CN108264568A - 重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法 - Google Patents

重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108264568A
CN108264568A CN201711479646.2A CN201711479646A CN108264568A CN 108264568 A CN108264568 A CN 108264568A CN 201711479646 A CN201711479646 A CN 201711479646A CN 108264568 A CN108264568 A CN 108264568A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
seq
recombinant polypeptide
val
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711479646.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108264568B (zh
Inventor
孙大伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogend Therapeutics Co ltd
Original Assignee
Oseo Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Bo Sheng Medical Ltd By Share Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oseo Pharmaceutical Ltd By Share Ltd, Bo Sheng Medical Ltd By Share Ltd filed Critical Oseo Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Publication of CN108264568A publication Critical patent/CN108264568A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108264568B publication Critical patent/CN108264568B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种重组多肽、包含该重组多肽的同型二聚体和异型二聚体蛋白、编码该重组多肽的核酸分子，以及包含该核酸分子的载体及宿主细胞。本发明也提供包含该重组多肽的组合物，以及制备该重组多肽的方法。

Description

重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法
技术领域
本发明关于一种重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法，尤其是指一种具有诱发碱性磷酸酶活性能力的重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法。
背景技术
骨是一种高度刚性的组织，具有独特机械性质构成脊椎骨骼的一部分，该独特机械性质是衍生自其广泛的基质结构。动物终其一生中，骨组织会不断地更新。
骨生成及更新的过程由个别特化的细胞进行。成骨作用(osteogenesis，骨生成或骨成长)是由成骨细胞(osteoblasts，骨生成细胞)进行。骨再成型作用(Bone remodeling)是由称为破骨细胞(osteoclasts)的骨吸收细胞与骨生成的成骨细胞间相互作用所完成。由于这些过程是由特定的活细胞进行，所以化学(例如：药物和/或激素)、物理及物理化学的变化可影响骨组织的质量、数量及形状。
各种生长因子(例如：PDGF)及细胞介质会参与骨生成的过程。因此，辨识出可在预定位点诱发骨生成的生理可接受的化学介质(例如：激素、药物、生长因子及细胞介质)是相当有价值的。然而，为了成功地将化学介质作为治疗工具，需克服几个障碍。障碍之一包括开发具有骨诱发(osteoinductive)活性的重组多肽。例如：重组人类血小板衍生的生长因子-BB中的骨诱发活性尚未得到证实。另一障碍是在化学介质中骨诱发的变异性。例如：去矿物质骨基质(demineralized bone matrix，DBM)是一种化学介质，是一种衍生自加工骨的骨诱发同种异体移植物。市场上以DBM为基础的产品越来越多，但是在不同产品及同一产品不同批号之间已发现骨诱发的变异性。因此，需要一种化学介质展现一致的骨诱发活性，例如：重组多肽及相关组合物。
发明内容
本发明揭示一种重组多肽，其包含：一第一域(domain)，其是选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组；一第二域，其是选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组；及一第三域，其是选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组；其中该第二域包含一个分子内双硫键(intramolecular disulfide bond)。
于一实施方式中，该第二域包含在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间的一个分子内双硫键。
于一实施方式中，该重组多肽具有诱发碱性磷酸酶活性的能力。
于一实施方式中，该第三域包含：一第一氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中该第三域包含在该第一和该第二氨基酸序列之间的二个分子内双硫键。
于一实施方式中，该重组多肽包含：(1)在该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子内双硫键，且在该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子内双硫键；或(2)在该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子内双硫键，且在该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子内双硫键。
本发明也揭示一种重组多肽，其包含：一第一域(domain)，其是选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组；一第二域，其是选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组；及一第三域，其是选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组；其中该重组多肽包含一氨基酸序列，该氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348组成的群组。
本发明也揭示一种同型二聚体蛋白，其包含如上所述的二个相同的重组多肽。
于一实施方式中，其包含在该两个之其一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸和该另一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸之间的一个分子间双硫键。
于一实施方式中，每一该重组多肽的该第三域包含：一第一氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中该同型二聚体蛋白包含：在该两个之其一重组多肽的该第三域中的该第一氨基酸序列和该另一重组多肽的该第三域中的该第二氨基酸序列之间的二个分子间双硫键。
于一实施方式中，其包含：(a)在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子间双硫键，及在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子间双硫键；或(b)在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子间双硫键，及在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子间双硫键。
本发明也揭示一种异型二聚体蛋白，其包含如上所述的二个相异的重组多肽，其中该异型二聚体蛋白包含：在该二个相异重组多肽的该些第一域之间的一个分子间双硫键。
于一实施方式中，其包含在该两个之其一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸和该另一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸之间的一个分子间双硫键。
本发明也揭示一种经分离的核酸分子，其包含一编码如上的重组多肽的多核苷酸序列。
本发明也揭示一种重组核酸分子，其包含一表达控制区，可操作地连结至如上所述的经分离的核酸分子。
本发明也揭示一种经分离的宿主细胞，其包含如上所述的经分离的核酸分子或如上所述的重组核酸分子。
本发明也揭示一种制备一重组载体的方法，其包含将如上所述的经分离的核酸分子插入一载体内。
本发明也揭示一种制备一重组宿主细胞的方法，其包含将如上所述的经分离的核酸分子或如上所述的重组核酸分子导入至一宿主细胞内。
本发明也揭示一种制造一重组多肽的方法，其包含：培养如上所述的经分离的宿主细胞，以及分离该重组多肽。
本发明也揭示一种组合物，其包含如上所述的重组多肽、如上所述的同型二聚体蛋白或如上所述的异型二聚体蛋白。
附图说明
图1A和1B所示为实验组A至实验组G的母兔(NZW品系)尺骨的代表性X光影像。每个实验组中的尺骨包含一外科手术创造的20mm大的圆周缺陷(即缺损部位)。对于A组至F组，在该缺损部位中置入移植物。A组至E组每个尺骨接受一200mg的β-TCP植入物，A、B、C和D中的该β-TCP是分别作为重组多肽(即SEQ ID NO：260)的2、6、20和60μg载体。E组中该β-TCP不携带任何重组多肽。F组接受一髂骨碎片自体移植物。G组在该缺损部位未接受任何移植物。对A组至G组各组于0周(即手术后立即摄影，以“0W”表示)时，以及在手术后2、4、6及8周(即分别以“2W”、“4W”、“6W”及“8W”表示)时拍摄X光影像。该尺骨上的植入部位(A组至F组)或缺损部位(G组)位于每个影像中白色星号的正上方。
图2A及2B所示为实验组A组至G组的代表性计算机断层扫描(CT)影像。该植入部位(A组至F组)或缺损部位(G组)的中心随着时间的横断面影像变化显示为0周(即手术后立即摄影，以“0W”表示)，以及手术后4周及8周(即分别以“4W”和“8W”表示)。A组至G组如上述图1所述。
图3所示为未经手术改造无缺损的尺骨及实验A组至G组(即分别以“A”至“G”表示)的抗扭强度测试结果图示。最大扭矩为牛顿-公尺(Newton-meters)以“N-m”表示。A组至G组如上述图1部分所述。
具体实施方式
本发明提供重组多肽、包含该重组多肽的同型二聚体和异型二聚体蛋白、编码该重组多肽的核酸分子及载体，及表达该重组多肽的宿主细胞。本发明也提供该重组多肽的组合物及制造该重组多肽的方法。
本文引用的所有出版物的全部内容通过引用并入本文，包括但不限于本文引用的所有期刊文章，书籍，手册，专利申请和专利，其程度和范围如同具体地和个别地将各别出版物通过引用而并入。
[专门用语]
除非另有定义，本文中所有技术和科学用语与本发明所属领域中具有通常知识者所理解的含义相同。如在本申请中所使用的，以下术语具有如下含义。
除非上下文中另有指定外，本文及申请专利范围所述单数格式的“一”、“一个”、“一种”及“该”包含多个。因此，例如：“一域”是包含一个域或多个域、“该重组多肽”包含一个或多个重组多肽，诸如此类。本文中的用语例如：“一”、“该”、“一或多”、“多个”及“至少为一”可互相代换。
除非另有说明，本文所述的“或”表示“和/或”的意思。相似地，本文所述的“包含”、“包括”、“含有”、“囊括”、“具有”也可互相代换而不受限制。
除此之外，本文所述的“和/或”、“及/或”被用作特指表达两个特定特征或组合物的其一或全部。因此，用语“和/或”用于表达语句如“A和/或B”是包含“A和B”、“A或B”、“(单独)A”“(单独)B”的意思。相同的，用语“和/或”用于表达语句如“A、B和/或C”是包含如后所述的含义：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；(单独)A；(单独)B；(单独)C。
应当理解，本文用语“包含”无论在描述任何方面的情况下，也提供相似用语“由…组成”和/或“基本上由…组成”所描述的意思。
“氨基酸”是一种具有一与氢原子连结的中心碳原子(α-碳原子)、一羧酸基(该碳原子在本文中称为“羧酸碳原子”)、一氨基(该氮原子在本文中称为“氨基氮原子”)以及一侧链R基团的结构的分子。当并入肽、多肽或蛋白质时，氨基酸会在脱水反应中失去其氨基酸羧酸基上的一或多个原子将一个氨基酸与另一个氨基氨基酸连结。因此，当并入蛋白质时，将氨基酸称为“氨基酸残基”。
“蛋白质」或“多肽”是指通过肽键连结二或多个单个氨基酸的任何聚合物(无论是否为自然发生)，并且发生当与一氨基酸(或氨基酸残基)上的α-碳原子键结的羧酸基上的羧酸碳原子对于与一邻近氨基酸上非α-碳原子键结的氨基的氨基氮原子变为共价键。所述的“蛋白质”是包含“多肽”和“肽”的含义(内文用语会互相代换)。除此之外，蛋白质包含多个多肽次单元(如：DNA聚合酶III、RNA聚合酶II)或其他组成物(如：RNA分子、也会在端粒酶中发生)在本文中也被理解为“蛋白质”的意思。相似地，蛋白质和多肽的碎片也在本文揭示涉及的“蛋白质”范畴。一方面，本文揭示的多肽包含二或多个亲代肽段的嵌合体。用语“多肽”也涉及和包含多肽转译后修饰(Post-translation modification,PTM)的产物，包含但不限于双硫键生成、醣化、胺甲酰化、脂化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/阻断基团衍生、分解蛋白切割、被非天然氨基酸修饰、或任何其他调控或修饰，例如与标记组合物接合。多肽可衍生自天然生物源或通过基因重组科技产生。其不需从特定核酸序列转译，亦可经由任何方法包括化学合成的方式生成。“经分离”的多肽或片段、变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定程度的纯化。例如：经分离多肽可以是简单的从其天生或天然环境移除。为了本公开之用，在宿主细胞中表达的重组制造多肽及蛋白质被认为是经过分离的，视同天然或重组多肽已经被经由任何适当技术分离、分级、部分或大体上的纯化。
本文所述的“域”可被用语“肽段”代换，其是涉及蛋白质或者是较大的多肽或蛋白质的碎片。域不需具有本身的机能活性，在一些例子中，域可具有其自身的生物活性。
一给定蛋白质的特定氨基酸序列(即当从氨基末端到羧酸基末端写入时该多肽的“主要结构”)是由mRNA编码部分的核苷酸序列所确定，其是依次由遗传讯息来指明，通常是基因体DNA(包括胞器DNA如线粒体或叶绿体DNA)。因此，确定基因的序列有助于预测对应多肽的主要序列，更具体而言是经由该基因或多核苷酸序列的编码预测多肽或蛋白质的作用或活性。
本文所述的“N端”是指多肽中相对于多肽上氨基末端的氨基酸、域或肽段的方位或位置。例如：“A域位于B域和C域的N端”是指A域是位于相较于B域和C域更靠近氨基末端的位置，如此，当B和C域的位置未特别指定时，该多肽从氨基末端的域排列顺序则可理解为A-B-C或A-C-B。此外，包含零的任何数量氨基酸可存在于N端的域到另一域之间。相似地，包含零的任何数量氨基酸可存在于多肽的N端及一域其是多肽中其它域N端两者之间。
本文所述的“C端”是指多肽中相对于多肽上羧酸基末端的氨基酸、域或肽段的方位或位置。例如：“A域位于B和C域的C端”是指A域是位于相较于B域和C域更靠近羧酸基末端的位置，如此，当B域和C域的位置未特别指定时，该多肽从氨基末端的域排列顺序可理解为B-C-A或C-B-A。此外，包含零的任何数量氨基酸可存在于C端的域到另一域之间。相似地，包含零的任何数量氨基酸可存在于多肽的C端及一域其是多肽中其它域C端两者之间。
当指二或多个域广义地涉及重组多肽形成中以任何化学或物理方法将该二或多个域结合(coupling)时，用语“融合”、“操作性连结”及“操作性结合”在本文中可互相代换。于一实施例中，本文所揭示的重组多肽是一嵌合体多肽其包含来自二或多个相异多肽的多个域。
包含本文所揭示的二或多个域的重组多肽可以由包含编码每个域的多核苷酸序列的单个编码序列所编码。除非另有说明，编码每个域的多核苷酸序列为“in frame(框架内)”，如此包含该多核苷酸序列的单一mRNA的转译会使单一多肽包含每个域。一般而言，本文所述重组多肽中的域会直接彼此融合或被肽连结子(peptide linker)所连结。编码肽链接子的各种多核苷酸序列是本领域已知的。
本文所述的“多核苷酸”或“核酸”是指聚合形式的核苷酸。在一些情况下，多核苷酸包含一序列，该序列要不是非直接紧邻编码序列就是直接紧邻(在5’终端或3’终端上)，其是从有机体天然存在的基因体中所衍生的编码序列。因此，该用语包含例如：被并入载体中的重组DNA、被并入自主复制的质体或病毒中的重组DNA或被并入原核或真核的基因体中的重组DNA，或者是独立于其他序列如同分离分子(如cDNA)般存在的重组DNA。本文所述的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或该核苷酸之一的修饰型。本文所述的多核苷酸尤其是指单股及双股DNA、单股及双股区域的混合DNA、单股及双股RNA、单股及双股区域的混合RNA或包含DNA和RNA的杂交分子，杂交分子中含有的DNA及RNA可以是单股、更为典型的双股或单、双股区域混合。多核苷酸包含基因体DNA或RNA(取决于生物体，即病毒的RNA基因体)及被该基因体DNA编码的mRNA，以及cDNA。于某些实施例中，多核苷酸包含传统磷酸二酯键或非传统键(如：酰胺键，在肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)中发现)。“经分离”核酸或多核苷酸是指从其天然环境中移出的核酸分子如：DNA或RNA。例如为了本公开之用，核酸分子包含多核苷酸编码载体中含有的重组多肽被认为是“经分离”。经分离的多核苷酸的其他示例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中从其他多核苷酸纯化(一部分或大部分上)的重组多核苷酸。经分离的RNA分子包含本发明揭示的多核苷酸的体内(in vivo)或体外(in vitro)RNA转录物。根据本发明揭示的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的多核苷酸和核酸(如：核酸分子)。
本文所述的“编码区”或“编码序列”是多核苷酸的一部分，其由可转译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)一般不会被转译成氨基酸，但其可被认为是编码区的一部分，但任何毗邻序列如：启动子、核糖体结合位、转录终止子、内含子等并非编码区的一部分。编码区的边界通常由所得多肽的编码氨基末端即位于5’端的起始密码子，及所得多肽编码羧酸基末端即位于3’端的转译终止密码子所决定，但本发明不限于此。
本文所述的“表达控制区”是指转录控制单元，其可操作地与编码区结合，以引导或控制由编码区编码的产物表达，包括如：启动子、强化子、操纵子、抑制子、核糖体结合位、转译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位、效应子结合位、茎环结构及转录终止讯号。例如：若启动子功能的诱导导致包含编码产物的编码区的mRNA转录，则编码区和启动子是“可操作地结合”，且如果启动子和编码区间的连接性质并非干扰启动子引导由编码区编码的产物表达的能力，或是干扰DNA模板被转录的能力。表达控制区包含位于编码区上游(5’非编码序列)内部或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其会影响相关联编码区的转录、RNA加工、稳定性或转译。如果编码区用于真核细胞中的表达，多腺苷酸化讯号及转录终止序列通常位于编码序列3’端。
“核苷酸片段”、“寡核苷酸片段”或“多核苷酸片段”是指一较大多核苷酸分子的一部分。多核苷酸片段不需对应至蛋白质的经编码的功能域，然而在某些情况下，该片段将编码蛋白质的功能域。多核苷酸片段的长度可为大约6个或更多的核苷酸(例如：6-20、20-50、50-100、100-200、200-300、300-400个或更多核苷酸的长度)。
本文所述的“载体”是指将核苷酸分子转殖和/或转移到宿主细胞中的任何媒介物。用语“载体”包括包括病毒及非病毒载体，用以导入核酸至一体外、离体或体内细胞中(如质体、噬菌体、黏接质体、病毒)。
本文所述的“宿主细胞”及“细胞”用语可相互代换，其是指任何类型携带或能够携带核酸分子(如：重组核酸分子)的细胞或细胞群体，如：初级细胞、培养是统中的细胞或来自细胞株的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或是真核细胞，例如：真菌细胞如酵母菌细胞、各种动物细胞如昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本文所述的“培养(Culture、to culture、culturing)”是指允许细胞生长、分裂或维持细胞处于存活状态的体外条件下孵育细胞。“经培养细胞”是指经体外繁殖的细胞。
本文所述的“骨诱发性(Osteoinductive)”是指可诱导骨和/或软骨的形成或生长，包括例如：诱发与骨和/或软骨生成或生长相关的标记(如：诱发碱性磷酸酶活性)。
本文所述的“酵母双杂交试验”或“酵母双杂交系统”用语可被相互代换，其是指用以检测蛋白质对之间的交互作用的试验或系统。在典型的双杂交筛选试验/系统中，转录因子分裂为两个独立的片段分别为结合域(binding domain，BD)和活化域(activationdomain，AD)，该些片段各别提供于独立的质体上，且该些片段各别与感兴趣的蛋白质融合。该酵母双杂交试验系统包含(1)一“诱饵”载体，其包括一诱饵蛋白质及系统中所用该转录因子的结合域；(2)一“猎物”载体，其包括一猎物蛋白质(或一裂物蛋白质数据库被筛选用以与该诱饵蛋白质进行交互作用)及该转录因子的活化域；及(3)一合适的报导酵母菌株，其含有结合序列用以于系统中使用该转录因子的该结合域。当诱饵-猎物发生交互作用时，该转录因子的该活化域驱动一或多种报导蛋白质的表达。将该诱饵和该猎物载体导入该报导酵母菌株，其中经表达的诱饵和猎物蛋白质可能相互作用。或者，可将各自含有诱饵载体或猎物载体的独立单倍体酵母菌株配对，而所得到的二倍体酵母菌株表达两种蛋白质。相互作用的诱饵及猎物蛋白质对会导致该转录因子的重组和活化，然后结合于该报导酵母菌株中所提供与其兼容的活化域，依次触发该报导基因的表达，接着被侦测。
[重组多肽及组合物]
本文揭示一种重组多肽，包含任二个或多个选自由SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355所组成的群组的域，包含但不限于如表3所示二个域的任何组合。于一实施例中，重组多肽包含任意三个域，包含但不限于如表3所示三个域的任何组合。
本文所述的重组多肽的任一域可位于相对该重组多肽的氨基末端或羧酸基末端的任何位置。例如：本文所述的重组多肽的任一域可位于该重组多肽中任一个或多个其他域的N端。相似地，本文所述的重组多肽的任一域可位于该重组多肽中任一个或多个其他域的C端。
本文揭示一种重组多肽包含任二个或多个选自由SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355所组成的群组的域，其具有相较于在该重组多肽中任何个别域更高的活化素受体IIB蛋白质(即ActRIIBecd)细胞外域的亲和力。已知ActRIIBecd的核酸序列及多肽序列，以及天然存在的变异，例如：ActRIIBecd可为本文所述的SEQ ID NO：9，其对应本文所述的SEQ ID NO：8的27-117残基。亲和力可通过如：放射性免疫测定法(RIA)、表面电浆子共振(如：BIAcoreTM)或本领域已知的任何其他结合分析来测量。于一些实施例中，此般重组多肽包含二个域的组合，该域的组合选自如下：SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：57及SEQ ID NO：47，其中该二个域中的任一个是位于另一域的N端或C端。于一些实施例中，此般二个域的组合产生一包含选自由如后所述序列的群组所组成的重组多肽：SEQ IDNO：188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248及254。于一些实施例中，此般重组多肽包含三个域的组合，该域的组合选自如下：SEQ ID NO：39、49及61；SEQ ID NO：35、47及57；SEQ ID NO：39、47及61；SEQ ID NO：35、49及57；SEQ ID NO：39、57及47；SEQ ID NO：35、61及49，其中任一域是位于另一或另二个域的N端或C端。于一些实施例中，此般三个域的组合产生一包含选自如后所述序列的群组所组成的重组多肽：SEQ ID NO：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及348。
本文揭示一种重组多肽包含一SEQ ID NO：39的第一域、一SEQ ID NO：49的第二域及一SEQ ID NO：61的第三域，其中该第一域是位于该第二域的C端，该第三域位于该第二域的N端，或其组合。于某些实施例中，该重组多肽包含第一域是选自由SEQ ID NO：35及SEQID NO：39所组成的群组、第二域是选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组、第三域是选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组，其中该第一域是位于该第二域的C端，该第三域是位于该第二域的N端，或当该第一、第二及第三域分别为SEQ ID NO：39、49及61时其的组合。
于某些实施例中，本文所述的重组多肽包含一转译后修饰(PTM)，包含但不限于双硫键形成、醣苷化、胺甲酰化、脂化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/阻断基团衍生、分解蛋白切割、通过非天然存在氨基酸修饰，或任何其他操作或修饰，例如：与标记成分接合。
于某些实施例中，重组多肽可包含一或多个半胱胺酸，其在生理条件下或任何其他标准条件(纯化条件或储存条件)下能够参与一或多个双硫键的生成。于某些实施例中，双硫键是在重组多肽中的两个半光胺酸残基间所形成的分子内双硫键。于某些实施例中，双硫键是在二聚体中两个重组多肽之间形成的分子间双硫键。在某些实施例中，分子间双硫键是在如本文所述的两个相同重组多肽之间所形成，其中该两个相同的重组多肽形成一同型二聚体。于某些实施例中，同型二聚体包括至少一个或多于三个分子间双硫键。于某些实施例中，分子间双硫键是在如本文所述的两个相异重组多肽之间所形成，其中该两个相异重组多肽形成一异型二聚体。在某些实施例中，异型二聚体包括至少一个或多于三个分子间双硫键。
本文揭示一种重组多肽包含一第一域，其是选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组；一第二域，其是选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组；以及一第三域，其是选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组；其中该重组多肽包含一个分子内双硫键。
于某些实施例中，该第一域、该第二域、该第三域或其组合包含一个分子内双硫键。于某些实施例中，一个或多个分子内双硫键位于单一域之内、一域和另一域之间、具有多于两个半胱胺酸的一个域和一个或多个另一域之间或其组合。于某些实施例中，该第一域包含一个双硫键。于某些实施例中，该第二域包含一个双硫键。于某些实施例中，该第三域包含一个双硫键。于某些实施例中，每一个域包含一个双硫键。本文所述的“域包含一个双硫键”当涉及分子内双硫键时，如果在一个域中存在多于一个半胱胺酸则是指单一域中两个半胱胺酸之间的双硫键，或是在两个的其中一域中的半胱胺酸和另一域中的半胱胺酸之间。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽的该第二域包含在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间的一个分子内双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第一域和该第三域之间、该第三域内或两者皆是，进一步包含一个或多个附加的分子内双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第三域的第9个氨基酸和该第三域的第43氨基酸之间、在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第41氨基酸之间、在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第43氨基酸之间或在该第三域的第9氨基酸和该第三域的第41个氨基酸之间，进一步包含一个分子内双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第三域的第9氨基酸和该第三域的第43的氨基酸之间进一步包含一个双硫键，以及在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第41氨基酸之间包含一个双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第43的氨基酸之间进一步包含一个双硫键，以及在该第三域的第9氨基酸和该第三域的第41氨基酸之间包含一个双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽的该第三域包含一第一氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中该第三域在该第一和第二氨基酸序列之间包含两个分子内双硫键或两个分子间双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含一个第一分子内或分子间双硫键，以及在该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含一个第二分子内或分子间双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含一个第一分子内或分子间双硫键，以及在该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含一个第二分子内或分子间双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间进一步包含一个分子内双硫键。
本文揭示一种重组多肽，其包含一氨基酸序列，该氨基酸序列是选自由SEQ IDNO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340和SEQ IDNO：348所组成的群组，其中该重组多肽包含一个分子内双硫键。于某些实施例中，该分子内双硫键包含从该重组多肽的氨基末端编号的半胱胺酸15、半胱胺酸44、半胱胺酸48、半胱胺酸79、半胱胺酸80、半胱胺酸112、半胱胺酸114及其组合的一个或多个双硫键。于某些实施例中，该分子内双硫键包含半胱胺酸44、半胱胺酸48或两者皆含。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽在从该重组多肽的氨基末端编号的半胱胺酸44和半胱胺酸48之间包含一分子内双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在半胱胺酸79和半胱胺酸112之间、半胱胺酸80和半胱胺酸114之间、半胱胺酸80和半胱胺酸112之间或半胱胺酸79和半胱胺酸114之间进一步包含一分子内或一分子间双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在半胱胺酸79和半胱胺酸112之间进一步包含一分子内或一分子间双硫键，以及在半胱胺酸80和半胱胺酸114之间进一步包含一分子内或一分子间双硫键。于某些实施例中，该重组多肽在半胱胺酸80和半胱胺酸112之间进一步包含一分子内或一分子间双硫键，以及在半胱胺酸79和半胱胺酸114之间进一步包含一分子内或一分子间双硫键。
