PT1524993E - Composições de vacina de neisseria compreendendo uma combinação de antigénios - Google Patents

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PT1524993E
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Ralph Biemans
Carine Goraj
Jan Poolman
Philippe Denoel
Francois-Xavier Jacques Berthet
Christiane Feron
Vincent Weynants
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Glaxosmithkline Biolog Sa
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Description

DESCRIÇÃO
"COMPOSIÇÕES DE VACINA DE NEISSERIA COMPREENDENDO UMA COMBINAÇÃO DE ANTIGÉNIOS"
Campo Técnico A presente invenção refere-se ao campo das composições e vacinas imunogénicas de Neisseria, sua preparação e a utilização destas composições em medicina. Mais particularmente, refere-se a composições de vacina compreendendo uma combinação de antigénios que possuem qualidades que permitem às vacinas da invenção estimular uma surpreendente boa resposta imunitária como medido num ensaio de protecção ou um ensaio bactericida em soro.
Antecedentes
As estirpes de bactérias Neisseria são os agentes causais para várias patologias humanas, contra as quais existe uma necessidade de se desenvolverem vacinas eficazes. Em particular Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis causam patologias que podem ser tratadas por vacinação.
Neisseria gonorrhoeae é o agente etiológico de gonorreia, uma das doenças sexualmente transmitidas mais frequentemente reportadas no mundo com uma incidência anual estimada de 62 milhões de casos (Gerbase et ai., 1998 Lancet 351; (Supl. 3) 2-4). As manifestações clínicas da gonorreia incluem inflamação 1 das membranas mucosas do tracto urogenital, infecções da garganta ou recto e olho neonatal. As infecções de gonococos ascendentes em mulheres podem levar à infertilidade, gravidez ectópica, doença inflamatória pélvica crónica e formação de abcesso do tubo ovárico. Septicémia, artrite, endocardite e meningite estão associadas com gonorreia complicada. 0 elevado número de estirpes de gonococos com resistência a antibióticos contribui para morbidez aumentada e complicações associadas com gonorreia. Uma alternativa atractiva ao tratamento de gonorreia com antibióticos seria a sua prevenção utilizando a vacinação. Não existe actualmente vacina para infecções de N. gonorrhoeae.
Neisseria meningitidis é um importante patogénico, particularmente em crianças e jovens adultos. Septicemia e meningite são as formas mais ameaçadoras à vida da doença invasiva meningocócica (IMD). Esta doença tornou-se um problema de saúde em todo o mundo devido à sua elevada morbidez e mortalidade.
Treze serogrupos de N. meningitidis foram identificados com base nas diferenças antigénicas nos polissacáridos capsulares, sendo os mais comuns os A, B e C que são responsáveis por 90% de doença em todo o mundo. O serogrupo B é a causa mais comum de doença meningocócica na Europa, EUA e vários países na América Latina.
As vacinas com base no polissacárido capsular de serogrupos A, C, W e Y foram desenvolvidas e foram apresentadas para controlar surtos de doença meningocócica (Peltola et al., 1985 Pediatrics 76; 91-96). Contudo, o serogrupo B é fracamente 2 imunogénico e induz apenas uma resposta de anticorpo transiente de um isotipo predominantemente IgM (Ala'Aldeen D e Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157). Não existe, deste modo, uma vacina amplamente eficaz actualmente disponível contra o serogrupo B de meningococos que é responsável pela maior parte da doença na maioria dos países temperados. Isto é particularmente problemático uma vez que a incidência da doença do sorotipo B está a aumentar na Europa, Austrália e América, principalmente em crianças menores de 5. 0 desenvolvimento de uma vacina contra o meningococos do serogrupo B apresenta particulares dificuldades porque a cápsula de polissacáridos é fracamente imunogénica graças à sua semelhança imunológica com a molécula de adesão de células neurais humanas. As estratégias para a produção de vacina concentraram-se, deste modo, nas estruturas expostas à superfície da membrana meningocócica externa mas foram dificultadas pela variação marcada nestes antigénios entre as estirpes.
Outros desenvolvimentos levaram à introdução de vacinas preparadas a partir de vesículas da membrana externa que irá conter várias proteínas que constituem o conteúdo normal da membrana bacteriana. Um destes é a vacina cubana VA-MENGOC-BC® contra N. meningitidis dos serogrupos B e C (Rodriguez et al., 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440) . Esta vacina foi concebida para combater um surto da doença meningocócica invasiva em Cuba que não foi eliminado por um programa de vacinação utilizando uma vacina de polissacárido capsular AC. Os serogrupos prevalecentes foram o B e o C e a vacina VA-MENGOC-BC® foi bem sucedida no controlo do surto com uma eficiência estimada da vacina de 83% contra as estirpes de serogrupo B de N. meningitidis (Sierra et al., 1990 Em
Neisseria, Walter Gruyter, Berlin, m. Atchman et al., (eds) 3 ρ. 129-134, Sierra et al., 1991, NIPH Ann 14; 195-210). Esta vacina foi eficaz contra um surto especifico, no entanto, a resposta imunitária estimulada não protege contra outras estirpes de N. meningitidis.
Os estudos subsequentes eficazes conduzidos na América Latina durante epidemias causadas por estirpes meningocócicas do serogrupo B homólogo e heterólogo apresentaram alguma eficácia em crianças mais velhas e adultos mas a sua eficácia foi significativamente inferior em crianças mais novas que estão em grande risco de infecção (Milagres et al., 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424). É questionável o quão eficaz esta vacina seria em países com doença endémica multi-estirpes tal como o RU. Os estudos de imunogenicidade contra estirpes heterólogas demonstraram apenas uma actividade bactericida limitada de reacção cruzada em soro, especialmente em crianças (Tappero et al., 1999, JAMA 281; 1520-1527).
Uma segunda vacina de vesícula da membrana externa foi desenvolvida na Noruega utilizando um isolado de serotipo B típico dos prevalentes na Escandinávia (Fredriksen et al., 1991, NIPH Ann, 14; 67-80). Esta vacina foi testada em ensaios clínicos e verificou-se uma eficácia protectora após 29 meses de 57% (Bjune et al., 1991, Lancet, 338; 1093-1096).
No entanto, a utilização de vesículas da membrana externa em vacinas é associada com alguns problemas. Por exemplo, o OMV contém lipopolissacáridos tóxicos e estes podem conter antigénios imunodominantes que são específicos para a estirpe ou são expressos de forma variável. Vários processos foram descritos que podem ser utilizados para ultrapassar alguns dos problemas da preparação de vacinas de vesículas da membrana 4 externa. 0 documento W001/09350 descreve os processos que abordam estes problemas, por exemplo, por redução da toxicidade e modificação dos antigénios presentes nas vesículas da membrana externa.
Uma vacina de vesícula da membrana externa compreendendo LPS e proteínas da membrana externa de classes 1, 3, 4 e 5 é divulgada em Andersen et al., 1997,Microbial Pathogenesis 23 :139-155. 0 documento WOOl/52885 descreve a possibilidade de combinação de vesículas da membrana externa com outros antigénios e uma lista de mais 2000 proteínas potenciais de Neisseria é incluída a partir da qual é especulado que podem ser desenvolvidas vacinas com eficácia contra uma vasta gama de serotipos.
Uma vacina de membrana externa nativa intranasal preparada a partir de uma estirpe de cápsula negativa do grupo B de Neisseria meningitidis, cultivada sob condições de limitação de ferro de modo a induzir proteínas reguladas pelo ferro, é divulgada em Katial et al., 2002, Infection and Immunity, 70 : 702-707.
Existem diversos problemas com as vacinas anti-meningocócicas actualmente disponíveis.
As vacinas de membrana externa à base de proteína tendem a ser específicas e eficazes contra apenas algumas estirpes. As vacinas de polissacárido são também sub-óptimas uma vez que estas tendem a estimular respostas imunitárias pobres e curtas, 5 particularmente contra o serogrupo B (Lepow et al., 1986;
Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96).
As infecções com Neisseria representam um considerável problema de cuidados de saúde para o qual não existem vacinas disponíveis no caso de N. gonorrhoeae ou estão disponíveis vacinas com limitações da sua eficácia e capacidade de protecção contra estirpes heterólogas no caso de N. meningitidis. Existe claramente a necessidade de desenvolvimento de vacinas superiores contra infecções por Neisseria que melhorarão a eficácia das vacinas actualmente disponíveis e permitem a protecção contra uma vasta gama de estirpes.
Descrição das Figuras
Figura 1. - Detecção de TbpA e Hsf em OMV preparadas a partir de uma estirpe recombinante de N. meningitidis regulada positivamente para a expressão de tbpA e hsf. A separação de preparações de OMV (10 mg) por análise de SDS-PAGE (géis de gradiente 4-20%) corados com azul brilhante de Coomassie.
Figura 2. - Detecção de domínio de passagem de Hsf recombinante produzida em E. coli, 10 pg de proteína de passagem de Hsf purificada (Pista 2 & 3) foram separados por SDS-PAGE num gel a 12% em comparação com um marcador de peso molecular (Pista 1).
Figura 3. - Análise de pureza do Hap de passagem como detectado por (A) coloração de Coomassie, (B) coloração por prata, (C) transferência de western com anti-His5 e 6 (D) anti-E. coli 10 mg de antigénios purificados foram separados por SDS-PAGE num gel de gradiente de acrilamida a 4-20%.
Figura 4. - Regiões de semelhança de sequências partilhadas pelas proteínas FrpA e FrpC isoladas a partir de N. meningitidis estirpe FAM20. (A) Organização do domínio das proteínas FrpA e FrpC de N. meningitidis estirpe FAM20 RTX. (B) Produtos de amplificação FrpA/C obtidos a partir de N. meningitidis estirpe H44/76.
Figura 5. - Expressão do antigénio de E. coli Frp23 recombinante (região conservada FrpA/C com 23 repetições). Análise SDSPAGE de extractos de células totais de E. coli BL21DE3 não induzidas (NI) e induzidas (I) transformadas com vectores de controlo (pET24d) ou construções recombinantes (Frp3, Frpl3 e Frp23 respectivamente). Os géis foram corados com azul de Coomassie (A) ou transferidos para nitrocelulose e imuno-detectados com soro de murganho anti-His6.
