CN100510087C

CN100510087C - 模块转染系统

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Publication number: CN100510087C
Application number: CNB028062205A
Authority: CN
Inventors: H·-M·施密特; L·阿特罗格; D·伦兹; G·里门; H·布罗斯特赫斯; E·洛巴奇; J·黑尔弗里奇; K·海因; M·格雷姆斯; T·马莱斯; R·克里斯廷; G·西本科坦; B·奥特曼; T·图尔班斯基; A·克莱斯
Original assignee: Amaxa AG
Current assignee: Lonza Cologne GmbH
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2002-01-10
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2022-01-10
Also published as: IL156780A0; WO2002055721A2; EP1427837B1; WO2002055721A3; KR20030074702A; US20040137622A1; DE10290072D2; WO2002055721B1; JP4697982B2; US7999073B2; JP2005505233A; NO20033144L; AU2002238376B2; CN1529759A; US7320859B2; NO20033144D0; ATE530659T1; EP1427837A2; US20080220527A1; JP2008200041A

Abstract

本发明涉及用至少一种能够形成核蛋白丝的蛋白质转染细胞的方法。所述蛋白质首先被至少一种功能性组分修饰，这会影响转染的至少一个步骤，然后待转染的核酸用修饰的蛋白质荷载。所述核酸和蛋白质形成丝状复合体，所述复合体然后被加到待转染的细胞中。本发明还涉及核蛋白丝(NPF)的转染剂，至少一种形成核蛋白丝的蛋白质被至少一种用于转染的功能性组分修饰。本发明进一步涉及所发明的转染剂在生产用于人和动物基因治疗的药物中的用途。最后，本发明涉及相应的药物制剂，尤其是用于基因治疗，以及以试剂盒内的组分形式的此类转染剂的用途。

Description

模块转染系统

发明背景

本发明涉及核酸的非病毒转染领域。术语转染通常是指将外源物质引入细胞。本发明涉及在至少一种能够形成核蛋白丝的蛋白质的帮助下转染细胞的方法。本发明还涉及含有核蛋白丝(NPF)的转染剂，它是由至少一种待转染的核酸和至少一种能够形成核蛋白丝的蛋白质形成的。此外，本发明涉及如本发明所述转染剂、相应的药物制剂的用途，尤其是用于基因治疗，涉及一种供核酸转染细胞的试剂盒，尤其是采用本发明转染剂的方法。

技术现状

已知的非病毒转染剂受到了许多限制。在核酸的非病毒转染中，球状核酸复合体(它通常是单侧带电的)的大小以及一个或多个转染步骤可控性的缺乏通常是主要的问题。后一情况的一个原因是穿入外细胞膜或内部区室的膜的能力不足，不足以免遭酶降解，由细胞内的非生物分子造成的不足的可控性的低生物利用度和生物效应。主要含有高度延伸的空间结构的核酸容易被酶降解，且它们的单侧电荷过剩使它们易于与碱性细胞结构关联。进入核的相关不足的能力导致现有的核酸转染技术几乎都必需使用癌症样转化的细胞，如细胞系，这些细胞系中的核膜在细胞分裂时临时分解，且进入细胞核是可能的。然而，转化的细胞无法与原代细胞的原始生理状态相比，因此基于使用转染的细胞进行研究所得的初级转染细胞的行为的结论无法信赖。

已知许多转染剂，其中大多数都会通过静电作用与核酸(直径通常大于50nm)形成球状复合体(Tang和Szoka，1997)。这些复合体大多数在细胞表面连有大量过剩的电荷并通过内吞作用摄入。它们离开内体，要么通过缓冲内体的酸化至其爆发(如，用聚乙烯亚胺、星爆树型化合物(Kukowska-Latello等，1996)或加入氯喹)，要么通过膜活性类、脂质或亲脂性肽的作用。然而，这种复合体在下一次细胞分裂期间仅能达到细胞核，以在核酸释放后在那里显示出所需的效果。

使用NLS-肽(NLS＝核定位信号)可避免依赖于分裂的核输入问题，尤其是当注意力放在信号掩蔽和非特异性蛋白质结合的问题上时(WO 00/40742，Amaxa)。

美国专利5,468,629描述了RecA蛋白以及其它对RecA具有功能同源性的蛋白质在用ssDNA(单链DNA)转染细胞中的应用。通过影响链配对以及随后的链交换，显然通过催化，RecA蛋白支持转运的ssDNA和细胞DNA的同源重组过程。这里使用的复合体含有最多700个核苷酸的ssDNA以及RecA蛋白，这种复合体被称为“包被RecA的”复合体。这种ssDNA-蛋白质复合体是RecA和ATP-γ-S存在时，在稳定的螺旋突触前纤维形成时由DNA形成的。使用这些复合体已经获得了小小的成功，例如，用于细胞系的转染，即用来活化分裂的细胞，尤其是转化的细胞。

发明概要

本发明的目的是提供将任何类型的核酸转染入任何类型的细胞的方法和转染剂，这可改进细胞的摄取且同时可控制转染的过程。这种目的的转染剂应在转染过程中足够稳定，而且还保证足够释放靶细胞区室中待转染的核酸。

根据本发明，用该说明书中提到的方法实现了这一目的，其中，所述蛋白质最初被至少一种影响一个或多个转染步骤的功能性组分修饰。所述待转染的核酸然后被放在被修饰的蛋白质上，所述核酸和蛋白质形成丝状复合体，且所述复合体最终被加到将待转染的细胞中。

此外，该目的还可通过说明书中所提类型的转染剂来实现，其中能够形成核蛋白丝的蛋白质被至少一种影响转染的组分修饰。

作为修饰一种或几种蛋白质的结果，这种蛋白质可与一种或几种相同或不同的其它功能性组分形成核蛋白丝(NPF)，复杂转染过程的各个步骤可以特殊的有利方式进行控制。此外，与已知方法相比，本发明的方法和转染剂可使转染效率明显提高。

根据本发明，NPF形成蛋白以有利的方法使用，特别是作为功能基团的模块运载系统，这就不仅仅是单纯保护DNA。所述复合体有非常低的空间延伸性，在两个方面：它是丝状的而不是球状的，且它在每条丝中仅含一个核酸分子。由于这种装配导致每个运载蛋白少数核苷的化学计量比，与球状复合体相比，特别高的转染功能信号密度是可能的。通过将不同的功能化的载体蛋白和没有官能团的蛋白质混合，则可分别调节信号密度和不同信号的结合，这样，本发明的转染剂就可被设计成用于各种不同转染情况的模块系统。所述低空间延伸性和高信号密度还使其能够用于内源转运系统，这特别适合小分子。由于其丝状特性、其简单的结构及其可调节性以及非常高的信号密度，采用内源机制，本发明的方法或本发明的转染剂能够特异性转运较大的核酸分子，比如表达载体。

例如，其它功能性组分可直接结合到NPF蛋白或通过间隔区、非功能性间隔单位结合。这种类型的间隔区可在NPF和功能性组分之间产生较大间隔，这可避免NPF蛋白和功能性组分之间的相互位阻并保证较好的空间利用率。因此所述本发明试剂的结构可大大地避免功能性组分的遮蔽。

NPF形成蛋白大多数通过协同结合与核酸形成核蛋白丝，其中所述蛋白质与核酸形成了一种复合体，该复合体的直径或大小远小于已知的球状转染剂形成的复合体的直径或大小。例如，这种类型的NPF可在核苷三磷酸如ATP(腺苷三磷酸)存在时由RecA家族的蛋白质形成，它们是DNA依赖的ATP酶，其密度的总负载为，例如，双链DNA中每三个碱基一个蛋白质(Bianco等，1998)。这种高蛋白质密度可极好地免遭核酸的酶水解，大大降低了酶对可能位点的攻击。NPF不仅可使复合体充分稳定，而且，例如可在核中释放足够的转运核酸。使用无法水解或水解能力弱的核苷三磷酸如ATP和/或GTP的类似物，比如ATP-γ-S或GTP-γ-S，也尽可能地为形成ATP形成蛋白的NPF，如RecA家族提供额外的稳定性。

根据本发明，所述能够形成NPF的蛋白质还包括衍生的NPF蛋白质。例如，可产生的融合蛋白。此外，NPF形成蛋白可被截短或延长，删除各个段或氨基酸，引入或化学修饰，只要它们的功能是本发明必需的，保持NPF和核酸的结构形成。

本发明一个特别的优点是NPF的空间结构，这种结构使其能够利用核转运的天然机制。转染剂的最大直径由核孔的大小确定，即使是非常长的核酸也不会超出这一范围，即不取决于待转染的核酸的长度NPF可用作转染剂。已知转运通过核孔的大小限制约为25nm(Feldherr和Akin，1997)或50nm(SV40病毒)(Yamada和Kasamatsu，1993)。核酸，其与具有球状结构和/或非特异性结合的一些核酸分子的常规转染剂经转染组分通过核膜的输入被阻碍，用本发明的转染剂可以容易地受到这种限制。根据所使用的NPF形成蛋白，本发明转染剂的结构甚至使得首次可能使用≤11nm的直径。因此，使用NPF蛋白装配的丝状结构还适合用来转运长达数千碱基的核酸。因此，本发明的方法和本发明的转染剂特别适用于转染具有较大核酸序列的细胞。本发明的转染剂优选包含至少有700个核苷酸的待转染的核酸。

