物可以是药物组合物。本发明提供药物组合物，其包含与生理学相容的载体混合的(i)硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂(例如，小分子调节剂)，或(ii)根据本发明的硬化蛋白结合配偶体模拟物。除了活性成分之外，这些药物组合物可以包含显著量的能够药用的一种或多种无机或有机的固体或液体的可药用载体，以及生理上可接受的稀释剂(如水，磷酸缓冲盐水，或盐水)。
根据本发明的药物组合物适于施用于温血哺乳动物，特别是人(或施用于源自温血哺乳动物，特别是人的细胞或细胞系，例如成骨细胞或破骨细胞)，用于治疗，改善，诊断，或预防硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症。
根据本发明的药物组合物是经肠道，如鼻，直肠或口，或肠胃外，如肌内或静脉内施用于温血哺乳动物(特别是人)的那些药物组合物。活性成分的剂量取决于温血哺乳动物的物种、体重、年龄和个体条件，个别的药物动力学数据，待治疗的疾病和施用方式。例如，给温血哺乳动物，例如体重约为70kg的人施用的调节剂(例如，小分子调节剂)或其可药用的盐的剂量优选地为从大约3mg到大约10g，更为优选地从大约10mg到大约1.5g，最优选地从大约100mg到大约1000mg/人/天，优选地分成1～3个单次剂量，所述单次剂量可以是，例如相同大小的。通常，儿童服用成人剂量的一半。
合适的剂量也可以在试验中确定，首先在合适的动物模型中，随后在待治疗的物种中。施用的量和频率当然将取决于这些因素，诸如待治疗适应症的性质和严重性，预期反应，待治疗个体的状况等等。合适的剂量是在从大约10ng/kg/天到大约100μg/kg/天的范围内，可单独或组合给药。优选地可以预期从100ng/kg/天到大约1000ng/kg/天的剂量持续1-20天诱导以适当的生物学效应。或者，可以在大约4天的间隔内进行从大约1μg/kg/天大约100μg/kg/天的快速浓注以通过免疫加强由巨噬细胞/单核细胞介导的免疫和/或炎性反应来发挥抗微生物作用。
药物组合物包含从大约1％到大约95％，优选地从大约20％到大约90％的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是，例如，单位剂型，如安瓿，小瓶型，栓剂，糖锭剂，片剂或胶囊剂的形式。
本发明的药物组合物可以本身已知的一种方法制得，例如用常规的溶解、冻干、混合、粒化或成型的方法。
优选应用活性成分的溶液和混悬液，以及尤其优选应用等渗水溶液或混悬液，例如，在只包含活性成分或还含有载体如甘露醇的冻干组合物情形中，使用前配制成此类溶液或混悬液。药物组合物必须灭菌和/或可以含有赋形剂，例如防腐剂，稳定剂，润湿剂和/或乳化剂，增溶剂，调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且可按本来已知的方式制得，例如用通常的溶解或冻干的方法。所述溶液或混悬液可含有粘性增强物质，如羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮或凝胶。
油中的混悬液包含作为油组分的常用于注射目的的植物油，合成油或半合成油。尤其提及的是液态脂肪酸酯，其含有作为酸组分的具有8～22，尤其12～22个碳原子的长链脂肪酸，例如月桂酸，十三酸，十四酸，十五酸，棕榈酸，十七酸，硬脂酸，花生酸，二十二烷酸或相应的不饱和酸，例如油酸，反油酸，芥酸，巴西酸(brasidic)或亚油酸，如果需要的话，加入抗氧剂，例如维生素E，β-胡萝卜素或3，5-二叔丁基-4-羟基甲苯。这些脂肪酸酯的醇组分最多有6个碳原子且是单-或多-羟基的，例如单-，二-或三-羟基的，醇，例如甲醇，乙醇，丙醇，丁醇或戊醇或其异构体，但尤其是乙二醇和甘油。因此，脂肪酯的例子如下：油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯，“Labrafil M 2375”(三油酸聚氧乙烯甘油酯，Gattefosse，法国)，“Miglyol 812”(链长为C8～C12的饱和脂肪酸的甘油三酯，HulsAG，德国)，但尤其是植物油，如棉籽油，杏仁油，橄榄油，蓖麻油，芝麻油，大豆油，和特别是花生油。
在无菌条件下，用通常的方式可制得注射组合物；同样也适用于把组合物装入安瓿或小瓶中并密封容器。
用于口服的药物组合物可如下得到：将活性成分和固体载体组合，需要的话，粒化得到的混合物，以及需要或必要的话，在加入适当的赋形剂后，把混合物加工成片剂、糖锭剂核心或胶囊剂。也可能把药物组合物掺入塑料载体中，其使活性成分以可测的量扩散或释放出。
合适的载体尤其是填充剂，如糖，例如乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，如淀粉糊剂，例如使用玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，和/或，如果需要的话，崩解剂，如上述的淀粉，及羧甲基淀粉，交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，藻酸或其盐，如藻酸钠。赋形剂尤其是流动调节剂和润滑剂，例如硅酸，滑石，硬脂酸或其盐，如镁或钙的硬脂酸盐，和/或聚乙二醇。糖锭剂具有合适的、任选肠的包衣，特别用的是浓的糖溶液，其中含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，或合适有机溶剂中的包衣溶液，或对于肠包衣的制备，合适的纤维素制剂的溶液，如乙基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。胶囊是由明胶制成的干填胶囊和由明胶和增塑剂如丙三醇或山梨醇制成的软密封胶囊。干填的胶囊含有颗粒状的活性成分，和填充剂，如乳糖，粘合剂，如淀粉，和/或助流剂，如滑石或硬脂酸镁，且需要的话，还有稳定剂。在软胶囊中，活性成分优选溶于或悬浮于合适的油性赋形剂中，如脂肪油，石蜡油或液态聚乙二醇，也可能加入稳定剂和/或抗菌剂。例如，为了鉴定目的或指出活性成分的不同剂量，可在片剂或糖锭剂包衣或胶囊外壳中加入染料或色素。
抗体
利用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，可以将硬化蛋白结合配偶体用作免疫原来产生抗体。可以使用全长多肽或蛋白质，或者，备选地，本发明提供抗原肽片段用作免疫原。本发明的蛋白质的抗原肽包含硬化蛋白结合配偶体的氨基酸序列的至少8个(优选地10，15，20，或30个)氨基酸残基，并包括蛋白质的表位，从而使得针对该肽生成的抗体与所述蛋白形成特异性免疫复合体。
抗原肽所包含的优选的表位是位于蛋白质表面上的区域，例如，亲水区。可以利用亲水性图或类似分析来鉴定亲水区。
一般通过免疫合适的受试者(例如，兔，山羊，小鼠或其它哺乳动物)利用免疫原来制备抗体。合适的免疫原制品可以包含，例如，重组表达或化学合成的多肽。该制品可以进一步包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。
本文所用的术语抗体指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点特异性结合抗原，如硬化蛋白结合配偶体。抗体包括常规免疫免疫球蛋白分子，及其片段，所述片段也与硬化蛋白结合配偶体和/或硬化蛋白特异性反应。可以利用常规技术将抗体片段化并以下面对于完整抗体所述的相同方式对片段筛选用途。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab’)2片段，其可以通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来生成。本发明提供多克隆和单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，指只包含一种抗原结合位点的抗体分子群体，所述抗原结合位点能够与特定表位免疫反应。
多克隆抗体可以如上所述通过用本发明的多肽作为免疫原来免疫合适的受试者来制备。在经免疫的受试者中抗体效价可以通过标准技术来监测，如使用固定化多肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。如果必要，可以从哺乳动物体内(例如从血液中)分离抗体分子，并且通过公知技术进一步纯化，如蛋白A层析，以便获得IgG级分。可以在免疫之后的适当时间，例如，在特异性抗体效价最高时，从所述受试者体内获得抗体生产细胞，并且用于通过标准技术制备单克隆抗体，如最初由Kohler和Milstein((1975)Nature 256：495-497)所披露的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol Today 4：72)，EBV杂交瘤技术(Cole等(1985)，Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)或三瘤技术。用于生产杂交瘤的技术是众所周知的(一般参见Current Protocols in Immunology(1994)Coligan等(eds.)John Wiley &Sons，Inc.，New York，NY)。例如，利用标准ELISA测定，通过对杂交瘤培养上清液筛选结合目标多肽的抗体来检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的备选方案，针对本发明的多肽的单克隆抗体可以通过用目标多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)来进行鉴定和分离。可以通过商业渠道获得用于制备和筛选噬菌体展示文库的试剂盒((例如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，目录号27 9400 01；和Stratagene SurfZAPTM PhageDisplay Kit，目录号240612))。另外，特别适用于制备和筛选抗体展示文库的方法和试剂的例子可以参见以下文献，例如，美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：13701372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：8185；Huse等(1989)Science 246：12751281；Griffiths等(1993)EMBO J.12：725734。
此外，可以用标准重组DNA技术制备的包括人和非人部分的重组抗体，如嵌合和人源化的单克隆抗体属于本发明的范围。嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分源自不同的动物物种，如具有源自鼠mAb的可变区以及人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。(参见，例如，Cabilly等，美国专利号4,816,567；和Boss等，美国专利号4,816397，其全部内容并入本文作为参考)。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。(参见，例如，Queen，美国专利号5,585,089，在此并入其全部内容作为参考)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来生产，例如，使用在PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science240：10411043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：34393443；Liu等(1987)J.Immunol.139：35213526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214 218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47：999 1005；Wood等(1985)Nature 314：446449；and Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553 1559)；Morrison(1985)Science 229：1202 1207；Oi等(1986)Bio/Techniques 4：214；U.S.Patent 5,225,539；Jones等(1986)Nature321：552525；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141：40534060中描述的方法。
完全人抗体对于人类患者的治疗性治疗而言是尤其理想的。这类抗体可以采用转基因小鼠来生产，所述转基因小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因，但它可以表达人类重链和轻链基因。所述转基因小鼠用所选抗原，例如本发明的多肽的全部或一部分以正常方式免疫。可以采用常规杂交瘤技术获得针对所述抗原的单克隆抗体。所述转基因小鼠含有的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，采用这种技术，有可能生产治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关生产人抗体的这种技术的综述，参见Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93)。有关生产人抗体和人单克隆抗体的这种技术和生产这类抗体的方案的详细讨论，参见例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。此外，可以雇用例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)公司，采用与上述技术相似的技术提供针对所选抗原的人抗体。
可以采用称为“指导选择(guided selection)”的技术，产生识别所选表位的完全人抗体。在这种方法中，用所选非人类单克隆抗体，例如，小鼠抗体来指导识别同一表位的完全人抗体的选择。(Jespers等(1994)Bio/technology 12：899-903)。
通过标准技术如亲合层析或免疫沉淀，可以用针对本发明多肽的抗体(例如单克隆抗体)来分离该多肽。另外，这种抗体可以用来检测蛋白质(例如，在细胞裂解物或细胞上清液中)以评估多肽表达的丰度和模式。该抗体还可以诊断性地监测组织中蛋白质水平，作为临床测试方法的部分，例如，测定给定治疗方案的效力。通过将抗体偶联到可检测的物质上能够有利于检测。可检测物质的例子包括各种酶，辅基，荧光物质，生物发光物质以及放射性物质。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮，荧光素，荧光素异硫氰酸酯，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白，而合适的放射性物质的例子包括125I，131I，35S或3H。
抗体样(例如，非免疫球蛋白)支架
可以采用多种抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要得到的多肽包括至少一个对靶蛋白特异性的结合区。这种构架或支架包括5种主要独特型的人免疫球蛋白，或其片段(如本文其它地方所披露的)，并包括其它动物物种的免疫球蛋白，优选地具有人源化部分。在此方面单重链抗体如在骆驼科动物中鉴定的那些特别有利。新的构架，支架和片段不断被本领域技术人员所发现和开发。
在一方面，本发明涉及通过筛选针对硬化蛋白结合配偶体的非免疫球蛋白支架文库来生成基于非免疫球蛋白的支架分子。对于筛选非免疫球蛋白支架文库，可以使用与抗体文库所用相似的展示技术，包括但不限于噬菌体展示，核糖体展示，RNA展示或酶母展示。在另一方面，本发明涉及利用非免疫球蛋白支架来生成基于非免疫球蛋白的抗体，可以向所述非免疫球蛋白支架上移植本发明的CDR。可以采用已知的或将来的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含与靶蛋白质特异的结合区。这样的化合物在本文称作“包含靶特异性结合区的多肽”，或抗体样支架。已知的非免疫球蛋白构架或支架包括，但不限于基于纤连蛋白III衍生的分子如Adnectins(纤连蛋白)(Adnexus，Inc.，Waltham，MA)，锚蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，Switzerland)，结构域抗体(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium))，脂笼蛋白(Anticalin)(Pieris Proteolab AG，Freising，Germany)，小模块式免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)，maxybodies(Avidia，Inc.(Mountain View，CA))，A蛋白(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛蛋白)(Scil Proteins GmbH，Halle，Germany)。
根据本发明，不管采用的构架或支架如何，可以将抗硬化蛋白或抗硬化蛋白结合配偶体蛋白质抗体或其片段，或包含硬化蛋白特异性或硬化蛋白结合配偶体特异性结合区的多肽，共价或非共价地结合到附加的部分上。附加的部分可以是多肽、惰性聚合物如PEG、小分子、放射性同位素、金属、离子、核酸或其他类型的生物学相关分子。已知为免疫缀合物、免疫毒素等的这类结构也包括在本文使用的抗体、抗体片段或包含硬化蛋白特异性或硬化蛋白结合配偶体特异性结合区的多肽的含义中。
(i)基于III型纤连蛋白的支架
基于III型纤连蛋白的支架是基于III型纤连蛋白结构域(例如，III型纤连蛋白的第十个模块(10Fn3结构域))。III型纤连蛋白结构域具有7或8个β链，其分布在两个β折叠之间，所述β折叠自身相互组装以形成蛋白质的核心，进一步包含将β链彼此连接起来的环(与CDR类似)并且是溶剂暴露的。在β折叠夹层的每个边缘上都有至少三个这种环，其中所述边缘是与β链方向垂直的蛋白质的边界。(US 6,818,418)。
这些基于纤连蛋白的支架并不是免疫球蛋白，尽管全部折叠与最小功能性抗体片段的全部折叠密切相关，所述最小功能性抗体片段为重链的可变区，其包含骆驼和骆马IgG中的完整抗原识别单位。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟抗原结合特征，其性质和亲和性与抗体类似。这些支架可以用于体外的环随机化和改组策略，其类似于体内抗体的亲和性成熟过程。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中可以利用标准克隆技术将分子的环区用本发明的CDR代替。
(ii)锚蛋白-分子配偶体
该技术是基于利用具有锚蛋白源的重复模块的蛋白质作为支架，用于承载可变区，所述可变区可以用来结合不同的靶标。锚蛋白重复模块是33个氨基酸的多肽，其由两个反平行的α螺旋和转角所组成。通过利用核糖体展示将可变区的结合最大程度地优化。
(iii)Maxybodies/Avimers-Avidia
Avimers源自包含蛋白质如LRP-1的天然A-结构域。根据蛋白质-蛋白质相互作用的性质使用这些结构域，并且在人体中超过250种蛋白质在结构上是基于A-结构域的。Avimers由多个不同的“A-结构域”单体(2-10个)过氨基酸接头连接组成。利用在例如，20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中所述的方法可以生成能够结合到靶抗原上的Avimers。
(vi)A蛋白-Affibody
亲合配体是小的，简单的蛋白质，其由基于A蛋白的一个IgG-结合结构域的支架的三个螺旋束所组成。A蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白质。这一支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个被随机化以生成文库，具有大量配体变体(参见例如，US 5,831,012)。分子模仿抗体，与抗体150kDa的分子量相比，它们具有6kDa的分子量。尽管其尺寸小，但