Figura 6. - Sequência de ADN preferida do fragmento 2°/3° FHAB2 expressa em E. coli.
Figura 7. - Purificação de FHAB 2/3° recombinante a partir de extractos de E. coli B121DE3 induzidas. (A) Passos principais no processo de purificação. (B) Análise de SDS-PAGE das fracções de proteína amostradas em diferentes passos do processo de purificação.
Figura 8. - Actividades de bloqueamento de adesão de anti-soros dirigidos contra os antigénios de N. meningitidis 7 FHAB2/30, Hap, domínio de passagem de Hap, Hsf e domínio de passagem de Hsf.
Figura 9. - Um gel corado com Coomassie apresentando os níveis de expressão de Hsf, TbpA e NspA nas preparações de vesícula da membrana externa derivadas de diferentes estirpes de N. meningitidis. Pista 1 - marcadores de peso molecular; pista 2 - vesículas da membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76, em gue polissacáridos capsulares foram regulados negativamente; pista 3 vesículas de membrana externa preparadas a partir de estirpe H44/76, em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente; pista 4 - vesículas da membrana externa preparadas a partir de estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e o NspA foi regulados positivamente; pista 5 vesículas da membrana externa preparadas a partir de estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e Hsf foi regulado positivamente; pista 6 - vesículas da membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e TbpA foi regulado positivamente; pista 7 - vesículas da membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e TbpA e Hsf foram regulados positivamente; pista 8 - vesículas da membrana externa preparadas a partir da estirpe H44/76 em que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente e TbpA e NspA foram regulados positivamente.
Descrição detalhada A presente invenção divulga combinações particulares de antigénios de Neisseria que quando combinados, leva a uma surpreendente melhoria da eficácia da vacina contra infecção por Neisseria. Deste modo, a invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo ... [etc. como reivindicação 1].
As infecções com Neisseria progridem ao longo de vários estádios. Por exemplo, o ciclo de vida do meningococos envolve colonização nasofaringica, ligação às mucosas, cruzamento da corrente sanguínea, multiplicação no sangue, indução do choque tóxico, cruzamento da barreira hemato-encefálica e multiplicação no fluido cerebrospinal e/ou nas meninges. Diferentes moléculas na superfície da bactéria estarão envolvidas em diferentes passos do ciclo de infecção. Direccionando a resposta imunitária contra uma quantidade eficaz de uma combinação particular de antigénios, envolvidos em diferentes processos de infecção com Neisseria, pode ser conseguida uma vacina de Neisseria com uma eficácia surpreendente elevada.
Em particular, combinações de certos antigénios de diferentes classes, alguns das quais estão envolvidos em adesão a células hospedeiras, alguns dos quais estão envolvidos na aquisição de ferro, alguns dos quais são autotransportadores e alguns dos quais são toxinas, podem estimular uma resposta imunitária que protege contra múltiplos estádios de infecção. Estas combinações de antigénios podem levar, surpreendentemente, a uma melhorada eficácia de vacina (de um modo preferido, sinergicamente melhorada) contra infecção por Neisseria em que mais do que uma função da bactéria são o alvo de resposta imunitária, de uma forma óptima. 9 A eficácia de vacinas pode ser avaliada através de uma variedade de ensaios. Os ensaios de protecção em modelos animais são bem conhecidos na técnica. Além disso, o ensaio bactericida de soro (SBA) é, normalmente, o marcador imunológico mais consensual para estimar a eficácia de uma vacina meningocócica (Perkins et al., J Infect Dis. 1998, 177:683-691).
Algumas combinações de antigénios (por exemplo, combinações de certas proteínas de autotransporte e certas proteínas de aquisição de ferro) pode levar a uma protecção melhorada em ensaios em modelo animal e/ou títulos de SBA sinergicamente elevados. Sem desejar estar ligado à teoria, esta combinação sinérgica de antigénios é possível através de várias características da resposta imunitária à combinação de antigénios. Os próprios antigénios são normalmente expostos na superfície das células de Neisseria e tendem a ser conservados mas também não tendem a estar presentes em quantidade suficiente à superfície da célula para que uma resposta bactericida óptima ocorra utilizando anticorpos estimulados contra o antigénio isolado. A combinação dos antigénios da invenção pode resultar numa formulação que estimula uma combinação vantajosa de anticorpos bactericidas que interage com as células de Neisseria para lá de um limiar crítico. Neste nível crítico, anticorpos suficientes de qualidade suficiente ligam-se à superfície da bactéria para permitir a morte eficiente pelo complemento, e são observados efeitos bactericidas muito elevados, como uma consequência.
Como um ensaio bactericida em soro (SBA) reflecte de forma próxima a eficácia dos candidatos a vacinas, a obtenção de bons títulos em SBA através de uma combinação de antigénios é uma boa indicação da eficácia protectora de uma vacina contendo essa 10 combinação de antigénios. A invenção refere-se à utilização de uma combinação de dois antigénios isolados ou enriquecidos numa mistura com outros antigénios. Quando combinados, esta combinação dos antigénios interage vantajosamente e, de um modo preferido, estimula sinergicamente uma resposta imunitária que é superior em termos de actividade bactericida (por exemplo, como medido pelo ensaio bactericida em soro ou SBA) e, de um modo preferido, mais elevada do que a resposta aditiva estimulada pelos antigénios individualmente, de um modo mais preferido, por um factor de, pelo menos, 1,2, 1,5, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, de um modo muito preferido, por um factor de, pelo menos, dez.
Uma vantagem adicional da invenção é que a combinação dos antigénios da invenção de diferentes famílias de proteínas numa composição imunogénica pode permitir a protecção contra uma vasta gama de estirpes. A presente divulgação refere-se a composições imunogénicas compreendendo uma pluralidade (duas ou mais) de proteínas seleccionadas de, pelo menos, duas diferentes categorias de proteína, possuindo diferentes funções em Neisseria. Exemplos destas categorias de proteínas são adesinas, proteínas de autotransporte, toxinas, proteínas integrais da membrana externa e proteínas de aquisição de Fe. As combinações de vacina da invenção mostram uma melhoria surpreendente na eficácia da vacina contra estirpes homólogas de Neisseria (estirpes a partir das quais os antigénios são derivados) e, de um modo preferido também contra as estirpes heterólogas de Neisseria. São aqui divulgadas composições imunogénicas compreendendo, pelo menos, ou, exactamente, dois, três, quatro, cinco, seis, 11 sete, oito, nove ou dez de diferentes antigénios seleccionados de, pelo menos, ou, exactamente, duas, três, quatro ou todas as cinco categorias de antigénios seleccionadas dos seguintes: • pelo menos uma adesina de Neisseria; • pelo menos um autotransportador de Neisseria; • pelo menos uma toxina de Neisseria; • pelo menos uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria; • pelo menos uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido, proteína da membrana externa, particularmente proteína integral da membrana externa). São também divulgadas composições imunogénicas que compreendem, pelo menos, ou, exactamente, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez diferentes antigénios de Neisseria. Estes antigénios podem ser seleccionados de, pelo menos, ou, exactamente, duas, três, quatro ou cinco grupos de proteínas seleccionadas dos seguintes: • pelo menos uma adesina de Neisseria seleccionada do grupo consistindo em FhaB, NspA PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB 0315, NMB 0995, NMB 1119 e NadA; • pelo menos um autotransportador de Neisseria seleccionado do grupo consistindo em Hsf, Hap, igA protease, AspA e NadA; 12 • pelo menos uma toxina de Neisseria seleccionada do grupo consistindo em VapD, NM-ADPRT e uma ou ambas de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3; • pelo menos uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria seleccionada do grupo consistindo em TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964, NMB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB e P2086 (XthA); e • pelo menos uma proteína associada a membrana de Neisseria, de um modo preferido, proteína da membrana externa, particularmente proteína integral da membrana externa, seleccionada do grupo consistindo em PilQ, OMP85, NspA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MltA, HpuB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA (GNA1946), NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA e PldA (OmplA).
Os antigénios da presente invenção são todos isolados, o que significa que estes são alterados pela mão do homem. De um modo preferido, estes são purificados em algum grau, de um modo muito preferido, a mais de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99% puros (antes combinação com os outros componentes das composições imunogénicas da invenção).
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma adesina de Neisseria e, pelo menos, um autotransportador de Neisseria e opcionalmente uma toxina de Neisseria, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria ou uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido, proteína integral da membrana externa). De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima nomeados. 13
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma adesina de Neisseria e, pelo menos, uma toxina de Neisseria e opcionalmente um autotransportador de Neisseria, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria ou uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido proteína integral da membrana externa). De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma adesina de Neisseria e, pelo menos, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria e opcionalmente uma toxina de Neisseria, um autotransportador de Neisseria ou uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido proteína integral da membrana externa). De um modo preferido, os antigénios são seleccionados a partir dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma adesina de Neisseria e, pelo menos, uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido proteína integral da membrana externa) e opcionalmente uma toxina de Neisseria, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria ou um autotransportador de Neisseria. De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, um autotransportador de Neisseria e, pelo menos, uma toxina de Neisseria e opcionalmente uma adesina de Neisseria, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria ou uma proteína associada a membrana de Neisseria (de 14 um modo preferido, proteína integral da membrana externa). De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, um autotransportador de Neisseria e, pelo menos, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria e opcionalmente uma adesina de Neisseria, uma toxina de Neisseria ou uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido, proteína integral da membrana externa). De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, um autotransportador de Neisseria e, pelo menos, uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido, proteína integral da membrana externa) e opcionalmente uma adesina de Neisseria, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria ou uma toxina de Neisseria. De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma toxina de Neisseria e, pelo menos, uma proteína de aquisição de Fe de Neisseria e opcionalmente uma adesina de Neisseria, um autotransportador de Neisseria ou uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido proteína integral da membrana externa). De um modo preferido, os antigénios são seleccionadas dos antigénios acima mencionados. 15
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma toxina de Neisseria e, pelo menos, uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido, proteína integral da membrana externa) e opcionalmente uma adesina de Neisseria, um autotransportador de Neisseria ou uma toxina de Neisseria. De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
Numa forma de realização divulgada uma composição imunogénica compreende, pelo menos, uma proteína de aquisição de
Fe de Neisseria e, pelo menos, uma proteína associada a membrana de Neisseria (de um modo preferido proteína integral da membrana externa) e opcionalmente uma adesina de Neisseria, um autotransportador de Neisseria ou uma toxina de Neisseria. De um modo preferido, os antigénios são seleccionados dos antigénios acima mencionados.
