DE19925052B4

DE19925052B4 - Proteinkomplexe für den zielgerichteten Transport von (Poly)Peptide und Nukleinsäuren und sequenzspezifische Integration von DNA-Vektoren

Info

Publication number: DE19925052B4
Application number: DE1999125052
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-01
Filing date: 1999-06-01
Publication date: 2012-01-12
Anticipated expiration: 2019-06-02
Also published as: DE19925052A1

Abstract

Transportsystem auf Proteinkomplex-Basis, umfassend eine Rekombinase, z. B. HIV-1 Integrase (10), die mit einer sequenz-spezifischen DNA-bindenden Domäne (DBD) (6) fusioniert ist, die eine sequenz-unspezifische DBD der Rekombinase ersetzt, und weiterhin umfassend angekoppelte konstante und/oder variable Proteindomänen und/oder variable Nukleinsäure-Anteile.

Description

Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie. Es ist bekannt, dass es die Methodik der Gentherapie erlaubt, bestimmte DNA-Vektoren zu transportieren und in Zellen zu integrieren. Dafür werden Viren benutzt, deren DNA oder RNA entfernt und durch bestimmte transgene DNA oder RNA ersetzt wird. Ein solcher Virus infiziert eine Zelle, wobei ein Transgen von diesem Virus in die Zelle bzw. ins Zytosol übertragen wird.
Die Nachteile dieser Methodik bestehen darin, dass der Transport von DNA-Vektoren, die bestimmte Transgene enthalten, nicht zielgerichtet ist. Nach der Infektion verbleibt die virale Hülle ohne Nukleinsäuren und wird im Organismus abgebaut oder abgeführt, oder, wenn die transgene DNA bei der Infektion repliziert wird, muss man die Virusvermehrung nach einer bestimmten Zeit hemmen.
Außerdem ist die gentherapeutische Verwendung von Viren in vivo schwierig, weil die Partikel groß, in der Herstellung teuer usw. sind.
Die Effektivität bzw. der Wirkungsgrad der Gentherapie soll im Stand der Technik verbessert werden, indem eine DNA-Vektorsequenz unspezifisch zur Integration gebracht wird, wobei sie aber folglich neben oder in einem Onkogen oder wichtigen funktionalen Gen plaziert werden kann, wodurch neue Krankheiten verursacht werden können.
Das Spektrum der Krankheiten, die gentherapeutisch behandelt werden können, ist sehr breit. Z. B. werden mehrere Stoffwechselkrankheiten oder andere Krankheiten, wo ein Protein oder Enzym fehlt, durch die Mutation eines Gens für dieses Protein oder Enzym verursacht. Beim Insulin-abhängigen Diabetes ist die Mutation im Gen für Insulin vorhanden, oder die Expression dieses Gens wird ausgeschaltet. Bei der Parkinsonkrankheit ist die Mutation im Gen für Tyrosinhydroxylase vorhanden, bei der Taubheit ist die Mutation im Gen Connexin 16 vorhanden oder die Expression findet nicht mehr statt. So werden verschiedene Hormone, Enzyme, Proteine usw. bei der Mutation ihrer Gene funktionsunfähig oder gar nicht produziert.
Außerdem kann man die Krankheiten, die durch einen viralen, pro- oder eukaryontischen Erreger verursacht werden, effektiv gentherapeutisch behandeln. Die DNA-Vektoren, die eingeführt werden, enthalten die Gene für antisense RNA, die eine virale RNA blockiert oder für Ribozyme, die virale RNA sequenz-spezifisch spalten.
Bei der Proteintherapie werden Proteine, Enzyme, Hormone, nukleare Proteine, z. B. Transkriptionsfaktoren, in den Organismus eingeführt, z. B. wenn deren Konzentration nicht ausreichend ist.
Es gibt Anti-Tumor-Proteintherapien, wobei Angiostatin und Endostatin die Angiogenese hemmen und somit Tumorschwellungen von der Blutzufuhr abschneiden und absterben lassen. Die therapeutischen Proteine sollten auch zielgerichtet transportiert werden.
Eine erste Aufgabe der Erfindung ist es, einen zielgerichteten Transport von (Poly)Peptiden und Nukleinsäuren und eine sequenz-spezifische Integration von DNA-Vektoren zu erreichen. Manche transportierten (Poly)Peptide bzw. Proteine sollen, genau wie Nukleinsäuren, ins Zytosol gebracht werden.
Diese Aufgabe der Erfindung wird in einer ersten Ausführungsform beispielsweise dadurch gelöst, daß eine Rekombinase, z. B HIV-1 Integrase mit einer sequenz-spezifischen DNA-bindenden Domäne (DBD) fusioniert wird, die die eigene sequenz-unspezifische DBD ersetzt.
I.
Die HIV-1 Integrase ist ein virales Enzym, welches im Retrovirus HIV-1 vorhanden ist. Dieses Enzym katalysiert die Übertragung der viralen DNA in den Nukleus des Wirtes bzw. der befallenen Zelle und die Integration dort in die Chromosomen-DNA (s. Simon Litvak 1996. „Retroviral Reverse Transcriptases” S. 73–77). Die HIV-1 Integrase besteht aus 288 Aminosäuren und kann in drei funktionale Domäne geteilt werden:
Die erste von 1 bis 49 AS ist die N-terminale Domäne, die zentrale katalytische Domäne reicht von 50 bis 212 AS und die C-terminale Domäne weist eine starke sequenz-unspezifische DNA-bindende Aktivität auf (siehe Woerner AM, Marcus-Sekura CJ, „Characterization of a DNA-binding domain in the C-terminus of HIV-1 integrase by deletion mutagenesis.” Nucleic Acids Res 1993; 21: 3507–11).
Wenn man eine bestimmte DNA-Sequenz in der Chromosomen DNA kennt, wo ein DNA-Vektor spezifisch integriert werden muss, kann man eine sequenz-spezifische DNA-bindende Domäne (DBD), welche diese DNA-Sequenz in den Chromosomen findet und bindet modellieren, indem man sie in die kodierende DNA umschreibt und diese mit der kodierenden DNA für 1 bis 212 AS der HIV-1 Integrase durch DNA-Ligase fusionieren. Das Fusionsprotein wird auf diese Weise eine HIV-1 Intergrase, die einen DNA-Vektor sequenz-spezifisch in der Chromosomen DNA integrieren kann. Die Modellierung von sequenz-spezifischen DBD ist realisierbar (s. S. C. Harrison „A. Structural taxonomy of DNA-bindung domains.” Nature 353 (1991) 715–719; P. S. Freemont et al. ”Stuctural Aspects of Protein-DNA Recognition & 1. Winicor New Concepts in Protein-DNA Recognition. Sequence-directed DNA-binding and Flexibility” Prog. Nucl. Acid Res. Biol. 47 (1994) 195–270). Die sequenz-spezifische Integration ist notwendig, um eine Beeinträchtigung eines Onkogens oder eines Funktional-Gens zu vermeiden.