本文揭示一种同型二聚体蛋白，其包含如本文所述的二个相同的重组多肽。
本文揭示一种异型二聚体蛋白，其包含如本文所述的二个相异的重组多肽。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白，其在该二个重组多肽的该些第一域之间、该二个重组多肽的该些第二域之间、该二个重组多肽的该些第三域之间、该二个重组多肽的该第一域和该第二域之间、该二个重组多肽的该第一域和该第三域之间、该二个重组多肽的该第二域和该第三域之间或其组合包含一个或多个分子间双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体或异型二聚体蛋白，其在该二个之其一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸和该另一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间、在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间、在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间或在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间进一步包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白进一步在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白进一步在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一双硫键。
于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在从该重组多肽的氨基末端编号的该二个之其一重组多肽的半胱胺酸15和该另一重组多肽的半胱胺酸15之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白进一步在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间、在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间、在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间或该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白进一步在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间包含一分子间双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白进一步在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间包含一分子间双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间包含一分子间双硫键。
于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间、在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间、在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间或在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一双硫键。
于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在从该重组多肽的氨基末端编号的该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间、该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间、该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间、该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间包含一分子间双硫键，以及该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间包含一分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸80和该另一重组多肽的半胱胺酸112之间包含一分子间双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的半胱胺酸79和该另一重组多肽的半胱胺酸114之间包含一分子间双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体或异型二聚体蛋白的每一该重组多肽的该第三域包含一第一氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)及一第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，其中该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第三域中的第一氨基酸序列和该另一重组多肽的该第三域中的第二氨基酸序列之间包含二个分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含一第一分子间双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含一第二分子间双硫键。于某些实施例中，该同型二聚体或异型二聚体蛋白在该二个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含一第一分子间双硫键，以及在该二个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含一第二分子间双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽包含如本文所述的任一个或多个该分子内双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽的该第二域包含一分子内双硫键。于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸包含一分子内双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽在从该重组多肽的氨基末端编号的半胱胺酸44和半胱胺酸48之间包含一分子内双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的同型二聚体蛋白包含二个重组多肽，其中每一个多肽包含相同序列，其中该序列是选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ IDNO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348所组成的群组。于一些实施例中，该重组多肽包含如本文所述的相同分子内双硫键。于一些实施例中，该重组多肽包含如本文所述的相异分子内双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的相异二聚体蛋白包含二个相异重组多肽，其中每一个多肽包含相异序列，该序列选自由如后所述所组成的群组：SEQ ID NO：260、SEQ IDNO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348。于某些实施例中，该相异二聚体蛋白中的该二个之其一重组多肽包含序列SEQ ID NO：260，而该另一重组多肽包含一序列其选自由如后所述所组成的群组：SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ IDNO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348。于一些实施例中，该重组多肽包含如本文所述的相同分子内双硫键。于一些实施例中，该重组多肽包含如本文所述的相异分子内双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白在如表4或5中所列的半胱胺酸对之间包含该一个或多个双硫键。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白包含骨诱发活性。可以常规用于测量此类活性的任何条件状况下量测骨诱发活性(即“骨诱发条件”)。
例如：C2C12细胞是来自营养不良小鼠肌肉的鼠类的肌纤维母细胞品系。将C2C12细胞暴露于具有骨诱发活性的多肽可将C2C12细胞从肌肉转移到骨的分化，例如：通过诱发骨相关蛋白如碱性磷酸酶的表达为特征的成骨细胞形成。碱性磷酸酶是一种广泛接受的骨标记，且检测碱性磷酸酶活性的测定被认为可用以表现骨诱发活性。参见如：Peel等人(2003年公开于J.Craniofacial Surg.14：284-291)、Hu等人(2004年公开于GrowthFactors 22：29033)及Kim等人(2004年公开于J.Biol.Chem.279：50773-50780)的研究。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体或异型二聚体蛋白具有诱发碱性磷酸酶活性的能力。
于某些实施例中，骨诱发活性可利用医学影像技术或骨样本的组织学检验来进行检测，或是任何其他用以检测骨生成或成长的常规检验方法。于某些实施例中，上述检测包括放射摄影影像，例如：X光影像。于某些实施例中，上述检测包括计算机断层摄影(CT)扫描。于一些实施例中，上述检测包括分子影像或核影像(即，正电子发射断层摄影术(PET))。于某些实施例中，上述检测包括组织学检验。于某些实施例中，上述检测包括苏木素-伊红(HE)染色法。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白可包含但不限于片段、变体或其衍生物分子。当涉及多肽时，用语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包含保留参考多肽的至少一些性质或生物活性的任何多肽。多肽片段可包含分解蛋白片段、缺失片段及当植入动物中时更容易到达作用位点的片段。多肽片段可包含变体区域，包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有经改变氨基酸序列的多肽。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。本文揭示的多肽片段可包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。变体多肽在本文中也可称为“多肽类似物”。本文揭示的多肽片段也可包括衍生分子。本文所用多肽或多肽片段的“衍生物”是指一主体多肽，其具有一个或多个由官能侧基团的反应以化学性衍生的残基。“衍生物”也包括该些多肽其含有一个或多个20个标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物。例如：4-羟脯胺酸可被取代以作为脯胺酸；5-羟离胺酸可被取代以作为离胺酸；3-甲基组胺酸可被取代以作为组胺酸；高丝胺酸可被取代以作为丝胺酸；及鸟胺酸可被取代以作为离胺酸。
于某些实施例中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白包含一标记。于某些实施例中，该标记是一种可催化基质化合物或组成物的化学改变酵素标记、放射性标记、荧光团、发色团、成像剂或金属包括金属离子。
于某些实施例中，本文所述的重组多肽包括一个或多个保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是一种具有相似侧链的相异氨基酸残基的氨基酸取代。本领域已定义具有相似氨基酸侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(如：离胺酸、精胺酸、组胺酸)、酸性侧链(天冬胺酸、麸胺酸)、不带电极性侧链(甘胺酸、天冬酰胺、麸酰胺酸、丝胺酸、苏胺酸、酪胺酸、半胱氨酸)、非极性侧链(丙胺酸、缬胺酸、白胺酸、异白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支链侧链(苏胺酸、缬胺酸、异白胺酸)及芳香族侧链(酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、组胺酸)。因此，若多肽中的氨基酸被来自同一侧链家族的另一氨基酸替换，则认为该取代是保守的。于另一实施例中，一氨基酸链可被以差异在于顺序和/或侧链家族成员组成的结构上相似氨基酸链保守的替换。
于某些实施例中，本文揭示的重组多肽通过如本文所述的核酸分子或载体所编码，或是通过如本文所述的宿主细胞所表达。
[核酸分子、载体及宿主细胞]
本文揭示是针对一种经分离的核酸分子，其包含一编码如本文所述的任一重组多肽的多核苷酸序列。
于某些实施例中，该经分离的核酸分子包含任二个或多个编码如本文所述的域的多核苷酸序列。于某些实施例中，该经分离的核酸分子包含任二个或多个多核苷酸序列，该多核苷酸序列是选自由SEQ ID NO：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76及78所组成的群组，其编码如本文所述的域分别对应SEQ IDNO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355。于某些实施例中，该经分离核酸分子包含二个或三个多核苷酸序列的任何组合，该些多核苷酸序列编码本文表3中所示的二个或三个域的对应组合。
于某些实施例中，该经分离的核苷酸分子包含多核苷酸序列是选自由SEQ ID NO：115、157、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、267、275、283、291、299、307、315、323、331、339及347所组成的群组，其编码如本文所述的重组多肽分别对应SEQ ID NO：116、158、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及348。
于某些实施例中，多核苷酸序列经密码子优化(codon-optimized)。
本文揭示是针对一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含一表达控制区可操作的连结至如本文所述的经分离的核酸分子。于某些实施例中，该表达控制区是启动子、增强子、操纵子、抑制子、核糖体结合位、转译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位、效应子结合位、茎环结构、转录终止讯号或其组合。于某些实施例中，该表达控制区是一启动子。表达控制区可以是转录控制区和/或转译控制区。
本发明所属技术领域已知各种转录控制区。该些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于：来自巨细胞病毒的启动子及增强子片段(迅早期启动子，与内含子-A连接)、猴病毒40(早期启动子)、反转录病毒(如劳斯肉瘤病毒)。其他转录控制区包括那些衍生自脊椎动物基因如：肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素及兔β-球蛋白，以及在真核细胞中能控制基因表达的其他序列。另外，适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴介质诱导型启动子(如：干扰素或介白素可诱导的启动子)。
类似地，本发明所属技术领域已知各种转译控制控制单元。该些转译控制控制单元包括但不限于：核糖体结合位、转译起始与终止密码子，以及衍生自微小核醣核酸病毒的单元(特别是内部核糖体进入位(internal ribosome entry site，IRES)，也称为CITE序列)。
于某些实施例中，该重组核酸分子是一种重组载体。
载体可以是将核酸转殖和/或转移至宿主细胞内的任何媒介。本领域已知和已使用大量载体，包括例如：质体、噬菌体、黏接质体、染色体、病毒、经修饰的真核病毒、经修饰的细菌病毒。将多核苷酸插入至合适的载体可以通过将适当的多核苷酸片段连接至具有互补的黏合端的所选载体中来完成。
可以将载体设计成编码选择性标记或报导者，该选择性标记或报导者提供用来选择或辨识已并入该载体的细胞。选择性标记或报导者的表达允许宿主细胞辨识和/或选择，该宿主细胞是并入且表达该载体上所含的其他编码区。本领域已知及已使用的选择性标记基因包括例如：对于胺芐青霉素、链霉素、健他霉素、康霉素、潮霉素、新霉素、嘌霉素、双丙胺磷除草剂(bialaphos herbicide)、磺酰胺及其类似物提供抗性的基因，以及使用作为表型标记的基因，即花青素调节基因、异戊烯基转移酶基因及其类似物。本领域已知及已使用的报导者包括例如：荧光素酶(Luc)、绿荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基移转酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄醣醛酸酶(Gus)及其类似物。选择性标记也可当作报导者。
用语“质体”是指通常带有基因的染色体外单元，该基因并非细胞中心代谢的一部分，且通常是环状双股DNA分子形式。此般单元可以是衍生自任何来源自主复制序列(ARS)、基因体整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性、环状或超旋扭的单股或双股DNA或RNA，其中已有许多核苷酸序列被连接或重组成独特构造，该构造能够为了所选基因产物将启动子片段和DNA序列连同适当3’端未转译序列一起导入细胞中。
可以使用的真核病毒载体包括但不限于：腺病毒载体、反转录病毒载体、腺相关病毒载体及痘病毒，如牛痘病毒载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。非病毒载体包括质体、脂质体、带电性脂质(细胞增生素)、DNA-蛋白质复合物及生物聚合物。哺乳动物表达载体可包含非转录单元如：复制起点、与待表达基因连结的合适启动子和增强子，以及其他5’端或3’端毗邻非转录序列及5’端或3’端非转译序列，如必需的核糖体结合位、多腺苷酸化位、剪接供给者与接受者位及转录终止序列。
该重组载体可以是一种“重组表达载体”，其是指任何核酸构造，该核酸构造含有用以转录和转译已插入的编码序列的必须单元，或是在RNA病毒载体的情况下，当导入至适当宿主细胞时用以复制和转译的必须单元。
本文揭示针对一种制备一重组载体的方法，其包含将如本文所述的经分离的核酸分子插入至一载体内。
本文揭示针对一种经分离的宿主细胞，其包含如本文所述的经分离的核酸分子或重组核酸分子。于某些实施例中，该经分离的宿主细胞包含如本文所述的重组载体。
核酸分子可以通过本领域已知的方法导入至宿主细胞中，例如：转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)，基因枪的使用或DNA载体转运蛋白。
本文揭示针对一种制备重组宿主细胞的方法，其包含将如本文所述的经分离的核酸分子或重组核酸分子导入至一宿主细胞内。于某些实施例中，该方法包含将如本文所述的重组载体导入至一宿主细胞内。
如本文所述的宿主细胞可表达如本文所述的任何经分离的核酸分子或重组核酸分子。关于在宿主细胞中核酸分子的表达所使用的术语“表达/表现”是指通过基因引起生物化学的过程，例如：RNA或多肽。该过程包括细胞内所具有该基因的功能出现的任何具体呈现，包括但不限于：瞬态表达或稳定表达。其包括但不限于将该基因转录成传讯RNA(mRNA)以及将该mRNA转译成多肽。
宿主细胞包括但不限于原核生物或真核生物。适当宿主细胞的代表性实例包括：细菌细胞、真菌细胞如酵母菌、昆虫细胞及经分离的动物细胞。细菌细胞可包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如：大肠杆菌(Escherichia coli)。或者，也可使用乳酸杆菌(Lactobacillus)属物种或芽孢杆菌(Bacillus)属物种作为宿主细胞。真核细胞可以包括但不限于已建立的哺乳动物来源细胞品系。合适的哺乳动物细胞品系包括例如：COS-7、L、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa及BHK细胞品系。
该宿主细胞可以在适合如本文所述的用以活化启动子、选择转化体或扩增核酸分子的经适当修饰的常规营养培养基中进行培养。该培养的条件如温度、pH等，可以是当使用选择用以表达的宿主细胞时已知使用或经常规修饰的任何条件，并且对于本发明所属技术领域中具有普通知识者是显而易见地。
本文揭示一种制造一重组多肽的方法，其包含：培养如本文所述的经分离的宿主细胞，以及从该宿主细胞分离该重组多肽。从经培养的宿主细胞分离多肽的技术，可以选择用以表达的宿主细胞分离多肽时已知使用或经常规修饰的任何技术，并且对于本发明所属技术领域中具有普通知识者是显而易见地。
[组合物]
本文揭示一种组合物，其包含如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白。
于某些实施例中，该组合物进一步包含生理可接受载体、赋形剂或稳定剂。参见如1990年美国宾州伊士顿的麦克出版社(Mack Publishing Co.,Easton,PA)出版的雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)。可接受载体、赋形剂或稳定剂可包含对受试者无毒的物质。于某些实施例中，该组合物或该组合物中一个或多个成分是无菌的。无菌成分可使用如过滤(如通过无菌过滤膜)或放射线照射(如通过γ-射线照射)来制备。
于某些实施例中，如本文所述的组合物进一步包含骨或骨碎片的同种异体移植物或自体移植物。
于某些实施例中，如本文所述的组合物进一步包含骨移植替代物。
于某些实施例中，该骨移植替代物是一种生物陶瓷(bioceramic)材料。用语“生物陶瓷材料”及“生物陶瓷”于本文中可相互代换。于某些实施例中，该生物陶瓷在体内是可生物相容的且可再吸收的。于某些实施例中，该生物陶瓷是任何基于以磷酸钙盐类为基础的生物陶瓷。于某些实施例中，该生物陶瓷是选自由磷酸三钙(TCP)、α-磷酸三钙(α-TCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、双相磷酸钙(BCT)、氢氧磷灰石、硫酸钙及碳酸钙所组成的群组。于某些实施例中，该生物陶瓷是β-磷酸三钙(β-TCP)。
于某些实施例中，该骨移植替代物是一种生物活性玻璃(bioactive glass)。于某些实施例中，该生物活性玻璃包含二氧化硅(SiO2)、氧化钠(Na2O)、氧化钙(CaO)或氧化铂(Pt2O5)。
以下实施例是用以说明而非限制本发明。
[实施例]
[实施例1]-质体建构
为了建构质体pQE-80L-Kana，利用BspHI(BioLab公司)从pET-24a(+)(Novagen公司)切割康霉素抗性基因，以产生875-bp康霉素抗性基因(+3886到+4760)片段(SEQ ID NO：1)。用BspHI切割pQE-80L(凯杰公司)载体以去除胺芐青霉素抗性基因(+3587到+4699)片段(SEQ ID NO：2)，然后将该康霉素抗性基因片段连接到该pQE-80L载体中以生成4513-bp质体(pQE-80L-Kana)。(SEQ ID NO：3)。
[实施例2]-酵母双杂合(two-hybrid)筛选
A.诱饵质体建构
使用市售系统(媒合双杂合系统2；美国加州帕洛阿尔托的CLONTECH公司)进行酵母双杂合筛选。为了建构诱饵质体，用具有pCRII/ActRIIB的聚合酶连锁反应(polymerasechain reaction，PCR)(1994年Hilden等人公开于Blood83(8):2163-70的研究)生产IIB型活化素受体(ActRIIB)蛋白的细胞外域(+103到+375bp)(SEQ ID NO：4)的编码区以作为模板。设计用于扩增ActRIIB该细胞外域(ActRIIBecd)的引子(XmaI：5'-CCCGGGACGGGAGTGCATCTACAACG-3'(SEQ ID NO：5)；SalI：5'-GTCGACTTATGGCAAATGAGTGAAGCGTTC-3'(SEQ ID NO：6))使其在5’末端分别包含一个XmaI和SalI限制位。使用模板DNA 10ng、每个引子0.2μM、每个dNTP 0.2mM、1X PCR缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、pH 8.3、50mM氯化钾(KCl)及1.5mM氯化镁(MgCl2))以及pfuDNA聚合酶(劲因科技有限公司)1.25U，在总体积50μl下进行PCR。进行PCR 30次循环：在95℃下变性30秒，接着在45℃下黏合1分钟，在68℃下延伸5分钟。以XmaI-SalI切割该PCR产物，然后在框架内经次转殖(subcloned)到在pAS2-1载体(CLONTECH公司GenBank登入号：U30497)中GAL4的DNA-结合域中相同的限制位，以产生质体pAS-ActRIIBecd。
已知ActRIIB的核酸序列和多肽序列以及天然存在的变体。例如野生型ActRIIB核酸序列为SEQ ID NO：7。对应的多肽序列为SEQ ID NO：8。ActRIIB的细胞外域(ActRIIBecd)为SEQ ID NO：9，其对应SEQ ID NO：8的残基21-117，且由核酸序列SEQ ID NO：4编码。
B.pACT2/MC3T3cDNA数据库建构
为了建构pACT2/MC3T3cDNA数据库，由Tu Q.等人(2003年公开于J Bone MinerRes.18(10):1825-33)所揭示大约7×106转殖的小鼠MC3T3-E1成骨细胞cDNA数据库，并进行一些修饰以容许cDNA数据库插入小于1.5kb，该数据库建构到pACT2载体(CLONTECH公司GenBank登入号：U29899)中，其中在S1核酸酶处理后(英杰生命科技公司cDNA合成系统CAT.编号18267-013)，在pACT2载体中转殖该双股cDNA，其经SmaI切割以表达具有GAL4活化域的融合蛋白。接着根据制造商(美国加州帕洛阿尔托的CLONTECH公司)的方案，以“HIS3Jump-Start”程序筛选pACT2/MC3T3cDNA数据库。于另一实施例中，该pACT2cDNA数据库是由市售产品获得。
C.酵母菌株选择
首先以诱饵质体转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y190细胞(美国加州帕洛阿尔托的CLONTECH公司，MATa、ura3-52、his3-D200、lys2-801、ade2-101、trp1-901、leu2-3、112、gal4D、gal80D、URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ、cyhr2、LYS2::GALUAS-HIS3TATA-HIS3)，并在不含色胺酸的合成葡萄糖培养基(SD-Trp)上进行筛选。随后以pACT2/MC3T3cDNA数据库转化在该SD-Trp培养基上生长的转化体，并在不含色胺酸和白胺酸的培养基(SD-Trp-Leu)上进行筛选。于不含色胺酸、白胺酸及组胺酸(SD-Trp-Leu-His)并具有30mM的3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole)的培养基上(美国密苏里州圣路易，西格玛奥瑞奇公司)收集并再培养该诱饵与数据库共转化后的转殖体，以抑制Y190细胞的渗漏生长。进一步测定在此步骤中所选的转殖体其β-半乳糖苷酶活性。经过30℃培养3天后，将培养皿拍照摄影。至少进行了三次独立实验，并有相似结果。从个别阳性转殖体纯化该pACT2数据库质体，并在大肠杆菌中进行扩增。用珀金埃尔默ABI自动DNA定序仪定序插入阳性转殖体中的该cDNA，如表1所示(引子5'-AATACCACTACAATGGAT-3'(SEQ ID NO：10))。
表1
[实施例3]-易误(Error-prone)随机诱变PCR
A.从质体设计引子的诱变
将来自实施例2的阳性转殖体的DNA序列诱发突变。
于一实施例中，经定序的阳性转殖体被次转殖到pQE-80L-Kana中，接着进行随机诱变PCR。用于扩增阳性转殖体DNA序列如表1所示的引子，经设计在其5’末端包含一个MseI或BamHI限制位。该PCR条件如实施例2所述。该PCR产物以MseI-BamHI进行切割，接着在框架内经次转殖到该pQE-80L-Kana载体中的相同限制位。在Leung等人(1989年公开于Technique,1,11-15)揭示的易误PCR基础下，经些微修饰，将随机诱变导入至该经次转殖的pQE-80L-Kana质体内。使用线性化pQE-80L-Kana(经XhoI切割)作为模板DNA。用于使诱变PCR扩增的引子(MseI：5'-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAA(SEQ ID NO：29)；BamHI：5'-CCGGGGTACCGAGCTCGCATGCGGATCCTTA(SEQ ID NO：30))，经设计在其5’末端分别包含一个MseI或BamHI限制位。使用模板DNA10ng、每个引子40pM、每个dNTP 0.2mM、1X PCR缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl及1.5mM MgCl2)、氯化锰(MnCl2)0.2-0.3mM、二甲亚砜1％及Taq DNA聚合酶1.25U(美国加州卡尔斯巴德的英杰公司)，在总体积50μl下进行诱变PCR。诱变PCR进行30次循环：在94℃下变性30秒，接着在55℃下黏合2分钟，在72℃下延伸3分钟。用MseI和BamHI切割该PCR产物。这个片段与经MseI和BamHI切割的pQE-80L-Kana的4.5-kb片段连接。以所得的pQE-80L-Kana衍生物转化大肠杆菌BL 21(Novagen公司)。菌落在LTB-琼脂培养基(LB补充有1％v/v甘油三丁酸酯、0.1％v/v土温乳化剂-80、100mg/L的康霉素、0.01μM的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷及1.5％琼脂)的培养皿中于37℃环境下生长。
B.表1引子的诱变
于另一实施例中，基于先前Lenug所揭示的易误PCR并经一些修改，将随机诱变导入至来自该阳性转殖体的该pACT2数据库质体中。使用该线性化pACT2(经XbaI切割)作为模板DNA。使用具有如表1所示MseI和BamHI限制位的合成寡核苷酸作为诱变PCR扩增反应的引子。使用模板DNA 10ng、每个引子40pM、每个dNTP 0.2mM、1X PCR缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl及1.5mM MgCl2)、MnCl2 0.2-0.3mM、二甲亚砜1％及Taq DNA聚合酶1.25U(美国加州卡尔斯巴德，英杰公司)，在总体积50μl下进行诱变PCR。诱变PCR进行30次循环：在94℃下变性30秒，接着在55℃下黏合1.5分钟，在72℃下延伸4分钟。用MseI和BamHI切割该PCR产物。将此片段与经MseI和BamHI切割的pQE-80L-Kana的4.5-kb片段连接。以所得的pQE-80L-Kana衍生物转化大肠杆菌BL 21(Novagen公司)。菌落在LTB-琼脂培养基(LB补充有1％v/v甘油三丁酸酯、0.1％v/v土温乳化剂-80、100mg/L的康霉素、0.01μM的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷及1.5％琼脂)的培养皿中于37℃环境下生长。