De um modo preferido, todos os cinco grupos de antigénio são representados na composição imunogénica da invenção.
Quando uma proteína é especificamente aqui mencionada, é, de um modo preferido, uma referência a uma proteína nativa, de comprimento total e às suas variantes naturais (i. e., a uma proteína nativa obtenível a partir de uma Neisseria, de um modo preferido, estirpe meningocócica) mas pode também incluir seus fragmentos antigénicos (particularmente no contexto de vacinas de subunidades). Estes são fragmentos (especificamente aqui descritos com frequência) contendo ou compreendendo, pelo menos, 10 aminoácidos, de um modo preferido, 20 aminoácidos, de um modo mais preferido, 30 aminoácidos, de um modo mais preferido, 40 aminoácidos ou de um modo ainda mais preferido, 50 aminoácidos, tomados de forma contígua a partir da sequência 16 de aminoácidos da proteína. Adicionalmente, fragmentos antigénicos denotam fragmentos que são imunologicamente reactivos com anticorpos produzidos contra as proteínas de comprimento total de Neisseria ou com anticorpos produzidos por infecção de um mamífero hospedeiro com Neisseria. Os fragmentos antigénicos também incluem fragmentos que, quando administrados numa dose eficaz, estimulam uma resposta imunitária protectora contra infecção com Neisseria, de um modo mais preferido, é protectora contra infecção contra N. meningitidis e/ou N. gonorrhoeae, de um modo ainda mais preferido, é protectora contra infecção com N. meningitidis serogrupo B.
Também incluídas na invenção estão proteínas de fusão recombinantes de proteínas de Neisseria da invenção ou seus fragmentos. Estes podem combinar diferentes proteínas de Neisseria ou seus fragmentos no mesmo polipéptido. Alternativamente, a invenção também inclui a fusão de proteínas individuais de proteínas de Neisseria ou seus fragmentos, como uma proteína de fusão com sequências heterólogas, tais como um fornecedor de epitopos de células T ou etiquetas de purificação, por exemplo: β-galactosidase, glutationa-S-transferase, proteínas verde fluorescentes (GFP), etiquetas de epitopo, tais como FLAG, myc tag, poli-histidina, ou proteínas da superfície virai, tais como hemaglutinina do vírus influenza, toxoide do tétano, toxóide de difteria, CRM197.
Antigénios da invenção
As referências NMB referem-se a números de referência para sequências que podem ser encontradas em www.neisseria.org. 17 1. Adesinas
As adesinas incluem FhaB (documento WO98/02547, NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445; NMB 1994), Hsf também conhecida como NhhA (NMB 0992) (documento W099/31132), Hap (NMB 1985)( documento W099/55873), NspA (documento W096/29412), MafA (NMB 0652) e MafB (NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000); Nature Biotech 20; 914-921 (2002)), Omp26 (NMB 0181), NMB 0315, NMB 0995, NMB 1119 e PilC (Mol. Microbiol. 1997, 23; 879-892). Estas são proteínas que estão envolvidas na ligação de Neisseria à superfície de células hospedeiras. Hsf é um exemplo de uma adesina, assim como o de uma proteína de autotransporte. As composições imunogénicas aqui divulgadas podem, deste modo, incluir combinações de Hsf e outras proteínas de autotransporte, em que Hsf contribui para a sua capacidade como uma adesina. Estas adesinas podem ser derivadas de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras adesinas de Neisseria.
FhaB
Este antigénio foi descrito no documento WO98/02547 SEQ ID N° 38 (nucleótidos 3083-9025) - ver, também, NMB0497. A presente requerente verificou que FhaB era particularmente eficaz na indução de anticorpos anti-adesivos isolados e, em particular, com outros antigénios da invenção. Embora o FhaB de comprimento total possa ser utilizado, a requerente verificou que os truncados particulares C-terminais são surpreendentemente, pelo menos, tão eficazes e, de um modo preferido, ainda mais eficazes em termos de efeito de estirpe 18 cruzada. Estes truncados foram também vantajosamente apresentados por serem bastante mais fáceis de clonar. Os truncados de FhaB da invenção correspondem tipicamente, aos dois terços do N-terminal da molécula de FhaB, estando, de um modo preferido, o novo C-terminal situado na posição 1200-1600, de um modo mais preferido, na posição 1300-1500 e, de um modo ainda mais preferido, na posição 1430-1440. As formas de realização especificas possuem o C-terminal aos 1433 ou 1436. Estes truncados de FhaB podem ser componentes da combinação de composições imunogénicas da invenção. O N-terminal pode também ser truncado até os 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos. 2. Proteínas de autotransporte
As proteínas autotransportadoras são, tipicamente, constituídas por uma sequência sinal, um domínio de passagem e um dominio de ancoragem para ligação à membrana externa. Exemplos de proteínas de autotransporte incluem Hsf (documento W099/31132) (NMB 0992), HMW, Hia (van Ulsen et al.,
Immunol. Med. Microbial. 2001 32; 53-64), Hap (NMB 1985) (documento WO99/55873; van Ulsen et al., Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64), UspA, UspA2, NadA (NMB 1994) (Comanducci et al., J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454) , AspA (Infection and Immunity 2002,70(8 ); 4447-4461; NMB 1029), proteína tipo Aida-1, SSh-2 e Tsh. NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445) é outro exemplo de uma proteína de autotransporte, sendo ainda uma adesina. As composições imunogénicas aqui divulgadas podem, deste modo, incluir combinações de NadA e adesinas, em que NadA contribui na sua capacidade como uma proteína de autotransporte. Estas proteínas podem ser derivadas de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae ou outras 19 estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras proteínas de autotransporte de Neisseria.
Hsf
Hsf possui uma estrutura que é comum a proteínas de autotransporte. Por exemplo, Hsf da estirpe de N. meningitidis H44/76 consiste numa sequência sinal constituída por aminoácidos 1-S1, uma cabeça no terminal amino da proteína madura (aminoácidos 52-479) que é exposta à superfície e contém regiões variáveis (aminoácidos 52-106, 121-124, 191-210 e 230-234), uma região de pescoço (aminoácidos 480-509), uma região de hélice alfa hidrofóbica (aminoácidos 518-529) e um domínio de ancoragem, em que quatro cadeias transmembranares atravessam a membrana externa (aminoácidos 539-591).
Embora o Hsf de comprimento total possa ser utilizado em composições imunogénicas da invenção, vários truncados de Hsf e deleções podem também ser vantajosamente utilizados dependendo do tipo de vacina.
Quando o Hsf é utilizado numa vacina de subunidades, é preferido que uma porção do domínio de passagem solúvel seja utilizada; por exemplo, o domínio completo de aminoácidos 52 a 479, de um modo ainda mais preferido, uma sua porção conservada, por exemplo, a sequência particularmente vantajosa dos aminoácidos 134 a 479 . As formas preferidas de Hsf podem ser truncadas de modo a remover regiões variáveis da proteína divulgada no documento WOOl/55182. As variantes preferidas incluirão a remoção de uma, duas, três, quatro, ou cinco regiões variáveis como definido no documento WOOl/55182. As sequências 20 acima e as descritas a seguir, podem ser estendidas ou truncadas até 1, 3, 5, 7, 10 ou 15 aminoácidos num terminal N ou C ou em ambos.
Os fragmentos preferidos de Hsf incluem, deste modo, toda a região da cabeça de Hsf, contendo, de um modo preferido, os aminoácidos 52-473. Os fragmentos adicionais preferidos de Hsf incluem regiões da cabeça expostas à superfície incluindo um ou mais das seguintes sequências de aminoácidos; 52-62, 76-93, 116-134, 147-157, 157-175, 199-211, 230-252, 252-270, 284-306, 328-338, 362-391, 408-418, 430-440 e 469-479.
Quando o Hsf está presente numa preparação da vesícula da membrana externa, pode ser expresso como a proteína de comprimento total ou, de um modo preferido, como uma variante vantajosa constituída por uma fusão de aminoácidos 1-51 e 134-591 (produzindo uma proteína madura da membrana externa da sequência de aminoácidos 134 ao terminal C) . As formas preferidas de Hsf podem ser truncadas de modo a remover as regiões variáveis da proteína divulgada no documento WOOl/55182. As variantes preferidas podem incluir a deleção de uma, duas, três, quatro, ou cinco regiões variáveis como definido no documento WOOl/55182. De um modo preferido, as primeiras e segundas regiões variáveis são removidas. As variantes preferidas removerão resíduos entre a sequência de aminoácidos 52 a 237 ou 54 a 237, de um modo mais preferido, removendo os resíduos entre o aminoácido 52 ao 133 ou 55 ao 133. A proteína madura não contém o péptido sinal. 21
Hap A análise por computador da proteína tipo Hap de Neisseria meningitidis divulga, pelo menos, três domínios estruturais. Considerando a sequência tipo Hap da estirpe H44/76 como uma referência, Domínio 1, compreendendo o aminoácido 1 a 42, codifica um péptido sinal dependente de sec característico da família de auto-transportadores, Domínio 2, compreendendo os aminoácidos 43 a 950, codifica o domínio de passagem, provavelmente para ser exposto à superfície e acessível ao sistema imunitário, Domínio 3, compreendendo os resíduos 951 a ao terminal C (1457), deduz-se que codificam uma cadeia beta para provavelmente montar uma estrutura tipo barril e para ser ancorada na membrana externa. Uma vez que o domínio 2 é, provavelmente, para ser exposto à superfície, é bem conservado (mais do que 80% em todas as estirpes testadas) e pode ser produzido como antigénios de subunidade em E. coli, representa um interessante candidato a vacina. Uma vez que os domínios 2 e 3 são para, provavelmente, ser expostos à superfície, são bem conservados (Pizza et al., (2000), Science 287: 1816-1820), estes representam interessantes candidatos a vacinas. O domínio 2 é conhecido como o domínio de passagem.