Die Fusion von Proteinen oder ihrer Domäne wird z. B. dadurch erreicht, des die DNA-Sequenzen für diese Proteine oder bestimmte Domänen durch DNA-Ligasen fusioniert und in ein optimales Expressionssystem eingeführt werden, oder Peptide können durch Peptidligasen z. B. Substiligasen fusioniert werden. Die rekombinante DNA Technologie mit einem optimalen Expressionssystem kann Proteine relativ billig und in großen Mengen produzieren.
Die HIV-1 Integrase, die eine sequenz-spezifische DBD enthält (zu HIV-1 Integrase-DBD-Fusionsproteinen siehe F. D. Bushman et al., J. Virol. (1997) 71 (1) 458–464 oder M. D. Miller et al., Curr. Biol. (1995) 5 (9) 1047–56), kann weiterhin mit einer Transkriptions-aktivierenden Domäne fusioniert werden, oder ein DNA-Vektor mit welchem sie interagiert, enthält einen Promotor z. B. eine TATA box für die Aktivierung der Transkription. Noch weiterhin kann dieses Fusionsprotein zusätzlich mit einer Protein-Protein-Interaktionsdomäne, wie z. B. Peptid-Antipeptid fusioniert werden oder ein Protease-sensitives Fragment zwischen der Protein-Protein-Interaktionsdomäne und der anderen Domäne enthalten.
II.
Eine erste Aufgabe der Erfindung ist es, einen zielgerichteten Transport von (Poly)Peptiden und Nukleinsäuren zu erreichen.
Die Immunglobuline z. B. IgG sind Proteine, die vom Immunsystem produziert werden, und können bestimmte Proteine, wenn sie ihre Antigene sind, zielgerichtet finden und binden. Ein IgG besteht aus einem Fab- und Fc-Fragment. Ein Feb-Fragment besteht aus einer leichten oder L-Kette und einer schweren oder H-Kette. Die L- und H-Ketten sind parallel und man kann ein Fab-Fragment in eine konstante und eine variable Region unterteilen. Die variable Region eines Fab-Fragments ist für die zielgerichtete Bindung eines Antigens zuständig. Man kann mit einer Hybridom-Technik die monoklonalen Antikörper erzeugen, die ein bestimmtes Antigen binden. (C. Milstein u. a., Nobelpreis f. Medizin. 1984). Die Fab-Fragmente der monoklonalen Antikörper können für den zielgerichteten Transport verwendet werden. Ein N-Terminus einer L- und/oder einer H-Kette wird mit einer Membranpenetrations-Domäne (MPD) z. B. des Bakteriophagen fd oder mit einem fusogenischen Peptid eines viralen Glycoproteins, z. B. dem HIV-1 gp 120 oder dem Influenza-HA fusioniert, damit ein solches Fab-Fragment Lipidmembranen penetrieren kann. Die C-Termini dieses Fab-Fragments können mit einer ”Hinge” Domäne fusioniert werden. Eine Hinge-Domäne befindet sich zwischen Fc- und Fab-Fragmenten und erlaubt die Flexibilität, durch die zwei kombinierte Fragmente unabhängig voneinander operieren können.
Variante a)
Ein C-Terminus der H- oder L-Kette wird mit einem beliebigen (Poly)Peptid fusioniert. Zwischen diesem (Poly)Peptid und einer anderen Domäne kann eine Protease-sensitive Domäne eingebaut werden. Dieses Peptid kann z. B. ein Endotoxin oder ein Peptidantibiotikum, eine „Death”-Domäne (DD), eine „Death Effector”-Domäne (DED) der Proteine MRIT/FLICS, ein Tubulin oder Mikrotubuli-Bindungspeptid, wie z. B. Gephyrin sein. Diese Komplexe (Proteinkomplex A) können gegen Krebszellen und gegen mikrobielle Krankheitserreger verwendet werden.
Das C-terminale Peptid kann auch ein Enzym, ein Transkriptionsfaktor, ein Transportprotein wie z. B. Serumalbumin, eine sequenz-spezifiscne oder -unspezifische RNA-bindende Domäne sein, welche z. B. mit einer antisense RNA, einem Ribozym, einer Telomerase RNA, die für die katalytische Aktivität der Telomerase notwendig ist, oder mit einer mRNA interagiert, oder eine DNA-bindende Domäne, z. B. Polylysin sein, welches mit einer antisense oder einer replikationsunfähigen DNA oder einem DNA-Vektor interagiert.
Das C-terminale Peptid kann ein Immortalisationsprotein, wie z. B. Telomerase, TRF 2 Peptidinhibitor des TRFs 1, ein ATPase Modul, z. B. beta-katalytische Untereinheit (subunit) der mitochondrialen ATPase sein. Weiterhin kann ein anderes C-terminales Peptid auch phosphoryliert werden, um sein Affinität zu erhöhen.
Variante b)
Ein C-Terminus der H- oder L-Kette wird mit einer Protein-Protein-Interaktions-Domäne fusioniert, welche mit der Protein-Protein-Interaktions-Domäne der rekombinierten und genetisch veränderten bzw. modifizierten HIV-1 Integrase interagieren bzw. Komplexe bilden kann. Diese Proteinkomplexe B können beliebige DNA-Vektoren durch Fab-Fragmente zu den bestimmten Zellen transportieren, durch MPD oder fusogenische Peptide Lipidmembranen penetrieren und ins Zytosol einführen, durch sequenz-spezifische DBD an bestimmte Sequenzen der chromosomalen DNA binden, und durch ihre Integrase-Domäne dort integrieren.