Figure A20088000318100674
分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
(v)Anticalins-Pieris
Figure A20088000318100675
是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们源自脂笼蛋白——广泛分布的一组小且稳健的蛋白质，其通常参与化学上敏感或不可溶化合物的生理运输或存偖。几种天然脂笼蛋白发生在人体组织或体液中。
蛋白质结构提示免疫球蛋白，其在刚性构架的顶部具有高变环。但是，与抗体或其片段相反，脂笼蛋白由具有160到180个氨基酸残基的单一多肽链组成，只比单个免疫球蛋白结构域稍大。
构成结合口袋的四环组显示显著的结构可塑性并耐受多种侧链。因而在专有方法改造结合位点以便以高度亲和性和特异性识别不同形状的预定靶分子。
脂笼蛋白家族的一个蛋白质Pieris Brassicae的后胆色素-结合蛋白质(BBP)已经被用于通过诱变四环组来开发anticalins。描述″anticalins″的专利申请的一个例子是PCT WO 199916873。
(vi)Affilin-Scil蛋白质
AffilinTM分子是小的非免疫球蛋白蛋白质，其被设计用于对蛋白质和小分子具有特定亲合力。新的Affilin TM分子可以非常快速地从两个文库中选出，所述文库每一个都是基于不同的人源支架蛋白质。
AffilinTM分子并未显示任何与免疫球蛋白蛋白质的结构同源性。Scil蛋白质采用两个AffilinTM支架，其中之一是γ晶状体蛋白——一种人结构眼晶状体蛋白，另一个是″泛蛋白″超家族蛋白质。两种人支架都非常小，显示高度的温度稳定性，并且几乎耐受pH变化和变性剂。这种高度的稳定性主要是由于该蛋白质扩展的β折叠结构造成的。γ晶状体蛋白源蛋白质的例子在WO200104144中描述，而″泛蛋白样″蛋白质的例子在WO2004106368中描述。
融合蛋白
本发明提供嵌合或融合蛋白。本文所用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含全部或部分(优选生物学活性部分)的本发明的多肽，其有效连接到异源多肽(即，本发明多肽之外的多肽)上。在融合蛋白内，术语“有效连接”意欲表明本发明的多肽和异源多肽彼此融合成构架。可以将异源多肽融合到本发明多肽的N末端或C末端。
一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中将本发明的多肽融合到GST序列的C末端。这些融合蛋白可以有利于本发明的重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白在其N末端包含异源信号序列。例如，可以将本发明多肽的天然信号序列去除并用来自另一蛋白质的信号序列代替。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等，eds.，John Wiley &Sons，1992)。其他真核生物异源信号序列的例子包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。在又一个实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，出处同上)和A蛋白分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。
在又一个实施方案中，融合蛋白为免疫球蛋白融合蛋白，其中将本发明多肽的全部或部分融合到衍生自免疫球蛋白蛋白质家族成员的序列上。可以将本发明的免疫球蛋白融合蛋白掺入药物组合物中并施用于受试者以抑制配体(可溶的或膜结合的)和细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，由此在体内抑制信号转导。可以使用免疫球蛋白融合蛋白来影响本发明多肽的同族配体的生物利用率。配体/受体相互作用的抑制在治疗上可以是有用的，对于治疗增生性和分化性病症以及对于调节(例如，促进或抑制)细胞存活都是有用的。另外，可以将本发明的免疫球蛋白融合蛋白用作免疫原以便在受试者中产生针对本发明多肽的抗体，纯化配体，并在筛选测定中鉴定抑制受体与配体相互作用的分子。
本发明的嵌合和融合蛋白可以通过标准重组DNA技术来生产。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括自动DNA合成仪来进行合成。或者，基因片段的PCR扩增可利用锚定引物来进行，所述的引物可在两连续的基因片段间产生互补的突出端，然后退火、再扩增以产生嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等，同上)。另外，许多已编码了融合部分(如GST多肽)的表达载体是可商购的。可将编码本发明多肽的核酸克隆到这种表达载体中，从而使融合部分与本发明的多肽符合读框地相连。
这种融合蛋白的一个例子是包含LRP4细胞外部分的蛋白质融合，例如，由SEQ ID NO：3组成的细胞外部分。这种融合蛋白的一个例子是SEQID NO：4的多肽。
RNAi
本发明提供小干扰核糖核酸序列(siRNA)，以及在细胞或哺乳动物中利用siRNA抑制SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的表达的组合物和方法。通过使用siRNA，本发明还提供用于治疗哺乳动物中病理状况和疾病的组合物和方法，所述病理状况和疾病是由SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的异常表达所引起的，或由信号途径异常所引起的，所述基因是该信号途径的组成成员。siRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。
本发明的siRNA包含这样的RNA链(反义链)，其具有长度小于30个核苷酸的区域，一般长19-24个核苷酸，并与SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的mRNA转录物的至少部分基本上互补。使用这些siRNA能够进行基因的mRNA的定向降解，所述基因涉及硬化蛋白，BMP，或Wnt信号途径。
根据本发明的siRNA分子介导RNA干扰(“RNAi”)。术语“RNAi”是本领域公知的并且一般理解为细胞中的一种或多种靶基因被siRNA所抑制，所述siRNA具有与靶基因互补的区。测试siRNA介导RNAi的能力的多种测定法是本领域公知的(参见例如Elbashir等，Methods 26(2002)，199-213)。当与未用根据本发明的RNA分子处理的细胞相比较时，根据本发明的siRNA对基因表达的作用一般将导致靶基因的表达被抑制至少10％，33％，50％，90％，95％或99％。
根据本发明的“siRNA”或“小干扰核糖核酸”具有本领域已知的意义，包括下列方面。siRNA由核糖核苷酸的两条链组成，其在生理条件下沿着互补区杂交。所述链是分离的，但是在某些实施方案中它们可以通过分子接头连接起来。个别的核糖核苷酸可以是未经修饰的天然发生的核糖核苷酸，未经修饰的天然发生的脱氧核糖核苷酸，或者它们可以如本文其它处所述进行化学修饰或是合成的。
根据本发明的siRNA分子包含双链区，其与靶基因的mRNA区基本上相同。与靶基因的相应序列具有100％同一性的区域是合适的。这种状态称作“完全互补”。但是，与靶基因的相应区域相比，该区也可以包含一个，两个或三个错配，这取决于被靶定mRNA的区域的长度，并因此可以不是完全互补的。在一个实施方案中，本发明的RNA分子特异性靶向一个给定基因。为了仅仅靶向希望的mRNA，siRNA试剂可以与靶标mRNA具有100％同源性并与该细胞或生物中存在的所有其它基因具有至少2个错配的核苷酸。分析和鉴定具有充足序列同一性以便有效抑制特定靶序列表达的siRNA的方法是本领域已知的。序列同一性可通过本领域已知的序列对照和比对算法来进行优化(参见Gribskov和Devereux，SeqHence Analysis Primer，Stockton Press，1991，和其中引用的参考文献)，并通过例如使用缺省参数的BESTFIT软件程序(例如University of Wisconsin Genetic Computing Group)中实现的Smith-Waterman算法计算核苷酸序列之间的百分比差异来优化序列同一性。
影响RNAi试剂效率的另一种因素是靶基因的靶区。对于RNAi试剂抑制有效的靶基因的区域可以通过实验测定。合适的mRNA靶区将是编码区。另外非翻译区也是合适的，如5’-UTR，3’-UTR，和剪接接头。例如，为此目的可以进行Elbashir S.M.等人，2001EMBO J.，20，6877-6888中所述的转染测定。本领域存在技术人员所公知的多种其它合适测定法和方法。
根据本发明，与靶标互补的siRNA的区域长度可以是10-100个核苷酸，12-25个核苷酸，14-22个核苷酸或15，16，17或18个核苷酸。当对于相应靶区有错配时，互补区的长度一般需要在某种程度上更长。
由于siRNA可以携带突出端(其可以或不可以与靶标互补)，或与其自身互补但不与靶基因互补的核苷酸，siRNA的每个分离链的总长可以为10到100个核苷酸、15到49个核苷酸、17到30个核苷酸或19到25个核苷酸。
用语“每条链为49个核苷酸或更少”意指该链中连续核苷酸的总数，其包括所有修饰或未修饰的核苷酸，但不包括可以添加到链3’或5’末端上的任何化学部分。未计入插入到链中的短的化学部分，但设计用来连接两个分离链的化学接头并不被认为生成了连续的核苷酸。
用语“在5’末端或3’末端至少之一上的1到6个核苷酸突出端”指互补siRNA的结构，其是在生理条件下由两条分离链形成的。如果末端核苷酸是siRNA双链区的部分，则认为siRNA是平末端的。如果在末端一个或多个核苷酸未配对，则生成突出端。通过突出端核苷酸数目测量突出端长度。突出端核苷酸可以在每条链的5’末端或3’末端。
通过在至少一条链中包括至少一个修饰的核苷酸，根据本发明的siRNA对于口服递送赋予高度的体内稳定性。因而根据本发明的siRNA包含至少一个修饰的或非天然核糖核苷酸。在公布的PCT专利申请WO200370918中列出了许多已知化学修饰的长篇描述，在此将不再重复。对于口服递送合适的修饰在本文的实施例和说明书中更加具体地列出。合适的修饰包括，但不限于对糖部分(即糖部分的2’位置，例如2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即，烷氧基烷氧基基团)或碱基部分(即非天然或经修饰的碱基，其保留了与另一核苷酸链中的其它特定碱基配对的能力)的修饰。其它修饰包括所谓的‘主链’修饰，其包括，但不限于，替换磷酸酯基团(连接邻近的核糖核苷酸与例如硫代膦酸酯、手性硫代膦酸酯或二硫代磷酸酯)。最后，有时在本文称作3’帽或5’帽的末端修饰可以是重要的。帽可以由多种本领域技术人员已知的更复杂的化学部分组成。
在一个实施方案中，本发明提供用于抑制SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。dsRNA包含
Figure A20088000318100721
Figure A20088000318100722
包含一条包括第一序列的有义链和一条包括第二序列的反义链。反义链包含这样的核苷酸序列，其与编码SOST基因的mRNA或编码硬化蛋白结合配偶体的基因的至少部分基本上互补，互补区长度小于30个核苷酸，一般长度为19-24个核苷酸。在与表达SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的细胞接触后，dsRNA抑制所述基因的表达至少
Figure A20088000318100723
在另一个实施方案中，本发明提供包含本发明dsRNA之一的细胞。该细胞一般是哺乳动物细胞，如来自小鼠、大鼠、兔、绵羊、奶牛或灵长类动物的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供在生物，一般为人受试者中抑制表达SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的表达的药物组合物，其包含本发明的一种或多种dsRNA以及可药用的载体或递送运载体。
在另一个实施方案中，本发明提供在细胞中抑制SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的表达的方法，包括下列步骤：
(a)向细胞中导入双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含
Figure A20088000318100732
包含一条包括第一序列的有义链和一条包括第二序列的反义链。反义链包含互补区，其与编码硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的mRNA的至少部分基本上互补，并且其中互补区长度小于30个核苷酸，一般长度为19-24个核苷酸，并且其中dsRNA在与表达SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的细胞接触后，抑制所述基因的表达至少
Figure A20088000318100733
和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持充足时间，以便获得SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的mRNA转录物的降解，由此抑制所述基因在细胞中的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗，预防或控制由硬化蛋白，BMP，或Wnt信号转导介导的病理过程，例如硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症，包括向需要这种治疗、预防或控制的患者施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的siRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供用于在细胞中抑制SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因表达的载体，其包含有效连接到核苷酸序列的调控序列，所述核苷酸序列编码本发明的一种siRNA的至少一条链。
抑制性核酸化合物可以通过常规方法在可商购的自动DNA合成仪上合成，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)380B，392或394型DNA/RNA合成仪等等仪器。可以采用亚磷酰胺化学。还可以对本发明的抑制性核酸化合物进行修饰，例如，可以使用许多参考文献中所述的核酸酶耐受性主链如例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亚磷酰胺，等等。抑制性核酸的长度必须足够足够确保生物学活性被抑制。因而，例如对于反义寡核苷酸来说，必须足够大以确保特异性结合只发生在希望的靶多核苷酸上并且不发生在其它偶然位点上。通过几种因素来确定长度上限，包括合成和纯化长度大于约30-40个核苷酸的寡聚物的不便性和花费，较长寡核苷酸比较短寡核苷酸更加耐受错配，等等。优选地，本发明的反义寡核苷酸具有大约15到40个核苷酸的长度。更加优选地，寡核苷酸部分具有大约18到25个核苷酸的长度。
双链RNA，即，有义-反义RNA，也称作小干扰RNA(siRNA)分子，也可以用来抑制SOST基因或编码硬化蛋白结合配偶体基因的核酸的表达。RNA干扰是这样一种方法，其中施用外源的短RNA双链体，其中一条链对应于靶mRNA的编码区(Elbashir等(2001)Nature 411：494)。在进入细胞后，siRNA分子不仅引发外源RNA双链体的降解，还引发具有相同序列的单链RNA的降解，其包括内源信使RNA。因此，siRNA可以比传统的反义RNA方法更加有力和有效，因为据信该技术通过催化机制作用。优选的siRNA分子一般为19到25个核苷酸长，优选地大约21个核苷酸长。向靶细胞递送siRNA的有效策略包括，例如，利用物理或化学转染的转导作用。
或者可以利用，例如，各种PolIII启动子表达盒来在细胞中表达siRNA，所述表达盒允许功能性siRNA或其前体的转录。参见，例如，Scherr等(2003)Curr.Med.Chem.10(3)：245；Turki等(2002)Hum.Gene Ther.13(18)：2197；Cornell等(2003)Nat.Struct.Biol.10(2)：91。本发明还覆盖了其它小RNA，其能够介导RNA干扰(RNAi)，如例如微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)。
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的意义相同。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述相似或等同的方法和材料，在下面描述合适的方法和材料。将本文所提及的全部出版物，专利申请，专利和其它参考文献的全部内容并入本文作为参考。在出现冲突时，以本说明书，包括定义为准。此外，材料，方法和实施例只是示例性的，并不意欲进行限定。
下列实施例只是示例性的，并不意味着以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间关联的发现
为了鉴定硬化蛋白，BMP，和Wnt途径的新调节剂，我们对硬化蛋白应用一种系统串联亲和纯化(TAP)方法。如在Rigaut等(NatBiotechnol.(1999)17(10)：1030)，Seraphin和Rigaut WO 00/09716专利申请)中所述，特此将其并入作为参考，TAP纯化方法包括将TAP标签融合到目标靶蛋白质上并将构建体导入同类宿主细胞或生物中。
TAP标签是(i)来自金黄色葡萄球菌的A蛋白的IgG-结合单位；和(ii)钙调蛋白结合肽(CBP)的串联融合，其通过TEV蛋白酶剪切位点分离。它允许复合体从相对小数目的细胞中快速纯化，而不用事先了解复合体组成，活性或功能。与质谱分析相结合，TAP策略能够鉴定与给定靶蛋白相互作用的蛋白质。
将N和C末端标记的硬化蛋白在HEK293T和成骨细胞UMR-106细胞中表达，所述细胞不处理或用50ng/ml BMP-2处理4和20小时。此外N末端TAP标签包含来自CD33蛋白质的人工信号序列。选择UMR-106和HEK293T细胞，因为我们先前发现UMR-106和相关的HEK293细胞表达内源性SOST mRNA。(Keller，H.和Kneissel，M(2005)Bone 37：148)。
通过间接免疫荧光监测SOST TAP标记的蛋白质的正确亚细胞定位。预测试表明在生化制备的膜级分中发现足量的TAP标记的硬化蛋白，以便起始TAP方法。另外，发现硬化蛋白的两种标记构建体在任一细胞类型的培养基中都被分泌。C-TAP硬化蛋白在来自UMR-106细胞的膜级分中的表达水平被发现不足以进行TAP纯化。那些样品的进一步加工被终止。
将细胞生长在具有10％FCS的DMEM培养基中。为了进行刺激，将用包含50ng/ml BMP2的新鲜培养基或单独的新鲜培养基代替该培养基。在通过机械分离收获之前，将细胞刺激4小时和20小时，在冰上用过量PBS洗涤并在免疫沉淀缓冲液中裂解。
粗制裂解物进行亚细胞分级分离以富集膜结合的蛋白质。
使用膜级分来进行TAP纯化。为了纯化分泌型TAP标记的SOST复合体，从几个细胞培养板上收集细胞培养物上清液。
对于膜级分进行一式三份的纯化，同时只进行单份的细胞培养物上清液纯化。
通过1D-SDS-PAGE分离纯化的蛋白质复合体并通过胶体考马斯蓝进行染色。将完整的凝胶泳道全部切成薄片并如在Shevchenko(Shevchenko，A.，Wilm，M.，Vorm，O.& Mann，M.Mass spectrometric sequencing ofproteins silver-stained polyacrylamide gels.Anal.Chem.68，850-858(1996))中所述用胰蛋白酶在凝胶中对蛋白质进行消化。通过LC-MS/MS进行蛋白质鉴定，并将MS数据对保持在EBI(Hinxton，UK)的国际蛋白质索引(IPI)的内部副本版本进行检索。数据库检索的结果被读入数据库系统用于进一步的生物信息学分析(包括将命中条目进行计算机辅助靶标选择(CATS)分析)。