As composições imunogénicas da invenção podem compreender a proteína Hap de comprimento total, de um modo preferido, incorporado numa preparação OMV. As composições imunogénicas da invenção podem também compreender o domínio de passagem de Hap que na estirpe H44/76 é composta pelos resíduos de aminoácidos 43-950. Este fragmento de Hap será, particularmente, vantajosamente utilizado numa composição de subunidades da invenção. A sequência acima para o domínio de passagem de Hap 22 pode ser estendida ou truncada até 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos no terminal N ou C ou em ambos. 3. Proteínas de aquisição de ferro
As proteínas de aquisição de ferro incluem TbpA (NMB 0461) (documento WO92/03467, US5912336, WO93/06861 e EP586266), TbpB (NMB 0460) (documento WO93/06861 e EP586266), LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32:1117), LbpB (NMB 1541) (documento WO/99/09176), HpuA (U73112.2) (Mol Microbiol. 199 7, 23; 737-749), HpuB (NC_003116.1) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749), P2086 (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002), FbpA (NMB 0634), FbpB, BfrA (NMB 1207), BfrB (NMB 1206), Lipo28, também conhecido como GNA2132 (NMB 2132), Sibp (NMB 1882), HmbR, HemH, Bcp (NMB 0750), proteína ABC transportador-permease de Ferro (III) (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000), Ferro (III) ABC transportador -periplásmico (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000), receptor dependente de TonB (NMB 0964 e NMB 0293) (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000) e proteína relacionada com a proteína de ligação a transferrina (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815 2000). Estas proteínas podem ser derivadas de Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras proteínas de aquisição de ferro de Neisseria.
TbpA um complexo de que se liga a A TbpA interage com TbpB para formar proteínas na membrana externa de Neisseria, 23 transferrina. Estruturalmente, a TbpA contém um domínio intracelular N-terminal com uma caixa TonB e domínio de encaixe, cadeias beta transmembranares múltiplas ligadas por ansas intracelulares curtas e extracelulares longas.
Foram distinguidas duas famílias de TbpB, possuindo um peso molecular elevado e um peso molecular baixo, respectivamente. As formas de peso molecular alto e baixo de TbpB associam-se com diferentes famílias de TbpA que são distinguíveis com base na homologia. Apesar de serem de peso molecular semelhante, são conhecidos como as famílias de peso molecular elevado e famílias de peso molecular baixo devido à sua associação com a forma de peso molecular elevado ou baixo de TbpB (Rokbi et al., FEMS Microbiol. Lett. 100; 51, 1993). Os termos TbpA (elevado) e TbpA (baixo) são utilizados para se referirem a estas duas formas de TbpA e de um modo semelhante para TbpB. As composições imunogénicas da invenção podem compreender TbpA e TbpB dos serogrupos A, B, C, Y e W-135 de N. meningitidis, assim como proteínas de aquisição de ferro de outras bactérias incluindo N. gonorrhoeae. As proteínas de ligação à transferrina TbpA e TbpB também foram referidas como Tbpl e Tbp2 respectivamente (Cornelissen et al., Infection and Immunity 65; 822, 1997).
TbpA contém várias regiões distintas. Por exemplo, no caso de TbpA de N. meningitidis estirpe H44/76, o terminal amino de 186 aminoácidos forma um domínio globular interno, 22 cadeias beta espalham-se na membrana, formando um estrutura beta em barril. Estes estão ligados por ansas intracelulares curtas e ansas extracelulares maiores. As ansas extracelulares 2, 3 e 5 possuem o grau mais elevado de variabilidade de sequências e a ansa 5 é exposta à superfície. As ansas 5 e 4 estão envolvidas na ligação ao ligando. 24
Fragmentos preferidos de TbpA incluem as ansas extracelulares de TbpA. Utilizando a sequência de TbpA de N. meningitidis estirpe H44/76, estas ansas correspondem aos aminoácidos 200-202 para a ansa 1, aminoácidos 226-303 para a ansa 2, aminoácidos 348-395 para a ansa 3, aminoácidos 438-471 para a ansa 4, aminoácidos 512-576 para a ansa 5, aminoácidos 609-625 para a ansa 6, aminoácidos 661-671 para a ansa 7, aminoácidos 707-723 para a ansa 8, aminoácidos 769-790 para a ansa 9, aminoácidos 814-844 para a ansa 10 e aminoácidos 872-903 para a ansa 11. As sequências correspondentes, após alinhamento de sequências, noutras proteínas Tbp, também deveriam constituir fragmentos preferidos. Os fragmentos preferidos iriam incluir sequências de aminoácidos que constituem a ansa 2, ansa 3, ansa 4 ou ansa 5 de Tbp.
Quando as composições imunogénicas da invenção compreendem TbpA, é preferível que incluem ambos TbpA (elevado) e TbpA (baixo). Embora o TbpA seja, de um modo preferido, apresentado numa vacina OMV, podem também ser parte de uma vacina de subunidades. Por exemplo, proteínas de aquisição de ferro isoladas que podem ser introduzidas numa composição imunogénica da invenção são bem conhecidas na técnica (documento WOOO/25811). Elas podem ser expressas num hospedeiro bacteriano, extraídas utilizando detergente (por exemplo, 2% de Elugent) e purificados por cromatografia de afinidade ou utilizando técnicas de cromatografia em coluna convencionais bem conhecidas na técnica (Oakhill et al., Biochem J. 2002 364; 613-6) .
Quando o TbpA é apresentado numa vacina OMV, a sua expressão pode ser regulada positivamente através de técnicas genéticas aqui discutidas, ou podem ser, de um modo preferido, regulados 25 positivamente por cultura da estirpe parental em condições de limitação de ferro como descrito a seguir. Este processo também irá resultar na regulação positiva de proteínas reguladas por ferro variáveis, particularmente FrpB que pode tornar-se imunodominante e é, deste modo, vantajosa para regular negativamente a expressão (e, de um modo preferido, eliminar os genes codificantes) dessas proteínas (particularmente FrpB) como descrito a seguir, para assegurar que a composição imunogénica da invenção estimula uma resposta imunitária contra antigénios presentes numa vasta gama de estirpes de Neisseria. É preferido possuir ambos TbpA (elevado) e TbpA (presente) presente na composição imunogénica e isto é, de um modo preferido, alcançado por combinação de OMV derivados de duas estirpes, expressando as formas alternativas de TbpA. 4. Toxinas
As toxinas incluem NM-ADPRT (NMB 1343) (13th International
Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al., p 135), VapD (NMB 1753), lipopolissacárido (LPS; também denominado lipooligossacárido ou LOS) imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. FrpA e FrpC contém uma região que é conservada entre estas duas proteínas e um fragmento preferido das proteínas seria um polipéptido contendo este fragmento conservado, de um modo preferido, compreendendo aminoácidos 227-1004 da sequência de FrpA/C. Estes antigénios podem ser derivados de Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae ou outras estirpes de Neisseria. A invenção pode também incluir outras toxinas de Neisseria. 26
Numa forma de realização alternativa divulgada, as toxinas podem incluir antigénios envolvidos na regulação da toxicidade, por exemplo, OstA, que funciona na síntese de lipopolissacáridos.
LPS LPS (lipopolissacárido, também conhecido como LOS-lipooligossacárido) é a endotoxina na membrana externa de Neisseria. A parte de polissacárido do LPS é conhecido por induzir anticorpos bactericidas. A heterogeneidade na parte de oligossacárido da LPS cria diversidade estrutural e antigénica entre diferentes estirpes de Neisseria (griffiss et al., Inf. Immun. 1987; 55: 1792-1800).
Isto foi utilizado para subdividir as estirpes de meningococos em 12 imunotipos (Scholtan et al., J Med Microbiol 1994, 41:236-243). Os imunotipos L3, L7, & L9 são imunologicamente idênticos e são estruturalmente semelhantes (ou mesmo iguais) e foram, deste modo, designados L3,7,9 (ou, para os objectivos desta descrição, genericamente como "L3"). A LPS L3,7,9 (L3), L2 e L5 meningocócicas podem ser modificadas por sialilação ou pela adição de ácido citidina 5' -monofosfato-N-acetilneuramínico. Embora L2, L4 e L6 LPS sejam distinguíveis imunologicamente, elas são estruturalmente semelhantes e em que L2 é aqui mencionada, seja L4 ou L6 podem ser opcionalmente substituídas dentro do âmbito da invenção. Ver Μ. P. Jennings et al., Microbiology 1999, 145, 3013-3021 e Mol Microbiol 2002, 43:931 43 para posterior ilustração de estrutura e heterogeneidade de LPS. 27 A LPS, de um modo preferido, a LPS meningocócica, incluída nas vacinas da invenção, é dos imunotipos L3 e é apresentada numa vesícula da membrana externa (de um modo preferido, em que a vesícula é extraída com uma baixa percentagem de detergente, de um modo mais preferido, 0-0,5%, 0,02-0,4%, 0,04-0,3%, 0,06-0,2%, 0,08-0,15% ou 0,1%, de um modo ainda mais preferido, desoxicolato [DOC]) mas podem também ser parte de uma vacina de subunidades. Os LPS podem ser isolados utilizando processos bem conhecidos incluindo o processo de água-fenol quente (Wesphal e Jann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965). Ver também Galanos et al., 1969, Eur J Biochem 9: 245-249, e Wu et al., 1987, Anal Bio Chem 160:281-289. As LPS podem ser utilizadas isoladas ou conjugadas com uma fonte de epitopos de células T, tais como a toxoide do tétano, toxóide da Difteria, proteínas da membrana externa CRM-197 ou OMV. Técnicas para conjugar isolados LOS são também conhecidas (ver, por exemplo, o documento EP 941738 aqui incorporado por referência).
Quando LOS (em particular, o LOS da invenção) está presente numa formulação de vesícula, o LOS é, de um modo preferido, conjugado in situ por métodos que permitem a conjugação de LOS com uma ou mais proteínas da membrana externa também presentes na preparação de vesícula (e. g., PorA ou PorB em meningococos) .