[实施例4]-ActRIIBecd相关多肽的表达
使用如实施例3所述经稳定转化的大肠杆菌细胞，以表达来自实施例2的该诱变DNA的与ActRIIBecd交互作用的多肽(即“域”)。
A.转化体发酵
于一实施例中，将具有pQE-80L-Kana衍生物的大肠杆菌BL21转化体在含有康霉素25-32μg/mL的65mL培养基(10g/L BBL植物蛋白胨、5g/L Bacto酵母萃取物、10g/L NaCl)于500mL锥形瓶中，在30℃至37℃下，以180±20rpm搅拌，进行隔夜培养(约10小时)。将前述隔夜培养物37-420mL加至3.7-42L的TB培养基(BBL植物蛋白胨18g、Bacto酵母萃取物36g、磷酸二氢钾(KH2PO4)18.81g、甘油6mL，于1L水中)中，该培养基于5-50L发酵槽中含有23.8-38.5μg/mL的康霉素及1-3mmol/L的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并且将温度控制在37℃至42℃范围内，以260-450rpm搅拌该培养基10-24小时。在GSA旋转器(索福公司)中，经8,000rpm离心10分钟后，在冰水浴中收集该细胞。
于另一实施例中，将1L的LB液状培养基(具有100mg/L康霉素)与新鲜长成的菌落(具有pQE-80L-Kana衍生物的大肠杆菌BL21转化体)或10mL的新鲜长成的培养物接菌，并在37℃下孵育直到OD600达0.4-0.8。通过加入40或400μM的IPTG在37℃下经3至5小时，以诱发该多肽表达。经离心后(约8,000rpm)，于4℃下收集细胞。
B.回收与纯化来自大肠杆菌的多肽
如先前实施例4A所述，发酵大肠杆菌BL21/pQE-80L-Kana衍生物细胞。于一实施例中，在4℃下将来自那些衍生物的多肽进行细胞破碎和回收。将约18g的湿细胞悬浮于60mL的0.1M的TRIS/HCl、10mM EDTA(乙二胺四醋酸)、1mM PMSF(苯基甲烷磺酰氟)、pH 8.3(破碎缓冲液)之中。根据制造商的说明书，该些细胞通过法式细胞破碎器(Frenchpress，SLM仪器公司)2次，并用破碎缓冲液将体积调整至200mL。将悬浮液在15,000g下离心20分钟。将所获得的沉淀物悬浮于含有1M氯化钠(NaCl)的100mL破碎缓冲液中，并如上所述离心10分钟。将沉淀物悬浮于含有1％Triton X-100(Pierce公司)的100mL破碎缓冲液中，并再次如上所述离心10分钟。然后将冲洗下来的沉淀物悬浮于50mL的Tris/HCl、1mM EDTA、1mM PMSF、1％DTT(二硫苏糖醇)中，并在铁氟龙(Teflon)组织研磨机中均质化。所得的悬浮液中含有不可溶型态的粗多肽(crude polypeptide)。
将根据前述实施例所获得的10mL多肽悬浮液以10％醋酸酸化至pH 2.5，并使用Eppendorf离心机在室温下离心10分钟。上清液在10％醋酸流速1.4mL/min下，使用Sephacryl S-100型管柱(法玛西亚公司，2.6×78cm)进行层析。合并在适当时间区间冲提出的含多肽的层析馏分。使用此材料用于再折迭以得到生物活性多肽或是用于进一步纯化。
将来自前述实施例的5mg多肽溶解于140mL的50mM的Tris/HCl、pH 8.0、1M的NaCl、5mM的EDTA、2mM的还原型麸胱甘肽、1mM的氧化型麸胱甘肽和33mM的Chaps生化试剂(Calbiochem公司)中。在4℃下经72小时后，将上述溶液的酸碱值以盐酸(HCl)调整至pH2.5，并将前述混合物在Amicon超滤杯(stirred cell)中以YM 10薄膜(美国麻州丹佛斯，Amicon公司)进行超滤10倍浓缩。将前述经浓缩的溶液以10mM的HCl稀释至原始体积，并再经同样方法浓缩至最终体积为10mL。所形成的沉淀物以5000g离心30分钟移除。在非还原状态下，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)判断含有双硫连结的多肽的前述上清液。使用表面电浆共振式生物分子传感器(BIAcoreTM)量测前述制剂的生物活性(实施例5)。
将来自前述实施例中的该浓缩溶液以1mL/min流速施加到Mono S HR 5/5型管柱(法玛西亚公司)，该管柱经85％缓冲液A(20mM醋酸钠、30％异丙醇，pH 4.0)及15％缓冲液B(含有1M氯化钠的缓冲液A)的混合物平衡。然后以相同流速冲洗该管柱，保持上述缓冲液混合物的组成恒定直到280nm吸亮度读值达基线水平，接着在平衡状态下开始注射线性梯度超过20分钟，最后以50％缓冲液A/50％缓冲液B的混合物结束。生物活性多肽在梯度开始后约9分钟被冲提，并将其收集。利用生物活性测定及非还原条件下的SDS-PAGE判断。
于另一实施例中，该多肽经由实施例4所收集细胞的包涵体制备。在室温下隔夜萃取(50mM的醋酸钠、pH 5、8M的尿素、14mM的2-巯基乙醇)，并对水彻底透析后，该多肽再折迭、浓缩，并通过Sephacryl S-100HR型管柱(法玛西亚公司)以1％的醋酸或5mM的HCL在流速1.8mL/min下浓化。最后以蛋白质层析仪(FPLC，Fractogel EMD SO3-650、50mM的醋酸钠、pH 5、30％的2-丙醇)纯化并以从0至1.5M的NaCl梯度冲提。合并在适当时间区间冲提出的含多肽馏分。对水彻底透析后，该多肽经冷冻/干燥后储存于-20℃。以SDS-PAGE分析该多肽的纯度，接着以考马斯亮蓝R染色。
于另一实施例中，将衍生自例如上述实施例4A的每1克的细胞颗粒再悬浮于10-20mL的10mM的TRIS/HCl、150mM的NaCl、1mM的EDTA、5mM的DTT、pH 8.0(破碎缓冲液)中，并以音波处理使细胞爆破，该音波处理是使用具有1号增幅器(Enhance Booster#1)探针的Misonix S4000仪器在30A(仪器刻度)上使用5分钟。可选择性地通过离心(18,000×g经20分钟或15,000×g经30分钟)澄清前述细胞裂解混合物，并将沉淀物以含有1v/v％TritonX-100的10-20mL破碎缓冲液冲洗数次，并如上述离心10分钟。将细胞裂解物以含有6M尿素的100-200mL破碎缓冲液溶解，并如上述离心10分钟，保留含有该多肽的上清液以进一步纯化。
将前述上清液溶解于再折迭缓冲液(100mL的Tris/HCl pH 8.0、500mM的精胺酸-HCl、5mM的EDTA、25mM的Chaps、2mM的氧化型麸胱甘肽和1mM的还原型麸胱甘肽)中。在室温经4-7天后，该多肽以FPLC(Fractogel EMD SO3-650、20mM醋酸钠、pH 4-5、30％2-丙醇和25mM Chaps)纯化并以从0至3M的NaCl梯度冲提。合并在适当时间区间冲提出的含多肽馏分。以SDS-PAGE分析该多肽的纯度，接着以考马斯亮蓝R染色。
于某些实施例中，本文揭示的异型二聚体可以通过如先前在实施例3所述在瞬态表达系统中共表达(co-expression)来制备，且可以从该培养基分离出该异型二聚体以实施例5的测定进行筛选。
[实施例5]-体外BIAcoreTM测定
生物传感器实验。于一实施例中，在BIAcoreTM T100/T200型仪器(PharmaciaBiosensor AB公司)的多信道模式(串流路径涉及细胞流动室1+2+3+4)下进行实验。流速为10μl/min，温度为25℃，并以2.5点/秒记录数据。利用氨基偶联法将所有四个片段的传感器芯片CM5涂覆链亲和素(streptavidin，西格玛公司)至密度2000pg/mm2(2000共振单位)。将ActRIIBecd(10mg)和胺-PEG3-生物素(amine-PEG3-Biotin，10mg，美国伊利诺伊州罗克福德，Pierce公司)溶于200μl的水中，并加入10mg的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)以制备生物素化的ActRIIBecd。将反应混合物于70℃下加热24小时，之后再进一步加入10mg的NaCNBH3，接着将该反应物于70℃下再加热24小时。冷却至室温后，该混合物以旋转管柱(3,000截留分子量(MWCO))脱盐。收集生物素化的ActRIIBecd，经冷冻干燥后用于链亲和素(SA)芯片制备。然后将氨基生物素化的ActRIIBecd在流速为5μL/min下独立地固定在细胞流动室2-4上10分钟，并在10mM醋酸钠中浓度为20μM，pH 4.0，密度为50-250共振单位(RU)。将储存的该多肽溶解于甘胺酸缓冲液(2.5g的甘胺酸、0.5g的蔗糖、370mg的L-麸胺酸盐、10mg的氯化钠和10mg的土温乳化剂-80，于100mL水中，pH 4.5)中以制备10mg/mL溶液，接着用先前的甘胺酸缓冲液稀释以制备成各种浓度的分析物。在分析物(如先前所述的ActRIIBecd相关多肽(即，域))流动期间记录感应图谱，首先通过细胞流动室1(对照)，接着通过细胞流动室2(生物素化的ActRIIBecd)。将细胞流动室2获得的感应图谱减去细胞流动室1获得的感应图谱。通过仪器提供的程序(Pharmacia Biosensor AB公司，1995年软件手册，BIA评估2.1)，评估在1、11、3.33、10、30和90nM分析物上获得的感应图谱的平衡结合、结合速率和解离速率。分析物和牛血清白蛋白(BSA，阴性对照)列于表2中。使用如前所述的珀金埃尔默ABI自动DNA定序仪进行与分析物相关转殖体中该pQE-80L-Kana衍生物的定序(引子5'-CTCGAGAAATCATAAAAAAT TTATTTG-3'(SEQ ID NO：31))，该pQE-80L-Kana衍生物具有相较于白蛋白更高的亲和力常数。
表2
NB：结合(Binding)低于侦测极限(KD>1mM)
[实施例6]-重组多肽的制造
为了确定是否可以增强亲和力常数，使用Atanassov等人(2009年公开于PlantMethods 5:14)所揭示的PCR融合(PCR-Fusion)方法经一些修改，将表2中的个别域彼此融合以制造重组多肽。使用Phusion DNA聚合酶(芬兰，Finnzymes公司)和标准热循环仪进行PCR融合。以BP Clonase II和LR Clonase II酵素混合物(英杰公司)进行通路重组反应(Gateway recombination reactions)。胜任大肠杆菌DH5α细胞是根据Nojima等人揭示内容(1990年公开于Gene 96(1)：23-28)制备。使用公司的Spin Miniprep试剂盒和公司的胶体萃取和PCR纯化试剂盒(德国，凯杰公司)纯化质体DNA和PCR片段。
所得重组多肽的DNA模板、PCR引子和DNA/多肽序列如表3所示。PCR融合涉及来自质体模板的二个或三个平行PCR扩增。在来自该些平行反应的胶体经纯化PCR片段上，进行通过单个重迭延伸扩增片段的PCR融合。根据Phusion DNA聚合酶指引(NewEnglandBiolabs公司：PhusionTM高保真度(HF)DNA聚合酶手册)在本稿中对于所有PCR扩增用于反应混合及条件的循环参数皆相同。质体模板的黏合温度为55℃。
对于融合二个PCR片段，使用30μl重迭延伸反应，其包含：16μl的该二个PCR片段混合物(通常每个8μl，约200-800ng，DNA)、6μl的5×Phusion HF缓冲液、3μl的2mM dNTP混合物、0.3μl的PhusionTM DNA聚合酶(2U/μl)。在重迭延伸混合物中不加入引子。当融合三个DNA片段时，使用18μl该PCR混合物(通常每个6μl)。一般而言，使用等体积的经纯化PCR片段不会检查精确的DNA浓度。若该经扩增PCR片段的莫耳比看起来明显不同(例如：在琼脂糖电泳后估计DNA带强度超过5-7倍)，来自纯化过的PCR片段体积则应对应调整。上述反应混合物在98℃培养30秒、60℃培养1分钟、72℃培养7分钟。使用PCR纯化试剂盒纯化该重迭延伸反应后所获得的DNA。如前所述，PCR产物经切割并结合于pQE-80L-Kana载体中用以蛋白质/多肽表达。利用先前讨论过的BIAcoreTM T100/T200型(GE Healthcare公司)监测经纯化的蛋白质/多肽对于ActRIIBecd的亲和力，并使用实施例5中BIA评估软件版本4.1(GEHealthcare公司)进行数据分析。
表3
NB：结合(Binding)低于侦测极限(KD>1mM)
数据显示，与来自每一单个转殖体的个别多肽相比，来自如后述的二个转殖体组合所形成的重组多肽，其亲和力常数(KD)较低：转殖体编号10可操作地连接转殖体编号15(SEQ ID NO：188)、转殖体编号15可操作地连接转殖体编号10(SEQ ID NO：194)、转殖体编号15可操作地连接转殖体编号21(SEQ ID NO：200)、转殖体编号21可操作地连接转殖体编号15(SEQ ID NO：206)、转殖体编号21可操作地连接转殖体编号10(SEQ ID NO：212)、转殖体编号10可操作地连接转殖体编号21(SEQ ID NO：218)、转殖体编号8可操作地连接转殖体编号14(SEQ ID NO：224)、转殖体编号14可操作性地连接转殖体编号8(SEQ ID NO：230)、转殖体编号19可操作地连接转殖体编号8(SEQ ID NO：236)、转殖体编号8可操作地连接转殖体编号19(SEQ ID NO：242)、转殖体编号19可操作性地连接转殖体编号14连接(SEQ ID NO：248)及转殖体编号14可操作地连接转殖体编号19(SEQ ID NO：254)。换言之，来自所述组合所形成的该重组多肽相对于来自转殖体编号8(SEQ ID NO：35)、转殖体编号10(SEQ ID NO：39)、转殖体编号14(SEQ ID NO：47)、转殖体编号15(SEQ ID NO：49)、转殖体编号19(SEQ IDNO：57)及转殖体编号21(SEQ ID NO：61)的每个转殖体的各别多肽，具有对ActRIIBecd更高的亲和力。
除此之外，来自三个转殖体的组合而制成重组多肽，该转殖体是使用：转殖体编号8(SEQ ID NO：35)、转殖体编号10(SEQ ID NO：39)、转殖体编号14(SEQ ID NO：47)、转殖体编号15(SEQ ID NO：49)、转殖体编号19(SEQ ID NO：57)及转殖体编号21(SEQ ID NO：61)。令人意外的，与来自各别转殖体的多肽或来自二个转殖体组合的多肽相比，来自如后述的三个转殖体组合所形成的重组多肽的KD较低，该转殖体为：转殖体编号10可操作地连接转殖体编号15及21(SEQ ID NO：260)、转殖体编号15可操作地连接转殖体编号10及21(SEQ IDNO：268)、转殖体编号21可操作地连接转殖体编号15及10(SEQ ID NO：276)、转殖体编号21可操作地连接转殖体编号10及15(SEQ ID NO：284)、转殖体编号8可操作地连接转殖体编号14及19(SEQ ID NO：292)、转殖体编号14可操作地连接转殖体编号8及19(SEQ ID NO：300)、转殖体编号19可操作地连接转殖体编号8及14(SEQ ID NO：308)、转殖体编号19可操作地连接转殖体编号14及8(SEQ ID NO：316)、转殖体编号10可操作地连接转殖体编号14及21(SEQID NO：324)、转殖体编号8可操作地连接转殖体编号15及19(SEQ ID NO：332)、转殖体编号10可操作地连接转殖体编号19及14(SEQ ID NO：340)及转殖体编号8可操作地连接转殖体编号21及15(SEQ ID NO：348)。
[实施例7]-转译后修饰
研究关于转译后修饰(PTM)对于该重组多肽KD值的影响。PTM的一实施例是双硫键连接。表4所示为双硫键位置和结合亲和力之间关系的数据，结果显示PTM会影响该重组多肽对ActRIIBecd的结合亲和力。该PTM测定是根据以下实验进行。
A.酵素切割和二甲基标记
如实施例4和6制备多肽。标准蛋白购自西格玛公司(美国密苏里州圣路易斯)。可选择性地使用pH 6含有5mM的N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM，西格玛公司)的100mM醋酸钠(美国纽泽西州非力普堡，J.T.Baker公司)在室温下阻断游离半胱胺酸30分钟。酵素切割直接于醋酸钠中在37℃下以1：50胰蛋白酶(美国威斯康星州麦迪逊，劲因公司)进行。在二甲基标记之前，将蛋白质切割物使用100mM的醋酸钠(pH 5)进行三倍稀释。
于某些实施例中，如实施例4和6制备的重组多肽以50mM三乙基碳酸氢铵(Triethylammonium bicarbonate，TEABC，T7408，西格玛奥瑞奇公司)缓冲液(pH 7)稀释，并分装于二个试管用以不同酵素切割。首先，加入NEM(N-乙基顺丁烯二酰亚胺，E3876，西格玛奥瑞奇公司)至最终浓度5mM以阻断游离半胱胺酸。烷基化反应在室温下进行30分钟。经NEM烷基化后，该两个试管的其一于37℃下加入胰蛋白酶(V5111，劲因公司)(1：65)18小时，随后在37℃下以Glu-C(P8100S，New England BioLabs公司)(1：50)进行隔夜切割。另一试管则于37℃下加入Glu-C(1：50)18小时，随后在37℃下以胰凝乳蛋白酶(1：50)进行隔夜切割。
为进行二甲基标记，于50μL的蛋白质切割物中加入2.5μL的4％(w/v)甲醛-H2(J.T.Baker公司)或2.5μL的4％(w/v)甲醛-D2(奥瑞奇公司)，接着加入2.5μL的600mM氰基硼氢化钠(西格玛公司)，上述反应在pH 5-6进行30分钟。
B.质谱分析
使用配有CapLC系统(美国麻州密尔福，沃特斯公司)的电洒式四极棒-飞行时间(ESI Q-TOF)利用毛细管柱(台湾，志圣工业股份有限公司，内径75μm、长度10cm)进行测量扫描(MS，m/z 400-1600；MS/MS，m/z 50-2000)。将该经烷基化及二甲基化标记的蛋白质切割物进行液相层析串联式质谱(LC-MS/MS)分析，其在含有0.1％甲酸的乙腈线性梯度5％至50％中45分钟。
于某些实施例中，上述经切割及标记的蛋白质切割物以高分辨质谱(Q-ExactivePlus MS)连接快速液相层析(Ultimate 3000RSLC)系统进行分析。使用C18管柱(AcclaimPepMap RSLC,75μm x 150mm,2μm,)进行液相层析(LC)分离，其使用的梯度如下：
时间(min) A％ B％ 流速(μL/min)
0 99 1 0.25
6 99 1 0.25
45 70 30 0.25
48 40 60 0.25
50 20 80 0.25
60 20 80 0.25
65 99 1 0.25
70 99 1 0.25
移动相A：0.1％甲酸
移动相B：95％乙腈/0.1％甲酸
以m/z 300-2000范围进行全MS扫描，并将MS扫描中10个最强的离子用于串联式质谱(MS/MS)光谱碎片分析。
C.资料分析
使用MassLynx 4.0从原始数据产生峰值列表(减去30％，3/2Savitzky Golay平滑法，中央三通道80％质心)。可以用相对高地减法以消除背景噪声。真正的a1离子通常显示为主波峰，以使其可保留于峰值列表中。
D.逆相层析
在具有二元帮浦的安捷伦1100型高效液相层析系统(Agilent 1100HPLC)装备有UV侦测器和自动进样器。将蛋白质注入75℃操作下的Zorbax 300SB C8管柱(150±2.1mm，5μm，)。流速为0.5ml/min。移动相A为含有0.1％三氟乙酸的水。移动相B为70％异丙醇、20％乙腈，以及0.1％三氟乙酸水溶液。样品在10％B的负载条件下注入，并在2分钟内增加至19％B。在两分钟时开始1.1％B/min的线性冲提梯度，并在24分钟时结束。然后使用95％B冲洗该管柱5分钟。将该管柱于负载条件下5分钟以重新平衡。此方法能够部份分离区别双硫键异构物。
表4
a)分子内双硫键连接。
b)分子间双硫键连结以二聚合。
如表4所示，不同半胱胺酸位置间的双硫键会影响亲和力常数(KD)的值。除此之外，数据也显示，二聚体中两个重组多肽间的双硫键会显著降低KD值。换言之，二聚合作用可能有助于重组多肽的二聚体和该ActRIIBecd间体外的分子交互作用。
观察到一些重组多肽自发性形成如表4所示的二聚体蛋白。所有该二聚体蛋白可经由如实施例4B所述的凝胶过滤将其从重组多肽中分离纯化。于此实施例中，该二聚体蛋白是同型二聚体蛋白，因为其单体相同。于其它实施例中，若如实施例4中所述的经稳定转化的大肠杆菌细胞由选自SEQ ID No：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340和348所组成的群组的两个相异重组多肽共表达，则该二聚体蛋白可以是异型二聚体蛋白。
[实施例8]-碱性磷酸酶生物活性测定
使用已公开的C2C12细胞中碱性磷酸酶诱发检验法，研究该重组多肽与细胞受体结合以及诱发讯号传导途径的能力。参见如：Peel等人(2003年公开于J CraniofacialSurg.14:284-291)及Hu等人(2004年公开于Growth Factors22:29033)的研究。
在合流之前将C2C12细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯，ATCC登录号CRL-1772)继代，并再悬浮于补充有10％经热灭活的胎生牛血清的DMEM中1×105cells/mL。将96孔组织培养板(康宁公司，Cat#3595)的每孔植入100μL细胞悬浮液。加入连续稀释标准品及测试样本的等分试样，并将培养物保持于37℃和5％的CO2环境中。测试样本包括经限制的培养基、经纯化的重组多肽以及作为阳性对照的市售经纯化的重组人类BMP-2“rhBMP-2”(美国明尼亚波利斯，R&D Systems公司)。rhBMP-2已显示在骨及软骨发展上扮演重要角色，例如：Mundy GR等人(2004年公开于Growth Factors.22(4)：233–41)的研究。阴性对照培养物(培养基不加入样本或rhBMP-2)经培养2至7天。培养基每两日更换一次。
收获培养物时以生理食盐水润洗(0.90％的NaCl，pH 7.4)，并将润洗后的食盐水丢弃。在该些培养物中加入50μL萃取溶液(Takara Bio公司，catalogue#MK301)，然后在室温下超音波处理10分钟。溶菌液的碱性磷酸酶(ALP)的检测，是通过如Peel等人(2003年公开于J Craniofacial Surg.14:284-291)所揭示监测碱性缓冲液(美国密苏里州圣路易，西格玛奥瑞奇公司，catalog P5899)中硝基酚磷酸酯的水解作用，或是根据制造商的说明书使用TRACP&ALP检测试剂盒(Takara Bio公司，catalogue#MK301)。通过记录405nm吸亮度测定ALP活性。经重复样本的平均ALP活性计算活性评分。使用4参数曲线拟合法(4-parametercurve fit)对连续稀释样本及其相对活性评分作图以计算各个重组多肽的EC50浓度。数据显示如表5。于一些实施例中，使用考马斯亮蓝(布拉德福)蛋白质检测法(Coomasie(Bradford)Protein Assay，Pierce生物科技股份有限公司，catalogue#23200)将每个孔中细胞蛋白质含量的该ALP活性进行标准化。通过将每个孔的该ALP活性除以每个孔的蛋白质含量以计算每个样本该经标准化的ALP活性。
于另一实施例中。进行由Katagiri,T.等人(1990年公开于Biochem.Biophys.Res.Cornrnun.172,295-299)所揭示的碱性磷酸酶检测。将来自C3H10T1/2品系的小鼠纤维母细胞培养于加上10％胎生小牛血清的BME-Earle培养基，将1mL的1x 105cells/mL等分试样置于24孔培养板中，维持37℃和10％CO2环境下24小时。移除上清液后，加入带有各种浓度样本的1mL新鲜培养基。在进一步培养4天后，将细胞溶解于0.2mL缓冲液(0.1M的甘油、pH9.6、1％的NP-40、1mM的MgCl2、1mM的ZnCl2)中，碱性磷酸酶活性在50μL等分试样溶胞液中测定，该溶胞液是经过使用pH 9.6缓冲液作为基质，以0.3mM对硝基酚磷酸酯150μL处理。在37℃下培养20分钟后记录405nm的吸亮度。该活性是与每个样本中的蛋白质含量(BCA蛋白质检测法，Pierce化学公司)有关。
表5
NA：尚未分析。
a)分子内双硫键连接。
b)分子间双硫键连结以二聚合。
如表5所示，具有某些双硫连结的大多数重组多肽，其EC50值较rhBMP-2的EC50值为低。换言之，具有某些双硫连结的大多数重组多肽能够诱发骨或软骨生成或成骨作用相关的讯号传导路径。
[实施例9]-体内骨诱发活性
在兔子的尺骨轴缺损中，针对根据实施例6(即SEQ ID NO：260，包括分子内双硫键C44-C48)的两个重组多肽的同型二聚体蛋白的骨诱发活性以及多孔β-磷酸三钙(β-TCP)作为载体材料进行评估。
在40只雌兔(NZW品系，日本SLC股份有限公司)上，以外科手术暴露左和右的尺骨轴制造圆周20mm大的缺损。简言之，使用氯胺酮盐酸盐(商品名Ketalar，第一三共股份有限公司)及甲苯噻嗪(xylazine，商品名Selactar 2％注射液，拜耳医药有限公司)以3：1的组合进行复合麻醉。在长时间的手术中使用相同溶液作为额外麻醉。手术前，将氟霉宁(Flumarin学名flomoxef sodium，塩野义制药股份有限公司)作为抗生素皮下给药。前臂一般区域的毛使用电动剃刀将其刮除，并使用希必定酒精(Hibitane，葡萄糖酸氯己定-乙醇溶液，大日本住友制药股份有限公司)进行消毒。在尺骨的每个肢的后内侧部位制造一纵向切口。将肌肉组织抬起以暴露该尺骨。使用手术刀从该暴露尺骨的手部关节25mm处制造一标记。使用15mm直径的钻头在该标记处纵向及垂直钻孔，密切注意不造成该骨断裂。使用骨剪将该骨分割。在距离近端方向20mm处也制造一标记，并以相似方式分割。当分割时，该尺骨覆盖骨膜，接着将该骨膜移除，并用盐水彻底清洁该骨碎片。
如下表6所示，根据A组至G组之其一，对每个尺骨植入或不植入植入物。A组至D组的尺骨植入由β-TCP携带特定剂量同型二聚体蛋白的单一植入物。E组的尺骨植入仅β-TCP的单一植入物，没有任何同型二聚体蛋白。F组的尺骨植入骨自体移植的单一植入物。G组的尺骨则没有植入物。之后，迅速缝合肌肉及真皮组织。
表6
A组至E组中所使用的β-TCP为1-3mm的颗粒型式，其孔隙率为75％，孔径为50-350μm(日本，SuperporeTM公司，pentax陶瓷人工骨系列，“HOYA”人工骨替代物)。
于某些实施例中，A组E组中所使用的β-TCP为1-3mm的颗粒型式，其孔隙率为70％或以上，孔径为300-600μm(台湾微创医疗器材公司，“台微医”康骨益人工骨替代物)。
A组至D组中包含重组多肽(即SEQ ID NO：260)的同型二聚体蛋白是在每只动物植入前立即使用0.5mM盐酸(以注射剂(大冢制药公司)进行标准溶液稀释)从冷冻批次准备。对于单侧植入设定流体体积为180μl，并在已灭菌培养皿中200mg的β-TCP颗粒上均匀滴加。当流体完全滴落，以刮勺轻轻搅拌该β-TCP颗粒，在室温下静置超过15分钟，接着进行植入。
关于F组，自体移植骨是利用骨剪从左翼或右翼的胯骨获得。将骨加工成碎片，且植入的骨量与A组至E组的量相同。
A.X光评估
拍摄侧面及前面的X光影像(即，放射线照片)，分别为植入后立即拍摄以及每两周拍摄一次直至植入后8周。使用该放射线照片评估植入部位的状况及骨生成的程度。每一组代表性实施例的X光影像如图1A(A组至D组)及图1B(E组至G组)所示。
在2周时，在所有组别中可以清楚地看到受植床其移植材料的颗粒和边界的对比。在4周时，在该同型二聚体蛋白组(即A组至D组)中的TCP颗粒变的不明显，显示出该颗粒的吸收及骨生成的进度。在具有高剂量同型二聚体蛋白的C组和D组的部分样本中，该植入部位和该受植床之间的边界变的不明显。在6周时，B组中该植入部位和该受植床之间的边界变的不明显。在C组和D组的某些样本中观察到该受植床的连续性及骨皮质生成的改善。在8周时，A组和B组中该受植床的边界变得更加不明显。C组中该受植床的连续性及骨皮质生成改善。D组中观察到该尺骨缺损区的重建，如6周的影像所示。
在单独使用TCP的E组中，随着时间可观察到该受植床有骨生成。然而，即使在8周时剩余的TCP颗粒仍清晰可见，显示该植入部位上骨生成不足并且该受植床中的连续性差。因此，E组中缺损的修复在8周时仍然不完整。
在具有自体移植的F组中，随着时间可观察到骨生成的进度，且在8周时跟该受植床已达融合。然而，生成并不均匀。
在仅具有缺损而没有移植物的G组中，在8周时于桡骨上可观察到些微骨生成，而没有任何其他该缺损的修复。
B.计算机断层(Computerized Tomography，CT)扫描
在移植后当下、移植后4周及8周时使用CT扫描，以1mm间隔进行轴定向(GE横河医疗系统有限公司)。主要扫描该植入部位的影像。在图2A(A组至D组)和图2B(E组至G组)中的代表性实施例显示该植入部位中心随着时间推移的横截面影像变化。
在具有同型二聚体蛋白的A组至D组中，在移植后立刻观察到的颗粒在4周的横截面影像中部分降解，显示骨生成发生。在60μg剂量的D组中，进一步观察到骨生成的进度，并且在一些样本中观察到骨髓腔生成。8周时，在6μg以上剂量组别的影像中观察到骨髓腔和骨皮质生成的进度。在仅有TCP的E组中，即使在8周时仍有颗粒团聚体。在有自体移植的F组中，8周时观察到骨髓腔生成，如再成型过程中。在仅有缺损的G组中，仅观察到些微的骨生成。
C.抗扭强度测试
该移植材料从植入后8周安乐死的兔子中取出，从每一组的尺骨样本分离出的桡骨上进行抗扭强度测试。使用858Mini Bionix II工具(MTS系统公司)进行测试。该测试在50mm长的区域进行，即在该尺骨轴中心的20mm长的重建区域及在该重建区域的近侧和远侧15mm长的区域。每侧的边缘用牙科树脂固定。将树脂部分夹在量测设备中。以30°/min的旋转速度将左侧尺骨以逆时钟方向旋转，右侧尺骨以顺时钟方向旋转，以确定失败时的最大扭矩。并检查和比较分别获得的健康兔子尺骨。该些健康兔子尺骨是从日本白兔获得，与A组至E组中使用的类型不同。然而，该些日本白兔在安乐死时的年龄和性别与A组至E组相同，即26周龄的母兔。
图3所示为该抗扭强度测试下每一组所获得的最大扭矩。在具有同型二聚体蛋白的A组至D组中，最大扭矩和剂量的相依性高。
与单独使用TCP的E组相比，在具有同型二聚体蛋白剂量2μg及超过2μg的的A组至D组中观察到显著高的值。
与仅有缺损的G组相比，在具有同型二聚体蛋白剂量6μg及超过6μg的B组至D组中观察到显著高的值。
在完整无缺损尺骨、自体移植或同型二聚体蛋白的组别间未观察到显著差异。
由于在E组和G组中骨生成不足，当分离桡骨时，难以确保在一些样本中的支承。故，在测试中仅使用E组的2个样本和G组的4个样本，而A组至D组和F组则各使用6个样本。
下表7所示为使用相同动物模型的本发明与Kokubo等人(2003年公开于Biomaterials 24:1643–1651，2003)对于CHO衍生BMP-2的评估研究间测试条件和结果的比较。与Kokubo等人的报告相比，本发明在更为困难的条件下进行，例如：较大的骨缺损、较小剂量的活性剂，以及在抗扭强度测试之前较短的植入期间。然而，本发明显示尺骨成功修复，且本发明中的最大扭矩非常相似。
表7
*PGS：涂布PLGA的明胶海绵
^h.p.：同型二聚体蛋白
D.组织学评估
在8周和4周的组别中对所有动物制备标本。将尸体剖检时获得的组织保存于4％多聚甲醛溶液中并以10％的EDTA脱钙。接着将该组织以石蜡包埋。在平行于桡骨长轴的平面上制作薄片样本，以苏木素和伊红(HE)染色，并进行组织学评估。以确定骨生成和对该受植床的融合条件。
在具有同型二聚体蛋白的A组至D组中，在4周时骨生成进展成横纹型。在高剂量同型二聚体蛋白的样本中观察到主动性地骨生成。在60μg剂量的D组中观察到显著大量的新生骨和血管新生。在低剂量的A组和B组的一些样本中观察到残余材料，在C组和D组中则几乎没有观察到残余材料。在A和B组中，一些样本的该受植床边界附近观察到软骨生成。在所有样本中，该受植床直接与该横纹型的新生骨连接。在8周时，2μg剂量的A组仍可观察到横纹及残余材料。在受植床边界附近也可观察到软骨。即使再成型不足，仍可观察到骨生成的进展。在一些样本中观察到桡骨中骨皮质的生成。剂量超过6μg的B组至D组，通过再成型形成骨皮质及骨髓。在更高剂量的组别中进步更为显著。在植入部位上的连续性也增加。
