JPH06507545A

JPH06507545A - 組み換えハイブリッドポーリンエピトープ

Info

Publication number: JPH06507545A
Application number: JP4509343A
Authority: JP
Inventors: ゴールドステイン，ネイル; タックニー，チャールズ
Original assignee: イムクローン　システムズ　インコーポレーテッド
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1994-09-01
Anticipated expiration: 2016-10-02
Also published as: CA2105382C; WO1992016643A1; EP0575553A1; EP0575553B1; EP0575553A4; JP3213313B2; ATE174625T1; ES2127217T3; CA2105382A1; DE69227898D1; DE69227898T2; US5547670A; AU1749292A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えハイブリッドポーリンエピトーブ淋菌Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに起因する淋病等の疾病は世界中で最も蔓延した性病のひとつである。このような疾病は伝統的な抗生物質およびワクチン治療では制御困難であることが証明されている。

ＰＣＴ出願ＮＯ８９１０４８７３に＄いて、ＣａｒｂｏｎｅｔｔｉとＳｐａｒｌｉｎｇは、Ｎ、１＜ａｎｏｒｒｈｏｅａｅの外膜に存在するポーリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質に基づくワクチンへのアプローチを記載している。プロティンＩと呼ばれるこのタンパク質は、小さな親水性溶質が外膜を通り抜けられる様な孔を形成する。プロティンＩ　（Ｐ、Ｉ）は、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに存在する二つの遺伝的および免疫的に区別される血液型亜型群、すなわちＰ、ＩＡとＰ、ＩＢに分けられる。

ＩＡ血液型亜型であるＦ＾１９０Ｐ、Ｉ遺伝子のＤＮＡ配列は、１１０８９１０４８７３の図３の様に示される。ＩＳ血液型亜型であるＭＳ１１０ＰＩ遺伝子のＯＮＡ！ｊｉ！、列は、目８９１０４８７３の図９の様に示される。図３および図９に示されるＤＮ遁列は、同時に示されている対応するアミノ酸配列と共に本明細書に参考資料として含まれる。ＩＢ血液型亜型であるＲ１０のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列、および対応するアミノ酸配列は、Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈらにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８４．８１３５−８１３９　（１９８７）に開示されている。

Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈらにより報告されたＰ、ＩＢのＤＮＡおよびアミ人酸配列は本明細書に参考資料として含まれる。

淋菌感染の予防、診断および治療に対する有望なアプローチは、臨床的に重要なＮ０ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ血液型亜型群の双方に向けられなければならない。

この問題を解決する一つのアプローチは、インタータイプハイブリッド（ｉｎｔｅｒｔｙｐｉｃｈｙｂｒｉｄｓ）の開発である。このようなハイブリッドは一般的に、選択性マーカーを一つの血液型亜型のある株のＤＮＡに挿入し、そのＤＮＡを他の血液型亜型のある株に形質移入することにより調製される。形質移入された細胞におけるきわめて相同なＰ、Ｉ遺伝子の無秩序な組み換えは、Ｐ、ＩＡおよびＰ、ＩＢ双方のあるエピトープを発現するハイブリッド遺伝子に導く。このようなインタータイプハイブリッドはＣａｒｂｏｎｅｔｔｉおよびＳｐａｒｌｉｎｇにより、ＰＣＴ出願Ｎｏ　８９１０４８７３、並びに５ｈｉｎｎｅｒｓおよびＣａｔｌｉｎにより、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１５Ｂ、５２９−５３６　（１９８１１）に記載されている。

インタータイプハイブリッドのアプローチでの一つの困難は、組み換えポーリンタンパク質が約３００アミノ酸を有する長さ全体のＰ、Ｉタンパク質であるということである。このようなタンパク質は溶解度がきわめて小さいため取扱いが困難であり、また毒性問題のため遺伝子工学の方法によりＢ、ｃｏｌｉ中で生産することが困難である。多数のポーリン遺伝子含有バクテリア細胞を生育することの困難さは、Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈらにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８４．８１３５−８１３９　（１９８７）に、並びにＣａｒｂｏｎｅｔｔｉおよびＳｐａｒｌｉｎｇによりＰＣＴ出１！１１０８９１０４８７３に記載されている。

さらに、インタータイプハイブリッドは無秩序な組み換え操作に由来し、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに起因する疾病の診断法、ワクチンおよび治療に有用なタンパク質の設計への合理的なアプローチを構築しない。人は多様な無秩序に作られたタンパク質の中で、もしあるとすればどれが有用であるか決定するためにひとつひとつ取り上げて選ぶよりも、もっとうまくやりたいと希望する。

従ってＰ、ＩＡとＰ、ＩＢ双方のエピトープを含む、合理的に設計されたキメラタンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が必要である。Ｂ、ｃｏｌ　ｉに対し非毒性で３００より少ないアミノ酸ををするキメラタンパク質が特に必要である。

発明の要約当業者に明かなこれらの目的は、１３．ｃｏｌｉに非毒性のポリペプチドを提供するぶとにより解決された。そのポリペプチドは、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ、■＾に存在する少なくとも一つの抗原性配列と、ＮｏｇｏｎｏｒｒｈｏｅａａのＰ、ＩＢに存在する少なくとも一つの抗原性配列を含む。

本発明はさらに、ＮｌｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ、ＩＡに存在する少なくとも一つの抗原性配列と、Ｎ、　８ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ、ＩＢに存在する少なくとも一つの抗原性配列を含むポリペプチドに関する。Ｐ、ＩＡに存在する抗原性配列における全アミノ酸数は１２５以下である。ＰｊＢに存在する抗原配列における全アミノ酸数もまた１２５以下である。

図面の説明図１＾はＰ、Ｉフラグメント１−６に対応する抗原性配列を示す。それぞれのフラグメントは付加Ｎ−末端システィン残基を含んでいてもよい。アミノ酸数はＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　Ｆ＾１９株由来のＰ、ＩＡのアミノ酸残基（フラグメント１−４）　、またはＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ＭＳＩＩ株由来のＰ、１８のアミノ酸残基（フラグメント５および６）に対応する。

図ＩＢはＮ９ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　Ｆ＾１９株由来のＰ、　ＩＡ上のフラグメント１−ξおよびＮ、　ｇａｎｏｒｒｈｏｅａａ　ＭＳＩ１株由来のＰ、ＩＢ上のフラグメント５および６の相対位置を示す。

図２はＰＡＴＨ２０におけるポリリンカーのヌクレオチド配列を示す。

図３ＡはＧＣ２６と呼ばれるフラグメント２および６を含むキメラポリペプチドを調製するために用いられる６個のオリゴヌクレオチド（ａ−ｆ）のヌクレオチド配列を示す（実施例１参照）。

図３８はオリゴヌクレオチドａ−ｆの相互の関係、およびｐＧＣ２６におけるＰＡＴＩ（２０制限サイ）　Ｅ！ｃｏＲＩ＊よびＨｉｎｄＩＩＩに対する関係を示す。

図４＾はＧｅ２Ｓ３と呼ばれるフラグメント２．６および４を含むキメラポリペプチドを調製するために使用された４個のオリゴヌクレオチド（ｇ−ｊ）のヌクレオチド配列を示す。

図４Ｂはオリゴヌクレオチドｇ−ｊの相互の関係、およびＰＧＣ２６のＢｓａ＋ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに対する関係を示す。

図５はバクテリアでＧＣ２６を発現するのに用いられるヌクレオチド配列を示す（実施例１参照）。

本発明はＩＡまたはＩＢ血液型亜型のＮ１ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ４由来のＰ、ｌＡおよびＰ、ＩＢ双方の抗原性配列をそれぞれ含むフラグメントを含有するキメラポリペプチドに関する。血液型亜型群昆および■８双方の株が知られている。

ある既知の■へ株は、例えばＦＡ１９、ＦＡ６５９９、ＦＡ６６４２、ＮＲＬ　Ｖ、　１５、ＮＲＬ　７９２９、およびＮＲＬＧ、７を含む、ＩＢ血液型亜型のある株は、例えばＭＳｌｌ、ＲＩＯｌＮＲＬ　Ｔ、　１３、ＮＲＬ１９５５、ＮＲＬ５７６７．４４０３（Ｐｇｈ３−２）、４４０Ｂ　（Ｐｇｈ３−１）および４４Ｑ９　（５１２８８）を含む。

Ｐ、ＩＡおよびＰ、ＩＢの抗原性配列を含むフラグメントは、潜在的抗原性および／または露出という一般的な基準に基づいて選択される。この様な基準は親水性、およびＰ、ＩＡとＰ、ＩＢタンパク質の表面露出分析で測定される相対的抗原指数を含む。