Nachdem der Proteinkomplex B ins Zytosol gelangt, wird er durch zelluläre Proteasen in Protease-sensitive Fragmente gespalten. Dabei wird die HIV-1 Integrase mit einem DNA-Vektor, einer sequenzspezifischen DBD und einer Transkriptions-aktivierenden Domäne im Zytosol freigesetzt bzw. vom Komplex getrennt. So kann sie zum Nukleus migrieren, um dort den DNA-Vektor sequenz-spezifisch zu integrieren und um die Expression eines Gens oder mehrere Gene des DNA-Vektors zu erreichen. Die Gene im DNA-Vektor können für beliebige Produkte bzw. für (Poly)Peptide wie z. B. Hormone (z. B. LH, FSH, Leptin, Insulin usw.), Enzyme (z. B. Tyrosinhydroxylase, Catalase, Telomerase, Superoxid-Dismutase usw.), Wachstumsfaktoren (z. B. NGF, VFGF, FGF usw.), Proteine (Collagen, Agrin, TRF 2 usw.) oder für Ribonukleinsäuren wie z. B. Telomerase RNA, die für die katalytische Aktivität der Telomerase notwendig ist, eine tRNA, eine rRNA, eine antisense RNA oder ein Ribozym gegen eine virale RNA kodieren. Ein Gen im DNA-Vektor kann auch für einen Rezeptor z. B. für Insulin, LH usw. kodieren.
Diese Komplexe (Proteinkomplex B) können gegen die Krankheiten, die durch eine Mutation oder Inaktivierung eines Gens verursacht werden, wie z. B. Stoffwechselkrankheiten, verwendet werden.
Ein Bestandteile bzw. eine Domäne der Proteinkomplexe sind Module, die man spezifisch gegen eine Krankheit modellieren und diese Komplexe herstellen kann. Die Komplexe enthalten konstante und variable Fragmente oder Domänen.
Die variablen Fragmente im Proteinkomplex A sind die variablen Regionen der Fab-Fragmente und die C-terminalen Peptide, die beliebig sein können. Die variablen Fragmente der Proteinkomplexe B sind die variablen Regionen der Fab-Fragmente, die sequenz-spezifischen DBD und Transkriptions-aktivierende Domänen.
Die Gene im DNA-Vektor sind auch beliebig. Die Aminosäuresequenzen der variablen Regionen der Fab-Fragmente variieren je nach Aminosäurensequenzen der Antigene, und die Aminosäurensequenzen der sequenz-spezifischen DBD variieren je nach Nukleotidsequenzen der DNA. Ein Fab-Fragment der Proteinkomplexe A und B ist ein Modul, weil er durch einen beliebigen, möglichst hoch-affinen Rezeptor wie z. B. CD4 oder CD 155 oder einen Liganden wie z. B. Insulin oder LH ersetzt werden kann.
Eine bestimmte Kombination der Module, der variablen Fragmente oder Domänen und der DNA-Vektoren in den Proteinkomplexen A und/oder B, gegen eine bestimmte Krankheit, habe ich eine „optimale Modulkombination” (optimal module combination, OMC) genannt. Hier sind einige Beispiele für die Modellierung der optimalen Modulkombination (OMC) gegen eine bestimmte Krankheit.
Beispiel 1 (Proteinkomplex A)
Ein Proteinkomplex A enthält ein N-terminales Fab gegen ein virales Glycoprotein oder einen Rezeptor wie z. B. ein extrazelluläres Fragment des CD4 oder CD 155, welches mit einer MPD fusioniert wird und mit dem viralen Rezeptor interagieren kann. Das C-terminale Peptid ist eine sequenz-spezifische RNA-bindende Domäne RBD, welche mit einem 3'- oder 5'-Ende einer antiviralen antisense RNA oder eines Ribozyms interagiert.
Das C-terminale Peptid kann auch eine RNase für die Spaltung der viralen RNA, eine Protease, oder ein Peptidinhibitor eines viralen Enzyms wie z. B. der HIV-1 reversen Transkriptase oder der Polio-viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase sein. Ein CD4 ist ein Rezeptor für HIV und CD155 ist ein Rezeptor für Polio-Virus. HIV und Polio-Virus sind RNA-Viren, deswegen kann ihre RNA als ein Angriffsobjekt dienen. Bei der Interaktion von CD4 mit einem HIV oder von CD155 mit einem Polio-Virus wird die Lipidmembran des Virus durch die MPD penetriert. Dabei wird die Struktur des Virus und folglich seine Infektionsfähigkeit beeinträchtigt. Wenn das Kapsid beschädigt wird und die virale RNA auf eine komplementäre antisense RNA, ein Ribozym oder eine RNase wie z. B. S1 Endonuklease trifft, so wird diese virale RNA entweder blockiert oder degradiert, welches eine effektive Bekämpfung von extrazellulären Viren darstellt.
Im Einsatz gegen DNA-Viren kann das C-terminale Peptid des Komplexes z. B. eine DNase oder eine SI Endonuklease sein, oder ein Polylysin welches mit einer antisensetriplexbildenden DNA interagiert.
Beispiel 2 (Proteinkomplex A)
Das C-terminale Peptid kann ein Polylysin sein, welches mit einem DNA-Vektor interagiert. Wenn der DNA-Vektor die Apoptose bzw. zellvernichtende Gene enthält, so kann dieser Proteinkomplex spezifisch gegen Tumorzellen eingesetzt werden. Ein Apoptose-Gen oder die Apoptose-Gene im DNA-Vektor können z. B. für folgende wachstumshemmende oder zytotoxische Proteine oder Peptide kodieren: für Diphteria-Toxin, welches die Proteinbiosynthese hemmt, für bakterielle Zytolysine, wie Streptolysin 0 (SLO), Streptolysin S, Pneumolysin, Alveolysin, Theta-Toxin oder Perfringolysin 0, Listeriolysin oder Alpha-Toxin (Phospholipase C), die die Zellmembran beeinträchtigen und die Zytolyse verursachen; für Perforine und Defensine, die Ionenkanäle in Lipidmembranen ausbilden, wobei Kalzium-Ionen aus dem extrazellulären Raum ins Zytosol einfließen, und die zytotoxische Wirkung bzw. Apoptose verursachen; für Zykline P12 oder P53; für Gephyrin, Tubulin- und Mikrotubuli-bindende Domänen der MAP Ia, MAP ib (Microtubule-associated Proteins) und des Tau Proteins. Die wachstumshemmende Wirkung dieser Proteine beruht auf der Bindung der Mikrotubuli des Zytoskeletts, wobei die Zellteilung bzw. die Mitose gehemmt wird.
Beispiel 3 (Proteinkomplex B)
Ein DNA-Vektor des Proteinkomplexes B kann z. B. das Gen für Insulin oder des Rezeptors für Insulin enthalten. Diesen Proteinkomplex kann man bei Insulin-abhängigem und Insulin-unabhängigem Diabetes mellitus verwenden.