本发明用于转染核酸或与其它转染方法和物质结合使用是有利的。装载NPF形成蛋白的程度高增加了对水解的稳定性，同时NPF直径较小使得可利用内源细胞转运机制，这种机制仅当分子足够小时才存在，例如核转运系统的分子。此外，确保适当地将待转染的核酸释放在细胞区室中，优选是在细胞核中。

本发明的术语“转染剂”因理解为核酸或其衍生物的转运载体，它通常含有待转染的核酸。本发明的转染剂至少作为所述复杂转染过程的一个步骤。

在本发明文中，术语“核蛋白丝”(NPF)是指由核酸或核酸衍生物和蛋白质构成的分子结构，作为非共价的结果，它们大多数是协同结合的，形成了丝状或线状的复合体，该复合体优选仅含有一种核酸分子或其衍生物。特别优选的是螺旋状的核蛋白丝，例如，由RecA和单链或双链DNA形成的那些(Di Capua等，1982)。

“待转染的核酸”可以是双链或单链DNA，或是双链或单链RNA，或是具有单链末端的双链DNA，DNA/RNA杂交体，反义DNA，反义RNA或经化学修饰的核酸衍生物，其中，例如，增加了对水解的抗性(肽核酸，PNA)，或者其中已引入反应分子基团用于共价结合和/或修饰靶核酸。可转染的核酸的衍生物因理解为包括用序列特异性或共价结合的蛋白质修饰的核酸。优选的本发明的核酸是DNA，尤其是双链DNA。迄今为止，NPF形成蛋白大多数与单链DNA一起使用，例如用于重组。令人惊奇的是，本发明文本中显示，在合适的条件下NPF形成蛋白也和双链DNA形成稳定的复合体，并可用于按照本发明转染双链DNA。因此，本发明的另一个优点是，用双链DNA有效转染也是可能的。

在本发明有利的实施方案中，被功能性组分修饰的NPF是通过修饰原始的NPF形成蛋白或其衍生物产生的。这种修饰可以是删除或插入氨基酸和/或蛋白质域。还可通过化学改变氨基酸和/或其它分子基团，和或通过肽、蛋白质、碳水化合物、脂质或其它分子化学偶联到NPF形成蛋白或其衍生物来进行修饰。这些修饰可在使用间隔区时进行。

转染的第一个障碍是转染复合体与细胞表面的结合。因此，本发明方法和转染剂的一个优选的实施方案中使用了至少一种能够形成NPF的蛋白质，它被至少一种使所述复合体或试剂与细胞表面结合的官能团修饰。这可根据细胞类型特别地进行，方法是与在一种或只有少数细胞类型上表达对细胞类型特异的表面结构的结合，或是非特异性结合，例如通过静电相互作用。所有天然产生或合成产生的物质可用于细胞类型特异的结合，它与细胞表面上的受体如病毒或细菌为细胞进入所使用的受体，如EB病毒受体CD21(Delcayre，191)或单核细胞增生利真特氏菌受体E-钙粘着蛋白(Mengaud，1996)。其它使用配体-受体对的例子包括对需要许多铁的细胞使用运铁蛋白受体/运铁蛋白系统，对肝细胞使用脱唾液酸糖蛋白受体/半乳糖，整联蛋白/整联蛋白结合肽，如RGD(Harbottle 1998)或molossin(Collins 2000)或与激素受体结合的激素，如胰岛素(Rosenkranz 1992)、EGF(表皮生长因子)或胰岛素样生长因子I(Feero，1997)以及与凝集素结合的寡糖(Midoux等，1993)。还可能使用细胞特异性抗体(Fominaya，1996)或蛋白质A或其IgG结合域(Ohno，1997)以及与生物素化蛋白(在细胞表面生物素化的蛋白质或生物素化的多克隆抗体)与链霉抗生物素蛋白联合在一起(Schoeman，1995)。本发明特别适合使用“表位标记”，即采用生物特异性抗体的细胞类型特异的转染，它一方面可识别称为短肽，如来自流感血凝素(Surdej，1994)或来自c-myc蛋白(Evan，1985)的表位，可通过遗传工程将其偶联或融合成NPF形成蛋白或其衍生物，另一方面，它可识别特异性细胞表面结构。对于通过静电力，转染复合体的非细胞特异性相互作用，它可能例如引入其它氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)的正电荷。

在本发明方法和转染剂的另一个特别优选的实施方案中，打算要所述功能性组分让所述复合体或试剂的非内体通道通过细胞膜。所述非内体膜通道的优点在于，所述试剂可立即出现在胞质溶胶中，且不暴露于溶酶体的水解活性环境。膜活性分子可达到这种类型的膜通道。这些可天然发生，经过修饰的肽或合成的肽大多数是脂肪族或两亲的，如病毒肽，例如HIV tat、VP22、HBV表面抗原；来自转录因子如例如触角足的同源域(Thoren等，2000)、锯齿状的、HOXA-5的肽；来自细胞因子如IL-1β、FGF-1、FGF-2的肽；来自细胞信号序列如卡波西成纤维细胞生长因子的肽；穿入活细胞的单克隆抗体，如mab 3E10(Weisbart等，2000)；合成或嵌合的肽如两亲模型肽或转运蛋白(transportane)(Pooga等，1998)。

此外，本发明一个有利的实施方案使用了至少一种本发明的功能性组分，这种组分使复合体或试剂从内体或溶酶体中释放。例如，通过细胞膜的通道可在胞吞作用时发生。胞吞后，核蛋白复合体必须从内体中释放。为了此目的，所有具有内体溶解活性的物质都可使用。例如，它们可以是肽、其衍生物或来自细菌或病毒的合成的类似物，或精通此领域的技术人员熟知的其它合成的物质。细菌的内体溶解物质包括，例如，链球菌溶血素0、肺炎球菌溶血素、葡萄球菌α-毒素、李斯特菌溶血素0(Provoda，2000)。病毒肽包括，例如，流感病毒的N-末端血凝素HA-2肽(Steinhauer等，1995)、鼻病毒HRV2的VP-1蛋白的N-末端(Zauner等，1995)或腺病毒的衣壳组分Ad2(Hong，1999)。合成的物质包括，例如，两亲肽(GALA、KALA、EGLA、JTS1)(Wagner，1999)或咪唑-(Pack，2000)或聚酰胺型胺类修饰的聚合物(Richardson，1999)。

通常依赖于细胞分裂且可能在刺激细胞后发生的进入细胞核的通道(输入)是所有转染剂的特殊障碍。因此，在本发明一个特别有利的实施方案中，有意使用了可使复合体或试剂转运入细胞核的功能性组分。核转运的关键首先是核孔的限制直径，其次是用于转运的信号分子。本发明文本中，核转运信号是与核受体结合的核配体。特别合适的核配体是NLS(核定位信号)或核转运机制的其它组分。特别优选使用的核定位信号是它们本身和/或与其侧翼区一起具有很少或没有正电荷过剩的信号，这是因为电荷过剩会导致非特异性的核酸结合，因此掩蔽信号。当肽的总电荷至少与侧翼带有负电荷的氨基酸大致平衡时，所谓经典的NLS的延伸序列是非常合适的。基于对结构的考虑，这些氨基酸在这些位置的肽/蛋白质中可自然发生或在那里引入。也可使用所谓非经典的NLS，例如来自流感病毒“核蛋白”的NLS(Wang等，1997，Neumann等，1997)或来自异源核RNP(hnRNP)A1蛋白质的序列M9，它不具有大量过剩的正电荷，或经非经典的转运途径进入细胞核。由T.Boulikas所作的可用于本发明实施方案的NLS的综述不完整但是好的(1993、1996、1997)。中性电荷序列大致包括，例如，带有侧翼负电荷的猿病毒40的大T-抗原，它是自然发生或人工引入的(也可参见WO 00/40742 Amaxa)。

因此，本发明一个特殊的优点是明显改进了真核细胞的核酸的转染，所述细胞是不分裂或仅仅每周分裂的，尤其是原代真核细胞。准确的说，这些细胞并没有丧失提供生物信息或医学信息的能力，这是因为它们可例如通过血液取样或组织活检直接取自机体，这对熟练的技术人员非常重要。随着几乎完全解码的人基因组的预期分析，在细胞系统中只检测基因的特异性表达，这最终将得到具有足够生理关系的可能的技术可用性的明确证据。此外，对原代细胞的转染是在体外和体内进行非病毒基因治疗的必需前提。

在本发明一个有利的实施方案中，本发明的方法和转染剂都包括至少一种能够形成核蛋白丝的被几种功能不同的功能性组分修饰的蛋白质和/或不同的蛋白质分别被功能不同的蛋白质修饰的不同的蛋白质。上述本发明的转染剂有许多可形成NPF或其衍生物的蛋白质，它们可以原始形式或功能性修饰的形式出现。可使用一种或几种可形成NPF的不同蛋白质，且根据转染的特定需要它们可被一种或几种功能相同或不同的功能性组分修饰。根据所需的目的，使用者可用这种方法装配不同的模块。这就产生了模块系统，可选择其中功能相同或不同的未修饰或修饰的NPF蛋白以实现待转染的核酸和靶细胞的转染策略的最佳适应性。