適切な基準の決定は当業者に公知であり、例えばＨｏｐｐら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　７８．３８２４−３８２８　（１９８１）　；　Ｋｙｔｅら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ吐１５７．１０５−１３２　（１９８Q）；Ｂ＋ｎ１ｎｉ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５５．８３６−８３９（１９８５）　；　Ｊａｍｅｓｏｎら、ＣＡ　ＢｒＯ３４，１８１−１８６（１X８８）；およびＫａｒｐｌｕｓら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ　７２．２１２−２１３　（１９８５）に記載されている。これらの基準で表面に露出すると予見されたアミノ酸ドメインは、より疎水性または隠ぺいされたと予見されたドメインより優先的に選択される。

図１＾に示したフラグメント１−６は適切な抗原性配列である。フラグメント１ −４は淋菌株Ｆ＾１９のＰ、ＩＡに見いだされたアミノ酸配列を含む。フラグメント５および６は淋菌株ＭＳ１１のＰ、ＩＢに見いだされたアミノ酸シーケンスを含む。これらのフラグメントは、Ｗｏ　８９１０４８７３号に対応する、Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉと５ｐａｒｌｉｎＢの同時に受理された継続出願であるＵ、　Ｓ、特許出願Ｎｏ、　０７／２４２．７５８に開示されている。

キメラポリペプチド本発明のキメラポリペプチドは、少なくとも二個の７ラグメントを含有する。

少なくとも一つのフラグメントは、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ、ＩＡに存在する抗原性配列を含有する。少なくとも一つの他のフラグメントは、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ、ＩＢに存在する抗原性配列を含有する。

さらに、本発明のキメラポリペプチドは、特定の免疫学的基準を満足する。第一に、このペプチドはＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのタイプＩＡおよびＩＳポーリン血液型亜型に特異的な単クローン性および多クローン性血清と結合すると同時に、キメラポリペプチドのそれぞれ個々のフラグメントに特異的な単クローン性および多クローン性抗体と結合する。また、キメラポリペプチドはタイプＡおよびタイプＢ血液型亜型の双方の少なくとも一つのエピトープに対する、ヒトを含む哺乳動物における血清抗体反応を禁止する。

本発明においては、少なくとも一つはＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ、ＩＡに存在し、それ以外の少なくとも一つはＰ、ＩＢに存在する少なくとも二つの抗原性配列を有し、上記免疫学的基準を満足する合理的に設計されたキメラポリペプチドが使用される。

本明細書において「キメラポリペプチド」という用語は、従来技術の無秩序に形成されたインタータイプのハイブリッドの配列とは反対に、論理的に設計されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。

本発明の好ましい実施例において、キメラポリペプチドは、Ｐ、ＩＢフラグメント５および６から選ばれる少なくとも一つのポリペプチドフラグメントに結合するＰ、Ｉ＾フラグメント１−４から選ばれる少なくとも一つのポリペプチドフラグメントを含有する。フラグメントがポリペプチドに出現する順序は、少なくとも一つのＰ、Ｉ＾フラグメントおよび少なくとも一つのＰ、＋８フラグメントが抗原性である限り重要ではない。本発明によるキメラポリペプチドの例にはフラグメント２−６．６−２．４−５．５−４．１−６．６−１．２−６−収２−４ −６、および２−５−６が含まれる。フラグメント２および６によって、並びにフラグメント２．４、および６によって形成されるキメラが好ましい。

フラグメント１−６等の本発明のフラグメントは、好ましくは高度に親水性であり、従って免疫学的に有効であると予想される。それぞれのフラグメントは少なくとも一つのＰ、Ｉエピトープを含有する。好ましくは、それぞれのフラグメントは一個以上のＰ、Ｉエピトープを含む。

キメラポリペプチドの抗原性フラグメントは、フラグメント１−６のサブフラグメントであり、その個々の７ラグメントのエピトープのすべてより少なく含有する。フラグメントは最低一つのエピトープを有する。例えば、フラグメント６の既知のエピトープはＹＳＩＰＳである。

一方、抗原性Ｐ、ＩＡおよび／またはＰ、ＩＢ配列のいくつか、または全ては、フラグメント１−６で示されるものではない。これらの他のフラグメントは、フラグメント１−６と重なり合っても重なり合わなくても良い。

キメラポリペプチドのフラグメントは、そのＮ−またはＣ−末端のいづれか、または両末端に付加アミノ酸配列を含んでもよい。これらの付加アミノ酸配列はＰ、ＩＡまたはＰ、ＩＢに存在する。一方、付加アミノ酸残基はＰ、ＩＡまたはＰ、ＩＢ以外のタンパク質に由来していてもよい。この様な付加アミノ酸残基はポリペプチドの単離と精製の助けになり、ホストに対する抗原性配列の表示を助け、あるいはポリペプチドの免疫学的性質を増大させる。

付加アミノ酸は、好ましくはＰ、Ｉ＾／Ｐ、ＩＢ抗原性フラグメントから適当な切断サイトによって分離される。化学的および酵素的切断サイトはいずれも公知である。酵素的に切断されるサイトの適当な例には、コラゲナーゼ（Ｋｅｉｌら、ＦＢＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５６．２９２−２９６（１９７５）　）　；　エンテロキナーゼ（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌｏｇｙ　６４．１２０４−１２１０　（１９８８）　）　；　Ｘａ因子（ｌｌａｇａｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍ盾戟B （１９８６）　”）によって特異的に認識され切断されるサイトが含まれる。コラゲナーゼは、Ｘが中性アミノ酸である配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−ＰｒｏにおけるプロリンとＸの間を切断する。エンテロキナーゼは配列＾５ｐ−Ａｓｐ−ＡＳＰ−＾５ｐ−Ｌｙｓにおけるリジンの後ろを切断する。Ｘａ因子は配列１１ｅ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇにおけるアルギニンの後ろを切断する。トロンビンは配列＾ｒｇ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏにおけるアルギニンとグリシンの間を切断する。

特異的化学的開裂剤もまた知られている。例えば臭化シアンはタンパク質のメチオニン残基で切断する。

キメラポリペプチドはできるだけ短くなければならない。不必要なアミノ酸はポリペプチドの長さを増し、それを取り扱う困難さを増す。従って、付加アミノ酸配列はフラグメントのＮ−末端もしくはＣ−末端、またはフラグメント間に存在するが、キメラポリペプチドはフラグメント１−６等のＰ、Ｉタンパク質からの抗原性フラグメント以外の付加アミノ酸配列を含まないことが好ましい。

フラグメントは、好ましくはＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのある株における配列と等しい。

しかしながら、エピトープの全てまたはいづれかに影響せずにアミノ酸をフラグメントから削除することにより、等価なフラグメントを作り出すことが可能である。

また、配列中のアミノ酸を等価のアミノ酸で置換することが可能であることも知られている。通常等価であると知られているアミノ酸のグループは：（ａ）　Ａｌａ　（Ａ）　Ｓｅｒ　（Ｓ）　Ｔｈｒ　（Ｔ）　Ｐｒｏ　（Ｐ）　Ｇｌｙ　（Ｇ）　：（ｂ）＾ｓｎ　（Ｎ）　Ａｓｐ　（Ｄ）　Ｇｌｕ　（Ｅ）　Ｇｌｎ　（Ｑ）　；（ｃ）　Ｈｉｓ　（Ｈ）　Ａｒｇ　（Ｒ）　Ｌｙｓ　（Ｋ）　；（ｄ）　Ｍｅｔ　（Ｍ）　Ｌｅｕ　（Ｌ）　ｌｉｅ　（１）　Ｖａｌ　ｍ　：および（ｅ）　Ｐｈｅ　（Ｆ）　Ｔｙｒ　（Ｙ）　Ｔｒｐ　（Ｗ）である。

抗原性配列における置換、付加および／または削除は、本発明のキメラポリペプチドが上記免疫学的基準を満足し続けるかぎり行われる。実質的に他の配列と同じであるが、一つまたはそれ以上の置換、付加および／または削除により別の配列とは異なるアミノ酸配列は等価な配列と考えられる。Ｐ、ＩＡまたはＰ、ＩＢ配列におけるアミノ酸残基の数の好ましくは２５％、より好ましくは１０％が、本発明のキメラポリペプチドのフラグメントと置換、フラグメントに追加、またはフラグメントから削除される。

アミノ酸の数を制限することにより、キメラポリペプチドの溶解度と取扱い易さが増す。好ましくは、ポメラポリベブチドにおける１または２以上のＰ、ＩＡ抗原性配列、あるいは１または２以上の等価配列の全アミノ酸数は約１２５以下、好ましくは約７５以下、より好ましくは約５０以下である。同様に、キメラポリペプチドにおける１または２以上のＰ、Ｉ８抗原性配列、あるいは１または２以上の等価配列の全アミノ酸数もまた約１２５以下、好ましくは約７５以下、より好ましくは約５０以下である。