Beim Insulin-abhängigen Diabetes ist die Expression der Gene für Insulin abgestellt, oder dieses Gen enthält eine funktionsstörende Mutation. Wird in diese Zelle das neue Gen für Insulin sequenz-spezifisch integriert, so produziert sie dieses Hormon weiter. Das Fab-Fragment des Komplexes findet und bindet in diesem Fall die Langerhansschen Zellen der Bauchspeicheldrüse, die Drüse die das Insulin produziert.
Beim Insulin-unabhängigen Diabetes ist die Expression der Gene für Rezeptoren für Insulin abgestellt. Das Insulin wird zwar produziert, aber es wird weniger Insulin-Rezeptor gebildet. Werden in den Muskelzellen, die am Insulin-Stoffwechsel beteiligt sind, die Gene für Insulin Rezeptoren sequenz-spezifisch integriert, so produzieren sie die Insulin Rezeptoren weiter. Wenn dieser Komplex kein Fab-Fragment im variablen Teil, sondern ein Insulin bzw. einen Liganden für die Insulin-Domäne des Komplexes, die mit einem Insulin-Rezeptor interagiert, enthält, so wird die Lipidmembran dieser Zelle durch die MPD penetriert und der Komplex gelangt mit dem Rezeptor ins Zytosol. Die HIV-1 Integrase mit der sequenz-spezifischen DBD und dem DNA-Vektor, welcher das Gen für den Insulin-Rezeptor und einen Transkriptionsaktivator, wie z. B. die TATA box enthält, wird durch zelluläre Proteasen, die im Ort des Protease-sensitiven Fragments spalten, vom Komplex getrennt. Sie migriert zum Nukleus und integriert den DNA-Vektor sequenz-spezifisch.
Die Nebenwirkungen bei der Verwendung der Proteinkomplexe A und B können z. B. durch Penetrationen der Zellmembran entstehen. Dabei ist es theoretisch besser, die Verwendung der Proteinkomplexe mit den anderen Präparaten zu kombinieren. Diese Präparate können z. B. Antientzündungsmittel wie z. B. Cyclooxygenase- und 5-Lipoxygenase-Inhibitoren, Membranmodifikatoren wie z. B. Phosphatidylserin u. v. a. Präparate sein.
Die folgenden Figuren sollen spezielle Ausgestaltungen der Erfindung erläutern.
In der 1 ist ein Proteinkomplex A schematisch dargestellt. Er enthält eine MPD 3, ein Fab-Fragment 1, eine Hinge- bzw. Flexibilitäts-Domäne 11, ein Polytyrosin- oder Polyserin-Fragment 25 für die Phosphorylierung, eine Disulfidbrücke 15 und ein bestimmtes C-terminalen Peptid 8. Die L-Kette besteht aus einem MPD 3, einer L-Kette (L) des Fab-Fragment 1 und der Phosphorylierungsdomäne 25. Die H-Kette (H) besteht aus der H-Kette des Fab-Fragments 1 der Hinge-Domäne 11, dem Protease-sensitiven Fragment 9 und dem C-terminalen Peptid 8. Die variable Region des Fab 1 und das C-terminale Peptid 8 sind variable Module (V), und die anderen Domänen sind konstant (C).
In der 2 ist ein Proteinkomplex B schematisch dargestellt. Er enthält ein MPD 3, einen Liganden 2, zwei miteinander interagierende Protein-Protein-Interaktionsdomänen 14 z. B. Peptid-Antipeptid mit hoher Affinität, eine Polytyrosin- oder Polyserin-Phosphorylierungsdomäne 25, eine Hinge-Domäne 11, ein Protease-sensitives Fragment 9, eine sequenz-spezifische DBD 6, die HIV-1 Integrase 10 mit dem DNA-Vektor 4, welcher einen Promotor 12 wie z. B. eine TATA box enthält. Die L-Kette (L) besteht aus der MPD 3, dem Liganden 2, einer Protein-Protein Interaktionsdomäne 14 und der Phosphorylierungsdomäne 25 für die Erhöhung der Affinität des Komplexes. Die H-Kette (H) besteht aus einer Protein-Protein Interaktionsdomäne 14, einer Hinge-Domäne 11, einem Protease-sensitiven Fragment 9, der sequenz-spezifischen DBD 6 und der HIV-1 Integrase 10. Der Ligand 2 und die sequenz-spezifische DBD 6 sind variable Module (V) und die anderen Domänen sind konstant (C), d. h. ihre Struktur wird bei der Modellierung des Komplexes nicht verändert.
In der 3 ist ein Proteinkomplex B schematisch dargestellt. Er enthält eine MPD 3, einen Liganden 2, eine Hinge-Domäne 11, ein Protease-sensitives Fragment 9, eine sequenz-spezifische DBD 6, die HIV-1 Integrase 10 mit dem DNA-Vektor 4, welcher einen Transkriptionsaktivator 12 wie z. B. eine TATA box enthält. Der Komplex besteht aus einer H-Kette, welche variable und konstante Module enthält. Der Ligand 2 und die sequenz-spezifische DBD 6 sind variable Module (V) und die anderen Domänen sind konstant (C). In der 4 ist die HIV-Integrase 10 mit der sequenz-spezifischen DBD 6 schematisch dargestellt.
In der 5 ist ein Proteinkomplex B schematisch dargestellt. Er enthält eine MPD 3, ein Fab-Fragment 1, eine Hinge-Domäne 11, eine Phosphorylierungsdomäne bzw. ein Polytyrosin- oder Polyserin-Oligopeptid 25, ein Protease-sensitives Fragment 9, zwei miteinander interagierende Protein-Protein-Interaktionsdomänen 14, eine sequenz-spezifische DBD 6, eine Transkriptions-aktivierende Domäne 13 und die HIV-1 Integrase 10 mit dem DNA-Vektor 4. Der Komplex besteht aus drei Ketten L, H1 und H2. Die L ist die kürzere Kette des Fab-Fragments und die H1 ist um eine Protein-Protein-Interaktiansdomäne verlängert, welche mit der Protein-Protein-Interaktionsdomäne der H2 Kette interagiert. Die Protein-Protein Interaktionsdomäne 14, die HIV-1 Integrase 10, der konstante Region des Fab-Fragment 1 und die MPD 3 sind konstante Module. Die variable Region des Fab-Fragments 1, die sequenz-spezifische DBD 6 und die Transkriptions-aktivierende Domäne 13 der H2 Kette sind variable Module. Die Ketten L und H1 sind durch die Disulfidbrücke 15 miteinander verbunden.