从两种细胞系中总共鉴定出大约100种蛋白质，其E值≤10，R值≥0.67。
在相对于核糖体蛋白和RNA结合蛋白，以及其它丰量的细胞质蛋白进行过滤后，将命中条目精选入短的列表中。硬化蛋白似乎显示了对于RNA结合蛋白的倾向(留下E值≤10的大约60种候选物)。本文所用的值如下：
IPI＝来自IPI数据库的蛋白质参照数目
R＝在一式三份纯化中鉴定的可重复性
E＝通过串联亲和纯化对于给定的参照数据组鉴定蛋白质的进入点的总数
MS＝通过MS鉴定各个蛋白质肽的数目。
如在表I和表II中所见，通过这种方法鉴定了下列硬化蛋白相互作用配偶体：多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP4、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、碱性磷酸酶(ALPL)和IL-17受体。
一方面，已经在HEK293(人胚肾细胞)，C28a2(未能检测到硬化蛋白的人软骨细胞细胞系)和/或UMR106(大鼠骨肉瘤细胞)细胞中测试了相互作用配偶体下调(siRNA)或上调(过表达)在Wnt1/STF测定中对于硬化蛋白作用的效应，一方面已经进行了生化测定(例子：ALPL)
实施例2：LRP4数据
简言之，在HEK293细胞中的Wnt1诱导型Wnt信号报告基因测定(supertopflash(STF))中针对LRP4筛选siRNA。所有针对LRP4的siRNA都能够击倒LRP4mRNA(图1)。LRP4mRNA击倒减弱了硬化蛋白抑制HEK293细胞中STF活性的能力(图2)。硬化蛋白剂量反应研究显示，与对照相比，在STF/Wnt1测定中LRP4击倒导致SOST的IC50的高达5倍的提高(图3)。
如通过STF测定所测量的，LRP4在HEK293细胞中过表达减弱Wnt信号转导(图4a)。LRP4在HEK293细胞中过表达导致SOST IC50的5倍减小，并对Dkk1IC50没有作用(图4b)。LRP4与LRP5一起在HEK细胞中的过表达对Dkk1IC50没有影响但与只过表达LRP5的对照细胞相比导致SOST IC50减小35倍(图4c)。LRP4与LRP6一起在HEK细胞中的过表达对Dkk1IC50没有影响但与只过表达LRP6的对照细胞相比导致SOST IC50减小20倍(图4d)。这些数据表明在HEK细胞中LRP4是硬化蛋白作用的特异性促进剂。
如在LRP5瞬时转染的细胞中通过STF测定法所测量的，LRP4在无SOST的C28a2细胞中过表达诱导常规Wnt信号转导减小2.5倍(图5a)。LRP4和LRP5在C28a2细胞中过表达对于Dkk1IC50没有影响但与只过表达LRP5的对照细胞相比导致SOST IC50减小16倍(图5b)。在600nMSOST作用的效力从52％提高到72％。所以这些数据表明在C28a2细胞中LRP4是硬化蛋白作用的促进剂，而它并不影响DKK1活性。
基于这些发现，LRP4被假定为硬化蛋白的重要相互作用配偶体，增强硬化蛋白作用。因此，这种相互作用的调节可以提供新的途径以抑制骨骼组织中的硬化蛋白作用。
实施例3：碱性磷酸酶数据
此外在MC3T3细胞中在基于细胞的碱性磷酸酶测定中测试了硬化蛋白对碱性磷酸酶的作用。这一测定是基于对内源性碱性磷酸酶的活性的检测，所述检测是通过分光光度测定对硝基苯磷酸的脱磷酸作用。为了测试硬化蛋白是否能够抑制BMP，Wnt和LRP5/6下游的碱性磷酸酶，测试硬化蛋白对GK3β抑制剂诱导的碱性磷酸酶的作用(图6)。硬化蛋白减少LiCl-诱导的碱性磷酸酶和GSK-3抑制剂IX(Calbiochem #361550)诱导的碱性磷酸酶。我们随后测试了硬化蛋白在无细胞测定中对于ALPL自身的作用，所述测定是基于4-甲基伞形酮基(umbelliferyl)磷酸酯的去磷酸化作用的荧光检测(图7)。硬化蛋白剂量反应研究显示，与对照相比，高浓度的硬化蛋白抑制碱性磷酸酶活性。这些数据提示SOST对于碱性磷酸酶活性具有直接抑制性作用。
本发明并不限于本文所述特定实施方案的范围。事实上，除了本文所述的那些实施方案之外，根据前面说明书和附图，对本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这种修改意欲落入随附的权利要求的范围中
本文引用了各种出版物，将其全部内容并入作为参考。
序列表
<110>诺瓦提斯公司
<120>硬化蛋白结合配偶体
<130>50511A
<160>4
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>1950
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Arg Arg Gln Trp Gly Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Cys Ala
1               5                   10                  15
His Ala Val Ala Leu Gly Leu Arg Ala Gly Glu Arg Thr Arg Ser Gly
            20                  25                  30
Pro Gly Ser Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ala Ser Ala
        35                  40                  45
Gly Ser Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu
    50                  55                  60
Ala Ser Ser Pro Glu Cys Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala
65                  70                  75                  80
Val Ser Ala Leu Gly Glu Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys
                85                  90                  95
Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile
            100                 105                 110
Leu Pro Thr Cys Ser Pro Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys
        115                 120                 125
Ile Arg Arg Ser Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Asp Cys Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe
145                 150                 155                 160
Pro Cys Gln Asn Gly Tyr Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly
                165                 170                 175
Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met Arg Lys
            180                 185                 190
Cys Ser Asp Lys Glu Phe Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile Ala Glu
        195                 200                 205
His Trp Tyr Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu
    210                 215                 220
Glu Asn Cys Pro Ser Ala Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Phe Gln Cys Ala Tyr Gly Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His Cys Asp
                245                 250                 255
Gly Asp Asp Asp Cys Gly Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys Ser Ser
            260                 265                 270
His Gln Pro Cys Arg Ser Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys
        275                 280                 285
Ile Asn Ala Gly Trp Arg Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln
    290                 295                 300
Ser Asp Glu Arg Asn Cys Thr Thr Ser Met Cys Thr Ala Glu Gln Phe
305                 310                 315                 320
Arg Cys His Ser Gly Arg Cys Val Arg Leu Ser Trp Arg Cys Asp Gly
                325                 330                 335
Glu Asp Asp Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn Cys Glu Asn Thr
            340                 345                 350
Gly Ser Pro Gln Cys Ala Leu Asp Gln Phe Leu Cys Trp Asn Gly Arg
        355                 360                 365
Cys Ile Gly Gln Arg Lys Leu Cys Asn Gly Val Asn Asp Cys Gly Asp
    370                 375                 380
Asn Ser Asp Glu Ser Pro Gln Gln Asn Cys Arg Pro Arg Thr Gly Glu
385                 390                 395                 400
Glu Asn Cys Asn Val Asn Asn Gly Gly Cys Ala Gln Lys Cys Gln Met
                405                 410                 415
Val Arg Gly Ala Val Gln Cys Thr Cys His Thr Gly Tyr Arg Leu Thr
            420                 425                 430
Glu Asp Gly His Thr Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Glu Glu Gly
        435                 440                 445
Tyr Cys Ser Gln Gly Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ala Phe Gln Cys Trp
    450                 455                 460
Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Arg Pro Asp Arg Arg Ser Cys Lys Ala
465                 470                 475                 480
Leu Gly Pro Glu Pro Val Leu Leu Phe Ala Asn Arg Ile Asp Ile Arg
                485                 490                 495
Gln Val Leu Pro His Arg Ser Glu Tyr Thr Leu Leu Leu Asn Asn Leu
            500                 505                 510
Glu Asn Ala Ile Ala Leu Asp Phe His His Arg Arg Glu Leu Val Phe
        515                 520                 525
Trp Ser Asp Val Thr Leu Asp Arg Ile Leu Arg Ala Asn Leu Asn Gly
    530                 535                 540
Ser Asn Val Glu Glu Val Val Ser Thr Gly Leu Glu Ser Pro Gly Gly
545                 550                 555                 560
Leu Ala Val Asp Trp Val His Asp Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gly
                565                 570                 575
Thr Ser Arg Ile Glu Val Ala Asn Leu Asp Gly Ala His Arg Lys Val
            580                 585                 590
Leu Leu Trp Gln Asn Leu Glu Lys Pro Arg Ala Ile Ala Leu His Pro
        595                 600                 605
Met Glu Gly Thr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Asn Thr Pro Arg Ile
    610                 615                 620
Glu Ala Ser Ser Met Asp Gly Ser Gly Arg Arg Ile Ile Ala Asp Thr
625                 630                 635                 640
His Leu Phe Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Gly Arg Arg
                645                 650                 655
Met Tyr Trp Val Asp Ala Lys His His Val Ile Glu Arg Ala Asn Leu
            660                 665                 670
Asp Gly Ser His Arg Lys Ala Val Ile Ser Gln Gly Leu Pro His Pro
        675                 680                 685
Phe Ala Ile Thr Val Phe Glu Asp Ser Leu Tyr Trp Thr Asp Trp His
    690                 695                 700
Thr Lys Ser Ile Asn Ser Ala Asn Lys Phe Thr Gly Lys Asn Gln Glu
705                 710                 715                 720
Ile Ile Arg Asn Lys Leu His Phe Pro Met Asp Ile His Thr Leu His
                725                 730                 735
Pro Gln Arg Gln Pro Ala Gly Lys Asn Arg Cys Gly Asp Asn Asn Gly
            740                 745                 750
Gly Cys Thr His Leu Cys Leu Pro Ser Gly Gln Asn Tyr Thr Cys Ala
        755                 760                 765
Cys Pro Thr Gly Phe Arg Lys Ile Ser Ser His Ala Cys Ala Gln Ser
    770                 775                 780
Leu Asp Lys Phe Leu Leu Phe Ala Arg Arg Met Asp Ile Arg Arg Ile
785                 790                 795                 800
Ser Phe Asp Thr Glu Asp Leu Ser Asp Asp Val Ile Pro Leu Ala Asp
                805                 810                 815
Val Arg Ser Ala Val Ala Leu Asp Trp Asp Ser Arg Asp Asp His Val
            820                 825                 830
Tyr Trp Thr Asp Val Ser Thr Asp Thr Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asp
        835                 840                 845
Gly Thr Gly Gln Glu Val Val Val Asp Thr Ser Leu Glu Ser Pro Ala
    850                 855                 860
Gly Leu Ala Ile Asp Trp Val Thr Asn Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ala
865                 870                 875                 880