好ましくは、本発明のキメラポーリンポリペプチドは、従来技術のＰ、　ＩＡ、　Ｐ、　ＩＳおよびＰ、Ｉ＾／Ｂインタータイプハイブリッドと異なり、Ｅ、　ｃｏ■に非毒性である。毒性タンパク質は一般に微生物の二元成長を６５Ｏｒｏｎにおける高い吸光度、または高い細胞数にしない。細胞数、従って細胞量の反映である６５０ｎｍでの吸光度は、培地消費およびプラトー成長までは成長期間中対数的に増加し続ける。ケモスタッ）　（ｃｈｅ＋ｎｏｓｔａｔｉｃ）または培地補給生長は全インキニベーション生長相の間、細胞溶解または死滅することなく起こる。細胞産生物、すなわち融合タンパク質は誘導（例えばＩＡＡ、　ＩＰＴＧ、　４２℃等）の後に着実に蓄積し、終夜振とう培養生長後に生成物が集められる。典型的な６５０叩吸光度値である５−１０ユニツトがフラスコ振とうで得られ、２５−１００ユニツトが培地補給ケモスタット環境で得られる。生長サイクル中の早期細胞溶解を表す生長曲線の影響はない。充分に高い細胞量またはへ〇５Ｏｆｉａ吸光度が達成できないことは、経済的に効率の良い工業的スケールの生産を妨げる。

でないステップは経ないということを意味する。

普通でないステップは、５ｔｕｄｉａｒのＴ７プロモーター／ポリメラーゼシステム［５ｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、、Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１８９．１１３−１３０（１９８６）並びにＭｏｆｆａｔｔおよび５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｃｅ１ｌ　４９．２２１−２２７　（１９８７）コ等のきわめて独特で一時的なシステムの使用、および特異的で一般には入手できないＢ、　ｃｏ■ホスト細胞（例えばＢＬ２１　ｐＬｙｓ等）または発現プラスミドの使用を含む。通常の方法では、生産物破壊の可能性のある早期細胞溶解と死滅を避けるため、比較的低い＾ｓｓｏレベルで成長を停止し細胞集団を採取することが必要である。

Ｂ、ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現のための通常の条件は、標準培地成分中右よび高細胞量および／または＾６３０値への連続的成長中での、標準ベクターシステムまたは一般的に人手できるプロモーターカセット（Ｔｒｐ、　Ｔａｃ、　Ｔｒｃ、　５ムタＰ１ベ一ターｇａ１等）の使用を含む。細胞成長は、早期細胞溶解、細胞溶解に起因する粘度増加、または連続後期誘導シェーカーもしくはファーメンタ−（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）成長で八ｇｓＯの突然の降下なく、培地置換またはケモスタット成長で連続的に起こる。その後のプラスミドの安定性は、連続成長およびポリペプチド生産で高いままである。

キメラポリペプチドの合成キメラフラグメントは当業者に公知の方法で個々のアミノ酸残基から合成される。適当な方法のいくつかは、５ｔｕａｒｔとＹｏｕｎｇにより「面相ペプチド合成」、第二版、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏａｌｐａｎｙ（１９８４年）に記載されている。

本発明のタンパク質は、好ましくは組み換えＤＮＡ技術によって製造される。単離されたＤＮＡから組み換えタンパク質を製造する一般的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより「分子クローニング」、第二版、Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｆ’ｒｅｓｓ（１９８７年）に記載されている。

簡単にいえば、本発明の望ましいアミノ酸配列に対するＩＩＮＡコードは天然起源からのフラグメントとして、また任意には修飾されて得られる。ＤＮＡはまた、全体または部分的に当業者に公知の方法で合成される。この様な方法には、Ｃａｒｕｔｈａｒｓによって、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．２８１−２８５　（１９８５）に記載されたものを含む。

本発明の望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡは、様々なホスト細胞中で様々なベクターを用いて複製できる。ホスト細胞は原核性または真核性である。ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含む。適当な原核ベクターのいくつかには、輩Ｍ匹、匹旺、岨胆競、咀１、」、ｐＭＢ９、および輩μ等の［７，ｃｏｌｉからのプラスミドが含まれる。原核ベクターはまた、！、釈旦および他のフィラメント状一本ｇｌｌＤＮＡファージ等のファージＤＮＡの誘導体を含む。

バクテリア、特にＢ、ｃｏｌｉのタンパク質を発現するベクターもまた知られている。

この様なベクターには、ＤｉｅｃｋｒｎａｎｎとＴｚａｇｏｌｏｆｆによってＪ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６０．１５１３−１５２０　（１９８５）に記載されたＦＡＴ）Ｉベクターが含まれる。これらのベクターはカルボキシ末端のポリリンカーがつながるアントラニル酸シンセターゼ（Ｔｒｐ日）をコードするＤＮＡｆｆ１列を含む。他の発現ベクター系はベーターガラクトシダーゼ（ｐＥＩＸ）ラムダＰＬ；マルトース結合タンパク質（ｐ＆１ＡＬ）　；グルタチオンＳ− ）ランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づ（−Ｇｅｎｅ　６７．３１　（１９ＢＢ）　およびＰｅｐｔ　１ｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ　３．１６７　（１９９０）参照。

酵母で有用なベクターもまた入手可能である。適当な例は２ｕプラスミドである。

哺乳類細胞での使用のために適当なベクターもまた知られている。この様なベクターには、周知の５Ｖ−４０誘導体、アデノウィルス、レトロウィルス由来のＤＮＡ配列およびプラスミドとファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクターが含まれる。

他の真核性発現ベクターも当業者に公知である。例えばＰ、　Ｊ、　５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ、Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏｌ、＾ｐｐｌｉ、　Ｇｅｎｅｔ、　！、　３２７−３４１（１９Ｂ２）　；　Ｓ、Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、に吐Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　ｌ、　８５４−８６４　（１９８１）　；Ｒ，Ｊ、にａｕｆｍａｎｎおよびＰ、ん５ｈａｒｐ、ｒモデュラージヒドロフォーレートレダクターゼ相補ＤＮＡ遺伝子と共形質移入された配列のモット卵巣細胞におけるヒト免疫インターフェロンＤＮＡ遺伝子生産物の発現とキ（１９８０）参照。

有用な発現ホストには、周知の原核性および真核性ホストが含まれる。適当な原核性ホストのいくつかには、例えば、し二旦５Ｇ−９３６、Ｌ玉１ｉ　Ｈｅ　１０１、Ｌ臼旦Ｖ４３１１０、Ｂ、ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６、Ｂ、ｃｏｌｉ　Ｘ２２８２、［！、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ、　！’ヨびＢ、ｃｏｌｉ　ＭＲＣｌ等（n ８、ｃｏｌｉ、　ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＳＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｕｔｉｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ■ が含まれる。適当な真核性細胞には、酵母および他のカビ類、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞等の動物細胞、ヒト細胞および組織培養の植物細胞が含まれる。

本発明に有用な発現ベクターは、望ましいＤＮＡ配列に能動的にリンクした少なくとも一つの発現制御配列を含む。制御配列はクローン化されたＤＮＡｆｆ１列の発現を制御し調整するためにベクター中に挿入される。有用な発現制御配列は、ｌａｃシステム、９正システム、亜システム、亜システム、ファージラムダのメジャーオペレーター（ｍａｊｏｒ　ｏｐｅｒａｔｏｒ）およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、例えば３−フォスファターゼキナーゼに対するプロモーターなどの酵母の解糖プロモーター、例えばＰｈＯ５、酵母アルファ交配因子のプロモーターなどの酵母酸性フォスファターゼのプロモーター、および、例えば初期および後期プロモーターまたはＳＶ４０などのポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、↓よびサルウィルスに由来するプロモーター、および原核性または真核性細胞、およびそれらのウィルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列である。

キメラポリペプチドは当業者に公知の方法で精製される。好ましくは、ポリペプチドは本質的に純粋な状態で単離される。ポリペプチドは、もしそれが少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の純度であれば、本質的に純粋であるとみなされる。ある精製方法では、キメラポリペプチドは精製と同定を促進するため、適当な融合パートナ−との融合タンパク質の形で発現される。有用な融合パートナ−のいくつかには、マルトース結合タンパク質、Ｇｕａｎら、Ｇｅｎｅ　６７．２１−３０　（１９８７）　ＨＭａｉｎａら、Ｇｅｎｅ　７４．３６−３７３　（１９８２）　）　；Ｒｉｇｇｓ、Ｐ、、　Ａｕ５ｅｂｅｌ、　Ｆ、Ｍ、ら（ｅｄｓ）　、分子生物学カレントプロトコール、Ｇｒｅｅｎｅ＾５ｓｏｃｉａｔａｓ／Ｗｉｌｅｙ　ＩｎｔａｒｓｃｉａｎｃｅＳＮｏｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９０年）；ベーターガラクトシダーゼ（Ｇｒａｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　７９．６５９Ｂ　（１９８２）　）　；　ｔｒｐＢ５８５　（１９８９）　）　：およびＶａｎ　Ｂｔｔｅｎら、Ｃｅ１ｌ　５Ｂ、６６９、（１９１１９））が含まれる。