Este processo pode aumentar vantajosamente a estabilidade e/ou imunogenicidade (proporcionar auxílio de células T) e/ou a antigenicidade do antigénio LOS na formulação de vesícula proporcionando, assim, o auxílio de células T para o imunogénio de oligossacárido independente de T na sua conformação mais protectora - como LOS no seu ambiente natural na superfície da membrana meningocócica externa. Adicionalmente, a conjugação do LOS na vesícula pode resultar numa desintoxicação do LOS (sendo 28 a porção de Lípido A integrada de forma estável na membrana externa estando, por isso, menos disponível para provocar toxicidade). Assim, os métodos de desintoxicação aqui mencionados de isolar vesículas de mutantes htrB- ou msbB-, ou adicionando péptido não tóxico funcional equivalente de polimixina B [uma molécula com elevada afinidade para o Lípido A] à composição (ver documento WO 93/14115, WO 95/03327, Velucchi et al., (1997) J Endotoxin Res 4: 1-12, e EP 976402 para mais detalhes de equivalentes funcionais de péptido não-tóxico de polimixina B - particularmente a utilização do péptido SAEP 2 (da sequência KTKCKFLKKC, em que as 2 cisteínas formam uma ligação persulfureto)) podem não ser necessárias (mas que podem ser adicionadas em combinação para segurança adicional). Assim, a requerente verificou que uma composição compreendendo vesículas em que o LOS presente nas vesículas foi conjugado de um modo intra-vesícula com proteínas da membrana externa também presente na vesícula pode formar a base de uma vacina para o tratamento ou prevenção de doenças provocadas pelo organismo a partir das quais as vesículas foram derivadas, em que essa vacina é substancialmente não-tóxica e é capaz de induzir uma resposta bactericida dependente de T contra LOS no seu ambiente nativo.
Esta divulgação proporciona ainda, deste modo, uma tal preparação de vesícula meningocócica conjugada com LOS intra-vesícula .
Essas preparações de vesícula podem ser isoladas a partir da bactéria em questão (ver documento WO 01/09350) e, depois, sujeitas a químicas de conjugação conhecidas para ligar grupos (e. g., NH2 ou COOH) na porção oligossacárido de LOS aos grupos (e. g., NH2 ou COOH) nas proteínas de vesícula da membrana 29 externa. Podem ser utilizadas técnicas de ligação reticulada utilizando glutaraldeido formaldeido ou misturas de glutaraldeído/formaldeído, mas é preferido que sejam utilizadas químicas mais selectivas, tais como EDAC ou EDAC/NHS (J.V. Staros, R.W. Wright e D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of watersoluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); e Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) p 173-176). Outras químicas de conjugação ou tratamentos capazes de criar ligações covalentes entre LOS e moléculas de proteína que podem ser utilizadas são descritas no documento EP 941738.
De um modo preferido, as preparações de vesícula são conjugadas na ausência de polissacárido capsular. As vesículas podem ser isoladas a partir de uma estirpe que não produz o polissacárido capsular (naturalmente ou via mutação como descrito a seguir) ou podem ser purificados a partir da maior parte e, de um modo preferido, de todos os polissacáridos contaminantes capsulares. Deste modo, a reacção de conjugação de LOS intra-vesícula é muito mais eficiente.
De um modo preferido, mais de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% do LOS presente nas vesículas é ligado reticuladamente/conjugado. A conjugação intra-vesícula deve, de um modo preferido, incorporar 1, 2 ou todos os 3 dos seguintes passos do processo: o pH da conjugação deve ser superior ao pH 7,0, de um modo preferido, superior a, ou igual a pH 7,5 (de um modo ainda mais preferido, inferior pH 9); condições de 1-5%, de um modo preferido, 2-4% de um modo ainda mais preferido, cerca de 3% de sacarose deve ser mantido durante a reacção; o NaCl deve ser 30 minimizado na reacção de conjugação, de um modo preferido, inferior a 0,1 M, 0,05 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M e, de um modo ainda mais preferido, não presente de todo. Todas estas caracteristicas do processo asseguram que as vesículas permanecem estáveis e em solução ao longo do processo de conjugação. 0 processo de conjugação de EDAC/NHS é um processo preferido para a conjugação intra-vesícuia. EDAC/NHS é preferido ao formaldeído que pode ligar-se reticuladamente numa extensão tão elevada que afecta adversamente a filterabilidade. 0 EDAC reage com ácidos carboxílicos (tais como KDO em LOS) para criar um intermediário éster activo. Na presença de um nucleófilo amina (tais como lisinas nas proteínas da membrana externa, tais como PorB) , é formada uma ligação amida com libertação de um sub-produto de isoureia. No entanto, a eficiência de uma reacção mediada por EDAC pode ser aumentada através da formação de um intermediário éster Sulfo-NHS. O éster Sulfo-NHS sobrevive em solução aquosa durante mais tempo do que o éster activo formado a partir da reacção de EDAC isoladamente com um carboxilato. Assim, podem ser obtidos rendimentos mais elevados de formação de ligação amida utilizando este processo de dois passos. A conjugação de EDAC/NHS é discutida em J.V. Staros, R.W. Wright e D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); e Bioconjugates
Techniques. Greg T. Hermanson (1996) p 173-176. De um modo preferido, é utilizado 0,01-5 mg EDAC/mg de vesícula na reacção, de um modo mais preferido, 0,05-1 mg EDAC/mg de vesícula. A quantidade de EDAC utilizada depende da quantidade de LOS presente na amostra que, por sua vez, depende da % de desoxicolato (DOC) utilizada para extrair as vesículas. A % de 31 DOC mais baixa (e. g., 0,1%), são utilizadas quantidades mais elevadas de EDAC (1 mg/mg e ainda mais), contudo a % de DOC superior (e. g. 0,5%), são utilizadas quantidades inferiores de EDAC (0,025-0,1 mg/mg) para evitar demasiada ligação reticulada inter-vesicula.
Um processo da presente divulgação é, deste modo, um processo para produzir conjugado LOS intra-vesicula (de um modo preferido meningocócica) compreendendo os passos de conjugar vesículas na presença de EDAC/NHS a um pH entre o pH 7,0 e pH 9,0 (de um modo preferido, cerca de pH 7,5), em 1-5% (de um modo preferido, cerca de 3%) de sacarose e opcionalmente em condições substancialmente desprovidas de NaCl (como descrito acima), e isolando as vesículas conjugadas a partir da mistura de reacção. A reacção pode ser seguida por géis de separação de Western da mistura de reacção utilizando mAb anti-LOS (e. g. anti-L2 ou anti-L3) para demonstrar o aumento do peso molecular de LOS para uma maior proporção do LOS nas vesículas à medida que o tempo de reacção passa.
Podem ser recuperadas vesículas num rendimento de 99% utilizando essas técnicas.
Observou-se que EDAC era um excelente agente de ligação reticulada intra-vesicula, uma vez que cruzava reticuladamente LOS com OMP de um modo suficiente para melhorar a imunogenicidade dependente de LOS T, mas não cruzou reticuladamente a um tal grau elevado que tivessem ocorrido problemas, tais como fraca filterabilidade, agregação e ligação reticulada inter-vesícuia. A morfologia das vesículas produzidas é semelhante à das vesículas não conjugadas (por microscopia 32 electrónica). Adicionalmente, o protocolo acima descrito evitou a ocorrência de uma ligação reticulada elevada excessiva (que pode diminuir a imunogenicidade de OMP protectoras naturalmente presentes na superfície da vesícula, e. g., TbpA ou Hsf). É preferido que a estirpe meningocócica a partir da qual as vesículas são derivadas seja uma estirpe mutante que não pode produzir polissacárido capsular (e. g., uma das estirpes mutantes descritas a seguir, em particular siaD~) . É também preferido que composições imunogénicas eficazes contra a doença meningocócica compreendam ambas as vesículas L2 e uma L3, em que os LOS L2 e L3 são ambos conjugados com proteínas de vesícula da membrana externa. Além disso, é preferido que a estrutura de LOS na vesícula conjugada com intra-vesícula seja consistente com ter sido derivada de uma estirpe meningocócica IgtB“ (como descrito a seguir). De um modo muito preferido, as composições imunogénicas compreendem vesículas conjugadas com intra-vesícuias: derivadas de uma estirpe meningocócica mutante e que não pode produzir polissacárido capsular e é IgtB-; compreendendo vesículas L2 e L3 derivadas de estirpes meningocócicas mutantes que não podem produzir polissacárido capsular; compreendendo vesículas L2 e L3 derivadas de estirpes meningocócicas mutantes que são IgtB-; ou de um modo ainda mais preferido compreendendo vesículas L2 e L3 derivadas de estirpes meningocócicas mutantes que não podem produzir polissacárido capsular e são IgtB”.
Uma estirpe meningocócica L3 típica que pode ser utilizada para a presente invenção é a estirpe H44/76 menB. Uma estirpe L2 típica é a estirpe B16B6 menB ou a estirpe de meningococos de tipo C, 39E. 33
Como referido acima, as vesículas da invenção podem ser desintoxicadas até um grau pelo acto de conjugação e podem, deste modo, não necessitar de serem ainda mais desintoxicadas, contudo, podem ser utilizados outros métodos de desintoxicação para segurança adicional, por exemplo, utilizando vesículas derivados de uma estirpe meningocócica que é htrB- ou msbB- ou adicionando um péptido não-tóxico funcional equivalente de polimixina B [uma molécula com afinidade elevada para o Lípido A] (de um modo preferido, SEAP 2) à composição de vesícula (como descrito acima).
No modo acima, são divulgadas vesículas meningocócicas e composições imunogénicas compreendendo vesículas que possuem como um importante antigénio LOS que é substancialmente não tóxico, desprovido de problemas autoimunitários, possui um carácter dependente de T, está presente no seu ambiente natural e é capaz de induzir uma resposta de anticorpo bactericida contra mais de 90% de estirpes meningocócicas (no caso de composições L2+L3).