在单独使用TCP的E组中，在桡骨中观察到移植材料上有骨生成，但即使在8周时残余材料仍清晰可见，显示在轴上骨生成不足且连续性差。
在具有自体移植物的F组中，4周时可见移植骨碎片上良好的骨生成，且新生骨与受植床接触。在受植床边界附近观察到软骨生成。8周时可观察到新生骨再成型及骨皮质生成的进展，但是仍可观察到残余的移植骨碎片。
在仅有缺损的G组中，仅在桡骨中观察到骨生成，且该缺损尚未完成修复。
本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上，除了所描述的内容之外，对于本发明所属技术领域的技术人员根据先前描述及附图中显而易见的各种修饰。此般修饰意同落入所附的申请专利范围之中。
其它实施例在所附的申请专利范围内。
序列表
<110> 博晟生医股份有限公司
Osteopharma Inc.
孙大伟
<120> 重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法
<130> 3902.0010000
<160> 357
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 875
<212> DNA
<213> 康霉素抗性基因 +3886 to +4760 片段(人工合成序列)
<400> 1
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 60
ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 120
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 180
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 240
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 300
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 360
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 420
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 480
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 540
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 600
aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 660
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 720
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 780
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 840
atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat taatt 875
<210> 2
<211> 1113
<212> DNA
<213> 胺芐青霉素抗性基因 +3587 to +4699 片段(人工合成序列)
<400> 2
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 60
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 120
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 180
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 240
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 300
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 360
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 420
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 480
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 540
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 600
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 660
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 720
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 780
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 840
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 900
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 960
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 1020
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 1080
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tat 1113
<210> 3
<211> 4513
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana(人工合成序列)
<400> 3
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120
ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gcatgcgagc tcggtacccc gggtcgacct 180
gcagccaagc ttaattagct gagcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag 240
aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga 300
atccaagcta gcttggcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc 360
actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt 420
cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta 480
aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc 540
ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg 600
gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc 660
tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg 720
tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc 780
tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac 840
ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg 900
ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt 960
aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt 1020
tattggtgcc cttaaacgcc tggggtaatg actctctagc ttgaggcatc aaataaaacg 1080
aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 1140
cctgagtagg acaaatccgc cctctagatt acgtgcagtc gatgataagc tgtcaaacat 1200
gagaattgtg cctaatgagt gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 1260
ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 1320
ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag 1380
ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg 1440
ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc 1500
ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt 1560
aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac 1620
gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc 1680
ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag 1740
acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc 1800
caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact 1860
gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc 1920
ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg 1980
ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat 2040
cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg 2100
cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc 2160
cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac 2220
tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg 2280
ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac 2340
cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcaccattc 2400
gatggtgtcg gaatttcggg cagcgttggg tcctggccac gggtgcgcat gatctagagc 2460
tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 2520
gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 2580
ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 2640
actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 2700
aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 2760
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2820
cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2880
gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2940
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3000
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3060
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3120
atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3180
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3240
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3300
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3360
ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3420
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3480
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3540
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg aattaattct 3600
tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata 3660
ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 3720
aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 3780
attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 3840
gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag 3900
ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc 3960
gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa 4020
tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat 4080
tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca 4140
tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt 4200
agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac 4260
aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca 4320
ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 4380
ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg 4440
taagcagaca gttttattgt tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 4500
ctttcgtctt cac 4513
<210> 4
<211> 273
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 4
cgggagtgca tctactacaa cgccaactgg gagctggagc gcaccaacca gagcggcctg 60
gagcgctgcg aaggcgagca ggacaagcgg ctgcactgct acgcctcctg gcgcaacagc 120
tctggcacca tcgagctcgt gaagaagggc tgctggctag atgacttcaa ctgctacgat 180
aggcaggagt gtgtggccac tgaggagaac ccccaggtgt acttctgctg ctgtgaaggc 240
aacttctgca acgaacgctt cactcatttg cca 273
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 5
cccgggacgg gagtgcatct acaacg 26
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 6
gtcgacttat ggcaaatgag tgaagcgttc 30
<210> 7
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 7
atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60
cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120
accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180
gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240
gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300
ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360
ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420
tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480
cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540
ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600
tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660
ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720
cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780
ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840
atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900
ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960
gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020
ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080
acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140
ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200
aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260
cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320
aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380
tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440
attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500
accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539
<210> 8
<211> 512
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 8
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr
145 150 155 160
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln
195 200 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys
210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys
225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys
275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp
290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg
305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu
355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile
370 375 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys
385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro
435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp
450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu
465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 9
<211> 91
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 9
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
1 5 10 15
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
20 25 30
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
35 40 45
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
50 55 60
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
65 70 75 80
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro
85 90
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 10
aataccacta caatggat 18
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> pACT2数据库质体插入(人工合成序列)
<400> 11
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca aatgtaacat acaccctttg 60
tac 63
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 12
ttaaccatgg gccaagccaa acgc 24
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 13
ggatccttag tacaaagggt gtatgttac 29
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> pACT2数据库质体插入(人工合成序列)
<400> 14
gtgagcttca aagacattgg gtggaatgac catgctagca gccagccggg gtatcacgcc 60
cgtccctgcc acggacaatg ccagaatatt ctggctgatc atctgaacga agattgtcat 120
gccattgttc agctgaagcc ccgctctgtt 150
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 15
ttaaccatgg tgagcttcaa agaca 25
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 16
ggatccttaa acagagcggg gcttcagct 29
<210> 17
<211> 132
<212> DNA
<213> pACT2数据库质体插入(人工合成序列)
<400> 17
atcgttgtgg ataataaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtcttcc ccatccgctg 60
taccttgacg agaataaaaa gcctgtatat aagaactatc aggacgcgct tctgcatagt 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 18
ttaaccatga tcgttgtgga taataag 27
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 19
ggatccttag cgacacccac aactatgca 29
<210> 20
<211> 90
<212> DNA
<213> pACT2数据库质体插入(人工合成序列)
<400> 20
acgtatccag cctctccgaa gccgatgagg tggtcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg 90
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 21
ttaaccatga cgtatccagc ctctccg 27
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 22
ggatccttac actgtccctg tctggttcc 29
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> pACT2数据库质体插入(人工合成序列)
<400> 23
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctggc cgcgagcctc ccgcaagtgc tgcctggtgc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 24
ttaaccatgg agcccctggg cggcgc 26
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 25
ggatccttac gaggccgtca ccgcgcgca 29
<210> 26
<211> 174
<212> DNA
<213> pACT2数据库质体插入(人工合成序列)
<400> 26
actgcgctgg ctgggactcg gggagcgcag ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc 60
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga 120
ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg cacgtggact ttaaggagct gggc 174
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 27
ttaaccatga ctgcgctggc tgggac 26
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 28
ggatccttag cccagctcct taaagtcca 29
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 29
gaattcatta aagaggagaa attaa 25
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 30
ccggggtacc gagctcgcat gcggatcctt a 31
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 31
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttg 27
<210> 32
<211> 63
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 32
gctcaagcca aacacaaagg gtataaacgc cttaagtcca attgtaaaag gcaccctttg 60
tac 63
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 33
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Asn Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr
20
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 34
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 35
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr
20
<210> 36