この様な融合タンパク質は、融合パートナ−に結合する試薬を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。その試薬は融合パートナ−の特異的リガンドまたは抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。例えば、ベーターガラクトシダーゼを含む融合タンパク質は、抗−ベーターガラクトシダーゼ抗体カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される（ＵｌｌｍａｎＳＧｅｎｅ　２９．２７−３１　（１９８４）　）　。同様に、マルトース結合タンパク質を含む融合タンパク質は、マルトースを含有するカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。

任意には、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、融合タンパク質がキメラポリペプチドと融合パートナ−の間で開裂サイトを有するように設計される。化学的および酵素的開裂サイトは、上記の通り当業者に公知である。この様なサイトは、本発明のフラグメントをその融合パートナ−から最終的には切断する。

他の調製法では、キメラポリペプチドは誘導プロモーターの後ろに重複発現され、特異的抗キメラポリペプチド抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。例えば、モノクローナル抗体５Ｍｌ０Ｉは、フラグメント２に対応するＰ、１＾のアミノ末端に結合すると考えられている。５Ｍ１０１は１ｌｉｒｊｉらのＪｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１３３．２６３９−２６４６　（１９８７）に記載されている。同様に、モノクローナル抗体５Ｍ２４はフラグメント６に対応するＰ、ＩＢの領域に結合すると考えられている。５Ｍ２４はＨｅｃｋｅｌｓらのＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＹ　１３５．２２６９−２２７６　（１９８９）に記載されている。

また別の方法として、重複発現ポリペプチドは、当業者に公知の方法により、イオン交換、サイズ排除、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの組み合わＰｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、、イングランド、１９８７年、に記載されている。

キメラポリペプチドのプローブとしての使用本発明のキメラポリペプチドは淋菌感染で生じる疾病を検出し予防するのに有用である。例えば、このタンパク質はラベルされ、淋病の診断を受ける患者の血清または他の体液などの検体中のタンパク質に対する抗体を検出するための標準的な免疫測定のプローブとして使用される。一般には、キメラポリペプチドはＰｊ＾またはＰ、ＩＢに対する抗体を含有すると思われる検体とインキュベートされる。

ポリペプチドはインキュベーションの前、途中、または後にラベルされる。検体中の抗体に結合したラベルされたポリペプチドの検出は、抗体の存在を示す。抗体は好ましくは固定化される。

Ｒ，Ｈ，にｅｎｎｅｔｈにより、Ｋｅｎｎｅｔｔら、モノクローナル抗体、Ｐｌｅｍｕｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、　Ｙ、、３７６ページ（１９８１年）「ポリビニルクロライドプレートに付着した細胞による酵素結合抗体分析」に記載された標準ＢＬＩＳ＾プロトコール等のポリペプチドとの抗体を検出するための適当な分析法は当業者に公知である。簡単にいうと、プレートは検出できる量の抗体を結合するために充分な量の抗原性ポリペプチドで被覆される。プレートをポリペプチドとインキュベートした後、プレートは、例えば１０％正常ヤギ血清等の適当なブロック剤でブロックされる。患者の血清等の検体を加え、終点を検出するため滴定する。陽性および陰性のコントロールが、未知の検体中に存在する関連する抗体の量を定量するため、同時に加えられる。インキュベーション後、検体は適当なラベルとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇでプローブされる。検体中の抗ポベブチド抗体の存在は、結合したラベルの存在で示される。

免疫測定で使用するため、ポリペプチドまたは他の分子プローブは放射性または非放射性原子または分子でラベルされる。これらをタンパク質にコンジュゲートするためのラベルおよび方法は当業者に公知である。

有用な放射性ラベルの例には３２ｐＳ＋２ＳＩ、　１３１１ＳおよびＨが含まれる。放射性ラベルの使用は英国特許第２．０３４．３２３号、米国特許第４．３５８．５３５号、および米国特許第４．３０２．２０４号に記載されている。

非放射性ラベルのいくつかの例には、酵素、発色団、電子顕微鏡で検出できる原子および分子、およびその磁気的性質で検出できる金属イオンが含まれる。

有用な酵素的ラベルのいくつかには、基質に検出できる変化をもたらす酵素が含まれる。有用な酵素、およびその基質のいくつかには、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ピロガロールおよび叶フェニレンジアミン）、ベーターガラクトシダーゼ（フルオレッセンベーター〇−力°ラクトピラノシド）、およびアルカリフォスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）が含まれる。酵素的ラベルの使用は英国特許第２、０１９．４０４号、欧州特許第６３．８７９号、およびＲｏｔ＋ｎａｎによるＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、４７、１９８１−１９９１　（１９６１年）に記載されている。

有用な発色団には、例えば染料の他、蛍光、化学発光、および生物発光分子が含まれる。本発明で有用な特異的発色団のいくつかには、例えばフルオレラセン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、アンベリフェロン、ルミノールが含まれる。

ラベルは当業者に公知の方法でプローブにコンジュゲートされる。ラベルは官能基でプローブ上に直接結合される。プローブはこの様な官能基を含有するか、または含有する様にされる。適当な官能基のいくつかには、例えばアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネートが含まれる。

ラベルはまた、上記の方法でリガンドをプローブに結合し、そのリガンドに対するラベルされたレセプターとのコンジュゲートとインキュベートすること１こより、プローブにコンジュゲートされる。既知のりガントレセプターの組み合わせが適当である。ビオチン−アビジンの組み合わせが好ましい。

免疫測定で使用するため、上記Ｐｊ＾またはＰ、ＩＢ上に存在するフラグメントを含有するキメラポリペプチドが使用される。等価のフラグメントもまた使用される。

等価のフラグメントには、ポリペプチドが特異的抗体を検出する能力を破壊しない置換、付加および削除変異体が含まれる。

ワクチンにおけるキメラポリペプチドの使用本発明のキメラポリペプチドはＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの生命活動にとって重要であり、外膜に見いだされるため、淋病等のｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ感染に起因する疾病の予防のためのワクチンに有用である。この目的のため、ポリペプチドが中和抗体を生産することが必要である。中和抗体は、生体外または生体内で淋菌細胞の生長を有意に阻害、または殺す抗体である。阻害が、感染した哺乳動物の疾病症状を予防または軽減するに充分であれば、淋菌細胞の生長は生体内で有意に阻害される。

ポリペプチドが望ましいエピトープを規定するが抗原性は不充分である場合、抗原性または半減期を増すためにキャリア分子にコンジュゲートされる。適当なキャリア分子のいくつかにはスカシ貝ヘモシアニン、Ｉｇ配列、ＴｒｐＢおよびヒトまたはウシ血清アルブミンが含まれる。コンジュゲーシヨンは当業者に公知の方法で行われる。この様な方法の一つは、フラグメントのシスティン残基をキャリア分子上のシスティン残基と結合することである。また、キャリア分子は、上記の様な組み換え方法により本発明のポリペプチドに結合される。抗原はまた自己架橋してポリメリック抗原またはコンカタマ−（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）を形成する。

それに加え、キメラボーリンフラグメントの送り出しは、原型サルモネラ送り出しシステムにおけると同様にビリンまたはフラジェリン配列に取り込むことによって実施される（Ｂ、　５ｔｏｃｋｅｒ、　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｖｏｌ、６　（１９８８）　）　ｏワクシニアウィルス粒子による発現またはＢＣＧバチルス粒子上の表現もまた可能である（ＷＨＯＭｅｅｔｉｎｇ。

ジュネーヴ、　１９８９年６月、　Ｖａｃｃｉｎｅ、　Ｖｏｌ、８　（１９９０）　）　。個々の場合、合成ペプチド配列は、高分子の内部および表面でそれらが共有発現するため、免疫系でより有利に表現される。

本発明のキメラポリペプチドを含有するワクチンは、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの生長を阻害するか、それを殺すために用いられる。好ましくは、キメラポリペプチドはＰ、Ｉ＾またはＰ、ＩＢタンパク質に存在するフラグメントを含有する。キメラポリペプチドはまた等価のフラグメントを含有する。この目的のための等価のフラグメントは、ヒトホスト等の哺乳動物ホストに中和抗体を生産する置換、付加または削除変異株を含む。

本発明はさらに、Ｎｌｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染に対する、ヒトを含む哺乳動物を免疫するためのワクチン組成物を含む。そのワクチンは本発明のキメラポリペプチドまたはそれらの等価物、および薬学的に許容される媒体およびアジュバントを含有する。キメラポリペプチドの等価物は上記の通りである。

ワクチンは薬学的に受容できる媒体中の抗体を含有する。ワクチンはムラミル（ｍｕｒａｍｙｌ）ペプチド等のアジュバント、およびインターフェロン、インターロイキン−１およびインターロイキン−６等のリンフ才力インを含む。抗体は、公知の様に、酸化アルミニウム粒子等の適当な粒子上に吸着されるか、リポソームに被包される。