De um modo preferido, a conjugação de LOS intravesícuia deve incorporar 1, 2 ou todos os 3 dos seguintes passos do processo: o pH da conjugação deve ser superior a pH 7,0, de um modo preferido, superior a, ou igual a pH 7,5 (de um modo ainda mais preferido, a pH 9); devem ser mantidas condições de 1-5%, de um modo preferido, 2-4%, de um modo ainda mais preferido, cerca de 3% de sacarose durante a reacção; o NaCl deve ser minimizado na reacção de conjugação, de um modo preferido, a 0,1 M, 0,05 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M e, de um modo ainda mais preferido, não presente de todo. Todas estas características do processo asseguram que as vesículas permanecem estáveis e em solução ao longo do processo de conjugação. 34
Embora LOS possa ser conjugado nas vesículas com as proteínas da membrana externa através de várias técnicas e químicas, o processo de conjugação de EDAC/NHS é um processo preferido para a conjugação intra-vesícuia. É preferido EDAC/NHS ao formaldeído que pode ligar-se reticuladamente até uma extensão demasiado elevada afectando desse modo adversamente a filterabilidade. EDAC reage com ácidos carboxílicos para criar um intermediário éster activo. Na presença de um nucleófilo amina, é formada uma ligação amida com libertação de um sub-produto de isoureia. No entanto, a eficiência de uma reacção mediada por EDAC pode ser aumentada através da formação de um intermediário éster Sulfo-NHS. 0 éster Sulfo-NHS sobrevive em solução aquosa durante mais tempo do que o éster activo formado a partir da reacção de EDAC isoladamente com um carboxilato.
Assim, podem ser realizados rendimentos superiores de formação de ligação amida utilizando este processo de dois estágios. A conjugação EDAC/NHS é discutida em J.V. Staros, R.W. Wright e D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); e Bioconjugates Techniques. Greg T.
Hermanson (1996) p 173-176.
Um processo preferido é, deste modo, um processo para produzir LOS conjugado intra-vesícula (de um modo preferido, meningocócico) compreendendo os passos de conjugar vesículas na presença de EDAC/NHS a um pH entre pH 7,0 e pH 9,0 (de um modo preferido, cerca de pH 7,5), em 1-5% (de um modo preferido, cerca de 3%) de sacarose e opcionalmente em condições substancialmente desprovidas de NaCl (como descrito acima) e isolando as vesículas conjugadas a partir da mistura de reacção. 35 A reacção pode ser seguida em géis de separação da mistura de reacção utilizando mAb anti-LOS (e. g., anti-L2 ou anti-L3) para demonstrar o aumento do peso molecular de LOS para uma proporção maior do LOS nas vesículas à medida que o tempo de reacção passa.
Podem ser recuperados rendimentos de 99% de vesículas utilizando essas técnicas. Observou-se que EDAC era um excelente agente de ligação reticulada intra-vesícula uma vez que faz ligação reticulada de LOS com OMP suficientemente para imunogenicidade dependente de LOS T melhorada, mas não fez ligação reticulada até a um grau elevado em que ocorram problemas, tais como fraca filterabilidade e ligação reticulada inter-vesícuia. Uma ligação reticulada demasiado elevada também seria evitada para evitar qualquer diminuição na imunogenicidade de OMP protectoras naturalmente presentes na superfície da vesícula e. g., TbpA. 5. Proteínas integrais da membrana externa
Outras categorias de proteínas de Neisseria podem também ser candidatas para inclusão nas vacinas de Neisseria da invenção e podem ser capazes de combinar com outros antigénios de um modo surpreendentemente eficaz. As proteínas associadas à membrana, particularmente as proteínas de membrana integrais e, mais vantajosamente, as proteínas da membrana externa, especialmente as proteínas integrais da membrana externa, podem ser utilizadas nas composições da presente invenção. Um exemplo dessas proteínas é a PldA, também conhecida como OmplA (NMB 0 464) . (documento WO00/15801), que é uma proteína fosfolipase de Neisseria da membrana externa. Outros exemplos são TspA 36 (ΝΜΒ 0341) (Infect. Immun. 1999, 67; 3533-3541) e TspB (proteína de estimulação de células T) (documento WO 00/03003; NMB 1548, NMB 1628 ou NMB 1747) . Outros exemplos incluem PilQ (NMB 1812) (documento WO99/61620), OMP85 - também conhecida como D15-(NMB 0182) (documento WOOO/23593), NspA (U52066) (W096/29412),
PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370, 1995), HpuB (NC_0 03116.1) , TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001, 147; 1277-1290), OstA (NMB 0280), MltA também conhecida como GNA33 e Lipo30 (NMB0033), HtrA (NMB 0532; documento WO 99/55872), HimD (NMB 1302), HisD (NMB 1581), GNA 1870 (NMB 1870), HlpA (NMB 1946), NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, TbpA (NMB 0461) (documento WO92/03467 (ver também acima em proteínas de aquisição de ferro) e LbpA (NMB 1541) . OMP85
As composições imunogénicas da invenção podem compreender o comprimento total OMP85, de um modo preferido, como parte de uma preparação de OMV. Fragmentos de OMP85 podem também ser utilizados nas composições imunogénicas da invenção, em particular, a exposta ao domínio de superfície de OMP85 constituída pelos resíduos de aminoácidos 1-475 ou 50-475 é, de um modo preferido, incorporada numa subunidade componente das composições imunogénicas da invenção. A sequência acima para o domínio exposto à superfície de OMP85 pode ser estendida ou truncada até 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos no terminal N ou C ou em ambos. É preferido que a sequência sinal seja omitida do fragmento OMP85. 37
OstA
OstA funciona na síntese de lipopolissacáridos e pode ser considerada como sendo um regulador de toxicidade. OstA pode ser alternativamente incluída na categoria de toxinas em que a categoria de toxinas é alargada para conter reguladores de toxicidade assim como toxinas.
Composições imunogénicas
Uma composição imunogénica é uma composição compreendendo pelo menos, um antigénio que é capaz de criar uma resposta imunitária quando administrado a um hospedeiro. De um modo preferido, essas preparações imunogénicas são capazes de gerar uma resposta imunitária protectora contra Neisseria, de um modo preferido, infecção com Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae. A invenção refere-se a composições imunogénicas compreendendo, pelo menos, dois antigénios que, de um modo preferido, estimulam uma ou mais de uma resposta sinergística, bactericida, protectora ou de bloqueamento de adesão.
Ensaios de bactericida de SBA da invenção
Uma tal resposta sinergística pode ser caracterizada por SBA estimulado pela combinação de antigénios sendo, pelo menos, 50%, duas vezes, três vezes, de um modo preferido, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes e, de um modo ainda mais preferido, dez vezes mais elevado do que o 38 SBA estimulado por cada antigénio separadamente. De um modo preferido, o SBA é medido contra uma estirpe homóloga a partir da gual os antigénios são derivados e, de um modo preferido, também contra um painel de estirpes heterólogas. (Ver a seguir para um painel representativo, por exemplo, BZ10 (B:2b:P1.2) pertencendo ao grupo A-4; B16B6 (B:2a: P1.2) pertencendo ao complexo ET-37; e H44/76 (B:15:P1.7,16)). 0 SBA é o marcador imunológico mais normalmente aceite para estimar a eficácia de uma vacina meningocócica (Perkins et ai., J Infect Dis. 1998, 177:683-691). 0 SBA pode ser apurado mais satisfatoriamente através de um qualguer método conhecido. 0 SBA pode ser realizado utilizando soros obtidos de modelos animais (ver exemplos 17-20) ou de indivíduos humanos.
Um método preferido para conduzir o SBA com soros humanos é o seguinte. Uma amostra de sangue é retirada antes da primeira vacinação, dois meses após a segunda vacinação e um mês após a terceira vacinação (sendo três vacinações num ano um calendário de vacinação primária humana tipica, administradas aos, por exemplo, 0, 2 e 4 meses, ou 0, 1 e 6 meses) . Esses calendários de vacinação primária humana podem ser realizados em crianças com menos de 1 ano de idade (por exemplo, ao mesmo tempo que são realizadas as vacinações de Hib) ou crianças com 2-4 anos de idade ou adolescentes também podem ser vacinados para testar SBA com esse calendário de vacinação primária. Uma outra amostra de sangue pode ser retirada 6 a 12 meses após a vacinação primária e um mês após uma dose de reforço, se aplicável. O SBA será satisfatório para um antigénio ou preparação de vesícula com actividade bactericida homóloga se um mês após a terceira dose de vacina (do calendário de vacinação primária) (e crianças de 2-4 anos de idade ou adolescentes, mas de um modo 39 preferido, em crianças no seu primeiro ano de vida) a percentagem de indivíduos com um aumento de quatro vezes em termos de título de SBA (diluição de anticorpo) (em comparação com o título da pré-vacinação) contra a estirpe de meningococos a partir das quais os antigénios da invenção foram derivados for superior a 30%, de um modo preferido, superior a 40%, de um modo mais preferido, superior a 50% e, de um modo ainda mais preferido, superior a 60% dos indivíduos.
Obviamente que uma preparação de antigénio ou de vesícula com actividade bactericida heteróloga também pode constituir preparação em vesícula com actividade bactericida homóloga se também puder estimular satisfatoriamente SBA contra a estirpe meningocócica a partir das quais é derivada. SBA será satisfatório para uma preparação de antigénio ou vesícula com actividade bactericida se um mês após a terceira dose de vacina (do calendário de vacinação primário) (em crianças com 2-4 anos de idade ou adolescentes, mas de um modo preferido em crianças no primeiro ano de vida) a percentagem de indivíduos com um aumento de quatro vezes em termos de título de SBA (diluição do anticorpo) (em comparação com o título de pré-vacinação) contra três estirpes heterólogas de meningococos for superior a 20%, de um modo preferido, superior a 30%, de um modo mais preferido, superior a 35% e, de um modo ainda mais preferido, superior a 40% dos indivíduos. Esse teste é uma boa indicação se as preparações de antigénio ou vesícula com actividade bactericida heteróloga podem induzir anticorpos de cruzamento bactericida contra várias estirpes meningocócicas. As três estirpes heterólogas podem, de um modo preferido, possuir diferentes padrões de complexo de tipo electroforético (ET) ou tipagem de sequência multilocus (MLST) 40 (ver Maiden et al., PNAS USA 1998, 95:3140-5) uns em relação aos outros e, de um modo preferido, à estirpe a partir das quais a preparação de antigénio ou de vesícula com actividade bactericida heteróloga é feita ou derivada. Um especialista será rapidamente capaz de determinar três estirpes com diferentes complexos ET que reflectem a diversidade genética observada entre meningococci, particularmente entre estirpes de meningococos de tipo B que são reconhecidos como sendo a causa de carga de doença significativa e/ou que representam linhagens híper-virulentas de MenB reconhecidas (ver Maiden et al., supra) . Por exemplo, três estirpes que podem ser utilizadas são as seguintes: BZ10 (B:2b:P1.2) pertencendo ao grupo A-4; B16B6 (B:2a:P1.2) pertencendo ao complexo ET-37; e H44/76 (B:15:PI.7,16) pertencendo ao complexo ET-5 ou quaisquer outras estirpes pertencendo ao mesmo Grupo ET. Essas estirpes podem ser utilizadas para testar uma preparação de antigénio ou de vesícula com actividade bactericida heteróloga produzida ou derivada de, por exemplo, a estirpe meningocócica CU385 (B:4:P1.15) que pertence ao complexo ET-5. Outra estirpe da amostra que pode ser utilizada é a partir do clone epidémico da Linhagem 3 (e. g., NZ124[B:4:P1.7,4]) . Outra estirpe de ET-37 é NGP165 (B: 2a:P1.2).