<211> 63
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 36
gcccaagcca aacataaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 37
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr
20
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 38
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
<210> 39
<211> 21
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 39
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr
20
<210> 40
<211> 63
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 40
gctcaagcca aacacaaagg tcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
<210> 41
<211> 21
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 41
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr
20
<210> 42
<211> 63
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 42
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 43
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr
20
<210> 44
<211> 150
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 44
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgcatcca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt 150
<210> 45
<211> 50
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 45
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro His Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val
50
<210> 46
<211> 150
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 46
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt 150
<210> 47
<211> 50
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 47
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val
50
<210> 48
<211> 150
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 48
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt 150
<210> 49
<211> 50
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 49
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val
50
<210> 50
<211> 150
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 50
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 150
<210> 51
<211> 50
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 51
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val
50
<210> 52
<211> 150
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 52
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tggatcgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 150
<210> 53
<211> 50
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 53
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val
50
<210> 54
<211> 150
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 54
gtggatttct ctgacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc aacgaaccat 120
gccattgttc agacccttgt taattctgtt 150
<210> 55
<211> 50
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 55
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val
50
<210> 56
<211> 132
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 56
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 57
<211> 44
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 57
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
35 40
<210> 58
<211> 132
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 58
aatagcaaaa tccccaaggc atgctgtcag ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtcgaaggg 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 59
<211> 44
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 59
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Gln Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
35 40
<210> 60
<211> 132
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 60
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 61
<211> 44
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 61
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
35 40
<210> 62
<211> 132
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 62
aatagcaaaa tccccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat aagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa ggtcgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 63
<211> 44
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 63
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
35 40
<210> 64
<211> 132
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 64
aatagcaaaa tacccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat tagcatgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtcgaaggg 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 65
<211> 44
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 65
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
35 40
<210> 66
<211> 132
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 66
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat aagcatgctg 60
taccttgacg agaatgagaa ggtggtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gc 132
<210> 67
<211> 44
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 67
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
35 40
<210> 68
<211> 90
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 68
acgtatccag cctctccgaa gccgatgagg cataaaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccgaac agggacagtg 90
<210> 69
<211> 30
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 69
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Lys Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Arg Thr Gly Thr Val
20 25 30
<210> 70
<211> 90
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 70
acgtatcccg cctctccgaa gccgatgagg cattcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg 90
<210> 71
<211> 30
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 71
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Ser Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Gln Thr Gly Thr Val
20 25 30
<210> 72
<211> 90
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 72
acgtatccag cctctccgaa gccgatgagg tggaagatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccggac agggacagtg 90
<210> 73
<211> 30
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 73
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg Trp Lys Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Arg Thr Gly Thr Val
20 25 30
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 74
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc cacgagcctc ccgcaagtgc tgcctggggc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
<210> 75
<211> 40
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 75
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Gly Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
35 40
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 76
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc agcgagcctc ccgcaagtgc tgcctggttc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
<210> 77
<211> 40
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 77
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Gln Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Val Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
35 40
<210> 78
<211> 174
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 78
accgccctag atgggactcg gggagcgcag ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc 60
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga 120
ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg cacgtggact ttaaggagct gggc 174
<210> 79
<211> 126
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 79
gcccaagcca aacataaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgctcaag ccaaacacaa aggtcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 120
ttgtac 126
<210> 80
<211> 42
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 80
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Arg Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
35 40
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 81
ttaaccatgg cccaagccaa acat 24
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 82
gtttggcttg agcgtacaaa gggtg 25
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 83
caccctttgt acgctcaagc caaac 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 84
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 85
<211> 126
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 85
gctcaagcca aacacaaagg tcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgcccaag ccaaacataa agggtataaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 120
ttgtac 126
<210> 86
<211> 42
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 86
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
35 40
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 87
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 88
gtttggcttg ggcgtacaaa gggtg 25
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 89
caccctttgt acgcccaagc caaac 25
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 90
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 91
<211> 300
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 91
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tggatcgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt gtggatttct ctgacgttgg gtggaatgac 180
catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc ttctattgcc acggagaatg cccgttccca 240
ctggctgatc atctgaactc aacgaaccat gccattgttc agacccttgt taattctgtt 300
<210> 92
<211> 100
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 92
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala
50 55 60
Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro
65 70 75 80
Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu
85 90 95
Val Asn Ser Val
100
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 93
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 94
cagagaaatc cacaacagaa ttaac 25
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 95
gttaattctg ttgtggattt ctctg 25
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 96
ggatccttaa acagaattaa caagg 25
<210> 97
<211> 300
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 97
gtggatttct ctgacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc aacgaaccat 120
gccattgttc agacccttgt taattctgtt gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac 180
tggatcgtgg caccgccggg gtatcacgcc ttctattgcc acggagaatg cccgttccca 240
ctggctgatc atctgaactc agataaccat gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 300
<210> 98
<211> 100
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 98
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala
50 55 60
Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro
65 70 75 80
Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu
85 90 95
Val Asn Ser Val
100
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 99
ttaaccatgg tggatttctc tgacg 25
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 100
cgctgaaatc cacaacagaa ttaac 25
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 101
gttaattctg ttgtggattt cagcg 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 102
ggatccttaa acagaattaa cgagg 25
<210> 103
<211> 264
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 103
aatagcaaaa tacccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat tagcatgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtcgaaggg 120
tgtgggtgtc gcaatagcaa agatcccaag gcatgctgtg tcccgacaga actcagtgcc 180
ataagcatgc tgtaccttga cgagaatgag aaggtggtac tcaagaacta tcaggacatg 240
gtagtccatg ggtgtgggtg tcgc 264
<210> 104
<211> 88
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 104
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Asn Ser Lys Asp
35 40 45
Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu
50 55 60
Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met
65 70 75 80
Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
85
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 105
ttaaccatga atagcaaaat accca 25
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 106
gatctttgct attgcgacac ccacac 26
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 107
gtgtgggtgt cgcaatagca aagatc 26
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 108
ggatccttac gacacccaca cccat 25
<210> 109
<211> 264
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 109
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat aagcatgctg 60
taccttgacg agaatgagaa ggtggtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcaatagcaa aatacccaag gcatgctgtg tcccgacaga actcagtgcc 180
attagcatgc tgtaccttga cgagaatgag aagcctgtac tcaagaacta tcaggacatg 240
gtagtcgaag ggtgtgggtg tcgc 264
<210> 110
<211> 88
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 110
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Asn Ser Lys Ile
35 40 45
Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu
50 55 60
Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met
65 70 75 80
Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
85
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 111
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 112
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 112
gtattttgct attgcgacac ccacac 26
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 113
gtgtgggtgt cgcaatagca aaatac 26
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 114
ggatccttag cgacacccac accct 25
<210> 115
<211> 153
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 115
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacacgtatc cagcctctcc gaagccgatg aggcataaaa tgcggagctg cgcgtgctgc 120
gccggaggtc tccggaaccg aacagggaca gtg 153
<210> 116
<211> 51
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 116
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His
20 25 30
Lys Met Arg Ser Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Arg Thr
35 40 45
Gly Thr Val
50
<210> 117
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 117
ttaaccatgg ctcaagccaa acacaa 26
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 118
gaggctggat acgtgtacaa agggtg 26
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 119
caccctttgt acacgtatcc agcctc 26
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 120
ggatccttac actgtccctg ttcgg 25
<210> 121
<211> 153
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 121
acgtatccag cctctccgaa gccgatgagg cataaaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccgaac agggacagtg gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc 120
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tac 153
<210> 122