Gly Thr Asp Arg Ile Glu Val Ala Asn Thr Asp Gly Ser Met Arg Thr
                885                 890                 895
Val Leu Ile Trp Glu Asn Leu Asp Arg Pro Arg Asp Ile Val Val Glu
            900                 905                 910
Pro Met Gly Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Ala Ser Pro Lys
        915                 920                 925
Ile Glu Arg Ala Gly Met Asp Ala Ser Gly Arg Gln Val Ile Ile Ser
    930                 935                 940
Ser Asn Leu Thr Trp Pro Asn Gly Leu Ala Ile Asp Tyr Gly Ser Gln
945                 950                 955                 960
Arg Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Gly Met Lys Thr Ile Glu Phe Ala Gly
                965                 970                 975
Leu Asp Gly Ser Lys Arg Lys Val Leu Ile Gly Ser Gln Leu Pro His
            980                 985                 990
Pro Phe Gly Leu Thr Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Trp
        995                 1000                 1005
Gln Thr Lys Ser Ile Gln Ser Ala Asp Arg Leu Thr Gly Leu Asp
    1010                1015                1020
Arg Glu Thr Leu Gln Glu Asn Leu Glu Asn Leu Met Asp Ile His
    1025                1030                1035
Val Phe His Arg Arg Arg Pro Pro Val Ser Thr Pro Cys Ala Met
    1040                1045                1050
Glu Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Arg Ser Pro Asn Pro
    1055                1060                1065
Ser Gly Phe Ser Cys Thr Cys Pro Thr Gly Ile Asn Leu Leu Ser
    1070                1075                1080
Asp Gly Lys Thr Cys Ser Pro Gly Met Asn Ser Phe Leu Ile Phe
    1085                1090                1095
Ala Arg Arg Ile Asp Ile Arg Met Val Ser Leu Asp Ile Pro Tyr
    1100                1105                1110
Phe Ala Asp Val Val Val Pro Ile Asn Ile Thr Met Lys Asn Thr
    1115                1120                1125
Ile Ala Ile Gly Val Asp Pro Gln Glu Gly Lys Val Tyr Trp Ser
    1130                1135                1140
Asp Ser Thr Leu His Arg Ile Ser Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser
    1145                1150                1155
Gln His Glu Asp Ile Ile Thr Thr Gly Leu Gln Thr Thr Asp Gly
    1160                1165                1170
Leu Ala Val Asp Ala Ile Gly Arg Lys Val Tyr Trp Thr Asp Thr
    1175                1180                1185
Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Gly Asn Leu Asp Gly Ser Met Arg
    1190                1195                1200
Lys Val Leu Val Trp Gln Asn Leu Asp Ser Pro Arg Ala Ile Val
    1205                1210                1215
Leu Tyr His Glu Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu
    1220                1225                1230
Asn Ala Lys Leu Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser Asp Arg Ala
    1235                1240                1245
Val Leu Ile Asn Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Val
    1250                1255                1260
Asp Lys Ala Ser Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala His Thr Glu
    1265                1270                1275
Arg Ile Glu Ala Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg His Thr Leu
    1280                1285                1290
Val Ser Pro Val Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Asp Ser
    1295                1300                1305
Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile His Arg Ala
    1310                1315                1320
Asp Lys Gly Thr Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg Ser Asn Leu
    1325                1330                1335
Pro Gly Leu Met Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala Gln Pro Leu
    1340                1345                1350
Gly Phe Asn Lys Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys Ser His Leu
    1355                1360                1365
Cys Leu Pro Arg Pro Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys Pro Thr Gly
    1370                1375                1380
Ile Gln Leu Lys Gly Asp Gly Lys Thr Cys Asp Pro Ser Pro Glu
    1385                1390                1395
Thr Tyr Leu Leu Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Ile Ser
    1400                1405                1410
Leu Asp Thr Ser Asp His Thr Asp Val His Val Pro Val Pro Glu
    1415                1420                1425
Leu Asn Asn Val Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val Asp Gly Lys
    1430                1435                1440
Val Tyr Tyr Thr Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg Arg Ala Asp
    1445                1450                1455
Leu Asn Gly Ser Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg Gly Leu Lys
    1460                1465                1470
Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr
    1475                1480                1485
Trp Thr Asp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser Arg Leu Asp
    1490                1495                1500
Gly Ser Cys Arg Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu Asp Glu Pro
    1505                1510                1515
Arg Ala Ile Ala Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr
    1520                1525                1530
Asp Trp Gly His Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly
    1535                1540                1545
Ser Glu Arg Lys Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly Trp Pro Asn
    1550                1555                1560
Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr Trp Val Asp
    1565                1570                1575
Ala His Leu Asp Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Leu
    1580                1585                1590
Arg Gln Val Leu Val Ser His Val Ser His Pro Phe Ala Leu Thr
    1595                1600                1605
Gln Gln Asp Arg Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys Ser
    1610                1615                1620
Ile Gln Arg Val Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys Glu Thr Val
    1625                1630                1635
Leu Ala Asn Val Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val Val Ser Pro
    1640                1645                1650
Gln Arg Gln Thr Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn Asn Gly Gly
    1655                1660                1665
Cys Thr His Leu Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe Val Cys Ala
    1670                1675                1680
Cys Pro Asp Glu Pro Asp Ser Arg Pro Cys Ser Leu Val Pro Gly
    1685                1690                1695
Leu Val Pro Pro Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser Glu Lys Ser
    1700                1705                1710
Pro Val Leu Pro Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr
    1715                1720                1725
Thr Arg Thr Arg Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly Arg Cys Ser
    1730                1735                1740
Glu Arg Asp Ala Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser Asn Asp Ala
    1745                1750                1755
Val Pro Ala Ala Pro Gly Glu Gly Leu His Ile Ser Tyr Ala Ile
    1760                1765                1770
Gly Gly Leu Leu Ser Ile Leu Leu Ile Leu Val Val Ile Ala Ala
    1775                1780                1785
Leu Met Leu Tyr Arg His Lys Lys Ser Lys Phe Thr Asp Pro Gly
    1790                1795                1800
Met Gly Asn Leu Thr Tyr Ser Asn Pro Ser Tyr Arg Thr Ser Thr
    1805                1810                1815
Gln Glu Val Lys Ile Glu Ala Ile Pro Lys Pro Ala Met Tyr Asn
    1820                1825                1830
Gln Leu Cys Tyr Lys Lys Glu Gly Gly Pro Asp His Asn Tyr Thr
    1835                1840                1845
Lys Glu Lys Ile Lys Ile Val Glu Gly Ile Cys Leu Leu Ser Gly
    1850                1855                1860
Asp Asp Ala Glu Trp Asp Asp Leu Lys Gln Leu Arg Ser Ser Arg
    1865                1870                1875
Gly Gly Leu Leu Arg Asp His Val Cys Met Lys Thr Asp Thr Val
    1880                1885                1890
Ser Ile Gln Ala Ser Ser Gly Ser Leu Asp Asp Thr Glu Thr Glu
    1895                1900                1905
Gln Leu Leu Gln Glu Glu Gln Ser Glu Cys Ser Ser Val His Thr
    1910                1915                1920
Ala Ala Thr Pro Glu Arg Arg Gly Ser Leu Pro Asp Thr Gly Trp
    1925                1930                1935
Lys His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Glu Ser Gln Val
    1940                1945                1950
<210>2
<211>524
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
        35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
    50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
                85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
            100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
        115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