Processos para medir a actividade de SBA são conhecidos na técnica. Por exemplo, um método que pode ser utilizado é descrito no documento WO 99/09176 no Exemplo 10C. Em termos gerais, uma cultura da estirpe a ser testada é cultivada (de um modo preferido, em condições de esgotamento de ferro - através da adição de um quelante de ferro, tal como EDDA ao meio de crescimento) na fase log do crescimento. Isto pode ser suspenso num meio com BSA (tal como meio de Hanks com 0,3% de BSA) de modo a obter uma suspensão de células de trabalho ajustada para 41 aproximadamente 20000 CFU/mL. Uma série de misturas de reacção pode ser preparada misturando uma série de diluições de duas vezes dos soros a serem testados (de um modo preferido, inactivados pelo calor, a 56 °C, durante 30 min) [por exemplo,
num volume de 50 mL/poço] e a suspensão da estirpe meningocócica a 20000 CFU/mL a ser testada [por exemplo, num volume de 25 mL/poço]. Os frascos de reacção devem ser incubados (e. g. a 37 °C, durante 15 minutos) e agitados (e. g., a 210 rpm). A mistura de reacção final [por exemplo, num volume de 100 mL] contém, adicionalmente, uma fonte complementar [tal como 25% do volume final de soro de coelho bebé pré-testado] e é incubado como acima [e. g., 37 °C, durante 60 min] . Pode ser utilizada uma placa de microt itulação de 96 poços de fundo em U de poliestireno estéril para este ensaio. Pode ser retirada uma fracção [e. g. 10 mL] de cada poço utilizando uma pipeta multicanal, e vertida para placas de agar Mueller-Hinton (de um modo preferido, contendo 1% de Isovitalex e 1% de Soro de Cavalo inactivado pelo calor) e incubados (por exemplo, durante 18 horas, a 37 °C, em CO2 a 5%). De um modo preferido, podem ser contadas colónias individuais até 80 CFU por fracção. Podem ser utilizadas como controlos as seguintes três amostras de teste: tampão + bactéria + complemento; tampão + bactéria + complemento inactivado; soro + bactéria + complemento inactivado. Os títulos de SBA podem ser calculados de uma forma directa utilizando um programa que processa os resultados para produzir uma medição da diluição que corresponde a 50% da morte das células através de um cálculo de regressão. 42
Ensaios de protecção animal
Alternativamente, a resposta sinérgica pode ser caracterizada pela eficácia da combinação de antigénios num ensaio de protecção animal. Por exemplo, podem ser utilizados os ensaios descritos no exemplo 12 ou 13. De um modo preferido, o número de animais protegidos pela combinação de antigénios é significativamente melhorado em comparação com a utilização dos próprios antigénios, particularmente a doses sub-óptimos de antigénio.
Uma vacina de sucesso para a prevenção de infecção por N. gono pode necessitar de mais do que um dos seguintes elementos: criação de anticorpos do soro e/ou da mucosa para facilitar a morte mediada pelo complemento dos gonococos e/ou para aumentar a fagocitose e a morte microbiana pelos leucócitos, tais como leucócitos polimorfonucleares e/ou para prevenir a ligação dos gonococci aos tecidos hospedeiros; indução de uma resposta imunitária mediada pela célula pode também participar na protecção. 0 melhoramento da eficácia de uma preparação de vacina de vesículas gono da invenção pode ser avaliado através da análise da resposta imunitária induzida aos anticorpos do soro e/ou da mucosa que possuem propriedades de anti-aderência, e/ou opsonizantes, e/ou actividade bactericida, como descrito por outros (McChesney D et al, Infect. Immun. 36: 1006, 1982; Boslego J et al: Efficacy trial of a purified gonococci pilus vaccine, in Program and Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984; Siegel M et al, J. 43
Infect. Dis 145: 300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20,1995) .
Foi recentemente descrito um modelo de murganho de infecção genital por N. gono (Plante M, J. Infect. Dis., 182: 848-55, 2000). O melhoramento da eficiência de uma vacina de vesículas gono da invenção também pode ser avaliada através da sua capacidade para prevenir ou para reduzir a colonização por N. gono neste modelo de murganho da infecção.
Ensaio de bloqueamento da adesão
Alternativamente, a resposta sinergística pode ser caracterizada pela eficácia da combinação de antigénios num ensaio de bloqueamento de adesão. Por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 11 pode ser utilizado. De um modo preferido, a extensão de bloqueamento induzido pelos anti-soros criados contra a combinação de antigénios é significativamente melhorada em comparação com a utilização de anti-soros criados contra os próprios antigénios, particularmente a doses sub-óptimas de anticorpo.
Composições de subunidade A composição imunogénica da invenção pode ser uma composição de subunidades. As composições de subunidade são composições em que os componentes foram isolados e purificados em, pelo menos, 50%, de um modo preferido, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90% puros antes de misturar os componentes para formar a composição antigénica. 44
Uma composição imunogénica de subunidades divulgada compreende, de um modo preferido, pelo menos, 2 antigénios seleccionados da seguinte lista: FhaB, PilC, Hsf, Hap, NadA, OMP85, IgA protease, AspA, domínio de passagem de AspA, domínio de passagem de Hsf, domínio de passagem de Hap, FrpA, FrpC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, TspA, TspB, PldA, PilQ, FhaC, NspA e um ou ambos do LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3.
As composições de subunidade podem ser soluções aquosas de proteínas solúveis em água. Elas podem compreender detergente, de um modo preferido, detergente não-iónico, zwitteriónico ou iónico, de modo a solubilizar porções hidrofóbicas dos antigénios. Elas podem compreender lípidos, de modo a que se possam formar estruturas de lipossoma, permitindo a apresentação de antigénios com uma estrutura que se estende pela membrana lipídica.
Preparações de vesícula de membrana externa N. meningitidis serogrupo B (menB) excreta vesículas de membrana externa em quantidades suficientes para permitir o seu fabrico numa escala industrial. As vesículas de membrana externa podem também ser preparadas através do processo de extracção com detergente das células bacterianas (ver, por exemplo, documento EP 11243).
Uma composição imunogénica pode também compreender uma preparação da vesícula da membrana externa possuindo, pelo menos, dois antigénios que foram regulados positivamente, quer de forma recombinante ou por outros meios que incluem a cultura em condições de esgotamento de ferro. Exemplos de antigénios que 45 seriam regulados positivamente numa tal preparação da vesícula da membrana externa incluem; NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA (elevado), TbpA (baixo), LbpA, TbpB, LbpB, PilQ, AspA, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NMADPRT, MafA, MafB e PldA. Essas preparações também iriam compreender um ou ambos os LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. 0 fabrico de preparações de vesícula das estirpes de Neisseria pode ser conseguido através de qualquer um dos métodos bem conhecidos para um especialista na técnica. De um modo preferido, são utilizados os métodos divulgados nos documentos EP 301992, US 5597572, EP 11243 ou US 4271147, Frederikson et al., (NIPH Annals [1991], 14:67-80), Zollinger et al., (J.
Clin. Invest. [1979], 63:836-848), Saunders et al., (Infect.
Immun. [1999], 67:113-119), Drabick et al., (Vaccine [2000], 18:160-172) ou documento WO 01/09350 (Exemplo 8). Em geral, os O MV são extraídos com um detergente, de um modo preferido, desoxicolato, e os ácidos nucleicos são removidos opcionalmente enzimaticamente. A purificação é alcançada por ultracentrifugação opcionalmente seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. Se 2 ou mais vesículas diferentes da invenção são incluídas, elas podem ser combinadas num único recipiente para formar uma preparação multivalente da invenção (embora uma preparação seja também considerada multivalente se as diferentes vesículas da invenção são composições separadas em recipientes separados que são administrados ao mesmo tempo [a mesma visita a um profissional] a um hospedeiro). As preparações de O MV são, normalmente, esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,2 mm, e são, de um modo preferido, armazenadas numa solução de sacarose (e. g., 3%) que é conhecida por estabilizar as preparações de vesícula. 46 A regulação positiva das proteínas nas preparações de vesícula da membrana externa pode ser conseguida pela inserção de uma cópia extra de um gene na estirpe de Neisseria a partir da qual a preparação de OMV é derivada. Alternativamente, o promotor de um gene pode ser permutado para um promotor mais forte na estirpe de Neisseria a partir da qual a preparação de OMV é derivada. Essas técnicas são descritas no documento W001/09350. A regulação positiva de uma proteína conduzirá a um nivel superior da proteína que está presente em OMV em comparação com o nível da proteína presente em derivados de OMV a partir de N. meningitidis não modificada (por exemplo, a estirpe H44/76) . De um modo preferido, o nível será 1,5, 2, 3, 4, 5, 7, 10 ou 20 vezes superior.