の抗体の誘導を最大にするような方法で抗原が存在することが好ましい。ＩｇＡ抗体の誘導は、抗原を消化管に暴露することによって最大になる。従って、経口ワクチン等の本発明のキメラタンパク質を消化管に暴露するワクチンが好ましい。

さらに抗原は、リポソーム中、またはウィルスまたはバクテリア複製粒子中の抗体を表現することによって消化管に暴露される。バクテリア複製粒子のいくつかには、例えばサルモネラ菌および赤痢菌が含まれる。ウィルス複製システムのいくつかの例には、ワタシニアおよびアデノウィルスが含まれる。一方、抗原は消化管に対して親和性を有するタンパク質に融合して提供される。この様なタンパク質の例には、例えばアデノスパー（ｓｐｕｒ）および肝炎Ｂコア抗原が含まれる。

本発明はさらに、ヒトを含むホスト補乳動物を有効な量の上記ワクチン組成物で免疫する方法を含む。ワクチンは公知の方法により哺乳動物に投与される。この様な方法には、例えば経口、静脈内、腹膜内、皮下または筋肉的投与が含まれる。

実施例実施例ＩＡ、ポリペプチドの合成オリゴヌクレオチド鎮は、ベーターシアノエチルフォスフオルアミダイトを基質として用いるモデル３８１八アプライドバイオシステムズ（＾ｐｐｌｉｅｄ　［］１ｏｓｙｓｔｅｌ！Ｉｓ）装置で特異的に合成した。合成ヌクレオチドオリゴマーは脱保護し、製造者が勧める通りの標準手順により樹脂支持体から切り離した。様々なオリゴヌクレオチド精製カートリッジのいずれも用いることができ、またＩＩＰＬＣ精製および単離で行うこともできる。

１００塩基までの長さの望ましいオリゴヌクレオチドを得るために効率の良い鎖延長が可能である。これらの鎖の特異的水素結合相補体もまた、適当な極性で合成される。特異的末端制限酵素サイト適合端もまた、ベクターまたは他の合成二重鎖への結さつによりアニーリングおよびクローニングを促進するために設計される。

１０＋＋＋Ｍ　ＴＲｌ５　）ＩＣＩ　ｐＨ７，５，０，１＋ｎＭ　ＢＤＴＡを含む緩衝液中で１００℃に短時間加熱し、徐々に室温に冷却することにより、約１１００ｎの特異的オリゴヌクレオチド鎮がその相補体にアニールされる。

合成と脱保護切断で得られる５’　ＤＨ末端は、いくつかの周知の手段で、ポリヌクエオチドキナーゼエンザイムおよびｒＡＴＰでリン酸化される（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＯＮ＾Ｃ１ｏｎｉｎｇ　Ｍａｎｕａｌ）。オリゴヌクレオチド二重鎮の特異的ベアーの結さっは、制限酵素サイト末端または「スティッキイエンド」により、特異的に設計された「張り出し」を通じて行われ、相補的水素結合オーバーラツプが得られる。共有ギャップ５−３°結合は、単純な緩衝液中でＢ、ｃｏｌｉまたはバクテリオファージ由来ＯＮ＾リガーゼ酵素により閉じられる。後者の場合、数時間の１６℃インキュベーションで１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ、　ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ａ＋Ｍ　ｒＡＴＰが適当である。

大きな配列をつくらなければならない場合、水素結合二重鎖のペアーまたはグループが混合され、全長が個々の合成二重鎖の長さに等しい特異的に配列した直線構造がつくられる。これらは次いで結さっされる。

適当な相補的制限サイト末端を有する特異的ベクターまたは発現ベクターを用いることにより、組立てられたオリゴヌクレオチド構造またはミニ遺伝子は容易にかつ直接クローン化され、タンパク質として発現される。

６個の個々のオリゴヌクレオチド鎮が混合されアニールされる一例を以下に示す。これらは、次ぎに結さっされタンパク質情報として翻訳される、特異的に配列した構造をつくる。それによりつくられた高密度の組み換えクローンは、適度に配列した挿入セグメントを含む。レポーターグループでラベルされた特異的な個別オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、クローンを同定するのに用いられる。ベクター中の非対称酵素末端（二つの異なった制限酵素）の使用は、組立てられた構造のアームからの類似の相補的非対称末端の特異的方向性、枠内クローニングを可能にする。

このプロセスは、より大きい特異的コード配列を生成するための合成配列のより多くのメンバーを含む様に拡張できる。また中間構造が合成配列をさらに拡張するための基質として、それ以前にコーディングドメイン内に加えられた特異的制限酵素サイトによってクローン化、単離および使用される。この方法で与えられた配列は、規定の方法で拡張、規制または他の方法で変更される。特にキメラ配列が製造され容易に分析される。

関心のあるタンパク質ドメインにエピトープを表現している特異的ポリペプチドを発現するために、制御可能タンパク質発現システムが使用される。これらのシステムは、アミノ酸コード配列を非融合プロセスとして制御するためにプロモーターの近接位置を含むか、それ自身プラスミドの制御下にある実在のタンパク質コード配列へのキメラ配列の連結を含む。これは、融合タンパク質システムとして知られている。非融合システムではｔｒｐ、　ｔｒｃ、　ｔｉｃＳｔａｃ、　ｌａｃ、　ＰＬ等、周知で、性格付けされ入手可能な任意のプロモーターを利用することができる。融合タンパク質システムはキメラコード配列の、ｔｒｐＢ、 β−ガラクトシダーゼ、プロティン＾、マルトース結合タンパク質等への連結を含む。

代表的な一般的な例として、ポーリンＰ、ＩＡＪよびボーリンＰ、ＩＢ株配列の特異的ドメインから選ばれた合成Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅポーリン配列が選ばれる。これらのアミノ酸配列は、自然界で相対的に分離されているのでなければ、Ｂ、ｃｏｌｉでバイアスされたコドン中に移され、化学的に合成される。

多重オリゴヌクレオチド鎖は配列の選ばれたセットを効率よく架橋することが要求される。これらは、アニーリングによる組立てが内部の互換住またはステイッキイエンド末端を通じて並べられる様な方法で合成される。最外部末端は、様々な制限酵素に対し特異的な末端を提供するか、または入手可能にする様に設計される。

フラグメント２および６を含有するキメラポリペプチドを発現するプラスミドはｐＧＣ２６と呼ばれる。ｐＧＣ２６をつくるためには、ベクターＰＡＴＩＩ２０が酵素ＢｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌによりそのクローニングリンカ−で消化される。Ｐ＾ＴｌＩ２０は、ＤｉｅｃｋｍａｎｎおよびＴｚａｇｏｌｏｆｆにより、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２６０．１５１３−１２０（１９８５）に記載されたＰＡＴＨベクターシステムの一部である。ＰＡＴＨ２０におけるポリリンカーのヌクレオチド配列は、図２に示されている。アントラニル酸シンセターゼ遺伝子または廿ｐＢ生産物に埋め込まれたこのポＩＪ　ＩＪンカーは、外来アミノ酸コード配列の「読み過し」融合タンパク質またはキメラポリペプチドとしての挿入を可能にする。もし適当な読みとり枠三重コドンパターンが同定されれば、ベクターｔｒｐＥ！タンパク質のＢｃｏＲＩサイトは、合成されたキメラオリゴヌクレオチドのＢｃｏＲＩにつながれる。同様に、核酸の個々の肛ｎｄｌＩＩサイト配列はアニールされ、結さつされる。ｐＧＣ２６の場合、６個のオリゴヌクレオチドａ−ｆ　（図３＾参照）が調製され、ＢｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌサイトで相互に、およびＰＡＴＨ２０に結さっされる。

フラグメン）ａ−ｆの相互、およびＰＡＴＨ２０のＥＩｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌサイトに対する関係を図３８に示す。得られたプラスミドは、亜プロモーターのＩＡＡ規制制御の下にｔｒｐＢタンパク質を発現し、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅポーリンＡ／Ｂ配列（フラグメント２および６）を共直線解放読みとり枠カルボキシ延長として同時発現する。

この新しいプラスミド、ｐＧＣ２６は、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ配列サイズの増加により、本来の配列より大きい分子量の新規タンパク質を発現する。個々のＮ１ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅエピトープ、および他の異なったＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅエピトープとのそれらの同時発現を位置づけし同定するために、免疫学的手法が用いられる。ポーリンの場合、クラスＡおよびクラス日配列は単一独自タンパク質配列に位置づけられる。この方法で、配列の特異的な組み合わせまたは潜在的エピトープが再現性のある方法で正確、かつ有用な収率で得られる。これらのタンパク質がＢまたはＴ細胞媒介特異的抗体反応を導き出すことが可能かどうか決定するため、標準的な方法が用いられる。これらの抗血清は同じ動物でキメラ配列の双方または全部位、またはエピトープに特異的反応を示すと期待される。これらの抗血清は、自然界でその特定のインタータイプの組み合わせまたは表示で普通には経験しない個々のエピトープに反応を示す。これらの抗血清は、個々のキメラエピトープ（例えばポーリン＾および／またはＢ）を表現する母体Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏ、ｅａｅを中和または不活性化する能力を有するかどうかを決定するために容易に試験される。