提到了本发明一个特别有利的实施方案，其中所述蛋白质荷载有许多功能性组分。用这种方法，总的信号密度仍可增加，这样提高了转染效率并可能更好地控制转染。

当作为辅因子的核苷三磷酸如ATP存在时，许多NPF形成蛋白形成NPF结构。因此加入核苷三磷酸可稳定NPF。因此在本发明的方法中，所述NPF结构可有利地被核苷三磷酸和/或这些不可水解的类似物形成或稳定，尤其是ATP(腺苷三磷酸)和/或GTP(三磷酸鸟苷)和/或其不可水解的类似物。这也可在光化学反应后通过共价结合而发生。不可水解的核苷三磷酸的类似物包括，例如，ATP-γ-S(腺苷5’-O-3-硫代三磷酸)和GTPγs(尿苷5’-O-3-硫代三磷酸))(Ellouze，1999)。在光化学反应后修饰NPF-ATP酶的可能的ATP类似物包括8N₃ATP(8-叠氮腺苷5’-三磷酸)和5’FSBA(5’-p-氟代磺酰苯甲酰腺苷)(Knight，1985)。

在本发明方法的有利的实施方案中，这是与其它用于生物活性分子的生物和/或化学和/或物理转染方法，如脂质体介导的转移、微注射、电穿孔、免疫穿孔、弹道法、在阳离子脂质的帮助下转移、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚爱或pH-敏感的水凝胶结合使用的。这种类型的转移方法，尤其是电穿孔，可有利地支持转染过程的各个步骤，例如输入细胞的胞质溶胶。

优选的本发明的转染剂包括选自含有RecA、RadA、ScRad51、RAD51、hDmcl、SASP、ICP8的蛋白的NPF形成蛋白，优选UvsX，更优选hRAD51或该组中至少两种蛋白质的混合物或一种或几种这些蛋白质的衍生物。本发明实施方案的NPF形成蛋白包括例如大肠杆菌的RecA以及来自病毒、原核细胞和真核细胞的其功能性同系物，如来自噬菌体T4的UVsX(Mosig，1987)、古细菌的RadA(Seitz等，1998)、酿酒酵母的ScRad51、哺乳动物的RAD51，以及尤其是人的hRad51。在至少60种不同的细菌(Roca和Cox，1990，Karlin和Brocchieri，1996，Karlin等，1995)、古细菌(Sandler等，1996)、所有已检真核细胞(Ogawa等，1993)、线粒体(Thyagarajan等，1996)和质体(Cerutti等，1992)中都检测到了RecA同源蛋白。RecA及其同源物与单链或双链DNA形成直径约为11nm的螺旋NPF。RecA的结合是协同的，并导致DNA螺旋的部分解旋。RecA、UvsX、ScRad51和hRad51形成具有结合化学剂量为每个单体三个碱基对(双链DNA)或每个单体3-6个核苷酸(单链DNA)的NPF(Bianco等，1998，Baumann和West，1998)。减数分裂特异的重组酶hDMCl是优选的；它和双链DNA形成了由线性排列的堆积蛋白质环构成的丝(Masson等，1999)。此外，杆菌和梭菌孢子的SASP蛋白质(小的酸溶性孢子蛋白)也是优选的。所述SASP也与双链DNA结合形成直径约为6.6nm的螺旋状NPF(Griffith等，1994)。可与单链和/或双链DNA形成丝的病毒蛋白质如单纯疱疹的蛋白质ICP80也是优选的作为NPF形成蛋白(Lee & Knipe，1985)。

每3个碱基对一个单体蛋白质的结合化学计量被证实可使NPF形成蛋白UvsX、Rad51和RecA与双链DNA完全结合(Bianco等，1998)。这种类型的完全结合可用UvsX实现，例如根据所用的结合缓冲液、核酸构象以及温度使用3-5倍过量的蛋白质(Yu和Egelman，1993)；用枯草杆菌的α/β型SASP，相应的蛋白质：DNA比例约为5:1(Griffith等，1994)。本发明文本中特别优选核酸与蛋白质的负载尽可能完全；这对各个优选的NPF形成蛋白是分别定义的。然而，核酸的不完全荷载低于特定NPF形成蛋白的绝对最高荷载程度在本发明文本中也是可能的。例如，当在转染步骤中使用额外的DNA结合蛋白或当必需为特定应用选择缓冲条件时，核酸与NPF形成蛋白的低荷载是优选的，其中所述特定应用对核酸和NPF形成蛋白完全荷载不是最佳的。

根据本发明，NPF形成蛋白应理解为包括天然的NPF形成蛋白及其衍生物。就NPF形成蛋白的衍生物而言，精通此领域的熟练技术人员应理解首先可通过在重组蛋白质中删除或插入额外的氨基酸序列或蛋白质域和/或以化学修饰已经存在的分子基团来引入官能团和/或化学偶联蛋白质、肽、碳水化合物、脂质或其它分子进行修饰。

本发明的转染剂也可有利地用来产生用于人和动物基因治疗处理的药物。可使治疗上有用的核酸与原代细胞接触和复杂的转染方法为本发明转染剂的形式。

本发明进一步的方面涉及含有本发明转染剂的药物制剂，可能还含有常规的佐剂和载体。

本发明进一步的方面涉及适合用核酸转染细胞的试剂盒，它包含至少一种能够形成本发明NPF的蛋白质和至少一种本发明的功能性组分以及至少一种以下组分：

a)核苷三磷酸和/或核苷三磷酸类似物

b)至少一种待转染的核酸

c)佐剂和添加剂

可根据技术人员的不同需要特殊设计这种试剂盒，例如，可根据某种核酸、靶细胞或稳定性要求，通过选择特定的NPF、特定的NPF修饰物或各种佐剂或添加剂将其最优化。因此所述已经荷载了功能性组分或蛋白质或功能性组分的蛋白质可独立包含在所述试剂盒中。

本发明进一方面涉及本发明的转染剂在细胞筛选中的用途，尤其是鉴定有丝分裂无活性或弱活性细胞、原代细胞和其它生命有限的细胞中所述转染剂的表达产物的激活剂或抑制剂。在制药工业中鉴定活性物质时，这种筛选是鉴定有效或无效的靶蛋白激活剂或抑制剂的基本方法。这些筛选方法通常经过计划，这样被外源核酸稳定转染的细胞就被暴露在潜在的抑制剂和/或激活剂中，并可确定它们对细胞生理学的影响，可能与作为比较的细胞相比。本发明的转染剂适合在加入激活剂或抑制剂前不久插入外源核酸，即使在有丝分裂无活性或弱活性细胞、原代细胞和其它生命有限的细胞中，并因此使这些细胞可作为受试细胞被接触。

本发明进一方面涉及本发明转染剂在鉴定生理活性核酸中的用途。这对于迅速和在生理上评价基因组数据特别重要，这些数据是科学界和药物界可获得的。由于用本发明转染剂进行的转染不取决于细胞分裂和/或胞吞，转染和分析之间的时间被大大缩短。这就可能有很高的样品流通量。即使是难以转染的细胞甚至是不分裂的细胞也可被本发明的转染剂接触。与对照细胞相比，所得转染和生理评估的变化使得对生理上有活性的核酸的鉴定变为可能。

缩写：

除了Duden¹中常用的缩写，使用了以下缩写：

AMP-PCP 腺苷-(β，γ-亚甲基)-二磷酸

AMP-PNP S’-腺苷酰亚胺二磷酸

DEAE 二乙氨基乙烷

DNA 脱氧核糖核酸

dYT 双酵母胰胨

FACScan 荧光激活细胞扫描

FCS 胎牛血清

FL 荧光

FSC 正向散射

GMP-PNP S’-鸟苷酰亚胺二磷酸

GTP 鸟苷三磷酸

H6 组氨酸六聚物

Ig 免疫球蛋白

kb 千碱基

ml 毫升

mM 毫摩尔

msec 毫秒

NCBI 国家生物信息中心

ng 纳克

nm 纳摩尔

PBS 磷酸缓冲盐溶液

PCR 聚合酶链反应

Pi 磷酸二氢钠/磷酸氢二钠

RNA 核糖核酸

RPMI Roswell Park纪念学会

SDS 十二烷基磺酸钠

SV40 猿病毒40

TAE Tris-乙酸/乙二胺四乙酸

U/mg 单位/毫克

rpm 每分钟转数

Cl-Puffer 细胞注射缓冲液

μg 微克

μl 微升

附图简述

图1：表达质粒的示意图

图1显示了实施例中所述的NPF形成蛋白的结构和生产的示意图。

图2：UvsX与双链DNA的结合

图2显示了200ng在每种情况中纯化的1kb PCR片段与给定量的溶于76mMK₂HPO₄、17mM KH₂PO₄、14mM NaH₂PO₄，pH＝7.2的H6UvsX、5mM MgCl₂和0或1mM ATP-γ-S的反应混合物，以15μl的终体积于室温下培育30min，然后加到0.8％ TAE/琼脂糖凝胶上，然后用溴化乙锭染色。

图3：存在不同的ATP类似物时NLS-修饰的UvsX与双链DNA的结合

将250ng纯化的1kb PCR片段与15μg溶于76mM K₂HPO₄、17mM KH₂PO₄、14mMNaH₂PO₄，pH＝7.2的UvsXH6N2、5mM MgCl₂和0.5或2mM所给核苷酸类似物以20μl的终体积于室温下培育30min。然后分开反应混合物并在其中一半(B)加入220ng的1.7kb PCR片段，在室温下培育30min；然后将所有反应混合物加到0.8％TAE/琼脂糖凝胶上，然后用溴化乙锭染色。