<211> 51
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 122
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Lys Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Arg Thr Gly Thr Val Ala Gln
20 25 30
Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His
35 40 45
Pro Leu Tyr
50
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 123
ttaaccatga cgtatccagc ctctcc 26
<210> 124
<211> 27
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 124
gtttggcttg agccactgtc cctgttc 27
<210> 125
<211> 27
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 125
gaacagggac agtggctcaa gccaaac 27
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 126
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 127
<211> 240
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 127
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt acgtatcccg cctctccgaa gccgatgagg 180
cattcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg 240
<210> 128
<211> 80
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 128
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Ser Met Arg
50 55 60
Ser Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Gln Thr Gly Thr Val
65 70 75 80
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 129
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 130
ggcgggatac gtaacagaat taacg 25
<210> 131
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 131
cgttaattct gttacgtatc ccgcc 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 132
ggatccttac actgtccctg tctgg 25
<210> 133
<211> 240
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 133
acgtatcccg cctctccgaa gccgatgagg cattcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac 120
tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc ttctattgcc acggagaatg cccgttccca 180
ctggctgatc atctgaactc agataaccat gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 240
<210> 134
<211> 80
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 134
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Ser Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Gln Thr Gly Thr Val Val Asp
20 25 30
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr
35 40 45
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
50 55 60
Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
65 70 75 80
<210> 135
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 135
ttaaccatga cgtatcccgc ctctcc 26
<210> 136
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 136
cgctgaaatc caccactgtc cctgtc 26
<210> 137
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 137
gacagggaca gtggtggatt tcagcg 26
<210> 138
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 138
ggatccttaa acagaattaa cgaggg 26
<210> 139
<211> 183
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 139
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgagcccc tgggcggcgc gcgctgggaa gcgttcgacg tgacggacgc ggtgcagagc 120
caccgccgct cgccacgagc ctcccgcaag tgctgcctgg ggctgcgcgc ggtgacggcc 180
tcg 183
<210> 140
<211> 61
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 140
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe
20 25 30
Asp Val Thr Asp Ala Val Gln Ser His Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ser
35 40 45
Arg Lys Cys Cys Leu Gly Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
50 55 60
<210> 141
<211> 28
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 141
ttaaccatgg ctcaagccaa acacaaac 28
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 142
ccgcccaggg gctcgtacaa agggtgtc 28
<210> 143
<211> 28
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 143
gacacccttt gtacgagccc ctgggcgg 28
<210> 144
<211> 28
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 144
ggatccttac gaggccgtca ccgcgcgc 28
<210> 145
<211> 183
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 145
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc cacgagcctc ccgcaagtgc tgcctggggc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 180
tac 183
<210> 146
<211> 61
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 146
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Gly Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr
35 40 45
Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
50 55 60
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 147
ttaaccatgg agcccctggg cggcg 25
<210> 148
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 148
gtttggcttg agccgaggcc gtcac 25
<210> 149
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 149
gtgacggcct cggctcaagc caaac 25
<210> 150
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 150
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 151
<211> 270
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 151
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg 180
ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac cgccgctcgc agcgagcctc ccgcaagtgc 240
tgcctggttc tgcgcgcggt gacggcctcg 270
<210> 152
<211> 90
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 152
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr
50 55 60
Asp Ala Val Gln Ser His Arg Arg Ser Gln Arg Ala Ser Arg Lys Cys
65 70 75 80
Cys Leu Val Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
85 90
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 153
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 154
gcccaggggc tcaacagaat taacg 25
<210> 155
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 155
cgttaattct gttgagcccc tgggc 25
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 156
ggatccttac gaggccgtca ccgcg 25
<210> 157
<211> 270
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 157
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc agcgagcctc ccgcaagtgc tgcctggttc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 180
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 240
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 270
<210> 158
<211> 90
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 158
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Gln Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Val Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp
35 40 45
Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His
50 55 60
Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His
65 70 75 80
Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
85 90
<210> 159
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 159
ttaaccatgg agcccctggg cggcg 25
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 160
gctgaaatcc accgaggccg tcacc 25
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 161
ggtgacggcc tcggtggatt tcagc 25
<210> 162
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 162
ggatccttaa acagaattaa cgagg 25
<210> 163
<211> 237
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 163
accgccctag atgggactcg gggagcgcag ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc 60
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga 120
ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg cacgtggact ttaaggagct gggcgctcaa 180
gccaaacaca aacagtacaa acgccttaag tccagctgta agagacaccc tttgtac 237
<210> 164
<211> 79
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 164
Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys
35 40 45
Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Ala Gln Ala Lys His Lys
50 55 60
Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
65 70 75
<210> 165
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 165
ttaaccatga ccgccctaga tgggac 26
<210> 166
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 166
gtttggcttg agcgcccagc tcctta 26
<210> 167
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 167
taaggagctg ggcgctcaag ccaaac 26
<210> 168
<211> 26
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 168
ggatccttag tacaaagggt gtctct 26
<210> 169
<211> 237
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 169
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaccgccc tagatgggac tcggggagcg cagggaagcg gtggtggcgg cggtggcggt 120
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg caggcagggg ccacgggcgc 180
agaggccgga gccgctgcag tcgcaagtca ctgcacgtgg actttaagga gctgggc 237
<210> 170
<211> 79
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 170
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser
50 55 60
Arg Cys Ser Arg Lys Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly
65 70 75
<210> 171
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 171
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 172
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 172
catctagggc ggtgtacaaa gggtg 25
<210> 173
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 173
caccctttgt acaccgccct agatg 25
<210> 174
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 174
ggatccttag cccagctcct taaag 25
<210> 175
<211> 324
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 175
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt accgccctag atgggactcg gggagcgcag 180
ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc 240
ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg 300
cacgtggact ttaaggagct gggc 324
<210> 176
<211> 108
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 176
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser
85 90 95
Arg Lys Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly
100 105
<210> 177
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 177
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 178
catctagggc ggtaacagaa ttaac 25
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 179
gttaattctg ttaccgccct agatg 25
<210> 180
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 180
ggatccttag cccagctcct taaag 25
<210> 181
<211> 213
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 181
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcagcgacgt tgggtggaat gactgggctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccct cgttaattct gtt 213
<210> 182
<211> 71
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 182
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
65 70
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 183
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 184
cgctgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 185
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 185
caccctttgt acgtggattt cagcg 25
<210> 186
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 186
ggatccttaa acagaattaa cgagg 25
<210> 187
<211> 213
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 187
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120
gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180
catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gtt 213
<210> 188
<211> 71
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 188
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
65 70
<210> 189
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 189
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 190
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 190
cactgaagtc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 191
caccctttgt acgtggactt cagtg 25
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 192
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 193
<211> 213
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 193
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tac 213
<210> 194
<211> 71
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 194
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
65 70
<210> 195
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 195
ttaaccatgg tggacttcag tgacg 25
<210> 196
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 196
gtttggcttg agcaacagag ttgac 25
<210> 197
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 197
gtcaactctg ttgctcaagc caaac 25
<210> 198
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 198
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 199
<211> 282
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 199
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc 180
ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta 240
aagaactatc aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc gc 282
<210> 200
<211> 94
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 200
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu
50 55 60
Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu
65 70 75 80
Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
85 90
<210> 201
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 201
ttaaccatgg tggacttcag tgacg 25
<210> 202
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 202
gaatcttaga gttaacagag ttgac 25
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 203
gtcaactctg ttaactctaa gattc 25
<210> 204
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 204
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 205
<211> 282
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 205
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgtggactt cagtgacgtg gggtggaatg actggattgt ggctcccccg 180
gggtatcacg ccttttactg ccacggagaa tgcccttttc ctctggctga tcatctgaac 240
tccactaatc atgccattgt tcagacgttg gtcaactctg tt 282
<210> 206
<211> 94
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 206
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Ser
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
85 90
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 207
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 208
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 208
actgaagtcc acgcgacacc cacaa 25
<210> 209
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 209
ttgtgggtgt cgcgtggact tcagt 25
<210> 210
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 210
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 211
<211> 195
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 211
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgctcaagc caaacacaaa cagcggaaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtac 195
<210> 212
<211> 65
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 212
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Ala Gln Ala Lys
35 40 45
His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr
65
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 213