同様な方法で、二つのＰＩＡアミノおよびカルボキシ配列に接している中央ＦＩＢフラグメントを含有するハイブリッドキメラポリペプチドは、フラグメント２．６および４から構成される。円＾／ＰｉＢ発現クローンｐＧＣ２６（上記参照）において、合成キメラポーリン配列は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌサイトでｔｒｐＢ配列に同位相で続＜ｐＡＴｌ１２０ポＩＪ　Ｕンカーにクローンされる（図３Ｂ参照）。独特の１３ｓｍＩｉ識配列は、オリゴヌクレオチドをコードするＦＩＢフラグメント６のカルボキシ末端を示すオリゴヌクレオチドフラグメン）Ｃ（図３Ａ）に存在する。制限酵素Ｂｓｍ１およびｔ（ｉｎｄｌｌｌによるもとのｐＧｃ２［ｉプラスミドの消化により、付加配列が既存の２／６合成配列へ延長鎮として共有的に結合される。

このように、１７８位置のアミノ酸Ｒで開始するアミノ酸配列４（図１＾）は、オリゴヌクレオチドｇ−Ｊの存在下にｐＧＣ２６をＢｓｍ１およびＨｉｎｄｌｌｌと結合させることにより、ＧＣ２６のカルボキシ末端に加えられる（図４＾）。オリゴヌクレオチド（ｇ）　５’　ＣＡＴＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣ３°および（ｈ）　５’　ＡＣＧＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＦＧＣＴＣＧＧＡＡＴＧＣＴ３゜は、上記の様にｐＧＣ２６ばかりでなくオリゴヌクレオチド対（１）５°ＡＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧ＾＾＾＾＾ＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴ＾３°および（Ｊ）５°＾ＧＣＴＴＡＡ　ＣＣＡＡ　ＣＣＡＧＡＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧ　ＧＴ　ＣＴＴＴＴＴ　ＣＧ　ＧＴ　ＧＧＴＧＴＡ　ＧＧＡＧＴf　３’ にアニールし、結さつする。オリゴヌクレオチドｇ−Ｊの相互、並びにｐＧｃ２６のこの新しいクローンは、生長し適当に誘導されて融合タンパク質を発現した場合、上記ｐＧＣ２６生産物より２５アミノ酸だけ長いキメラポリペプチドを生成する。

この新しいタンパク質は、ポーリン＾またはＢ領域２．６．４に対するポリクローナル抗Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ血清またはモノクローナル抗ペプチド血清とのＢＩＪＳＡおよびウェスタンプロットにおける特異的反応で同定できる。

本質的にモデルｐＧＣ２６およびｐＧＣ２６４に対する上記の様な方法は、関連する交差血清型ワクチンを同定する手段となる。関係する生体の別の方法で相互に排除する科のすべての関連する血液型亜型は、このようにしてこの新規免疫抗原で中和試験される。同等に感染性であるが区別される様々な血液型亜型が存在する自然界では、感染はより有効にまたは広く予防される。

従って、特異的アミノ酸配列を選択または同定し、それらを合成りＮＡ技術で製造することが可能になる。アミノ酸配列の特異的組み合わせが共直線的に結合し単一複合ポリペプチドとして同時発現されることは明かである。このようにして、関連するかまたは関連のない種またはドナー双方からの配列がキメラ配列中に近接して置かれる。特異的位置または「血液型亜型的」ドメインで遺伝的情報を交換しない、関連するかまたは関連しない血清型が、合併またはキメラ化される（式Ａ＋８＝八Ｂまたは＾十〇＋Ａ＝＾ＢＡ）。遺伝的交換またはインタータイプ的交換が頻繁でないか、または容易には検出できない場合、両株の重要なエピトープを発現する単一実体を製造するために、特異的新規キメラポリペプチドが創り出される。

この特異性をめざすプロセスは、自然界では再現性よく、または高精度で、または特異性を持って容易には得られない免疫的、ワクチンまたは予防的意義をもつ分子を創り出す。このことは、両者共に多種多様な病原性Ｎ１ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを表現すると信じられているが自然界に存在しないポーリン血清型＾およびＢの場合、特に有意義である。

相互に排他的である自然界の株が遺伝的要素を父換する例が見いだされているが、このプロセスは希で予見することはできない。個々の、またはいくつかの生体からの配列の特異的な組を同定し創造することにより、特異的キメラエピトープが創り出され、予防的または防御的ワクチンとしての臨床的意義と有用性が迅速に試験される。

Ｂ、　ｐＧＣ２６ブラスミドの構成発現プラスミドＰＡＴＨ２０（上記参照）は、ルリアブロス（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ　）および５０μｓ／ｎｔｆ！のアンピリジンサルフェートを含む振とうフラスコ中で培養した。スーパーコイルし、共有結合的に閉じた溝状プラスミドＯＮ＾をＣ３ＣＩ勾配超遠心で単離した。約１０μｇのプラスミドを、それぞれベクターを一回切断する制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで完全に消化した。この様な切断はＴｒｐＢ遺伝子（アンスラニン酸シンセターゼ）コード領域を中断し、不均一なりＮＡｆｆｉ列を受け入れるために使用される「ステイッキイエンド」を読みとり枠中につくりだし、結さっと選択に続くキメラヌクレオチドをつくりだす。酵素ＢｃｏＲｆと）ｌｉｎｄＩＩＩはそれぞれ１０ユニツト、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｉ！　ｐＨ７，５、ＬＭ　ＭｇＣｊ！２．５０ｍＭ　ＮａＣＣ１０μｇプラスミドを含む１００μｍ反応容積に加えられた。反応は４時間続けられ、その時間に消化をゲル電気泳動で確認した。二重消化プラスミドＯＮ＾は電気溶出により１％アガロースゲルから単離し、エタノール沈澱させた。約１μｇのこのプラスミドは、それぞれ２００ｎｇのアニールされたオリゴヌクレオチドａ／ｆ１ｂ／ｅｉよびｃ／ｄの相補的対と組み１００μβを３ＭストックからＮａ０ＡＣで０．３Ｍにし、０℃、１時間でエタノールで沈澱させた。エッペンドルフマイクロフニージ（Ｂｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｍｉｃｒｏ−ｆｕｇｅ）中で遠心分離後、ＤＮＡペレットを減圧下にサヴアントスピードーヴアック（Ｓａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ−ｖａｃ）で乾燥した。このペレットを１７μｌの水と２μｌの１０Ｘ’Ｊガーゼ緩衝液（６０＋＋＋ＭＴｒｉｓ　ｐＨ７，６，６６ｍＭ　ＭｇＣ１２，０，２Ｍ　０ＴＴ）中にＩＩ！１Ｍの最終ＡＴＰＩｉ度で再分散さぜた。

Ｔ４誘導ＯＮ＾リガーゼ（１μｌ）を加え、反応物を１６℃で１２時間インキュベートした。

組み換えプラスミドを与えるアンピシリン耐性ＨＢＩＯＩコロニーをつくるため、１００μｌの適合するＢ、　ｃａｌ　ｉ細胞を氷上で５μｌの結さつされた混合物と混ぜ合わせた。細胞とＤＮＡを氷上に３０分間置き、４２℃で２分間パルスし、３７℃で３０分間、１ｍｉ！の抗生物質を含まないルリアブロスと共に振とうした。−走部（１００μｌ）をアンピリン寒天板上に広げ、３２℃で終夜インキュベートした。生成したコロニーは、関心のあるキメラまたは個々のポーリン「エピトープ」配列を現す、Ｐ３２末端標識されたオリゴヌクレオチドに対しハイブリッドされた。この様にして、成功しまた結さつ操作を現すコロニーが迅速に選択され、分析のために拡張された。

誘導および非誘導（この場合Ｉ＾＾）コロニー生長の一部を、負コントロールホストＢ、ｃｏ１１と同様に溶解し、クマシーブルー（Ｃｏｕｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）ゲル染色および特異的ポーリンまたはキャリアタンパク質（ＴｒｐＢ）抗血清に対するウェスタンプロットで検査した。最後に、組み換えキメラエピトープ発現子を、その完全さを証明するため完全に配列解析した。