图4：UvsX和修饰的UvsX与双链DNA的结合

将200ng在每种情况中纯化的1kb PCR片段在76mM K₂HPO₄、17mM KH₂PO₄、14mMNaH₂PO₄，pH＝7.2、5mM MgCl₂和1mM ATP-γ-S以及给定量的纯化的H6UvsX或UvsXH6N2中于室温下培育30min，然后将所有反应混合物加到0.8％ TAE/琼脂糖凝胶上，然后用溴化乙锭染色。为排除作为盐的人工DNA的电泳行为的可能性，在泳道8和9中加入了痕量的咪唑或甘油、洗脱液或透析缓冲液样品。(最终浓度：1/10体积洗脱缓冲液和500mM咪唑、3/20体积透析缓冲液和50％甘油)。

图5：结合电穿孔进行的NIH3T3细胞转染的FACScan分析

图5a-d显示了FACScan分析：5a)没有DNA的电穿孔，5b)没有UvsX的载体DNA的电穿孔，5c)有包装在UvsX中的载体DNA，5d)有包装在UvsX-NLS中的载体DNA

图6：结合电穿孔进行的NIH3T3细胞转染的进一步的FACScan分析

图6显示了在有包装在NvsX-NLS(UvsXH6N2-2)中的载体DNA和包装在NvsX“缠绕的”NLS(UvsXH6N2sc)中的载体DNA时，对转染进行FACSscan分析的结果的柱状图。

图7：与微注射结合的NIH3T3细胞转染的荧光显微分析

在微注射的NIH3T3细胞中显示了荧光标记蛋白的表达(左边)。BSA-Cy5作为注射标记，在荧光滤波器中它是可见的(右侧)。图1和2显示了胞质中用DNA和UvsXH6N2sc注射的细胞；图3和4显示了用DNA和UvsXH6N2-2注射的细胞；图5和6显示了仅用DNA注射的细胞。

图8：SASP蛋白表达质粒的示意图

图8显示了实施例7和8所述的SASP蛋白的结构和生产的示意图。

图9：(A)SASP蛋白的纯化

(B)SASP蛋白的DNA结合能力

图9A显示了纯化的SASP蛋白的SDS凝胶。图9B显示了DNA移动分析中SASP蛋白与DNA的结合。

图10：(A)SASP-NLS蛋白的纯化

(B)SASP-NLS蛋白的DNA结合能力

图10A显示了纯化的SASP-NLS蛋白(SASP-H6N2)的SDS凝胶。图10B显示了DNA移动分析中SASP-NLS蛋白与DNA的结合。

图11：肽和RGD向H6UvsX移动的结合

图11显示了有或没有化学偶联的肽RGD2时H6UvsX蛋白的电泳分离。显示了两个单独制备的样品H6UvsX^*(RDG2)。在每个泳道中用1μg蛋白质。

图12：不同修饰的UvsX蛋白质与双链DNA的结合

图12显示了由双链DNA片段和H6UvsX^*(RDG2)与UvsXH6N2-2(泳道1)的混合物组成的NPF，或者单独的UvsXH6N2-2(泳道2)或单独的H6UvsX^*(RDG2)(泳道3)在琼脂糖凝胶上的分离。

图13：UvsXH6N2和UvsXH6N2NIT-2与荧光素标记的DNA结合的DNA移动分析

图13显示了DNA-UvsXH6N2和DNA-UvsXH6N2NIT-2的DNA移动。如实施例10所述，所述蛋白质与AlexaFluor488标记的DNA片段一起培育。

图14：通过胞吞作用在NIH3T3细胞中摄取NPF的荧光显微分析

图14a和14b显示了NIH3T3细胞的荧光显微图。每种情况下，一幅图显示了明视野图象(下图)，一幅在反射光荧光中(上图)。在明视野中可识别囊状的胞内区室，由于内吞的荧光素标记的DNA而发出荧光。

图15：含有内吞的NPF的细胞百分比

图15显示了抑制至少一种荧光囊状区室的细胞的百分比的柱状图。

图16：表达质粒的示意图

图16显示了用于生产hRAD51融合蛋白的表达质粒的结构示意图。

图17：NLS修饰的hRAD51(hRAD51H6N2)与双链DNA的结合

图17(A)显示了在镍螯合亲和层析后加有hRAD51H6N2(12.7μg)和hRad51H5(11μg)的SDS/考马斯凝胶。图17(B)显示了100ng在每种情况中纯化的0.9kb PCR片段和给定量的溶于38mM K₂HPO₄、8.5mM KH₂PO₄、7mM NaH₂PO₄，pH＝7.2的hRaD51H6N2、15mM MgC1₂、2.5mM ATP和25％甘油的反应混合物，所述混合物在30μl的终体积中于37℃培育10分钟，然后加到1％ TAE/琼脂糖凝胶上，再用溴化乙锭染色。

图18：不同修饰的UvsX(UvsX-NLS-VP22和UvsX-NLS)的混合物与双链DNA的结合

图18(A)显示了加有HvsXH6N2VP22c50的SDS/考马斯凝胶。

图18(B)：将100ng在每种情况中纯化的1.7kb PCR片段培育在96mM K₂HPO₄、21.5mM KH₂PO₄、18mM NaH₂PO₄，pH＝7.2、5mM MgCl₂和1.3mM ATP-γ-S中，并和指示量的纯化的UvsXH6N2VP22c50或UvsXH6N2-2在室温下培育30分钟。将所有的反应混合物加到0.8％ TAE/琼脂糖凝胶上，再用溴化乙锭染色。

图19：用DNA和UvsX-NLS-VP22和UvsX-NLS的混合物的复合体处理后转染的NIH3T3细胞

NIH3T3细胞的荧光显微图，用1μg表达载体DNA和19μg UvsXH6N2VP22c50和39μg UvsXH6N2-2的混合物的复合体处理24小时后。

图20：基于本发明核蛋白丝的方法和转染剂的基本结构的示意图。

发明详述

以下实施例将详细描述本发明，而不是将其限制在所例举的物质和方法之内。

实施例1：作为NPF形成蛋白的重组UvsX的产生

将蛋白质UvsXH6、UvsXH6-2、H6UvsX和H6UvsX-2用作NPF形成蛋白(见图1)。

蛋白质的结构：

UvsXH6(400个氨基酸)：

氨基酸1-391：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)，氨基酸392-394：由氨基酸G³⁹²GS³⁹⁴构成的接头，氨基酸395-400：由镍螯合亲和层析纯化的H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰，氨基酸交换：L⁴³→P。

UvsXH6-2(403个氨基酸)：

氨基酸1-391：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)，氨基酸392-394：由氨基酸S³⁹²YG³⁹⁴构成的接头，氨基酸395-400：H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰，氨基酸401-403：由氨基酸M⁴⁰¹YS⁴⁰³构成的C-末端。

H6UvsX(404个氨基酸)：

氨基酸1-4：由氨基酸M¹SYS⁴构成的N-末端；氨基酸5-10：H⁵HHHHH¹⁰，氨基酸11-13：由氨基酸S¹¹YG¹³构成的接头，氨基酸14-404：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)，氨基酸交换：Q³⁴⁰→L。

H6UvsX-2(404个氨基酸)：

氨基酸1-4：由氨基酸M¹GYS⁴构成的N-末端；氨基酸5-10：H⁵HHHHH¹⁰，氨基酸11-13：由氨基酸S¹¹YG¹³构成的接头，氨基酸14-404：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)。

表达质粒的克隆

为在合适的大肠杆菌细胞中表达上述蛋白质，在lac启动子的控制下构建了含有UvsXH6、UvsXH6-2、H6UvsX或H6UvsX-2编码序列的质粒(pExH-UvsXH6、pExH-UvsXH6-2、pExH-H6UvsX或pExH-H6UvsX-2，参见图1)。所述质粒是通过连接两种PCR产物产生的。第一种PCR产物扩增自pMCS5(MoBiTec，Gottingen，德国)。pMCS5是以与pBluescript SK(-)(Stratagene)类似的方式构建的，仅在lacZα片段编码序列的5’区域有所不同。因此PMCS5含有1ac启动子，然后是lac操纵基因，这样插入的编码序列的表达是基于活性lac阻遏物的缺乏。为了在任何情况下获得组成型表达，用这种方法选择扩增引物，即lac操纵基因不在PCR产物中出现。所得与pMCS5相对应的PCR产物从992-664位加限制性突出端。核苷酸GAATTC(EcoRI限制性位点)以及TGTGTG被加到992位之前(3’端至lac启动子)，核苷酸ACTAGT(Spe I限制性位点)和CACACA被加到664位之后，以便在用限制性内切酶EcoRI和SpeI消化后连接。用含有所需限制性位点、核糖体连接位点和额外密码子的引物PCR扩增T4DNA得到了UvsXH6、UvsXH6-2、H6UvsX和H6UvsX-2的编码序列。在其起始密码子之前的5’末端，所述PCR产物含有额外的核苷酸5’-CACACAGAATTCATAAAGGAAGATATCAT-3’，在其终止密码子之后的3’末端有额外的核苷酸5’-ACTAGTTGTGTG-3’。