    130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
                165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
            180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
        195                 200                 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
    210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
                245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
            260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
        275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
    290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305                 310                 315                 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
                325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
            340                 345                 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
        355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
    370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
                405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
            420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
        435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
    450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
                485                 490                 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
            500                 505                 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe
        515                 520
<210>3
<211>1744
<212>PRT
<213>人
<400>3
Ala Leu Gly Leu Arg Ala Gly Glu Arg Thr Arg Ser Gly Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly
            20                  25                  30
Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser
        35                  40                  45
Pro Glu Cys Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala Val Ser Ala
    50                  55                  60
Leu Gly Glu Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys Asp Gly Asp
65                  70                  75                  80
Asn Asp Cys Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile Leu Pro Thr
                85                  90                  95
Cys Ser Pro Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys Ile Arg Arg
            100                 105                 110
Ser Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Asp Cys Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe Pro Cys Gln
    130                 135                 140
Asn Gly Tyr Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly Asp Asn Asp
145                 150                 155                 160
Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met Arg Lys Cys Ser Asp
                165                 170                 175
Lys Glu Phe Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile Ala Glu His Trp Tyr
            180                 185                 190
Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys
        195                 200                 205
Pro Ser Ala Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu Glu Glu Phe Gln Cys
    210                 215                 220
Ala Tyr Gly Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His Cys Asp Gly Asp Asp
225                 230                 235                 240
Asp Cys Gly Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys Ser Ser His Gln Pro
                245                 250                 255
Cys Arg Ser Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys Ile Asn Ala
            260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu
        275                 280                 285
Arg Asn Cys Thr Thr Ser Met Cys Thr Ala Glu Gln Phe Arg Cys His
    290                 295                 300
Ser Gly Arg Cys Val Arg Leu Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Asp Asp
305                 310                 315                 320
Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn Cys Glu Asn Thr Gly Ser Pro
                325                 330                 335
Gln Cys Ala Leu Asp Gln Phe Leu Cys Trp Asn Gly Arg Cys Ile Gly
            340                 345                 350
Gln Arg Lys Leu Cys Asn Gly Val Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp
        355                 360                 365
Glu Ser Pro Gln Gln Asn Cys Arg Pro Arg Thr Gly Glu Glu Asn Cys
    370                 375                 380
Asn Val Asn Asn Gly Gly Cys Ala Gln Lys Cys Gln Met Val Arg Gly
385                 390                 395                 400
Ala Val Gln Cys Thr Cys His Thr Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Asp Gly
                405                 410                 415
His Thr Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Glu Glu Gly Tyr Cys Ser
            420                 425                 430
Gln Gly Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ala Phe Gln Cys Trp Cys Glu Thr
        435                 440                 445
Gly Tyr Glu Leu Arg Pro Asp Arg Arg Ser Cys Lys Ala Leu Gly Pro
    450                 455                 460
Glu Pro Val Leu Leu Phe Ala Asn Arg Ile Asp Ile Arg Gln Val Leu
465                 470                 475                 480
Pro His Arg Ser Glu Tyr Thr Leu Leu Leu Asn Asn Leu Glu Asn Ala
                485                 490                 495
Ile Ala Leu Asp Phe His His Arg Arg Glu Leu Val Phe Trp Ser Asp
            500                 505                 510
Val Thr Leu Asp Arg Ile Leu Arg Ala Asn Leu Asn Gly Ser Asn Val
        515                 520                 525
Glu Glu Val Val Ser Thr Gly Leu Glu Ser Pro Gly Gly Leu Ala Val
    530                 535                 540
Asp Trp Val His Asp Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gly Thr Ser Arg
545                 550                 555                 560
Ile Glu Val Ala Asn Leu Asp Gly Ala His Arg Lys Val Leu Leu Trp
                565                 570                 575
Gln Asn Leu Glu Lys Pro Arg Ala Ile Ala Leu His Pro Met Glu Gly
            580                 585                 590
Thr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Asn Thr Pro Arg Ile Glu Ala Ser
        595                 600                 605
Ser Met Asp Gly Ser Gly Arg Arg Ile Ile Ala Asp Thr His Leu Phe
    610                 615                 620
Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Gly Arg Arg Met Tyr Trp
625                 630                 635                 640
Val Asp Ala Lys His His Val Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser
                645                 650                 655
His Arg Lys Ala Val Ile Ser Gln Gly Leu Pro His Pro Phe Ala Ile
            660                 665                 670
Thr Val Phe Glu Asp Ser Leu Tyr Trp Thr Asp Trp His Thr Lys Ser
        675                 680                 685
Ile Asn Ser Ala Asn Lys Phe Thr Gly Lys Asn Gln Glu Ile Ile Arg
    690                 695                 700
Asn Lys Leu His Phe Pro Met Asp Ile His Thr Leu His Pro Gln Arg
705                 710                 715                 720
Gln Pro Ala Gly Lys Asn Arg Cys Gly Asp Asn Asn Gly Gly Cys Thr
                725                 730                 735
His Leu Cys Leu Pro Ser Gly Gln Asn Tyr Thr Cys Ala Cys Pro Thr
            740                 745                 750
Gly Phe Arg Lys Ile Ser Ser His Ala Cys Ala Gln Ser Leu Asp Lys
        755                 760                 765
Phe Leu Leu Phe Ala Arg Arg Met Asp Ile Arg Arg Ile Ser Phe Asp
    770                 775                 780
Thr Glu Asp Leu Ser Asp Asp Val Ile Pro Leu Ala Asp Val Arg Ser
785                 790                 795                 800
Ala Val Ala Leu Asp Trp Asp Ser Arg Asp Asp His Val Tyr Trp Thr
                805                 810                 815
Asp Val Ser Thr Asp Thr Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asp Gly Thr Gly
            820                 825                 830
Gln Glu Val Val Val Asp Thr Ser Leu Glu Ser Pro Ala Gly Leu Ala
        835                 840                 845
Ile Asp Trp Val Thr Asn Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ala Gly Thr Asp
    850                 855                 860
Arg Ile Glu Val Ala Asn Thr Asp Gly Ser Met Arg Thr Val Leu Ile
865                 870                 875                 880
Trp Glu Asn Leu Asp Arg Pro Arg Asp Ile Val Val Glu Pro Met Gly
                885                 890                 895
Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Ala Ser Pro Lys Ile Glu Arg
            900                 905                 910
Ala Gly Met Asp Ala Ser Gly Arg Gln Val Ile Ile Ser Ser Asn Leu
        915                 920                 925
Thr Trp Pro Asn Gly Leu Ala Ile Asp Tyr Gly Ser Gln Arg Leu Tyr