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 214
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 214
ttggcttgag cgcgacaccc acaac 25
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 215
gttgtgggtg tcgcgctcaa gccaa 25
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 216
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 217
<211> 195
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 217
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaactcta agattcctaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg 120
ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag 180
ggttgtgggt gtcgc 195
<210> 218
<211> 65
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 218
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg
65
<210> 219
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 219
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 220
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 220
gaatcttaga gttgtacaaa gggtg 25
<210> 221
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 221
caccctttgt acaactctaa gattc 25
<210> 222
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 222
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 223
<211> 213
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 223
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcaaggacgt tgggtggaat gaccatgctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccaa ggttaattct gtt 213
<210> 224
<211> 71
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 224
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Lys Val Asn Ser Val
65 70
<210> 225
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 225
ttaaccatgg gccaagccaa acgca 25
<210> 226
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 226
ccttgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 227
caccctttgt acgtggattt caagg 25
<210> 228
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 228
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 229
<211> 213
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 229
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tac 213
<210> 230
<211> 71
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 230
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
65 70
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 231
ttaaccatgg tggatttcaa ggacg 25
<210> 232
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 232
gtttggcttg gccaacagaa ttaac 25
<210> 233
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 233
gttaattctg ttggccaagc caaac 25
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 234
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 235
<211> 195
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 235
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcggccaagc caaacgcaaa gggtataaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtac 195
<210> 236
<211> 65
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 236
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Gly Gln Ala Lys
35 40 45
Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr
65
<210> 237
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 237
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 238
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 238
ttggcttggc cgcgacaccc acacc 25
<210> 239
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 239
ggtgtgggtg tcgcggccaa gccaa 25
<210> 240
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 240
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 241
<211> 195
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 241
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaatagca aagatcccaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg 120
ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat 180
gggtgtgggt gtcgc 195
<210> 242
<211> 65
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 242
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg
65
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 243
ttaaccatgg gccaagccaa acgca 25
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 244
gatctttgct attgtacaaa gggtg 25
<210> 245
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 245
caccctttgt acaatagcaa agatc 25
<210> 246
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 246
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 247
<211> 282
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 247
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcgtggattt caaggacgtt gggtggaatg accatgctgt ggcaccgccg 180
gggtatcacg ccttctattg ccacggagaa tgcccgttcc cactggctga tcatctgaac 240
tcagataacc atgccattgt tcagaccaag gttaattctg tt 282
<210> 248
<211> 94
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 248
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Lys
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn Ser Val
85 90
<210> 249
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 249
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 250
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 250
cttgaaatcc acgcgacacc cacac 25
<210> 251
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 251
gtgtgggtgt cgcgtggatt tcaag 25
<210> 252
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 252
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 253
<211> 282
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 253
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc 180
ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc 240
aagaactatc aggacatggt agtccatggg tgtgggtgtc gc 282
<210> 254
<211> 94
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 254
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu
50 55 60
Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu
65 70 75 80
Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
85 90
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 255
ttaaccatgg tggatttcaa ggacg 25
<210> 256
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 256
gatctttgct attaacagaa ttaac 25
<210> 257
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 257
gttaattctg ttaatagcaa agatc 25
<210> 258
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 258
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 259
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 259
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120
gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180
catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300
ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgc 345
<210> 260
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 260
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 261
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 261
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 262
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 262
cactgaagtc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 263
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 263
caccctttgt acgtggactt cagtg 25
<210> 264
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 264
gaatcttaga gttaacagag ttgac 25
<210> 265
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 265
gtcaactctg ttaactctaa gattc 25
<210> 266
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 266
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 267
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 267
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tacaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300
ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgc 345
<210> 268
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 268
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 269
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 269
ttaaccatgg tggacttcag tgacg 25
<210> 270
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 270
gtttggcttg agcaacagag ttgac 25
<210> 271
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 271
gtcaactctg ttgctcaagc caaac 25
<210> 272
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 272
gaatcttaga gttgtacaaa gggtg 25
<210> 273
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 273
caccctttgt acaactctaa gattc 25
<210> 274
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 274
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 275
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 275
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgtggactt cagtgacgtg gggtggaatg actggattgt ggctcccccg 180
gggtatcacg ccttttactg ccacggagaa tgcccttttc ctctggctga tcatctgaac 240
tccactaatc atgccattgt tcagacgttg gtcaactctg ttgctcaagc caaacacaaa 300
cagcggaaac gccttaagtc cagctgtaag agacaccctt tgtac 345
<210> 276
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 276
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Ser
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Ala Gln
85 90 95
Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His
100 105 110
Pro Leu Tyr
115
<210> 277
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 277
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 278
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 278
cactgaagtc cacgcgacac ccaca 25
<210> 279
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 279
tgtgggtgtc gcgtggactt cagtg 25
<210> 280
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 280
gtttggcttg agcaacagag ttgac 25
<210> 281
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 281
gtcaactctg ttgctcaagc caaac 25
<210> 282
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 282
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 283
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 283
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgctcaagc caaacacaaa cagcggaaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtacgtgga cttcagtgac gtggggtgga atgactggat tgtggctccc 240
ccggggtatc acgcctttta ctgccacgga gaatgccctt ttcctctggc tgatcatctg 300
aactccacta atcatgccat tgttcagacg ttggtcaact ctgtt 345
<210> 284
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 284
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Ala Gln Ala Lys
35 40 45
His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
<210> 285
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 285
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 286
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 286
gtttggcttg agcgcgacac ccaca 25
<210> 287
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 287
tgtgggtgtc gcgctcaagc caaac 25
<210> 288
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 288
cactgaagtc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 289
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 289
caccctttgt acgtggactt cagtg 25
<210> 290
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 290
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 291
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 291
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcaaggacgt tgggtggaat gaccatgctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccaa ggttaattct gttaatagca aagatcccaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta 300
ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat gggtgtgggt gtcgc 345
<210> 292
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 292
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Lys Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 293
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 293
ttaaccatgg gccaagccaa acgca 25
<210> 294
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 294
ccttgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 295
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 295
caccctttgt acgtggattt caagg 25
<210> 296
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 296
gatctttgct attaacagaa ttaac 25
<210> 297
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 297
gttaattctg ttaatagcaa agatc 25
<210> 298
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 298
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 299
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 299
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tacaatagca aagatcccaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta 300
ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat gggtgtgggt gtcgc 345
<210> 300
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 300
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 301
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 301
ttaaccatgg tggatttcaa ggacg 25
<210> 302
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 302
gtttggcttg gccaacagaa ttaac 25
<210> 303
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 303
gttaattctg ttggccaagc caaac 25
<210> 304
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 304
gatctttgct attgtacaaa gggtg 25
<210> 305
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 305
caccctttgt acaatagcaa agatc 25
<210> 306
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 306
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 307
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 307
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcggccaagc caaacgcaaa gggtataaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtacgtgga tttcaaggac gttgggtgga atgaccatgc tgtggcaccg 240
ccggggtatc acgccttcta ttgccacgga gaatgcccgt tcccactggc tgatcatctg 300
aactcagata accatgccat tgttcagacc aaggttaatt ctgtt 345
<210> 308
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 308
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Gly Gln Ala Lys
35 40 45
Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
<210> 309
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 309
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 310
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 310
gtttggcttg gccgcgacac ccaca 25
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 311
tgtgggtgtc gcggccaagc caaac 25
<210> 312
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 312
ccttgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 313
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 313
caccctttgt acgtggattt caagg 25
<210> 314
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 314
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 315
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 315