In der 6 ist ein Proteinkomplex A schematisch dargestellt. Er enthält eine MPD 3, ein Fab-Fragment 1, eine Polytyrosin/Polyserin-Domäne 25 auf der L-Kette, ein Protease-sensitives Fragment 9 und eine sequenz-spezifische (oder auch unspezifische wie z. B. Polylysin) DBD 6 oder RNA-bindende Domäne (RBD) 7 auf der H-Kette, welche mit einer einzel- oder doppelsträngigen DNA (ss/ds DNA) oder RNA 5 interagiert. Diese DNA kann z. B. eine antisense, triplex-bildende DNA oder ein Expressionsvektor, welcher ein Gen für ein Toxin enthält, sein und die RNA kann z. B. eine antisense RNA, eine mRNA, eine Telomerase RNA sein, die für die katalytische Aktivität der Telomerase notwendig ist. Diese Komplexe können gegen mikrobiellen Erreger, Tumor – und veralteten Zellen verwendet werden. Die L und H Ketten sind miteinander durch die Disulfidbrücke 15 verbunden. Die DBD 6 oder RBD 7 und die variable Region des Fab-Fragments sind variable Module. Die anderen Domänen sind konstante Module.
In der 7 ist ein Proteinkomplex B schematisch dargestellt. Er enthält eine MPD 3, ein Protease-sensitives Fragment 9, eine sequenz-spezifische DBD 6 und die HIV-1 Integrase 10 mit dem DNA Vektor 4, welcher eine transkriptions-aktivierende Sequenz bzw. einen Promotor 12 wie z. B. eine TATA box enthält. Dieses Fusionsprotein ist ein Monomer bzw. eine H-Kette. Die sequenz-spezifische DBD 6 ist ein variables Modul und die anderen Domänen sind konstant.
In der 8 ist ein System für die Produktion der Proteinkomplexe schematisch dargestellt. Das System enthält einen Container oder Behälter 16 mit einem Expressionssystem, Pumpen 17, ein Gerät z. B. die Zentrifuge 18 zur Isolierung und Reinigung von Proteinen, die im Expressionssystem im Behälter 16 produziert werden, einen Reaktor für die Mischung von z. B. zwei Edukten bzw. einen Misch- oder Mixreaktor 19, Rohrleitungen 20, die Behälter, Pumpen und Reaktoren miteinander verbinden, Ventile 21, für die Regulierung des Durchflusses, Container bzw. Behälter 22 für Nukleinsäuren, wie z. B. DNA-Vektoren, RNA, ssDNA usw., einen Behälter 23 für die gereinigten Tyrosin- oder Serinkinasen und Phosphatgruppen-Donatoren für die Phosphorylierung von C-Termini, und einen Behälter 24 für das End-Produkt.
Der Proteinkomplex A in der 1 findet und bindet ein bestimmtes Antigen bzw. Epitop durch das Fab-Fragment 1, penetriert die Lipidmembran durch MPD 3 oder ein fusogenisches Peptid und gelangt ins Zytosol oder in den intrazellulären Raum. Das Peptid 8 soll mit Hilfe dieses Antigens transportiert werden. Das Peptid 8 ist durch ein Protease-sensitives Fragment 9 und eine Hinge-Domäne 11 mit dem Fab-Fragment 1 verbunden. Der C-Terminus der leichten Kette (L) bzw. das Polytyrosin/Polyserie-Fragment 25 wird phosphoryliert, damit die Affinität des Komplexes erhöht wird. Die Hinge-Domäne 11 ermöglicht die Flexibilität eines Proteins. Diese Domäne befindet sich zwischen zwei beliebigen Domänen und somit können diese Domänen unabhängig voneinander operieren. Eine Hinge-Domäne gibt es in einem Immunglobulin G (IgG) zwischen F(ab')2 und dem Fc Fragment, und sie erlaubt unabhängige Aktivitäten von F(ab')2 und Fc. Zwischen der Hinge-Domäne 11 und dem Peptid 8 in der H-Kette befindet sich das Protease-sensitive Fragment 9, welches nach dem Eintreten ins Zytosol durch zelluläre Proteasen angegriffen wird. Nach der proteolytischen Spaltung in diesem Fragment 9 wird das Peptid 8 von den anderen Domänen getrennt. Dieses Peptid 8 kann beliebig sein, z. B. ein Transkriptionsfaktor, ein Endotoxin wie z. B. die H-toxische Kette des Vibrio cholerae-Endotoxins. Der Proteinkomplex A ähnelt einem einzelkettigen Antikörper (Single-Chain Antibody), wobei das Fc-Fragment durch ein beliebiges C-terminales Peptid ersetzt wird.
Der Proteinkomplex B in der 2 findet und bindet einen bestimmten Rezeptor auf einer bestimmten Zelle durch den Ligand 2, penetriert die Lipidmembran durch das MPD 3 oder ein fusogenisches Peptid 3 und gelangt ins Zytosol. Die Aufgabe des Proteinkomplexes B besteht darin, den DNA-Vektor 4 in dieser bestimmten Zelle sequenz-spezifisch zu integrieren. Diese sequenz-spezifische Integration des DNA Vektors 4 wird durch die HIV-1 Integrase 10, die eine sequenz-spezifische DBD 6 enthält, und mit einem hoch-affinen Protein-Protein-Interaktionsdomäne 14 fusioniert ist, erreicht. Zwischen der Protein-Protein-Interaktionsdomäne 14, welche die MPD 3, den Ligand 2, die Protein-Protein-Interaktionsdomäne und das Polytyrosin/Polyserin-Fragment 25 bzw. die L-Kette mit der H-Kette verbindet und der sequenz-spezifischen HIV-Integrase ist in der H-Kette ein Hinge 11 bzw. eine Flexibilitätsdomäne und ein Protease-sensitives Fragment 9 vorhanden. Nach dem Eintreten ins Zytosol wird das Protease-sensitive Fragment 9 durch Zellproteasen angegriffen und durch die proteolytische Spaltung wird die sequenz-spezifische HIV-1 Integrase 10 von den anderen Domänen getrennt. Die sequenz-spezifische Integrase mit dem DNA-Vektor bzw. die HIV-1 Integrase 10 mit der sequenz-spezifischen DBD 6 migriert zum Nukleus, gelangt durch die Nuklearporen in den Nukleolus, findet und bindet eine bestimmte Sequenz der Chromosomen-DNA durch den sequenz-spezifischen DBD 6 und integriert dort den DNA-Vektor 4 durch die Integrase, bzw. sie integriert den DNA-Vektor 4 sequenz-spezifisch. Der DNA-Vektor 4 enthält einen Transkriptionsaktivator 13 z. B. eine TATA box.
Der Proteinkomplex B in der 3 funktioniert ähnlich wie der Proteinkomplex in der 2, nur sind die Domäne bzw. das MPD 3, der Ligand 2, Hinge 11, Protease-sensitives Fragment 9, sequenz-spezifische DBD und die Integrase 10 mit dem DNA-Vektor 4, welcher einen Transkriptionsaktivator 13, z. B. eine TATA box enthält, in einer H-Kette miteinander fusioniert.