    930                 935                 940
Trp Ala Asp Ala Gly Met Lys Thr Ile Glu Phe Ala Gly Leu Asp Gly
945                 950                 955                 960
Ser Lys Arg Lys Val Leu Ile Gly Ser Gln Leu Pro His Pro Phe Gly
                965                 970                 975
Leu Thr Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys
            980                 985                 990
Ser Ile Gln Ser Ala Asp Arg Leu Thr Gly Leu Asp Arg Glu Thr Leu
        995                 1000                1005
Gln Glu Asn Leu Glu Asn Leu Met Asp Ile His Val Phe His Arg
    1010                1015                1020
Arg Arg Pro Pro Val Ser Thr Pro Cys Ala Met Glu Asn Gly Gly
    1025                1030                1035
Cys Ser His Leu Cys Leu Arg Ser Pro Asn Pro Ser Gly Phe Ser
    1040                1045                1050
Cys Thr Cys Pro Thr Gly Ile Asn Leu Leu Ser Asp Gly Lys Thr
    1055                1060                1065
Cys Ser Pro Gly Met Asn Ser Phe Leu Ile Phe Ala Arg Arg Ile
    1070                1075                1080
Asp Ile Arg Met Val Ser Leu Asp Ile Pro Tyr Phe Ala Asp Val
    1085                1090                1095
Val Val Pro Ile Asn Ile Thr Met Lys Asn Thr Ile Ala Val Gly
    1100                1105                1110
Val Asp Pro Gln Glu Gly Lys Val Tyr Trp Ser Asp Ser Thr Leu
    1115                1120                1125
His Arg Ile Ser Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Gln His Glu Asp
    1130                1135                1140
Ile Ile Thr Thr Gly Leu Gln Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp
    1145                1150                1155
Ala Ile Gly Arg Lys Val Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asn Arg
    1160                1165                1170
Ile Glu Val Gly Asn Leu Asp Gly Ser Met Arg Lys Val Leu Val
    1175                1180                1185
Trp Gln Asn Leu Asp Ser Pro Arg Ala Ile Val Leu Tyr His Glu
    1190                1195                1200
Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Asn Ala Lys Leu
    1205                1210                1215
Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser Asp Arg Ala Val Leu Ile Asn
    1220                1225                1230
Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser
    1235                1240                1245
Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala His Thr Glu Arg Ile Glu Ala
    1250                1255                1260
Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg His Thr Leu Val Ser Pro Val
    1265                1270                1275
Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Asp Ser Tyr Ile Tyr Trp
    1280                1285                1290
Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile His Arg Ala Asp Lys Gly Thr
    1295                1300                1305
Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg Ser Asn Leu Pro Gly Leu Met
    1310                1315                1320
Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala Gln Pro Leu Gly Phe Asn Lys
    1325                1330                1335
Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Pro Arg
    1340                1345                1350
Pro Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys Pro Thr Gly Ile Gln Leu Lys
    1355                1360                1365
Gly Asp Gly Lys Thr Cys Asp Pro Ser Pro Glu Thr Tyr Leu Leu
    1370                1375                1380
Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Ser
    1385                1390                1395
Asp His Thr Asp Val His Val Pro Val Pro Glu Leu Asn Asn Val
    1400                1405                1410
Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Thr
    1415                1420                1425
Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg Arg Ala Asp Leu Asn Gly Ser
    1430                1435                1440
Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg Gly Leu Lys Thr Thr Asp Gly
    1445                1450                1455
Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Thr
    1460                1465                1470
Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser Arg Leu Asp Gly Ser Cys Arg
    1475                1480                1485
Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile Ala
    1490                1495                1500
Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr Asp Trp Gly His
    1505                1510                1515
Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Glu Arg Lys
    1520                1525                1530
Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu
    1535                1540                1545
Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr Trp Val Asp Ala His Leu Asp
    1550                1555                1560
Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Leu Arg Gln Val Leu
    1565                1570                1575
Val Gly His Val Ser His Pro Phe Ala Leu Thr Gln Gln Asp Arg
    1580                1585                1590
Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys Ser Ile Gln Arg Val
    1595                1600                1605
Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys Glu Thr Val Leu Ala Asn Val
    1610                1615                1620
Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val Val Ser Pro Gln Arg Gln Thr
    1625                1630                1635
Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn Asn Gly Gly Cys Thr His Leu
    1640                1645                1650
Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe Val Cys Ala Cys Pro Asp Glu
    1655                1660                1665
Pro Asp Ser Gln Pro Cys Ser Leu Val Pro Gly Leu Val Pro Pro
    1670                1675                1680
Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser Glu Lys Ser Pro Val Leu Pro
    1685                1690                1695
Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr Thr Arg Thr Arg
    1700                1705                1710
Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly Arg Cys Ser Glu Arg Asp Ala
    1715                1720                1725
Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser Asn Asp Ala Val Pro Ala Ala
    1730                1735                1740
Pro
<210>4
<211>1998
<212>PRT
<213>人
<400>4
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Gly Leu Arg Ala Gly Glu Arg Thr Arg Ser Gly Pro Gly Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly
         35                  40                  45
Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser
    50                  55                  60
Pro Glu Cys Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala Val Ser Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Glu Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys Asp Gly Asp
                85                  90                  95
Asn Asp Cys Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile Leu Pro Thr
            100                 105                 110
Cys Ser Pro Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys Ile Arg Arg
        115                 120                 125
Ser Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp Ser Asp Glu
    130                 135                 140
Gln Asp Cys Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe Pro Cys Gln
145                 150                 155                 160
Asn Gly Tyr Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly Asp Asn Asp
                165                 170                 175
Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met Arg Lys Cys Ser Asp
            180                 185                 190
Lys Glu Phe Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile Ala Glu His Trp Tyr
        195                 200                 205
Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys
    210                 215                 220
Pro Ser Ala Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu Glu Glu Phe Gln Cys
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Gly Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His Cys Asp Gly Asp Asp
                245                 250                 255
Asp Cys Gly Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys Ser Ser His Gln Pro
            260                 265                 270
Cys Arg Ser Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys Ile Asn Ala
        275                 280                 285
Gly Trp Arg Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu
    290                 295                 300
Arg Asn Cys Thr Thr Ser Met Cys Thr Ala Glu Gln Phe Arg Cys His
305                 310                 315                 320