纯化：

在培养过夜的DH5中的pExH-H6UvsX接种1.5-31 dYT/氨基苄青霉素(200μg/ml)1:1000，然后和250UPM在37℃下生长过夜。以7000×g收获培养物，得到大约5-15g细菌沉淀物。将其在-20℃下冷冻1-3天。在冰中解冻沉淀物并将其悬浮在10-20ml冷的起始缓冲液中。在4℃下用10ml溶菌酶(Serva，190.000u/mg)和大约4g玻璃珠(Sigma，G-8893)缓慢搅拌1小时进行裂解。然后加入50μl DNA酶I(Serva，2mg/ml)并继续培育30分钟。裂解物离心之后(45分钟，10.000×g，4℃)，通过无菌滤器(孔径0.45μm)过滤上清，并将其加到平衡的预先装有Ni⁺⁺离子的1ml HiTrapTM螯合柱(Pharmacia)。根据各自的Pharmacia方案对含有组氨酸六聚物的蛋白质进行进一步的纯化步骤。在SDS/考马斯凝胶中加入等分的各种洗脱级分。将最纯的级分合并，并在Centriplus YM30柱(Millipore)上按照各自的方法进一步浓缩。然后，在4℃下用至少1000倍体积的ZI缓冲液将其透析两次(透析管：Spectra/Por，MWCO：25.000)，透析时间至少为1小时，然后在4℃用ZI缓冲液/50％甘油透析过夜。将透析液等分成30-50μl的级分并存储在-80℃。

所用缓冲液：

ZI缓冲液：76mM K₂HPO₄、17mM KH₂PO₄、14mM NaH₂PO₄，pH＝7.2

起始缓冲液：20mM Pi、0.5M NaCl、10mM咪唑，pH＝7.4

洗涤缓冲液：20mM Pi、0.5M NaCl、20-50mM咪唑，pH＝7.4

洗脱缓冲液：20mM Pi、0.5M NaCl、100-500mM咪唑，pH＝7.4

浓度测定：

通过测量OD₂₈₀并用Gene Inspector^TM(Textco，Inc)软件计算消光系数，以此来确定UvsX蛋白质的浓度。H6UvsX的浓度为2.5-3.5μg/μl.

实验描述：

将在Ni⁺⁺琼脂糖上纯化的H6UvsX与200ng1kb的PCR片段(有或没有1mM ATP-γ-S)一起培育。

蛋白质的结合使DNA移到琼脂糖凝胶上，即基于浓度H6UvsX与双链DNA结合，且这种结合被ATP-γ-S增强。

随着ATP-γ-S、蛋白质-DNA复合体的形成，与没有ATP-γ-S相比，这种复合体可更加强烈地被溴化乙锭染色，这表明核苷酸类似物使核蛋白丝发生了拓扑变化。

实施例2：转染剂的产生，基于UvsX作为NPF形成蛋白并以核定位信号作为功能性组分

如实施例1，制得了允许融合蛋白UvsXH6N2、UvsXH6N2-2、N2H6UvsX和N2H6UvsX-2表达的质粒，这是基于实施例1中所述的蛋白质，此外还含有核定位信号(参见图1)。

蛋白质结构：

UvsXH6N2(426个氨基酸)：

氨基酸1-391：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)，氨基酸392-394：由氨基酸G³⁹²GS³⁹⁴构成的接头，氨基酸395-400：H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰，氨基酸401-403：由氨基酸G⁴⁰¹GS⁴⁰³构成的接头，氨基酸404-417：核定位信号nls-2(氨基酸2-15，SEQ ID NO：9，来自WO 00/40742)，氨基酸418-421：噬菌体T4的UvsX的C-末端(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸388-391)，氨基酸422-426：由氨基酸K⁴²²LVTG⁴²⁶构成的C末端，氨基酸交换：Y²³⁸→V。

UvsXH6N2-2(420个氨基酸)：

氨基酸1-391：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)，氨基酸392-394：由氨基酸S³⁹²YG³⁹⁴构成的接头，氨基酸395-400：H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰，氨基酸401-403：由氨基酸M⁴⁰¹YS⁴⁰³构成的接头，氨基酸404-417：核定位信号nls-2(氨基酸2-15，SEQ ID NO：9，来自WO 00/40742)，氨基酸418-420：由氨基酸G⁴¹⁸YP⁴²⁰构成的C-末端。

N2H6UvsX(420个氨基酸)：

氨基酸1-3：由氨基酸M¹SY³构成的N-末端；氨基酸4-17：核定位信号nls-2(氨基酸2-15，SEQ ID NO：9，来自WO 00/40742)，氨基酸18-20：由氨基酸L¹⁸YS²⁰构成的接头，氨基酸21-26：H²¹HHHHH²⁶，氨基酸27-29：由氨基酸S²⁷YG²⁹构成的接头，氨基酸氨基酸30-420：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)，氨基酸交换：Q³⁵⁶→L。

N2H6UvsX-2(421个氨基酸)：

氨基酸1-4：由氨基酸M¹GYS⁴构成的N-末端；氨基酸5-18：核定位信号nls-2(氨基酸2-15，SEQ ID NO：9，来自WO 00/40742)，氨基酸19-21：由氨基酸S¹⁹YS²¹构成的接头，氨基酸22-27：H²²HHHHH²⁷，氨基酸28-30：由氨基酸S²⁸YG³⁰构成的接头，氨基酸31-421：噬菌体T4的UvsX(NCBI蛋白质登录号：AAD42669，氨基酸1-391)。

表达质粒的克隆

为在合适的大肠杆菌细胞中表达，在lac启动子的控制下构建了含有UvsXH6N2、UvsXH6N2-2、N2H6UvsX或N2H6UvsX-2编码序列的质粒(pExH-UvsXH6N2、pExH-UvsXH6N2-2、pExH-N2H6UvsX和pExH-N2H6UvsX-2，参见图1)。如实施例1所述，质粒是通过连接两种PCR产物产生的(参见图1)。

纯化：

如实施例1中所述对H6UvsX的纯化来进行UvsXH6N2的纯化。

浓度：10-20μg/μl。

实验描述：

使UvsXH6N2与双链DNA结合。用ATP-γ-S稳定此结合：为检测各种ATP类似物对UvsXH6N2与DNA结合性能的影响，首先将所述蛋白质与1kb DNA片段和各种ATP类似物一起培育。然后，加入1.7kb DNA片段进行竞争。如果加入一种ATP类似物可稳定所述蛋白质与DNA的结合，则可预测只要不存在平衡，HvsXH6N2就不大可能与竞争性DNA片段结合。如图3所示，与所有其它使用的ATP类似物相比，用1kb片段和UvsXH6N2产生的蛋白质-DNA复合物在ATP-γ-S和1.7kb片段不存在时保持稳定，即在观察时间内1.7kb片段显然不会被释放的UvsXH6N2分子占据或仅仅或多或少地占据。

实施例3：用修饰和未修饰的NPF形成蛋白的混合物产生转染剂

实验描述：

将不同比例的H6UvsX和UvsXH6N2和1kb DNA片段一起培育。由于它们的分子量不同，这两种蛋白质以不同的程度阻滞DNA(参见图4的柱2和3)。如果在加入DNA之前将所述蛋白质混合，基于H6UvsX和UvsXH6N2的比例形成了中间复合体，这产生了明显的条带，并因此有相等的平均分子量。这说明所述DNA在统计学上被两种蛋白质等同占据。

实施例4：结合电穿孔用UvsX-NLS转染细胞系(NIH3T3)

用编码鼠MHC I型蛋白H-2K^K重链的载体转染NIH3T3-Zellen(粘着，培养至70-80％汇合)。室温下，用25ng载体DNA将1×10⁶个细胞电穿孔30分钟，所述细胞已经预先培育在结合缓冲液(76mM K₂HPO₄、17mM KH₂PO₄、14mM NaH₂PO₄、5mM MgCl₂，pH＝7.21)中，该缓冲液中含有14μg UvsX或UvsX-NLS，且含或不含1mM ATP-γ-S。为了此目的，将所述细胞加到终体积为100μl的电穿孔缓冲液(103mM NaCl，5.36mMKCl，0.41mM MgCl₂，23.8mM NaHCO₃，5.64mM Na₂HPO₄，11.2mM葡萄糖，0.42mMCa(NO₃)₂，20mM HEPES，3.25μM谷胱甘肽)中，并在电极间隔为2mm的小槽中进行电穿孔。在240V电压和450μF电容下通过指数放电进行电穿孔。电压下降的半衰期通常为12msec。电穿孔后立即用培养基(含有10％FCS的RPMI)将细胞从小槽中洗出，在37℃下温育10min，然后转移到用培养基预热的培养皿中。培育6h后，收获细胞并用PBS洗涤两次，然后和Cy5偶联的抗-H-2K^K抗体一起培育，并通过流式细胞计数(FACScan)进行分析。用碘化丙锭染色确定死细胞的数目。电穿孔6小时后，用被游离载体DNA转染的7.4％或8.7％细胞表达H-2K^K蛋白(平均减去0.25％的本底)。比较而言，用载体UvsX转染的细胞的表达率为2.9％或3.8％。用载体UvsX-NLS转染后的表达率为19.2％或18.9％(参见图5a-5d)。

为检查核转运，选择物理过程的电穿孔，这样UvsX以外的其它生化成分就不会影响转染。然而，UvsX与ATP-γ-S对DNA的紧密结合会影响所述复合体在电场中的迁移率，并因此降低电穿孔的效率约60％。单独连接核转运信号导致在该系统中转染后不久表达平均增加到5.7倍。因此，与UvsX相比，UvsX-NLS造成表达率的增加证明以核转运信号用作功能性组分，UvsX可将DNA转运进细胞核。在转染后不久进行的一项分析有显著改进，这是由于即使细胞变得可接触也不会在转染和分析之间分裂。

实施例5：用UvsX-缠绕的-NLS或结合电穿孔用UvsX-NLS转染细胞系(NIH3T3)