Die HIV-1 Integrase in der 4 ist ein retrovirales Enzym, welches die Übertragung und Integration von DNA-Vektoren katalysiert. Die HIV-1 Integrase besteht aus 288 Aminosäuren und kann in drei Domänen bzw. die N-terminale, die Zentrale katalytische Domäne und die C-terminale sequenz-unspezifische DBD unterteilt werden. Die C-terminale sequenz-spezifische DBD wird durch eine bestimmte sequenz-spezifische DBD ersetzt. Dafür wird die DNA, die für die Aminosäuresequenz von 1 bis 212 AS der HIV-1 Integrase kodiert, mit der DNA für eine sequenz-spezifische DBD z. B. durch DNA-Ligasen unter ATP Zugabe fusioniert, so dass beim Fusionsprotein die AS (Aminosäuren) 1 bis 212 AS eine Integrasedomäne darstellen und die 212 bis ca. 300–350 AS eine sequenz-spezifische DBD 6 repräsentieren. Die sequenz-spezifische DBD 6 kann nur eine bestimmte Sequenz der Chromosomen DNA finden und binden. Eine HIV-1 Integrase, die eine sequenz-spezifische DBD enthält, wird zu einer sequenz-spezifischen Integrase, weil sie durch ihre sequenz-spezifische DBD eine bestimmte Sequenz der Chromosomen-DNA finden und binden kann und genau dort den DNA-Vektor 4, mit welchem sie interagiert, integrieren kann. Der Proteinkomplex B in der 5 penetriert eine Lipidmembran durch die MPD 3 und gelangt ins Zytosol. Die Lipidmembran umhüllt das Antigen des Fab-Fragments 1. Nach dem Eintreten ins Zytosol wird der Komplex im Protease-sensitiven Fragment 9 durch zelluläre Proteasen gespalten, wobei die HIV-1 Integrase 10, mit dem DNA-Vektor 4, der sequenz-spezifischen DBD 6 und der Transkriptions-aktivierenden Domäne 13 vom Komplex getrennt werden. Das getrennte Fusionsprotein migriert zum Nukleus und gelangt durch die Nuklearporen in den Nukleolus. Dort integriert die HIV-1 Integrase den DNA-Vektor sequenz-spezifisch. Der Komplex enthält entweder eine Transkriptions-aktivierende Domäne 13 oder einen Promotor 12 im DNA-Vektor 4. Die DNA-Vektoren der Proteinkomplexe sind Expressionsvektoren.
Der Proteinkomplex A in der 6 funktioniert ähnlich wie der Proteinkomplex in der 5 und in der 1. Das C-terminale Peptid ist eine DBD 6 oder RBD 7, welche mit einer DNA oder RNA 5 interagiert Eine dsDNA kann z. B. für ein Endotoxin kodieren, eine ssDNA kann einen Duplex mit einer viralen ssDNA oder einen Triplex mit einer dsDNA eines Krankheitserregers bilden. Die RNA kann z. B. ein Ribozym oder antisense Duplex-RNA-bildende RNA sein. Solche Nukleinsäuren können die eines mikrobiellen, eukaryontischen Krankheitserregers oder einer Tumorzelle blockieren oder spalten. Die Affinität des Komplexes wird durch Phosphorylierung der Polytyr/Polyser-Domäne erhöht. Die Phosphorylierung wird durch Tyr- oder Ser-Kinasen erreicht.
Der Proteinkomplex B in der 7 ist nicht zielgerichtet, d. h. er findet keine bestimmten Zellen, um diese zu penetrieren. Er kann potentiell alle Lipidmembranen penetrieren und den DNA-Vektor einführen. Nach der Penetration einer Lipidmembran durch die MPD 3 und dem Eintreten ins Zytosol wird der Komplex im Protease-sensitiven Fragment durch zellulären Proteasen gespalten.
Die HIV-1 Integrase 10 mit der sequenz-spezifischen DBD 6 und dem DNA-Vektor 4 migriert zum Nukleus und gelangt durch die Nuklearporen in den Nukleolus. Dort findet und bindet sie eine bestimmte Sequenz der Chromosomen-DNA durch ihre sequenz-spezifische DBD 6 und integriert den DNA-Vektor 4 folglich sequenz-spezifisch.
Ersetzt man die DBD der HIV-1 Integrase durch eine bestimmte sequenz-spezifische DBD, so wird die Integrase eine sequenz-spezifische Integration eines bestimmten DNA-Vektors erreichen.
Die Retroviren z. B. HIV-1 sind auch zielgerichtet. Diese Eigenschaft wird dadurch erreicht, dass z. B. das HIV-1 gp120 nur die CD4-Rezeptoren findet und bindet.
Durch das System in der 8 wird die Synthese des Komplexes erreicht. Die Container 16 enthalten Expressionssysteme, die jeweils die Produkte der Gene X1, X2 und X3 produzieren. Die Produkte sind entsprechend Proteine PR1, PR2 und PR3. Diese werden exprimiert, isoliert, und durch die Pumpen 17 in die Geräte 18 für die Reinigung wie z. B. Zentrifugen gepumpt. Nach der Reinigung werden die Proteine PR1 und PR2 im Mischreaktor 1 gemischt. Die Proteine PR1 und PR2 sind z. B. L- und H-Ketten eines Komplexes (s. Tabelle A zur Synthese).
Im Mischreaktor 1 werden Komplexe, die aus H- und L-Ketten bestehen, mit DNA-Vektoren gemischt. Die gereinigten DNA-Vektoren werden aus dem Container 22 gepumpt. Der Container 22 kann auch gereinigte ssDNAs, RNAs oder andere Nukleinsäuren enthalten.
Die Kontrolle des Prozesses wird durch Pumpen 17 und Ventile 21 erreicht. Die Mischung aus dem Reaktor R1 wird in den Reaktor R2 gepumpt. Im Reaktor R2 werden die Komplexe A1, B2, B5 und A6 mit gereinigten Tyr- oder Ser-Kinasen und Phosphatgruppen-Donatoren, die aus dem Container 23 gepumpt werden, gemischt, damit die C-terminalen Phosphorylierungsdomänen dieser Komplexe phosphoryliert werden. Im Mischreaktor R2 werden die Komplexe B5, welche L- und H1-Kette enthalten, mit den H2-Ketten gemischt. Die H2-Ketten sind Proteine PR3 bzw. Produkte der X3 Gene und werden aus dem Container 16, welcher die PR3 enthält, in den Mischreaktor R2 gepumpt.
Die gereinigten DNA-Vektoren können aus dem Container 22 in die beiden Mischreaktoren 1 und 2 gepumpt werden. Die im Reaktor 2 (R2) gebildeten bzw. gentechnisch synthetisierten Proteinkomplexe werden in den Container 24 zum erhalt des Endprodukts gepumpt. Das Endprodukt soll in vitro und in vivo getestet bzw. geprüft werden. Die gereinigten Proteinkomplexe werden hauptsächlich intravenös injiziert.
Bezugszeichenliste