Ser Gly Arg Cys Val Arg Leu Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Asp Asp
                325                 330                 335
Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn Cys Glu Asn Thr Gly Ser Pro
            340                 345                 350
Gln Cys Ala Leu Asp Gln Phe Leu Cys Trp Asn Gly Arg Cys Ile Gly
        355                 360                 365
Gln Arg Lys Leu Cys Asn Gly Val Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp
    370                 375                 380
Glu Ser Pro Gln Gln Asn Cys Arg Pro Arg Thr Gly Glu Glu Asn Cys
385                 390                 395                 400
Asn Val Asn Asn Gly Gly Cys Ala Gln Lys Cys Gln Met Val Arg Gly
                405                 410                 415
Ala Val Gln Cys Thr Cys His Thr Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Asp Gly
            420                 425                 430
His Thr Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Glu Glu Gly Tyr Cys Ser
        435                 440                 445
Gln Gly Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ala Phe Gln Cys Trp Cys Glu Thr
    450                 455                 460
Gly Tyr Glu Leu Arg Pro Asp Arg Arg Ser Cys Lys Ala Leu Gly Pro
465                 470                 475                 480
Glu Pro Val Leu Leu Phe Ala Asn Arg Ile Asp Ile Arg Gln Val Leu
                485                 490                 495
Pro His Arg Ser Glu Tyr Thr Leu Leu Leu Asn Asn Leu Glu Asn Ala
            500                 505                 510
Ile Ala Leu Asp Phe His His Arg Arg Glu Leu Val Phe Trp Ser Asp
        515                 520                 525
Val Thr Leu Asp Arg Ile Leu Arg Ala Asn Leu Asn Gly Ser Asn Val
    530                 535                 540
Glu Glu Val Val Ser Thr Gly Leu Glu Ser Pro Gly Gly Leu Ala Val
545                 550                 555                 560
Asp Trp Val His Asp Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gly Thr Ser Arg
                565                 570                 575
Ile Glu Val Ala Asn Leu Asp Gly Ala His Arg Lys Val Leu Leu Trp
            580                 585                 590
Gln Asn Leu Glu Lys Pro Arg Ala Ile Ala Leu His Pro Met Glu Gly
        595                 600                 605
Thr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Asn Thr Pro Arg Ile Glu Ala Ser
    610                 615                 620
Ser Met Asp Gly Ser Gly Arg Arg Ile Ile Ala Asp Thr His Leu Phe
625                 630                 635                 640
Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Gly Arg Arg Met Tyr Trp
                645                 650                 655
Val Asp Ala Lys His His Val Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser
            660                 665                 670
His Arg Lys Ala Val Ile Ser Gln Gly Leu Pro His Pro Phe Ala Ile
        675                 680                 685
Thr Val Phe Glu Asp Ser Leu Tyr Trp Thr Asp Trp His Thr Lys Ser
    690                 695                 700
Ile Asn Ser Ala Asn Lys Phe Thr Gly Lys Asn Gln Glu Ile Ile Arg
705                 710                 715                 720
Asn Lys Leu His Phe Pro Met Asp Ile His Thr Leu His Pro Gln Arg
                725                 730                 735
Gln Pro Ala Gly Lys Asn Arg Cys Gly Asp Asn Asn Gly Gly Cys Thr
            740                 745                 750
His Leu Cys Leu Pro Ser Gly Gln Asn Tyr Thr Cys Ala Cys Pro Thr
        755                 760                 765
Gly Phe Arg Lys Ile Ser Ser His Ala Cys Ala Gln Ser Leu Asp Lys
    770                 775                 780
Phe Leu Leu Phe Ala Arg Arg Met Asp Ile Arg Arg Ile Ser Phe Asp
785                 790                 795                 800
Thr Glu Asp Leu Ser Asp Asp Val Ile Pro Leu Ala Asp Val Arg Ser
                805                 810                 815
Ala Val Ala Leu Asp Trp Asp Ser Arg Asp Asp His Val Tyr Trp Thr
            820                 825                 830
Asp Val Ser Thr Asp Thr Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asp Gly Thr Gly
        835                 840                 845
Gln Glu Val Val Val Asp Thr Ser Leu Glu Ser Pro Ala Gly Leu Ala
    850                 855                 860
Ile Asp Trp Val Thr Asn Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ala Gly Thr Asp
865                 870                 875                 880
Arg Ile Glu Val Ala Asn Thr Asp Gly Ser Met Arg Thr Val Leu Ile
                885                 890                 895
Trp Glu Asn Leu Asp Arg Pro Arg Asp Ile Val Val Glu Pro Met Gly
            900                 905                 910
Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Ala Ser Pro Lys Ile Glu Arg
        915                 920                 925
Ala Gly Met Asp Ala Ser Gly Arg Gln Val Ile Ile Ser Ser Asn Leu
    930                 935                 940
Thr Trp Pro Asn Gly Leu Ala Ile Asp Tyr Gly Ser Gln Arg Leu Tyr
945                 950                 955                 960
Trp Ala Asp Ala Gly Met Lys Thr Ile Glu Phe Ala Gly Leu Asp Gly
                965                 970                 975
Ser Lys Arg Lys Val Leu Ile Gly Ser Gln Leu Pro His Pro Phe Gly
            980                 985                 990
Leu Thr Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys
        995                 1000                1005
Ser Ile  Gln Ser Ala Asp Arg Leu Thr Gly Leu Asp Arg Glu Thr
    1010                1015                1020
Leu Gln Glu Asn Leu Glu Asn Leu Met Asp Ile His Val Phe His
    1025                1030                1035
Arg Arg Arg Pro Pro Val Ser Thr Pro Cys Ala Met Glu Asn Gly
    1040                1045                1050
Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Arg Ser Pro Asn Pro Ser Gly Phe
    1055                1060                1065
Ser Cys Thr Cys Pro Thr Gly Ile Asn Leu Leu Ser Asp Gly Lys
    1070                1075                1080
Thr Cys Ser Pro Gly Met Asn Ser Phe Leu Ile Phe Ala Arg Arg
    1085                1090                1095
Ile Asp Ile Arg Met Val Ser Leu Asp Ile Pro Tyr Phe Ala Asp
    1100                1105                1110
Val Val Val Pro Ile Asn Ile Thr Met Lys Asn Thr Ile Ala Val
    1115                1120                1125
Gly Val Asp Pro Gln Glu Gly Lys Val Tyr Trp Ser Asp Ser Thr
    1130                1135                1140
Leu His Arg Ile Ser Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Gln His Glu
    1145                1150                1155
Asp Ile Ile Thr Thr Gly Leu Gln Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val
    1160                1165                1170
Asp Ala Ile Gly Arg Lys Val Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asn
    1175                1180                1185
Arg Ile Glu Val Gly Asn Leu Asp Gly Ser Met Arg Lys Val Leu
    1190                1195                1200
Val Trp Gln Asn Leu Asp Ser Pro Arg Ala Ile Val Leu Tyr His
    1205                1210                1215
Glu Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Asn Ala Lys
    1220                1225                1230
Leu Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser Asp Arg Ala Val Leu Ile
    1235                1240                1245
Asn Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Val Asp Lys Ala
    1250                1255                1260
Ser Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala His Thr Glu Arg Ile Glu
    1265                1270                1275
Ala Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg His Thr Leu Val Ser Pro
    1280                1285                1290
Val Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Asp Ser Tyr Ile Tyr
    1295                1300                1305
Trp Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile His Arg Ala Asp Lys Gly
    1310                1315                1320
Thr Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg Ser Asn Leu Pro Gly Leu
    1325                1330                1335
Met Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala Gln Pro Leu Gly Phe Asn
    1340                1345                1350
Lys Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Pro
    1355                1360                1365
Arg Pro Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys Pro Thr Gly Ile Gln Leu
    1370                1375                1380
Lys Gly Asp Gly Lys Thr Cys Asp Pro Ser Pro Glu Thr Tyr Leu
    1385                1390                1395
Leu Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr
    1400                1405                1410
Ser Asp His Thr Asp Val His Val Pro Val Pro Glu Leu Asn Asn
    1415                1420                1425
Val Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val Asp Gly Lys Val Tyr Tyr
    1430                1435                1440