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcgtggattt caaggacgtt gggtggaatg accatgctgt ggcaccgccg 180
gggtatcacg ccttctattg ccacggagaa tgcccgttcc cactggctga tcatctgaac 240
tcagataacc atgccattgt tcagaccaag gttaattctg ttggccaagc caaacgcaaa 300
gggtataaac gccttaagtc cagctgtaag agacaccctt tgtac 345
<210> 316
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 316
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Lys
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn Ser Val Gly Gln
85 90 95
Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His
100 105 110
Pro Leu Tyr
115
<210> 317
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 317
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 318
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 318
cttgaaatcc acgcgacacc cacac 25
<210> 319
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 319
gtgtgggtgt cgcgtggatt tcaag 25
<210> 320
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 320
gtttggcttg gccaacagaa ttaac 25
<210> 321
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 321
gttaattctg ttggccaagc caaac 25
<210> 322
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 322
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 323
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 323
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcaaggacgt tgggtggaat gaccatgctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccaa ggttaattct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300
ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgc 345
<210> 324
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 324
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Lys Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 325
ttaaccatgg ctcaagccaa acac 24
<210> 326
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 326
cttgaaatcc acgtacaaag ggtg 24
<210> 327
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 327
caccctttgt acgtggattt caag 24
<210> 328
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 328
gaatcttaga gttaacagaa ttaag 25
<210> 329
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 329
gttaattctg ttaactctaa gattc 25
<210> 330
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 330
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 331
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 331
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120
gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180
catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaatagca aagatcccaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta 300
ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat gggtgtgggt gtcgc 345
<210> 332
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 332
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 333
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 333
ttaaccatgg gccaagccaa acgc 24
<210> 334
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 334
actgaagtcc acgtacaaag ggtc 24
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 335
caccctttgt acgtggactt cagt 24
<210> 336
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 336
gatctttgct attaacagag ttgac 25
<210> 337
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 337
gtcaactctg ttaatagcaa agatc 25
<210> 338
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 338
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 339
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 339
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaatagca aagatcccaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg 120
ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat 180
gggtgtgggt gtcgcgtgga tttcaaggac gttgggtgga atgaccatgc tgtggcaccg 240
ccggggtatc acgccttcta ttgccacgga gaatgcccgt tcccactggc tgatcatctg 300
aactcagata accatgccat tgttcagacc aaggttaatt ctgtt 345
<210> 340
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 340
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
<210> 341
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 341
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 342
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 342
gatctttgct attgtacaaa gggtg 25
<210> 343
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 343
caccctttgt acaatagcaa agatc 25
<210> 344
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 344
cttgaaatcc acgcgacacc cacac 25
<210> 345
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 345
gtgtgggtgt cgcgtggatt tcaag 25
<210> 346
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 346
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 347
<211> 345
<212> DNA
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 347
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaactcta agattcctaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg 120
ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag 180
ggttgtgggt gtcgcgtgga cttcagtgac gtggggtgga atgactggat tgtggctccc 240
ccggggtatc acgcctttta ctgccacgga gaatgccctt ttcctctggc tgatcatctg 300
aactccacta atcatgccat tgttcagacg ttggtcaact ctgtt 345
<210> 348
<211> 115
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物(人工合成序列)
<400> 348
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
<210> 349
<211> 24
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 349
ttaaccatgg gccaagccaa acgc 24
<210> 350
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 350
gaatcttaga gttgtacaaa gggtg 25
<210> 351
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 351
caccctttgt acaactctaa gattc 25
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 352
tcactgaagt ccacgcgaca cccac 25
<210> 353
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 353
gtgggtgtcg cgtggacttc agtga 25
<210> 354
<211> 25
<212> DNA
<213> 引子(人工合成序列)
<400> 354
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 355
<211> 58
<212> PRT
<213> pQE-80L-Kana衍生物(人工合成序列)
<400> 355
Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys
35 40 45
Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly
50 55
<210> 356
<211> 9
<212> PRT
<213> 重组多肽的第三域片段(人工合成序列)
<400> 356
Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu
1 5
<210> 357
<211> 5
<212> PRT
<213> 重组多肽的第三域片段(人工合成序列)
<400> 357
Gly Cys Gly Cys Arg
1 5

Claims (19)

1.一种重组多肽，其特征在于，包含：
一第一域，其是选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组；
一第二域，其是选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组；及
一第三域，其是选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组；
其中该第二域包含一个分子内双硫键。
2.根据权利要求1所述的重组多肽，其特征在于，该第二域包含在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间的一个分子内双硫键。
3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其特征在于，该重组多肽具有诱发碱性磷酸酶活性的能力。
4.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其特征在于，该第三域包含：一第一氨基酸序列PKACCVPTE SEQ ID NO：356和一第二氨基酸序列GCGCR SEQID NO：357，且其中该第三域包含在该第一和该第二氨基酸序列之间的二个分子内双硫键。
5.根据权利要求4所述的重组多肽，其特征在于，该重组多肽包含：在该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子内双硫键，且在该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子内双硫键；或在该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子内双硫键，且在该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子内双硫键。
6.一种重组多肽，其特征在于，包含：
一第一域，其是选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组；
一第二域，其是选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组；及
一第三域，其是选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组；
其中该重组多肽包含一氨基酸序列，该氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：260、SEQ IDNO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ IDNO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348组成的群组。
7.一种同型二聚体蛋白，其特征在于，包含权利要求1、2或6所述的二个相同的重组多肽。
8.根据权利要求7所述的同型二聚体蛋白，其特征在于，包含在该两个之其一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸和该另一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸之间的一个分子间双硫键。
9.根据权利要求8所述的同型二聚体蛋白，其特征在于，每一该重组多肽的该第三域包含：一第一氨基酸序列PKACCVPTE SEQ ID NO：356和一第二氨基酸序列GCGCR SEQ ID NO：357，且其中该同型二聚体蛋白包含：在该两个之其一重组多肽的该第三域中的该第一氨基酸序列和该另一重组多肽的该第三域中的该第二氨基酸序列之间的二个分子间双硫键。
10.根据权利要求9所述的同型二聚体蛋白，其特征在于，包含：
在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子间双硫键，及在该两个的其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子间双硫键；或
在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的一第一分子间双硫键，及在该两个之其一重组多肽的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的一第二分子间双硫键。
11.一种异型二聚体蛋白，其特征在于，包含如权利要求1、2或6所述的二个相异的重组多肽，其中该异型二聚体蛋白包含：在该二个相异重组多肽的第一域之间的一个分子间双硫键。
12.根据权利要求11所述的异型二聚体蛋白，其特征在于，包含在该两个之其一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸和该另一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸之间的一个分子间双硫键。
13.一种经分离的核酸分子，其特征在于，包含一编码如权利要求1、2或6所述的重组多肽的多核苷酸序列。
14.一种重组核酸分子，其特征在于，包含一表达控制区，可操作地连结至如权利要求13所述的经分离的核酸分子。
15.一种经分离的宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求项13所述的经分离的核酸分子或如权利要求14所述的重组核酸分子。
16.一种制备一重组载体的方法，其特征在于，包含将如权利要求13所述的经分离的核酸分子插入一载体内。
17.一种制备一重组宿主细胞的方法，其特征在于，包含将如权利要求13所述的经分离的核酸分子或如权利要求14所述的重组核酸分子导入至一宿主细胞内。
18.一种制造一重组多肽的方法，其特征在于，包含：培养如权利要求15所述的经分离的宿主细胞，以及分离该重组多肽。
19.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求1、2或6所述的重组多肽、如权利要求7所述的同型二聚体蛋白或如权利要求11所述的异型二聚体蛋白。
CN201711479646.2A 2016-12-30 2017-12-29 重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法 Active CN108264568B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662440663P 2016-12-30 2016-12-30
US62/440,663 2016-12-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108264568A true CN108264568A (zh) 2018-07-10
CN108264568B CN108264568B (zh) 2021-11-16

Family

ID=62773086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711479646.2A Active CN108264568B (zh) 2016-12-30 2017-12-29 重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN108264568B (zh)
TW (1) TWI667253B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3562839A4 (en) 2016-12-30 2020-09-02 Biogend Therapeutics Co., Ltd. RECOMBINANT POLYPEPTIDES, ASSOCIATED COMPOSITIONS AND PROCESSES
TWI707874B (zh) * 2017-09-25 2020-10-21 博晟生醫股份有限公司 重組多肽及其組成物及方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180606B1 (en) * 1994-09-28 2001-01-30 Gensci Orthobiologics, Inc. Compositions with enhanced osteogenic potential, methods for making the same and uses thereof
US20020082697A1 (en) * 2000-12-22 2002-06-27 Damien Christopher J. Implantable osteogenic material
WO2004048409A2 (en) * 2002-11-22 2004-06-10 Lek Pharmaceuticals D.D. Mutants of the tumor necrosis factor alpha with deletion of n-terminal amino acids
CN1649899A (zh) * 2002-05-03 2005-08-03 米列姆·贝尔罗吉克公司 结缔组织刺激肽
CN101616684A (zh) * 2007-02-02 2009-12-30 诺瓦提斯公司 用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂
CN101677978A (zh) * 2007-02-15 2010-03-24 褚圣-贾斯汀公司 矫正骨吸收和骨形成失调的方法及其试剂盒和组合物
CN102776198A (zh) * 2011-05-09 2012-11-14 扬州泰达生物科技有限公司 在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法
EP2612674A1 (en) * 2010-09-01 2013-07-10 Osteopharma Inc. Freeze-dried recombinant human bone morphogenetic protein-2 preparation
CN104277118A (zh) * 2014-07-14 2015-01-14 天津科技大学 重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法
CN105530959A (zh) * 2013-03-15 2016-04-27 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 多聚化技术

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180606B1 (en) * 1994-09-28 2001-01-30 Gensci Orthobiologics, Inc. Compositions with enhanced osteogenic potential, methods for making the same and uses thereof
US20020082697A1 (en) * 2000-12-22 2002-06-27 Damien Christopher J. Implantable osteogenic material
CN1649899A (zh) * 2002-05-03 2005-08-03 米列姆·贝尔罗吉克公司 结缔组织刺激肽
WO2004048409A2 (en) * 2002-11-22 2004-06-10 Lek Pharmaceuticals D.D. Mutants of the tumor necrosis factor alpha with deletion of n-terminal amino acids
CN101616684A (zh) * 2007-02-02 2009-12-30 诺瓦提斯公司 用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂
CN101677978A (zh) * 2007-02-15 2010-03-24 褚圣-贾斯汀公司 矫正骨吸收和骨形成失调的方法及其试剂盒和组合物
EP2612674A1 (en) * 2010-09-01 2013-07-10 Osteopharma Inc. Freeze-dried recombinant human bone morphogenetic protein-2 preparation
CN102776198A (zh) * 2011-05-09 2012-11-14 扬州泰达生物科技有限公司 在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法
CN105530959A (zh) * 2013-03-15 2016-04-27 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 多聚化技术
CN104277118A (zh) * 2014-07-14 2015-01-14 天津科技大学 重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW201823268A (zh) 2018-07-01
TWI667253B (zh) 2019-08-01
CN108264568B (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021250992B2 (en) Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
JP4012243B2 (ja) 亜鉛フィンガータンパク質誘導体およびそのための方法
DE60207740T2 (de) Muteine von menschlichem mit neutrophiler Gelatinase-assoziiertem Lipocalin und damit verwandte Proteine
DE69827507T2 (de) Trimerisierendes modul
US6242568B1 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP1817430B1 (en) Means and methods for detecting methylated dna
EP1759013B1 (de) Identifizierung von oberflächen-assoziierten antigenen für die tumordiagnose und -therapie
US20040266993A1 (en) Non-immunoglobulin binding polypeptides
CN100510087C (zh) 模块转染系统
JP2002502249A (ja) ジンクフィンガータンパク質誘導体およびその方法
EP3865147A1 (en) Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
JP2010085108A (ja) 生体光イメージング用プローブ
CN108264568A (zh) 重组多肽、核酸分子及其组合物以及制造、使用其的方法
CN109825522A (zh) 一种无痕化双靶点基因组编辑系统
EP2957630A1 (en) Undifferentiated cell elimination method
JPH06503949A (ja) 新規インシュリン様成長因子結合タンパク質ｉｇｆｂｐ―５
DE60219809T2 (de) Verbindungen und Verfahren zur Nachweiss von Karzinomen und deren Vorstufen
Takacs et al. Fluorescent proteins, promoters, and selectable markers for applications in the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi
DE60126248T2 (de) Verwendung von brustkrebs membranproteine für behandlung, prophylaxe und diagnose von brustkrebs
CN110382523B (zh) 重组多肽及其组合物及方法
CN108531458A (zh) 治疗肿瘤的基因工程自然杀伤细胞产品
MXPA01002545A (es) Composiciones y metodos para el tratamiento de tumores.
CN110195103A (zh) 一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法
KR101228580B1 (ko) 신데칸―４ 막관통 전구체（Ｓｙｎ―４―ＴＭ） 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법
CN113583096A (zh) SARS-CoV-2 Spike蛋白受体结合域二聚体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230315

Address after: 4 Building No. 2, No. 3, Park Street, Nangang, Taipei, Taiwan, China

Patentee after: BIOGEND THERAPEUTICS CO.,LTD.

Address before: 4 Building No. 2, No. 3, Park Street, Nangang, Taipei, Taiwan, China

Patentee before: BIOGEND THERAPEUTICS CO.,LTD.

Patentee before: OSTEOPHARMA Inc.