1: Fab-Fragment
2: Ligand
3: MPD oder fusogenisches Peptid
4: DNA-Vektor
5: RNA oder DNA
6: sequenz-spezifische DNA-bindende Domäne (DBD)
7: sequenz-spezifische RNA-bindende Domäne (RBD)
8: ein bestimmtes Peptid
9: ein Protease-sensitives Fragment
10: HIV-1 Integrase
11: eine Hinge-Domäne (Flexibilitäts- oder Gelenkdomäne)
12: ein Promotor im DNA-Vektor 4 wie z. B. eine TATA box
13: eine Transkriptions-aktivierende Domäne
14: Protein-Protein Interaktionsdomäne z. B. ein Peptid-Antipeptid mit hoher Affinität
15: eine Disulfidbrücke
16: ein Container oder Behälter mit einem Expressionssystem
17: eine Pumpe
18: ein Gerät zur Reinigung von Proteinen die im Expressionssystem produziert werden z. B. eine Zentrifuge
19: ein Reaktor für die Mischung von zwei Edukten (ein Misch- oder Mixreaktor) R1 Mischreaktor 1 R2 Mischreaktor 2
20: Rohrleitungen
21: Ventil
22: Container oder Behälter für Nukleinsäuren wie z. B. DNA-Vektoren, RNA oder ssDNA
23: Container oder Behälter für die gereinigten Tyrosin- oder Serinkinasen und Phosphatgruppen-Donatoren (ATP) für die Phosphorylierung von C-Termini
24: Container oder Behälter für End-Produkt
25: Polytyrosin-, Polyserie- oder Polythreonin-Fragment zur Phosphorylierung