UvsX-缠绕的-NLS的产生

为测试核定位信号对转染的影响，出于比较目的制得了UvsX衍生物，其净电荷与具有NLS的UvsX蛋白一致，但其本身不含有功能性NLS。

采用部分同源的寡核苷酸引物，从质粒pExH-UvsXH6N2-2扩增出UvsX基因(比较图1)，这样就在所得蛋白质UvsXH6N2sc而不是氨基酸序列EEDTPPKKKRKVED(“nls-2”，相应于WO 00/40742的SEQ ID NO：9的氨基酸2-15)的C末端表达氨基酸序列SEQ ID NO：1(“缠绕的”，即混合的NLS序列)。就其成分而言，缠绕的氨基酸与所述的nls-2一致，但它们的顺序不同。因此，UvsXH6N2-2和UvsXH6N2sc的净电荷是相等的，但只有UvsXH6N2-2含有完整的核定位信号。

如实施例1中对蛋白质的纯化来纯化蛋白质UvsXH6N2sc。

用编码荧光标记蛋白的载体转染NIH3T3细胞(粘着，培养至70-80％汇合)。为了此目的，起初将25ng载体DNA与1.5mMATP-γ-S和16-18μg所述蛋白质在室温下于结合缓冲液(参见实施例1)中培育30分钟。将所述蛋白质-DNA复合体分别加到3×10⁵NIH3T3-Zellen中，重悬浮于80μl电穿孔缓冲液(140mM Na₂HP₄/NaH₂PO₄，10mM MgCl₂、5mM KCl，pH＝7.2)。在电极间隔为2mm的小槽中进行电穿孔。在240V电压和450μF电容下通过指数放电进行电穿孔。电压下降的半衰期通常为12msec。加入400μl由RPMI640(Gibco公司)、5％FCS、2mM glutamax(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，Invitrogen)、100U/ml青霉素/链霉素，0.5mMβ-巯基乙醇组成的培养基后，将细胞加到含有1ml预热的培养基的培养皿(6孔平板)中，并在37℃和5％ CO₂中培育。

结果显示在图6中。用游离载体DNA转染的细胞9％表达标记蛋白。然而，用载体-UvsX-NLS(DNA+UvsXH6N2-2)转染的细胞的表达率为21％。相比，用载体-UvsX-缠绕的-NLS(DNA+UvsXH6N2sc)转染质的细胞的表达率仅为4％。

因此，与游离DNA相比以及与由非功能性核定位信号进行修饰相比，用核定位信号修饰的UvsX显著提高了效率。由于后一种转染是对照，这说明用UvsX修饰可使转染效率提高至5倍。因此，用本发明的方法或转染剂可显著提高转染效率。此外，在这里，例如，当NPF形成蛋白被修饰时，一种直接进入细胞核的目标控制转染方法可能是有利的(也可参见实施例6)。

实施例6：与微注射结合转染细胞系(NIH3T3)

将140ng的1.7kb表达载体DNA与9μg结合缓冲液中修饰的上述UvsX蛋白和1mM ATP-γ-S在20μl的终体积中于室温下培育30分钟。在注射前立即将约1μg/μl的BSA-Cy5用作注射标记。

在反向荧光显微镜(LeicaDMIL)下，使用微操作器和transjector(Eppendorf)，通过将样品装到Femtotipps(Eppendorf)上，在置于CELLocate盖玻片前的一天，微注射已接种到亚汇合的NIH3T3细胞。

在37℃和5％CO₂中再培育5小时后，在荧光显微镜(Diagnostic Instruments公司的Olympus BX60荧光显微镜，数码b/w相机SPOT-RT，分析软件：UniversalImaging公司的Metaview Imaging系统)中进行分析。

图7显示了微注射的NIH3T3细胞。图象1和2显示注射了DNA和UvsXH6N2sc的细胞进入胞质，图象3和4显示注射了DNA和UvsXH6N2-2的，细胞，图象5和6显示仅注射了DNA的细胞。当蛋白质-DNA复合体含有UvsXH6N2-2时仅观察到表达，即用核定位信号修饰的UvsX蛋白(图7，图象3)。在对照的细胞中(图7，图象5：只有DNA，或者图7，图象1：在注射期间，仅在胞质已地注射具有UvsX-缠绕的—NLS的DNA，在细胞核中则没有，未观察到表达，甚至使用很长曝光也未观察到。

实施例7：作为NPF形成蛋白质的重组体SASP的产生

从枯草杆菌克隆、表达和纯化SASP蛋白质

按照大写Khorana方法从8个寡聚核苷酸合成来自枯草杆菌的SspC基因(如Bertram和Gassen所述：Gentechnische Methoden，Gustav Fischer Verlag，1991，第212-213页)，所述SspC基用于SASP(小的、可溶于酸的孢子蛋白质)编码，并在所述质体pARAl3的Ncol和Bglll限制位点之间连接(Cagnon等，1991，ProteinEngng.4：843-847)。这是以所述具有NCBI蛋白质登录号NP_389876的蛋白质序列为基础。使用基因的密码子优选进行所述DNA的反转录，在大肠杆菌中强烈的表达并在(Andersson和Kurland 1990；Microbiol.Rev.54：98-210)中描述。所得质体pARA13-SASP作为用于克隆两种其它质体的基质，所述质体用于SASP蛋白质编码，它在N-末端(H6-SASP)或者C-末端(SASP-H6)处携带6个组氨酸的聚组氨酸序列(图8)。所述质体被转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)plysS(Novagen，Madison)，并铺在LB/氨苄青霉素/葡萄糖(0.2％)上。

用单个集落接种20ml M9基本培养基(0.2％葡萄糖)，并在37℃和220rpm下生长过夜。次日，在OD600约为1.0时用0.2％阿拉伯糖诱导所述培养物，并再生长6小时。将所述粗提取物(0.5ml在PBS/加样缓冲液中沉淀的培养物)加到高分辨率的SDS凝胶中(根据Schagger和von Jagow 1987；Anal Biochem.166：368-79)并用考马斯蓝染色(图9A)。

为了制备型纯化，将2L M9/葡萄糖用过夜的培养物1:200接种。之后，再在OD600约为1.0时用0.2％阿拉伯糖诱导所述培养物，并再生长6小时。然后使所述细菌沉淀并在-20℃下冷冻。以下，举例说明SASP-H6的纯化。解冻约7g沉淀物，并在14ml起始缓冲液中重悬浮(见实施例1)，用完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂cocktail，Roche，Mannheim的片剂补充，并在280瓦下在冰上进行超声处理3分钟(Labsonic U、Braun Biotech，Melsungen，重复脉冲：0.5秒)。所述提取物在4℃下离心。此外，如对UvsX蛋白质所述的，通过HiTrap螯合柱(AmershomPharmacia，Uppsala)来进行所述纯化。在200mM和500mM咪唑之间的级分包含高浓度的蛋白质，将它们混合并使用centriplus柱(YM-3，Millipore，Eschborn)浓缩至3ml。然后，用1×Z1缓冲液透析所述SASP蛋白质三次(见实施例1)，等份以约5微克/微升的浓度在-80℃下冷冻。

SASP蛋白的DNA结合能力的测试

在室温下，在1*Z1缓冲液成1/10×Z1缓冲液中用不同量的SASP蛋白预培育125ng(在各情况中)1.7Kb DNA片段30min，然后施加到0.8％TAE-琼脂糖凝胶。图9显示DNA完全被蛋白质结合。DNA-蛋白质带的扩散可能是由于在凝胶展开时蛋白质从DNA中解离所造成的。

实施例8：以作为NPF-形成蛋白的SASP和作为修饰的核定位信号为基础产生转染剂

为了产生具有作为功能组分的核定位信号(NLS)的SASP，通过PCR扩增的所述已经获得的克隆pARA13-SASP-H6的C-末端(见图8)加入编码核定位信号的DNA序列(来自WO 00/40742，“nls-2”，氨基酸2-15，SEQ ID NO：9)。上述质粒作为PCR模板。如实施例7所述，转化所得质粒pARA13-SASP-H6N2(见图8)，并由此纯化所述蛋白质SASP-H6N2。

所述SASP-NLS蛋白质的结合能力的测试

在室温下，在1×Z1-Puffer中用不同量的SASP-H6N2蛋白质预培育125ng的各1.7kbDNA片段，然后施加到0.8％ TAE-琼脂糖凝胶。

图10B也显示了通过NLS-修饰的SASP来抑制所述DNA。所述DNA蛋白染色体带出现扩散。

实施例9：作为功能组分用于将复合体连接到细胞表面的具有整联蛋白结合基序的转染剂的产生

整联蛋白是细胞表面上的膜-锚定粘着蛋白，其中一些可识别作为结合配偶体的3种氨基酸的肽基序(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或者“RGD”基序)。所述结合导致在细胞表面上以及在细胞内吞作用中群集若干整联蛋白分子(Plow等，2001)。通过用RGD基序修饰作为NPF-结合蛋白的UvsX，可以实现将所述转染剂特别地通过整联蛋白吸收进入所述细胞的内体区室。

蛋白质的结构

所用蛋白质H6UvsX和UvsXH6N2-2和图1所示的相同，且如实施例1和2所述。

所述蛋白质H6UvsX*(RGD2)通过化学偶联产生。所述名为RGD2的蛋白质是由7型腺病毒的五邻体碱基蛋白质组成的九肽(NITRGDTYI)(Bal等，2000)，它以如下所述方式合成：在N-末端氨基处存在化学活性基团(SMCC，琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸酯)，这使得游离半胱氨酸SH基在所述UvsX蛋白质中偶联。