組み換えポーリン構成により生産されるタンパク質を発現するため、プラスミドを与える培養物を５０μｇ／μｇアンピシリンを含むＭ９培地中で約０．２−０．４の６００ｎｍ吸光度に培養した。インドールアクリル酸（Ｉ＾＾）を加え（１０ｍｇ／　１　）　、培養物を少なくとも５時間振とうするか、８−１６時間、終夜培養した。細胞をベレット化し、２５ｍｊ！　ＴＥＮＭ衝液（５０ｎ＋ｋｌ　Ｔｒｉｓ　７．５．０．５０１Ｍ［＋０７＾、０，３Ｍ　ＮａＣｊり中に再分散させた。リゾチームをＯ，１ｍｇ／ｍＩｌで加えた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびアプロチニンをそれぞれ１ｍＭおよび１０μ８／−で添加した。ＮＰ〜４０を最終濃度０．２％で加え、分解物を０℃で１０分間置いた。粘度が上昇した場合、ＭｇＣ１５を１０−で加え、ＤＮＡａｓｅ　ｌを１μｓ／ｍ１２で加えた。粘度が減少した場合は、懸濁物を４℃で１５分間、４０００　Ｘ　ｇで遠心分離し、上澄を捨てた。不溶性のペレットを冷ＴＥＮで１回洗い、ペレットを回収するため再遠心分離した。この物質は組み換え融合タンパク質が高度に濃縮され、ゲル電気泳動、ＢＬＩＳＡ、ウェスタンプロット、または動物注射等の他の免疫分析にきわめて適している。組み換え生産物はキャリアおよび／またはリガンド配列の特異的反応性により、上記方法のいづれでも検出できる。

得られたヌクレオチド配列を、対応する解放読みとり枠と同様に図４に示す。

この配列は最初のりジン残基（アミノ酸７）の後にエンテロキナーゼ切断サイトを有する。フラグメント２および６のキメラであるＧＣ２６は、エンテロキナーゼ切断から生じる。エンテロキナーゼはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から市販されている。タンパク質をエンテロキナーゼで切断する方法は当業者に公知である。例えば、製造者またはＨｏｐｐらのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．１２０４−１２１０　（１９８０）で推薦される方法が使用できる。

他の組み換え体はこのプロセスで生産、分析され、ワクチン候補の分析操作に利用される。

実施例２抗ＧＣ２６抗血清の製造抗Ｐ、Ｉ＾および抗Ｐ、ＩＢ液性反応を誘導するためのキメラポリペプチドの有効性を示すため、マウスをＧＣ−３０で高度免疫処置した。この構成物を含むバクテリア細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００とデオキシコール酸ナトリウムを含む緩衝液中で洗浄し溶解する。タンパク質濃度を測定し、１００＋ｎｇのキメラポリペプチドまたはＰＡＴＩＩベクター単独をメスＢａ１ｂ／（：マウス（８− １０週齢）に注射する。最初の注射混合物は完全フロインドアジュバントを含む。その動物は７日後に不完全フロインドアジュバントの第２回目の注射を１００ｍｇ受け、そして２１日後に１００ｍｇの最終注射を受ける。

、最後の注射の７日後、その動物は眼の眼窟後方ソケットから採血され、血清を遠心分離で分離した。

抗Ｐ、ＩＡおよびＰ、ＩＢ液性反応のタイターをＢＬＩＳＡで測定する。マイクロタイタープレート（９６穴）を精製したＰ、Ｉ＾またはＰ、ＩＢで被覆し、リン酸緩衝液生理食塩水、ｐＨ７，２（ＮＢ−１０）中の１０％新生細胞血清でブロックする。血清を連続的にＮＢ−１０中で希釈し、プレートに加える。３７℃ で２時間インキュベートした後、プレートを生理食塩水で洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスＩｇでプローブする。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、適当な発色体を加えて結合量を測定する。ＢＬＩＳＡプレートリーダー中、適当な波長で色の強さを測定する。

他の方法では、抗ＧＣ２６抗血清の生産はマウスをアフィニティー精製されたＴｒρ−ＧＣ−２６で免疫することによって行われた。これは構成物を結合するため、抗ＴｒｐＥモノクローナル抗体を使用するイムノーアフィニティ力ラムを用いて行われる。

ポリペプチドはグリシン緩衝液ｐ）１２．５を用いてカラムから溶離される。精製された物質は上記の通りマウスを免疫するために用いられる。

配列表（１）一般的情報（ｉ　）　出１１人ニイムクローン　システムズ　インコーホレーテッド（ｉｌ、発明の名称−組み換え１１イブリツドポーリンエピトープ（ｉｉｉ）配列の数＝１５（１ｖ）あて名：（Ａ）あて先ニイムクローン　システムズ　インコーホレーテッド（Ｂ）ストリート＝１８０バリツク　ストリート（Ｃ）市：ニューヨーク（Ｄ）州二ニューヨーク（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：１００１４（ｖ）コンピュータ入力形式：（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ −ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　ＰａｔｅｎｔＴｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＄１．０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ）本出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：１９９２年３月１３日（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）代理人：（Ａ）氏名：フェイト、イルピング　エヌ。