Abkürzungen

AS

Aminosäure

MPD

Membran Penetrationsdomäne

DBD

DNA-bindende Domäne

RBD

RNA-bindende Domäne

N

H₂N-Ende oder N-Terminus eines Proteins

C

COOH-Ende oder C-Terminus eines Proteins

L

leichte bzw. kürzere Kette

H

schwere bzw. längere oder eine lange Kette

C

konstantes Fragment

V

variables Fragment

Hinge

eine Domäne für die Flexibilität eines Polypeptides; die Hinge-Domäne befindet sich zwischen zwei beliebigen Domäne und schafft die „Trennung”, somit können diese Domänen unabhängig von einander operieren

ph

phosphorylierter C-Terminus

Claims

Transportsystem auf Proteinkomplex-Basis, umfassend eine Rekombinase, z. B. HIV-1 Integrase (10), die mit einer sequenz-spezifischen DNA-bindenden Domäne (DBD) (6) fusioniert ist, die eine sequenz-unspezifische DBD der Rekombinase ersetzt, und weiterhin umfassend angekoppelte konstante und/oder variable Proteindomänen und/oder variable Nukleinsäure-Anteile.
Transportsystem auf Proteinkomplex-Basis, umfassend eine sequenz-spezifische RNA-bindende Domäne (RBD) (7), und weiterhin umfassend angekoppelte konstante und/oder variable Proteindomänen und/oder variable Nukleinsäure-Anteile.
Transportsystem nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als konstante Proteindomänen im Proteinkomplex mindestens angekoppelt sind a) ein konstanter Teil eines Fab-Fragments (1), b) eine Membran-Penetrations-Domäne (MPD) (3), c) ein fusogenisches Peptid (3), d) ein Protease-sensitives Fragment (9), und/oder e) eine Hinge-Domäne oder Flexibilitäts- oder Gelenkdomäne (11).
Transportsystem nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als variable Proteindomänen und/oder variable Nukleinsäure-Anteile im Proteinkomplex mindestens angekoppelt sind a) ein variabler Teil eines Fab-Fragments (1), b) ein Ligand (2), c) ein C-terminales Peptid (8), und/oder d) eine an die Rekombinase (10) angekoppelte Nukleinsäure, ein DNA-Vektor (4) umfassend eine Transkriptions-aktivierende Sequenz (13) oder einen Promotor (12), eine DNA (5) und/oder eine RNA (5).
Transportsystem nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei separate, miteinander gekoppelte Systembauteile, z. B. eine schwere H-Kette (H) und eine leichte L-Kette (1), als Proteinkomplex ausgebildet sind.
Transportsystem nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ankopplung der Einzeldomänen oder der Systembauteile untereinander mindestens eine Disulfidbrücke (15) ausgebildet ist.
Transportsystem nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ankopplung der Systembauteile untereinander mindestens eine Protein-Protein-Interaktionsdomäne (14) ausgebildet ist.
Transportsystem nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-aktivierende Sequenz (13), z. B. eine TATA box enthält.
Transportsystem nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der DNA-Vektor (4) für Proteine kodierende Gene umfaßt, z. B. kodierende Gene für Enzyme, Hormone, Rezeptoren z. B. für Insulin Transkriptionsfaktoren.
Transportsystem nach einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend z. B. a) ein Fab-Fragment (1) eines monoklonalen Antikörpers, und/oder b1) als Ligarad (2) z. B. Insulin oder Insulinrezeptor, und/oder b2) als Membran-Penetrations-Domäne (MPD) (3) z. B. die des Bakteriophagen fd oder ein Fusionspeptid z. B. eines retroviralen Glycoproteins oder des HA des Influenzavirus oder ein hydrophobes Peptid oder Polymer für die Penetration einer Lipidmembran, und/oder c1) als C-terminales Peptid (8) z. B. ein Endotoxin, ein Peptid-Antibiotikum, eine „Death Domän” (CD), eine Death-Effector Domain (DED) der Proteine MRIT/FLICE, ein Tubulin- oder Mikrotubuli-Bindungsprotein wie MAP1b (MAP-Microtubuliassoziiertes Protein), Gephyrin, ein aktives Fragment des HLA-B7, ein Enzym, ein Transkriptionsfaktor, ein Transportprotein wie z. B. Serumalbumin, eine RNA-bindende Domäne (RBD), welche z. B. mit einer antisense RNA, einer PNA (Peptide nucleic acid), oder einem Ribozym interagiert, welches z. B. virale RNA blockieren oder spalten kann, oder mit einer Telomerase-RNA interagiert, die für die katalytische Aktivität der Telomerase notwendig ist, oder mit einer mRNA interagiert, kodierend für ein (Poly)Peptid, ein Immortalisationspeptid wie z. B. TRF2, Peptidinhibitor des TRFs 1, Telomerase, Tankyrase, ein ATPase Modul, und/oder ein C-Terminus enthaltend Tyrosine, Serine oder Threonine (25) um z. B. durch Tyrosinkinasen oder Serinkinasen phosphoryliert zu werden, zur Erhöhung der Reaktionsfreudigkeit oder der Affinität, oder der C-Terminus ist mit einem Phosphopeptid verbunden, und/oder d1) einen DNA-Vektor (4) kodierend für verschiedene Proteine mit antitumoralen Eigenschaften, z. B. ein Diphteriatoxin, welches die Proteinsynthese hemmt, bakterielle Zytolysine wie Streptolysin 0 (SLO), Streptolysin S, Pneumolysin, Alveolysin, Thetatoxin oder Perfringolysin 0, Listeriolysin, Alphatoxin oder Phospholipase C, die Lipidmembranen beeinträchtigen können; Perforin und Defensine, die in Lipidmembranen Ionenkanäle ausbilden, wobei Kalziumionen ins Zytosol einströmen und den Zelltod verursachen; Gephyrin, Tau-Protein, Mikrotubulibindende Domäne, die die Mitose bzw. das Zellwachstum hemmen; Zykline P53, P12; Endonucleasen, Neocarcinostatin, die H-toxische Kette des Vibrio cholerae-Endotoxins, Enterotoxine von Staphylococcus aureus, Colicin E2, Colicin E3, antitumorale Proteine, Immortalisationsproteine und Nukleinsäuren wie z. B. Telomerase, Tankyrase, TRF2, Peptidinhibitor des TRFs 1, Beta-katalytische Untereinheit der mitochondrialen ATPase, Telomerase-RNA.
Verwendung eines Transportsystems nach einem der voranstehenden Ansprüche, um beliebige DNA-Vektoren durch Fab-Fragmente Rezeptoren oder Liganden zu Ziel-Zellen zu transportieren, durch MPD oder fusogenische Peptide die Membran zu penetrieren und in das Zytosol einzuführen, durch sequenz-spezifische DBD an bestimmten Sequenzen der Chromosomen-DNA zu binden und durch Integrasedomäne zu integrieren.
Verwendung eines Transportsystems nach einem der voranstehenden Ansprüche, um Proteinkomplexe nach dem Eintreten ins Zytosol durch zelluläre Proteasen an den Stellen der Protease-sensitiven Fragmente (9) zu spalten, eine Rekombinase z. B. HIV-1 Integrase mit einem sequenz-spezifischen DBD und einem DNA-Vektor (4) nach der Spaltung durch zelluläre Proteasen im Zytosol freizusetzen, d. h. vom Komplex zu trennen und zum Nukleus migrieren zu lassen, um dort den DNA-Vektor sequenz-spezifisch zu integrieren und eine Expression des Gens des DNA-Vektors über den Promotor (12) zu erreichen.
Verwendung eines Transportsystems nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung von Kombinationspräparaten aus Proteinkomplexen und anderen Bestandteilen, wie z. B. Membranmodifikatoren (Phosphatidylserin), Antientzündungsmittel und/oder Antioxidanten.
Verwendung eines Transportsystems nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung von Kombinationspräparaten gegen Krebszellen oder gegen pro- oder eukaryontische Krankheitserreger.
Verwendung eines Transportsystems nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung von Kombinationspräparaten, wobei das Protein (8), z. B. das neuronale Protein Gephyrin, oder die Tubulin- und Mikrotubuli-Bindungsproteine antitumorale Eigenschaften haben, zur Hemmung des Zellwachstums durch Störung des Zytoskeletts.
Verwendung eines Transportsystems nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung von Kombinationspräparaten gegen Krankheiten, die durch virale oder einzellige Erreger, Tumorzellen oder durch Mutation eines Gens, z. B. Stoffwechselkrankheiten, ausgelöst werden.