为了偶联，在37℃下，在76mM K₂HPO4、17mM KH2PO4、14mM NaH₂PO4、pH＝7.2中，用60nmol肽培育6nmol H6UvsX 1小时，然后经过MicroCon过滤器(10kDa截流量)用培养缓冲液通过几次洗涤步骤来纯化以除去过量的肽。通过在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的改变工作性能来检测成功的偶联。图11显示了在SDS聚丙烯酰胺凝胶上两个单独产生的H6UvsX*(RGD2)制备物。所述偶联的肽导致分子量增加，由此导致SDS凝胶中工作性能的改变。

试验说明：

UvsX-NLS和UvsX-RGD与双链DNA的结合以及混合的NPFs的形成：

用140ng(在各情况中)纯化的1.6kb PCR DNA片段和15微克H6UvsX*(RGD2)和4微克UvsXH6N2-2的混合物、单用4微克UvsXH6N2-2、以及单用15微克H6UvsX*(RGD2)，在室温下，在最终体积为20微升的76mM K₂HPO4、17mM KH₂PO4、14mM NaH₂PO4、pH＝7.2、5mM MgCl₂和1mM ATP-γ-S中培育所述反应产物30分钟，然后，转移到0.8％TAE/琼脂糖凝胶中，之后用溴化乙锭染色。电泳在100V下进行1小时。

图12显示了两种在其工作性能方面明显不同的具有DNA的不同修饰的蛋白质形式NPFs。由双链DNA片段以及H6UvsX*(RGD2)和UvsXH6N2-2(泳道1)的混合物组成的或者单由UvsXH6N2-2(泳道2)单独组成仅单由H6UvsX*(RGD2)(泳道3)组成的NPF在琼脂糖凝胶中电泳分离。由于蛋白质以少量存在，因此也存在游离DNA片段。反应中两种蛋白质和DNA片段结合在一起，形成混合的NPF、其分子量在纯蛋白质的NPF(泳道1)的分子量之间。从这一点可知，确定所述UvsX-NLS和UvsX-RGD结合于双链DNA并可形成混合的NPF。

实施例10：通过整联蛋白介导的胞吞作用将NPF特异的吸收进入细胞中

蛋白质的结构

如实施例1所述，用重组方法产生质粒UvsXH6N2NIT-2(图1)，它允许表达UvsX和整联蛋白结合RGD基序的融合蛋白。

氨基酸1-391：来自噬菌体T4的UvsX(NCB1蛋白质登录号AAD42669，氨基酸1-391)；氨基酸392-394：由氨基酸5³⁹²YG³⁹⁴组成的接头；氨基酸395-400：H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰；氨基酸401-403：由氨基酸M⁴⁰¹YS⁴⁰³组成的接头；氨基酸404-417：核定位信号nls-2(来自WO 00/40742氨基酸2-15，SEQ ID NO：9)；氨基酸418-420：由氨基酸G⁴¹⁸YP⁴²⁰和氨基酸421-432：RGD基序组成的C-末端，“NIT”：N⁴²¹ITRGDTYIPY⁴³²。

试验说明：

从荧光标记DNA和UvsX衍生物中产生NPF：

在室温下，在最终体积为200微升的76mM K₂HPO4、17mM KH₂PO4、14mM NaH₂PO4、pH＝7.2、5mM MgCl₂和1mM具有100微克纯化的UvsXH6N2或UvsXH6N2NIT-2的ATP-γ-S中培育1微克各自含有AlexaFluor488标记的dUTP(Molecualr Probes，Eugene，Oregon，USA)而不是dTTP纯化的的1.6kb PCR DNA片段30分钟，然后，将10微升各NPF反应产物施加到0.8％TAE/琼脂糖凝胶，之后用溴化乙锭染色。电泳在100V下进行1小时。图13显示所述DNA完全延迟。因此，所述蛋白质的DNA结合没有受到DNA荧光素标记的妨碍。

通过胞吞作用在NIH3T3细胞中摄取NPFs：

将NIH3T3细胞置于6孔平板(3×10⁵/孔)，在37℃和5％CO₂下培育过夜，在次日早晨用预热的不含FCS的培养基洗涤，之后，加入2ml不含FCS的培养基。加入192微升的NPF反应产物(见以上)，在室温下培育30分钟，除去上清液，洗涤所述细胞并用3ml培养基中(与10％FCS)覆盖。在培养箱中，在37℃下再培育1小时之后，在荧光显微镜下进行分析。在图14a和14b中，在明视野(下面)和反射光荧光(上面)中各显示了一幅图。

在明视野中，可以看见囊状胞内区室，由于内吞的DNA，它在荧光中发光(图14b，上面)。

拍摄各孔的几张照片。计算所述细胞并以百分数确定所述包含至少一种囊状区室的细胞比例(在图15中显示)。各图显示细胞平均数为35。与UvsXH6N2NIT-2反应，分析9幅图；与UvsXH6N2-2反应，分析5幅图。

所述结果显示与对照(UvsXH6N2-2)相比，用作为功能组分的整联蛋白结合基序(UvsXH6N2-NIT-2)修饰UvsX可以显著提高所述转染剂在细胞中的内吞吸收。

实施例11：以作为NPF形成蛋白为基础产生转染剂

所述蛋白质hRad51H6和hRad51H6N2用作NPF形成蛋白(见图16)。

蛋白质的结构

hRad51H6(352个氨基酸)：

氨基酸1-339：人Rad51(NCB蛋白质登录号Qo6609，氨基酸1-339)；氨基酸340-343：由氨基酸Y³⁴⁰SYG³⁴³组成的接头；氨基酸344-349：通过镍螯合亲和层析进行纯化的H³⁴⁴HHHHH³⁴⁹；氨基酸350-352：由M³⁵⁰YS³⁵²组成的C-末端。

hRad51H6N2(369个氨基酸)：

氨基酸1-339：人Rad51(NCB蛋白质登录号Q06609，氨基酸1-339)；氨基酸340-343：由氨基酸Y³⁴⁰SYG³⁴³组成的接头；氨基酸344-349：通过镍螯合亲和层析进行纯化的H³⁴⁴HHHHH³⁴⁹；氨基酸350-352：由M³⁵⁰YS³⁵²组成的接头；氨基酸353-366：核定位信号nls-2(来自WO 00/40742的氨基酸2-15，SEQ ID NO：9)；氨基酸367-369：由氨基酸G³⁶⁷YP³⁶⁹组成的C-末端。

表达质粒的克隆

为了在合适的大肠杆菌细胞中表达上述蛋白质，在Lac启动子(pExH-hRad51H6或pExH-hRad51H6N2，见图16)的控制下构建含有hRad51H6或hRad51H6N2的编码序列的质粒。pExH-UvsXH6-2和pExH-UvsXH6N2-2用作源质粒(见图16)。所述UvsX的编码区域用EcoR V和BsiVV I切断，并用具有hRad51编码区域的PCR片段代替，所述片段以相同方式切断。使用包含所需限制位点的hRad51特异性引物从人cDNA库中扩增。在起始密码子前的5’-末端处，所述PCR产品包含其它核苷酸5’-CACACATCTAGACGTACGGATATCAT-3’，且在其3’-末端，它们包含其它核苷酸5’-TACTCGTACGGAGGTGGCGGCCGCTGTGTG-3’，而不是终止密码子。

纯化：

在DH5中，使用pExH-hRad51H6或pExH-hRad51H6N2的集落接种5ml dYT/氨苄青霉素的预培养液(100微克/毫升)，在37℃下以250rpm培养5小时。用这种预培养液接种10I dYT/氨苄青霉素(100微克/毫升)，并在37℃下用210UPM再培养24小时。以7000×g收获所述培养物，并产生约30-50g细菌团粒。在-20℃下冷冻1-3天。在冰上解冻所述团粒，并在100ml冷的起始缓冲液中重悬浮。然后，使用B.Braun Labsonic U(大探针，参数：300瓦，0.5秒脉冲/秒，8分钟超声处理)。然后，在4℃下用10mg溶菌酶(Serva，190，000u/mg)培养，并在缓慢搅拌中加入50微升DNAse I(Serva，2mg/ml)之后再培养30分钟。通过离心除去袭解物(45分钟，18000×g，4℃)，通过消毒过滤器过滤上清液(孔径0.45微米和0.2微米)，并装在预先荷载有Ni⁺⁺离子的平衡1ml HiTrap TM螯合柱(Pharmacia)上。根据所述各针对蛋白质的Pharmacia方案进行另一纯化步骤，所述蛋白质已经用组氨酸六聚物提供。各种洗提级分的等分加到SDS/考马斯凝胶。混合所述最纯的级分，并根据各方案通过Centriplus YM30柱(Millipore)进一步离心分离。然后，各自在4℃下用至少一个千倍体积的Z1缓冲液透析两次(透析管：Spectra/Por，MWCO：25.000)1小时，然后在4℃下用ZI缓冲液/50％甘油透析过夜。所述透析产物在30-50微升级分中等分，并储存在-80℃。图17A显示所述纯化的pExH-hRad51-H6或pExH-hRad51-H6N2蛋白质。