（Ｂ）登録番号：２８，６０１（Ｃ）処理番号：ＧＯＬ−ＩＴ（ｉｘ）通信情報；（Ａ）電話番号：２１２−６４５−１４０５（Ｂ）テレファックス：　２１２− ６４５−２０５４（２）配列番号：１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６アミノ酸ＣＢ）型二アミノ族（Ｄ）トポロジー−直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（徂）ハイポセティカル配列：否（１ｖ）アンチセンス：否（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端（ｖｉ）起源：（Ａ）生物窓：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ（Ｂ）株間：ＦＡ１９（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：　Ｐ、ＩＡフラグメント　１（×１）配列：配列番号：１：八ｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｆｌｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ（２）配列番号：２：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５アミ人酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物窓：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ（Ｂ）株間：ＦＡ１９（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩Ｉ　Ｐ、　ＩＡフラグメント　２（ｘｉ）配列：配列番号：２：Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ（２）配列番号：３：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：２８アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ＞生物窓：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ（Ｂ）株間：ＦＡ１９（ｖｉｉ）直接の起源二（Ｂ）クローン塩：　Ｐ、　１八フラグメント　３（ｘｌ）配列：配列番号：３；Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ１’５　１Ｑ　１５しｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　）Ｉｉｓ　Ｖａ１（２）配列番号：４：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎮状（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物窓：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ（Ｂ）株間：ＦＡ１９（■）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：　ｐ、　ｒ＾フラグメント　４（ｘｉ）配列：配列番号＝４：Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ＾Ｉａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５Ｌｙｓ　ｔｌｉｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ｆｌｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ（２）配列番号−５：（ｉ）配列の特ｗＬ：（Ａ）長さ：２７アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎮状（ｖｉ）起源：（Ａ）生物窓：　Ｎｅ１ｓｓａｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ（Ｂ）株間：ＭＳ１１（％ｒｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｐ、ＩＢフラグメント　５（ｘｉ）配列：配列番号：５：Ｇｌｙ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　）Ｉｉｓ　Ｔｈ■ ｌ　５　１０　１５Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ（２）配列番号：６：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２７アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎮状（ｖｉ）起源：（Ａ）生物窓：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ（Ｂ）株間：ＭＳ１１（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：　Ｐ、　Ｉ＾フラグメント　６（ｘｉ）配列：配列番号＝６＝Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＩＩｅＧｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５ｆｌｉｓ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａ１（２）配列番号ニア：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さニア８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木調（Ｄ）トポロジー：直鎮状（輔）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：　ＰＡＴＨ２０ポリリンカー（ｘｉ）配列：配列番号ニア：ＡＴＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＧＡＡｔｒＧ　ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ６O ＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴ　ＧＣＡＡＧ［ｒＴ　７８（２）配列番号：８：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二１８１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎮の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー二直鎮状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号二８：ＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡ　ＴＧＡＣＧＡＴ＾＾＾ＧＴＧＧ＾＾＾ＣＣＴ　ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴ　ＧＧＣＧＣＡＣＣＡＴ　ＧＧＣＧＣＧＣＡＧf　６０ＣＧＧＡＴＣＧＣＧＴ　Ｔ＾＾ＡＡＣＣＧＣＧ　ＡＣＣＧＡＡＡＴＴＧ　ＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧ　ＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧ　ＣＧＣＴＡＣＧＧbＧ　１２０（２）配列番号：９：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー二直鎮状（ｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：９：ＡＧＣＴＴＡＡＡＣＡ　ＡＡＣＡＧＧＣＴＣＧ　ＧＡＡＴＧＣＴＡＴＡ　ＡＡＣＣＴＧＡＴＧＴ　ＴＣＧＴＡＴＴＣＡＡ　ＴＴｒＴＩ’ＴｒfＧＴ　６０ＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧ　ＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡ　ＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧ　ＡＴＣＣＧＣＡＡＴＴ　ＴＣＧＧＴＣＧＣＧＧ　ＴＴＴＴＡＡＣＧbＧ　１２０ＡＴＣＣＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴ　ＧＣＧＣＣＡＣＧＧＡ　ＧＣＧＧＧＡＧＧＴＴ　ＴＣＣＡＣＴＴｒＡＴ　ＣＧＴＣＡＴＣＡＴf　１８０ＣＧ　１８２（２）配列番号：１０：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木調（Ｄ）トポロジー二直鎮状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６４合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：１０：ＣＡＴＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＴｒＴ　ＴＣＧＴＴＣＡＧＴＡ　ＣＧＣＴＧＧＴＴｒＣＴＡＣ４３（２）配列番号：１１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木調（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６４合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：１１：＾ＣＧＴＴＴＧＴＡＧ　Ａ＾＾ＣＣＡＧＣＧＴ　ＡＣＴＧＡＡＣＧＡ＾＾ＡＣＡＡＡＣＡＣＧ　ＣＴＣＧＧＡＡＴＧＣＴ　５１（２）配列番号：１２：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木調（Ｄ）トポロジー：直鎮状（畦）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６４合ＦｔＦ、ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：１２：ＡＡＡＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＧＧＴｒＧＧ　ＴＴＡ　５３（２）配列番号：１３：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：５１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木調（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６４合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：１３：ＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡ　ＡＣＣＡＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＴＴｒＣＧＧＴＧ　ＧＴＧＴＡＧＧＡＧＴ　Ｇ　５１（２）配列番号：１４：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号＝１４：ＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡ　ＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡ　ＧＴＡＧＡＡＡＣＴＴ　ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴ　ＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴ　ＧＧＡＧＣＴＣＡfＧ　６０ＣＧＧＡＴＣＧＣＧＴ　ＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴ　ＡＣＣＧＡＡＡＴＣＧ　ＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧ　ＣＴＴＧＴＴＣＣＡＡ　ＡＧＡＴＡＣＧＧbＧ　１２０ＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡ　ＡＡＡＡＡＴＣＧＡＡ　ＴＡＣＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴｒＴＡＴＡＧ　ＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴｒＧＴＴＴＡ@１８０ＡＡ　１８２（２）配列番号：１５：（ｉ）配列の特ｗｔ：（Ａ）長さ＝１８３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）　トポロジー：直鎮状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン塩：ＧＣ２６合成りＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：１５：ＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡ　ＣＭＡＣＡＧＧＣＴ　ＧＧＧＧＡＴＡＣＴＡ　ＴＡＡＡＣＴＴＧＡＴ　ＧＴＴＣＧＴＡＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡ@６０ＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＴＴｒＧ　ＧＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡ　ＴＴＴＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＣＧ　P２０ＣＧＡＴＣＣＧＣＣＴ　ＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧ　ＧＴＧＡＧＣＴＡＣＧ　ＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧ　ＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴ　ＡＴＣＧＴＣＡＴbＡ　１８０ＴＣＧ　１８３図ＩＡＰ、ＩＡフラグメント　アミ、酸１、　ＤＶＴＬＹＧＴ工ＫＡＧＶＥＴＳＲＳＶＡＫＨＧＡＱＡＤ　１−２６２　、　ＶＥＴＳＲ５ＶＡＸＨＧＡＱＡＪ）ＲＶＸＴＡＴＥ工ＡＤ　１２−３６：ｌ　、　ＤＴＧＧＦＮＰＷＥＧＫＳＹＹＬＧＬＳＮ工ＡＱＰＥＥＲＨＶ　９９−１２６４、ＦＶＱＹＡＧＦＹＫＲＨ５ＹＴ’ｒＥＫＨＱＶＨＲＬＶに　１６９−１９コＰ、！８フラグメント５、ＧＡ工ＫＡＧＶＱＴＹＲ５ＶＥＨＴＤＧＫＶＳＫＶＥＴＧＳ　６−３２６、　ＧＬＦＱＲＹＧＥＧＴＫ１’、工ＥＹＥＨＱＶＹＳ工ＰＳＬＦＶ　１７Ｂ−２０４図ＩＢＰ、ＩＡおよびＰ、ＩＢ上のフラグメント１−６の相対的位置Ｆ八１９　Ｐ、工ＡＭＳＩＩＰ、ＩＢ入ＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＣＣＣＣＣＧ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＧＭ　ＴＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＧＴ　ＡＣＣＣＧＧ　４２ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＣＴＴ　７８図３Ａｅ　べ−−一−」ｄ　４−−−−Ｊ図３ＢＤＤＤＩＸ　へ°フ゛チド２　、・、・ｆト・６図４Ａ（ｊ）　５Ｉ　ＡＧＣＴＴ入ＡｃＣ入ＡＣＣＡＧＡＣにＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＴｒＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＧＡＧＴＧ　コ′。

図４ＢＡＡＴＴＣＧＡＴＧ　ＡＴにＡＣＧ入Ｔ入Ａ　ＡＧＴＡＧＡＡＡＣＴ　ＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧ　ＴＡＧＣＴＣＡＣＣ入　５０国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５１０４　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１５／３１　ＺＮＡＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　８３１０−２Ｊ３３１５７１　Ｆ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｎ　１５／３１Ｃ１２Ｒ１：３６）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する少なくともひとつの抗原性配列と、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｃのＰ．ＩＢに存在する少なくともひとつの抗原性配列を含有し、Ｅ．ｃｏｌｉに非毒性であるポリヘプチト。
２．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント１−４から選ばれるものである請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
３．Ｈ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント５および６から選はれるものである請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
４．ポリペプチドがキヤリアタンパク質に融合する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
５．キヤリアペプチドが、切断できるサイトによってポリペプチドから離されている請求の範囲第４項記載のポリペプチド。
６．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が１２５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
７．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
８．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
９．Ｈ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が１２５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
１０．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
１１．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
１２．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が１２５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第９項記載のポリペプチド。
１３．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１０項記載のポリペプチド。
１４．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１１項記載のポリペプチド。
１５．Ｐ．１Ａに存在する抗原性配列中の全アミノ酸数が１２５以下であり、Ｐ．ＩＢに存在する抗原性配列中の全アミノ酸数が１２５以下である、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．１Ａに存在する少なくともひとつの抗原性配列とＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する少なくともひとつの抗原性配列を含有するポリペプチド。
１６．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント１−４から選ばれるものである請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
１７．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント５および６から選ばれるものである請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
１８．ポリペプチドがキャリアペプチドと融合する請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
１９．キャリアペプチドが、切断サイトによってポリペプチドから離されている請求の範囲第１８項記載のポリペプチド。
２０．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
２１．Ｈ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
２２．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
２３．Ｈ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１５項記載のポリペプチド。
２４．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２０項記載のポリペプチド。
２５．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２１項記載のポリペプチド。
２６．（ａ）検体を請求の範囲第１項または第１５項記載のキメラポリペプチドとインキュベートし；（ｂ）キメラポリペプチドに結合した抗体の存在を検出するステップを含む、検体中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに対し特異的な抗体と、同時にＰ．ＩＢに対し特異的な抗体の存在を検出する方法。
２７．請求の範囲第１項または１５項記載のキメラポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与することを含む、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ血液型亜型ＩＡおよびＩＢに対し補乳動物を同時に免疫する方法。
２８．薬学的に許容できる媒体中に、請求の範囲第１項または１５項記載のキメラポリペプチドの有効量を含有するワクチン組成物。
２９．ポリペプチドがＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する少なくともひとつの抗原性配列とＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する少なくともひとつの抗原性配列を含有し、Ｂ．ｃｏｌｉに非毒性であるポリヘプチトをコートするＤＮＡ分子。
３０．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント１−４から選ばれるものである請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
３１．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント５および６から選ばれるものである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
３２．ポリペプチドがキヤリアペプチドに融合する請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
３３．キヤリアペプチドが、切断サイトによってポリペプチドから離されている請求の範囲第３２項記載のＤＮＡ分子。
３４．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が１２５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２９項記載のＤＨＡ分子。
３５．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
３６．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
３７．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が１２５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
３８．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
３９．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２９項記載のＤＮＡ分子。
４０．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が１２５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第３７項記載のＤＮＡ分子。
４１．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ分子。
４２．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第３９項記載のＤＮＡ分子。
４３．Ｐ．ＩＡに存在する抗原性配列の全アミノ酸数が１２５以下であり、Ｐ．ＩＢに存在する抗原性配列の全アミノ酸数が１２５以下である、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＦ．ＩＡに存在する少なくともひとつの抗原性配列とＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する少なくともひとつの抗原性配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
４４．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント１−４から選ばれるものである請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ分子。
４５．Ｈ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する抗原性配列が図１Ａのフラグメント５および６から選ばれるものである請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ分子。
４６．ポリペプチドがキャリアタンパク質に融合する請求の範囲第４３項記載のＤＮＳ分子。
４７．キャリアポリペプチドが、切断サイトによってポリペプチドから離されている請求の範囲第４６項記載のＤＮＡ分子。
４８．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ分子。
４９．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＡに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ分子。
５０．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ分子。
５１．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ分子。
５２．Ｈ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が７５以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２０項記載のＤＮＡ分子。
５３．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ．ＩＢに存在する１または２以上の抗原性配列が５０以下のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２１項記載のＤＮＡ分子。