Thr Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg Arg Ala Asp Leu Asn Gly
    1445                1450                1455
Ser Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg Gly Leu Lys Thr Thr Asp
    1460                1465                1470
Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp Thr Asp
    1475                1480                1485
Thr Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser Arg Leu Asp Gly Ser Cys
    1490                1495                1500
Arg Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile
    1505                1510                1515
Ala Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr Asp Trp Gly
    1520                1525                1530
His Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Glu Arg
    1535                1540                1545
Lys Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr
    1550                1555                1560
Leu Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr Trp Val Asp Ala His Leu
    1565                1570                1575
Asp Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Leu Arg Gln Val
    1580                1585                1590
Leu Val Gly His Val Ser His Pro Phe Ala Leu Thr Gln Gln Asp
    1595                1600                1605
Arg Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys Ser Ile Gln Arg
    1610                1615                1620
Val Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys Glu Thr Val Leu Ala Asn
    1625                1630                1635
Val Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val Val Ser Pro Gln Arg Gln
    1640                1645                1650
Thr Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn Asn Gly Gly Cys Thr His
    1655                1660                1665
Leu Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe Val Cys Ala Cys Pro Asp
    1670                1675                1680
Glu Pro Asp Ser Gln Pro Cys Ser Leu Val Pro Gly Leu Val Pro
    1685                1690                1695
Pro Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser Glu Lys Ser Pro Val Leu
    1700                1705                1710
Pro Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr Thr Arg Thr
    1715                1720                1725
Arg Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly Arg Cys Ser Glu Arg Asp
    1730                1735                1740
Ala Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser Asn Asp Ala Val Pro Ala
    1745                1750                1755
Ala Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    1760                1765                1770
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
    1775                1780                1785
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
    1790                1795                1800
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
    1805                1810                1815
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    1820                1825                1830
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
    1835                1840                1845
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
    1850                1855                1860
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    1865                1870                1875
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    1880                1885                1890
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
    1895                1900                1905
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
    1910                1915                1920
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    1925                1930                1935
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
    1940                1945                1950
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
    1955                1960                1965
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
    1970                1975                1980
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    1985                1990                1995

Claims (39)

1.治疗由硬化蛋白介导的或与硬化蛋白水平异常相关联的病理性病症的方法，包括施用包含硬化蛋白结合配偶体的调节剂的组合物，其中该硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一。
2.权利要求1的方法，其中所述调节剂是特异性结合所述硬化蛋白结合配偶体的试剂。
3.权利要求1或2的方法，其中所述调节剂是抑制硬化蛋白与所述硬化蛋白结合配偶体结合的试剂。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中如在基于细胞的测定法中测量，所述调节剂是调节Wnt信号转导途径的试剂。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述调节剂是抗体或包含所述抗体的抗原结合部分的功能性蛋白质。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述病理性病症是骨矿物质密度异常病症，例如骨质疏松症或硬化性狭窄。
7.权利要求1-5任一项的方法，其中所述病理性病症是癌症，例如，具有骨质溶解病变的多发性骨髓瘤。
8.鉴定能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂的方法，其中该硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一，该方法包括：
a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；
b)在所述测试剂存在和缺失的情况下，测量硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的相互作用，
其中(i)相对于测试剂缺失情况下的相互作用，在测试剂存在下硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的减小，(1)当结合的硬化蛋白结合配偶体降低硬化蛋白作用时将测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂，和(2)当结合的硬化蛋白结合配偶体提高硬化蛋白作用时将测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂，并且其中(ii)相对于测试剂缺失情况下的相互作用，在测试剂存在下硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的提高，(1)当结合的硬化蛋白结合配偶体降低硬化蛋白作用时将该测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂，和(2)当结合的硬化蛋白结合配偶体提高硬化蛋白作用时将该测试剂鉴定为硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂。
9.鉴定能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂的方法，其中该硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一，该方法包括：
a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；和
b)测量由硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号转导或酶学反应，
其中与缺失该测试剂时的反应相比，在存在该测试剂时反应的至少10％、20％或30％的改变表明该测试剂被鉴定为能够调节硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用。
10.权利要求9的方法，其中将wnt信号转导活性测量为信号应答。
11.通过权利要求6-10任一项的方法鉴定的硬化蛋白结合配偶体的调节剂，其中所述调节剂是抗体或包含所述抗体的抗原结合部分的功能性蛋白质或siRNA。
12.抗体或包含所述抗体的抗原结合部分的功能性蛋白质，其中所述抗体或功能性蛋白质特异结合硬化蛋白结合配偶体，所述硬化蛋白结合配偶体选自由多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4组成的组。
13.权利要求12的抗体或功能性蛋白质，其抑制硬化蛋白与所述硬化蛋白结合配偶体的结合。
14.权利要求12或13的抗体或功能性蛋白质，其中如基于细胞的测定法测量，所述抗体或功能性蛋白质调节Wnt信号途径。
15.权利要求12-14任一项的抗体或功能性蛋白质，其中所述硬化蛋白结合配偶体是LRP4。
17.权利要求12-14任一项的抗体或功能性蛋白质，其中所述硬化蛋白结合配偶体是ALPL。
18.根据权利要求11-17任一项的调节剂或抗体或功能性蛋白质，其用作药物。
19.根据权利要求11-18任一项的调节剂或抗体或功能性蛋白质，用于治疗骨矿物质密度异常病症。
20.根据权利要求19的调节剂或抗体或功能性蛋白质，其中所述骨矿物质密度异常病症是骨质疏松症或硬化性狭窄。
21.根据权利要求11-18任一项的调节剂或抗体或功能性蛋白质，用于治疗癌症。
22.根据权利要求21的调节剂或抗体或功能性蛋白质，其中所述癌症是骨髓瘤。
23.根据权利要求22的调节剂或抗体或功能性蛋白质，其中所述骨髓瘤是具有骨质溶解病变的多发性骨髓瘤。
24.能够减弱哺乳动物细胞中硬化蛋白结合配偶体的蛋白质表达的siRNA，所述硬化蛋白结合配偶体选自由多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4组成的组。
25.权利要求24的siRNA，其中所述硬化蛋白结合配偶体是LRP4。
26.权利要求24或25的siRNA，用作药物。
27.权利要求24或25的siRNA，用于治疗骨矿物质密度异常病症或癌症。
28.诊断受试者中骨矿物质密度异常病症或骨矿物质密度异常病症倾向的方法，其包括以下步骤：
a)测量所述受试者中硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用，和
b)将步骤a)的所述相互作用与健康个体的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用相比较，在受试者和健康个体之间观察到的相互作用的差异表明在所述受试者中的骨矿物质密度异常病症或其倾向，
其中所述硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一。
29.鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物具有与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用相同、类似或提高的功能效应，其中所述硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一，并且其中该方法包括：
a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下将硬化蛋白与候选模拟物相接触；和
b)测量模拟物与硬化蛋白的相互作用，
其中相互作用为对于本文所述多种硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体所观察到的相互作用的至少10％将该候选模拟物区分为本发明的硬化蛋白结合配偶体模拟物。
30.权利要求29的方法，其中通过硬化蛋白模拟物相互作用诱导的wnt信号应答测量所述相互作用。
31.可溶性多肽，其包含特异性结合硬化蛋白的硬化蛋白结合配偶体的片段，其中所述硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一。
32.权利要求31的可溶性多肽，其抑制硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的结合。
33.权利要求31或32的可溶性多肽，其包含LRP4的硬化蛋白结合片段。
33.权利要求32的可溶性多肽，其是由LRP4的细胞外部分组成的LRP4的片段，优选地由SEQ ID NO：3组成的多肽。
34.治疗骨矿物质密度异常病症的方法，其包括施用包含根据权利要求31-33任一项的可溶性多肽的组合物。
35.权利要求34的方法，其中所述骨矿物质密度异常病症是骨质疏松症。
36.权利要求34的方法，其中所述骨矿物质密度异常病症是硬化性狭窄。
37.诊断受试者中骨矿物质密度异常或硬化蛋白相关病症倾向的方法，其包括：
a)获得所述受试者中的硬化蛋白结合配偶体基因的核苷酸序列，和
b)将它与健康受试者的序列相比较，其中在各个硬化蛋白结合配偶体基因中的突变，表明存在硬化蛋白相关病症或其倾向，其中所述硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一。
38.诊断受试者中硬化蛋白相关病症或硬化蛋白相关病症倾向的方法，其包括以下步骤：
a)测量所述受试者中的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用，和
b)将步骤a)的所述相互作用与健康个体的硬化蛋白：硬化蛋白结合配偶体相互作用相比较，在受试者和健康个体之间观察到的相互作用的差异表明在所述受试者中存在硬化蛋白相关病症或其倾向，其中所述硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一。
39.诊断受试者中硬化蛋白相关病症或硬化蛋白相关病症倾向的方法，其包括：
a)获得所述受试者中的硬化蛋白结合配偶体基因的核苷酸序列，其中所述硬化蛋白结合配偶体是多功能蛋白聚糖(CSPG2)、FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、C6orf93、多配体聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、生腱蛋白C、TRIM26、TRIM41、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、IL-17受体、碱性磷酸酶(ALPL)和LRP4之一，
和
b)将它与健康个体的序列相比较，其中在各个硬化蛋白结合配偶体基因中的突变表明存在硬化蛋白相关病症或其倾向。
CN200880003181A 2007-02-02 2008-01-30 用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂 Pending CN101616684A (zh)

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