所用的缓冲液：

如实施例1所述，但是不同的洗提缓冲液：20mM Pi，0.5M NaCl，

100-1000mM咪唑，pH＝7.4

浓度的测定：

使用所述Gene Inspector TM软件(Textco，Inc.)计算消光系数，通过测量OD₂₈₀来测所述hRad51蛋白质的浓度。

对hRad51H6或hRad51H6N2来说，它为11-13微克/微升。

试验说明：

NLS-修饰的hRad51与双链DNA的结合：

用100ng各0.9kb PCR片段培育经过Ni⁺⁺-琼脂糖凝胶纯化的hRad51H6N2。

由蛋白质结合引起的琼脂糖凝胶中的DNA移动表明，hRad51H6N2协同结合双链DNA，以所述浓度为基础(图17B)。即使是少量的hRad51H6N2，单个DNA分子被hRad51H6N2完全结合，因此，最大程度上被阻滞，使所述DNA的阻滞因蛋白质量的增大而不再增大。结论为所述hRad51H6N2结合dsDNA。

实施例12：以具有用于非内体膜渗透信号的UvsX和作为功能组分的核定位信号为基础产生转染剂

如实施例1所述，产生表达融合蛋白UvsXH6N2VP22c50的质粒(见图1)，它还包含一部分人疱疹病毒1的外被蛋白质VP22(基因UL49)，它以实施例2中所述的蛋白质UvsXH6N2-2为基础。本文所用的VP22肽作为非内体透入细胞膜的信号。因此，所述融合蛋白UvsXH6N2VP22c50包含膜转导信号和核定位信号(NSL)。

蛋白质的结构：

UvsXH6N2VP22c50(474个氨基酸)：

氨基酸1-391：来自噬菌体T4的UvsX(NCB1蛋白质登录号AAD42669，氨基酸1-391)；氨基酸392-394：由氨基酸S³⁹²YG³⁹⁴组成的接头；氨基酸395-400：H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰；氨基酸401-403：由M⁴⁰¹YS⁴⁰³组成的接头；氨基酸404-417：核定位信号nls-2(来自WO 00/40742的氨基酸2-15，SEQ ID NO：9)；氨基酸418-422：由氨基酸G⁴¹⁸YP⁴²²组成的接头，氨基酸423-472：人疱疹病毒的外被蛋白质VP22(GenUL49)的一部分(NCBI蛋白质登录号NP_044651，氨基酸252-301)，氨基酸473-474：由氨基酸P⁴⁷³R⁴⁷⁴组成的C-末端。

表达质粒的克隆：

为了在合适的大肠杆菌细胞中表达，通过用Acc65 I和Spe I进行限制酶消化来打开pExH UvsXH6N2-2(见实施例1和图1)，并用Acc65 I和Nhe I切断的PCT产物来连接，在5’-末端包含另一核苷酸5’-CACACAGGTACCCGGGATCC-3’，在3’-末端包含另一核苷酸5’-CCTAGGTAATAATAAGCGGCCGCGCTAGCTGTGTG-3’，以及用于人疱疹病毒1的外被蛋白质VP22(基因UL49)的最后50个氨基酸的编码序列(NCBI核苷酸登录号NC_001806，核苷酸105486-106391的互补序列)(见图1)。

纯化：

如用于H6UvsX的实施例1所述，进行UvsXH6N2VP22c50的纯化。

浓度：1.8微克/微升。

试验说明：

各种修饰的UvsX(UvsX-NLS-VP22和UvsX-NLS)的混合物与双链DNA的结合：

在室温下，在96mM K₂HPO4、21.5mM KH₂PO4、18mM NaH₂PO4、pH＝7.2、5mM MgCl₂和1.3mM具有图18所示量的纯化UvsXH6N2VP22c50或UvsX H6N2-2的ATP-γ-S中培养140ng(在各情况中)纯化的1.7kb PCR片段30分钟。然后，将所有的反应产物加到0.8％TAE/琼脂糖凝胶，之后用溴化乙锭染色。所述两种蛋白质在其分子量和净电荷方面不相同，因此在电泳过程中不同程度的阻滞所述DNA，具有在凝胶袋中残留粘性的UvsXH6N2VP22c50的复合体，且不再移动(见图18B中的泳道1和7)。当它们加入DNA之前混合所述蛋白质时，根据UvsX H6N2-2和UvsXH6N2VP22c50的比例形成中间复合体，其迁移性能在未混合的复合体的迁移性能之间(图18B)。这表明所述DNA由两种蛋白质占据。也可能是不同修饰的或者一次或两次修饰的NPF形成蛋白的混合物。

实施例13：具有DNA复合物的细胞系(NIH3T3)和UvsX-NLS-VP22和UvsX-NLS混合物的转染

试验说明：

将2.5×10⁵细胞(NIH3T3)在铺在6孔平板的各孔中，并在次日用包含表达荧光报道蛋白的基因的载体进行转染。为此，在室温下，在结合缓冲液(76mM K₂HPO4、17mM KH₂PO4、14mM NaH₂PO4、5mM MgCl₂、1mM ATP-γ-S、pH＝7.21)中，用36微克UvsXH6N2VP22c50或者19微克UvsXH6N2VP22c50和39微克UvsX H6N2-2的混合物预培养0-1微克线状或者1微克环状DNA30分钟，并向细胞中加入1mlRPMI，所述细胞之前已经用PBS/BSA洗涤。在37℃ 5％CO₂下培养1小时之后，分别1mlRPMI/20％FCS，并在培养箱中进一步培养。4小时或24小时之后，在荧光显微镜下分析所述细胞。观察所述细胞，所述细胞在用线状或环状DNA以及UvsXH6N2VP22c50和UvsX H6N2-2的混合物的复合体处理之后表达所述报道基因。所述转染的细胞数随所用DNA或DNA-蛋白质复合物的量增大。

但是，用仅包含UvsXH6N2VP22c50或者无DNA的DNA复合体不能获得所述报道基因的表达。

因此，似乎通过NPF形成蛋白的修饰，有利于具有膜-活性肽的UvsX、VP22、细胞的转染，尤其是膜渗透。通过结合不同的修饰蛋白质、用VP22和NLS的修饰强调本发明方法的模性质或者转染剂(也见图20)。但是，所述VP22-修饰的UvsX允许非内体膜渗透，所述NLS-修饰的UvsX将转染的DNA从细胞质引导到细胞核，然后，在那表达了转染的DNA。

由此，可以以尤其有利的方式，可特别地灵活和高效控制复杂转染程序的各步骤。

序列表

<110>埃麦克萨有限公司(amaxa GmbH)

<120>模块转染系统

<130>A02114PCT

<140>PCT/DE02/00060

<141>2002-01-10

<150>DE 101 00 966.8

<151>2001-01-10

<160>1

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：nls-2的缠绕序列(WO 00/40742中SEQ ID NO：9的氨基酸2-15)，即相

同的氨基酸但顺序不同

<400>1

Claims

1.一种转染细胞的方法，它使用了至少一种能够形成核蛋白丝的蛋白质，其特征在于，待转染的核酸被荷载在蛋白质上，所述核酸和蛋白质形成丝状复合体，且该复合体最终被加到待转染的细胞中，且其中所述蛋白质起初被几种功能不同的影响一个或多个转染步骤的功能性组分修饰，和/或不同的蛋白质分别被功能不同的影响一个或多个转染步骤的组分修饰。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质经氨基酸和/或蛋白质域的删除或插入修饰。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质经氨基酸的化学改变修饰。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质经肽、蛋白质、碳水化合物、脂质的化学偶联修饰。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性组分使所述复合体与所述细胞表面结合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性组分使所述复合体通过细胞膜的非内体通道。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性组分使所述复合体从内体/溶酶体中释放。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性组分使所述复合体转运进细胞核。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质被荷载在多个功能性组分上。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合体是通过加入核苷三磷酸稳定化。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法与其它生物和/或化学和/或物理核酸转染方法联合使用。

12.一种转染剂，所述转染剂含有核蛋白丝，并由至少一种待转染的核酸和至少一种能够形成核蛋白丝的蛋白质构成，其特征在于，所述能够形成核蛋白丝的蛋白质被几种功能不同的影响一个或多个转染步骤的功能性组分修饰，和/或不同的蛋白质分别被功能不同的影响一个或多个转染步骤的功能性组分修饰。

13.如权利要求12所述的转染剂，其特征在于，所述蛋白质被负载在多个功能性组分上。

14.如权利要求12或13所述的转染剂，其特征在于，它含有作为丝形成蛋白的选自以下组的蛋白质：RecA、RadA、RAD51、hDmc1、SASP、ICP8，UvsX，hRAN51，或至少两种所列蛋白质的混合物。

15.如权利要求12或13所述的转染剂，其特征在于，所述功能性组分使所述试剂与所述细胞表面结合。

16.如权利要求12或13所述的转染剂，其特征在于，所述功能性组分使所述试剂通过细胞膜的非内体通道。

17.如权利要求12或13所述的转染剂，其特征在于，所述功能性组分使所述试剂从内体/溶酶体中释放。

18.如权利要求12或13所述的转染剂，其特征在于，所述功能性组分使所述试剂转运进细胞核。

19.如权利要求12-18中任一项所述的转染剂在生产用于人和动物基因治疗的药物中的应用。

20.一种药物制剂，其特征在于，所述制剂含有如权利要求12-18中任一项所述的转染剂。

21.一种试剂盒，它适合转染含有核酸的细胞，其特征在于，所述试剂盒含有至少一种能够形成核蛋白丝的蛋白质，至少一种待转染的核苷酸和至少一种如权利要求12-18中任一项所述的功能性组分，以及至少一种以下组分：

a)核苷三磷酸，

b)佐剂和添加剂。

22.权利要求12-18中任一项所述转染剂用于鉴定表达产物的活化剂或抑制剂的用途。

23.权利要求12-18中任一项所述的转染剂转染用于鉴定具有生理活性的核酸的用途。