Quando se pretende que o LPS seja um antigénio adicional no OMV, pode ser utilizado, de um modo preferido, um protocolo utilizando uma concentração baixa de detergente de extracção (por exemplo, desoxicolato ou DOC) na preparação do método de OMV de modo a preservar níveis elevados de LPS ligado, enquanto se remove o LPS particularmente tóxico, fracamente ligado. A concentração de DOC utilizado é, de um modo preferido, 0-0,5% DOC, 0,02-0,4% DOC, 0,04-0,3% de DOC, de um modo mais preferido, 0,06%-0,2% DOC ou 0,08-0,15% de DOC, de um modo ainda mais preferido, em redor de, ou exactamente, 0,1% DOC. "Sequência de promotor mais forte" refere-se a um elemento de controlo regulador que aumenta a transcrição para um gene que codifica o antigénio de interesse. "Regulação positiva da expressão" refere-se a qualquer meio para aumentar a expressão de um antigénio de interesse, em relação à da vesícula não modificada (i. e., que ocorre naturalmente). Entende-se que a quantidade de "regulação positiva" irá variar dependendo do 47 antigénio particular de interesse, mas não excederá uma quantidade que irá romper a integridade da membrana da vesícula. A regulação positiva de um antigénio refere-se à expressão que é, pelo menos, 10% mais elevada do que a da vesícula não modificada. De um modo preferido, é, pelo menos, 50% superior. De um modo mais preferido é, pelo menos, 100% (2 vezes) superior. De um modo muito preferido é 3, 4, 5, 7, 10, 20 vezes superior. Alternativa ou adicionalmente, regular positivamente a expressão pode referir-se a tornar a expressão não condicional nas alterações metabólicas ou nutricionais, particularmente no caso de TbpA, TbpB, LbpA e LbpB. De um modo preferido, o nível de expressão é avaliado quando as vesículas foram derivadas de bactérias cultivadas em condições de ferro limitado (por exemplo, na presença de um quelante de ferro).
Novamente, para o objectivo de clareza, os termos "modificar uma estirpe bacteriana para produzir menos do referido antigénio" ou regulação negativa refere-se a quaisquer meios para reduzir a expressão de um antigénio (ou a expressão de um produto genético funcional) de interesse, em relação à não modificada (i. e., vesícula que ocorre naturalmente), de um modo preferido, por deleção, de modo a que a expressão seja, pelo menos, 10% inferior àquela da vesícula não modificada. De um modo preferido, é, pelo menos, 50% inferior e, de um modo ainda mais preferido, completamente ausente. Se a proteína regulada negativamente for uma enzima ou uma proteína funcional, a regulação negativa pode ser conseguida através da introdução de uma ou mais mutações resultando numa redução de 10%, 20%, 50%, 80% ou, de um modo preferido, 100% na actividade enzimática ou funcional. 48
Os passos de modificação necessários para modular a expressão de proteínas de Neisseria podem ser realizados numa variedade de formas conhecidas pelo especialista na técnica. Por exemplo, podem ser inseridas sequências (e. g., promotores ou grelhas de leitura aberta) e podem ser interrompidos promotores/genes através da técnica de inserção de transposões. Por exemplo, para regular positivamente a expressão de um gene, pode ser inserido um promotor forte através de um transposão até 2 kb a montante do códão de iniciação do gene (de um modo mais preferido, 200-600 pb a montante, de um modo ainda mais preferido, aproximadamente 400 pb a montante). Também pode ser utilizada mutação ou deleção pontual (particularmente para a regulação negativa da expressão de um gene).
Esses métodos, todavia, podem ser bastante instáveis ou incertos e, deste modo, é preferido que o passo de modificação seja realizado através de um evento de recombinação homóloga. De um modo preferido, o evento ocorre entre uma sequência (uma região recombinogénica) de, pelo menos, 30 nucleótidos no cromossoma bacteriano e uma sequência (uma segunda região recombinogénica) de, pelo menos, 30 nucleótidos num vector transformado na estirpe. De um modo preferido, as regiões têm 40-1000 nucleótidos, de um modo mais preferido, 100-800 nucleótidos, de um modo ainda mais preferido, 500 nucleótidos). Estas regiões recombinogénicas devem ser suficientemente semelhantes às que são capazes de hibridar uma com a outra em condições altamente restringentes.
Os métodos utilizados para realizar os eventos de modificação genética aqui descritos (tais como a regulação positiva ou regulação negativa de genes por eventos de recombinação e a introdução de outras sequências de genes num 49 genoma de Neisseria) são descritos no documento W001/09350. Os promotores típicos fortes preferidos que podem ser integrados em Neisseria são porA, porB, lgtF, Opa, pllO, lst, e hpuAB. São preferidos PorA e PorB como promotores constitutivos, fortes. Foi estabelecido que a actividade do promotor PorB está contida num fragmento que corresponde aos nucleótidos -1 a -250 a montante do códão de iniciação de porB.
Regulaçao positiva da expressão de antigénios por cultura em meios de limitação de ferro A regulação positiva de alguns antigénios numa preparação da vesícula da membrana externa da invenção é, de um modo preferido, alcançada isolando vesículas da membrana externa de uma estirpe parental de Neisseria cultivada em condições de limitação de ferro. Uma baixa concentração de ferro no meio irá resultar no aumento da expressão de proteínas envolvidas na aquisição de ferro incluindo TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB e P2086. A expressão destas proteínas é, por isso, regulada positivamente sem a necessidade de modificar de forma recombinante os genes envolvidos, por exemplo, inserindo um promotor mais forte ou inserindo uma cópia adicional do gene. A invenção também iria compreender a regulação positiva de proteínas de aquisição de ferro através de cultura em meio sem limitação de ferro em que o gene também foi modificado de forma recombinante. A limitação de ferro é alcançada pela adição de um quelante de ferro ao meio de cultura. Quelantes de ferro adequados incluem 2,2-Dipiridil, EDDHA (ácido etilenodiamina-di(o-hidroxifenilacético) e Desferal (mesilato de deferoxamina, 50
Sigma). Desferal é o quelante de ferro preferido e é adicionado ao meio de cultura a uma concentração entre 10 e 100 μΜ, de um modo preferido, 25-75 μΜ, de um modo mais preferido, 50-70 μΜ, de um modo ainda mais preferido, a 60 μΜ. O teor em ferro do meio vem principalmente dos constituintes de extracto de levedura e peptona de soja e a quantidade presente pode variar entre lotes. Por isso, diferentes concentrações de Desferal podem ser ótimas para alcançar a regulação positiva de proteínas de aquisição de ferro em diferentes lotes do meio. O especialista na técnica pode facilmente ser capaz de determinar a concentração óptima. Em termos básicos, pode ser adicionado quelante de ferro suficiente ao meio para regular positivamente a expressão da proteína regulada por ferro desejada, mas não o suficiente para afectar adversamente a cultura das bactérias.
De um modo preferido, a regulação positiva das proteínas de aquisição de ferro através de cultura em condições limitadas em ferro é combinada com a regulação positiva recombinante de outros antigénios de modo a que a vesícula da membrana externa da invenção seja alcançada.
Regulação Negativa/Remoçao de Antigénios Imunodominantes Variáveis e não protectores
Muitos antigénios de superfície são variáveis entre estirpes bacterianas e como uma consequência são protectores apenas contra um conjunto limitado de estripes intimamente relacionadas. São aqui divulgadas vesículas da membrana externa da invenção em que a expressão de outras proteínas é reduzida, ou, de um modo preferido, são eliminados o(s) gene(s) que codificam as proteínas de superfície variáveis. Esses resultados 51 de deleção resultam numa estirpe bacteriana que produz vesículas que, quando administradas numa vacina, possuem um potencial mais forte para reactividade cruzada contra várias estirpes devido a uma influência mais elevada exercida por proteínas conservadas (retidas nas membranas externas) no sistema de vacina imunitário. Exemplos desses antigénios variáveis em Neisseria que podem ser regulados negativamente nas composições imunogénicas de vesícula da invenção incluem PorA, PorB, Opa.
Outros tipos de gene que podem ser regulados negativamente ou desligados são genes que, in vivo, podem facilmente ser desligados em (expressos) ou desligados pela bactéria. As proteínas da membrana externa codificadas por esses genes não estão sempre presentes nas bactérias, a presença dessas proteínas nas preparações das vesículas podem também ser prejudiciais para a eficácia da vacina para as razões referidas acima. Um exemplo preferido para regular negativamente ou remover é a proteína Opc de Neisseria. A imunidade anti-Opc induzida por uma Opc contendo vacina de vesícula iria apenas possuir capacidade protectora limitada como o organismo infectante pode facilmente tornar-se Opc-.
Por exemplo, estes genes variáveis ou não protectores podem ser regulados negativamente na expressão ou desligados terminalmente. Isto possui a vantagem de concentrar o sistema imunitário em antigénios melhores que estão presentes em quantidades inferiores na superfície exterior das vesículas. Por regulação negativa também se entende que as ansas imunodominantes variáveis expostas à superfície das proteínas acima descritas da membrana externa podem ser alteradas ou eliminadas de modo a tonar a proteína da membrana externa resultante menos imunodominante. 52 Métodos para a regulação negativa da expressão são divulgados no documento W001/09350. Combinações preferidas de proteínas para serem regulados negativamente nas composições imunogénicas de vesículas da invenção incluem PorA e OpA; PorA e OpC; OpA e OpC; PorA e OpA e OpC. São conhecidos quatro genes Opa diferentes por existirem no genoma meningocócico (Aho et al., 1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37), deste modo, quando se refere que a Opa é regulada negativamente na expressão entende-se que, de um modo preferido, 1, 2, 3 ou (de um modo preferido) todos os 4 genes presentes em meningococos são assim regulados negativamente. Essa regulação positiva pode ser realizada geneticamente como descrito no documento WO 01/09350 ou por pesquisa de estirpes de meningococos estáveis, naturais, rapidamente encontradas, que não possuem expressão ou baixa expressão a partir dos loci de Opa. Essas estirpes podem ser encontradas utilizando a técnica descrita em Poolman et al., (1985 J. Med. Micro. 19:203-209) em que as células que são Opa” possuem um fenótipo diferente do das células que expressam Opa que pode ser observado vendo o aspecto das células nas placas ou sob um microscópio. Uma vez encontrada, a estirpe pode ser apresentada como sendo realizada de forma estável Opa” realizando uma transferência de Western nos conteúdos de células após uma fermentação corrida para estabelecer a falta de Opa.
Quando a regulação positiva de alguns antigénios na vesícula da membrana externa é alcançada por cultura em condições de limitação de ferro, a proteína FrpB variável (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)) irá também ser regulada positivamente. A requerente verificou que é vantajoso regular negativamente a expressão de FrpB nestas 53 circunstâncias por regulação negativa da expressão da proteína inteira como descrito no documento W001/09350 ou eliminando a(s) região(ões) variável(eis) de FrpB. Isto irá assegurar que a resposta imunitária estimulada pela composição imunogénica é dirigida a antigénios que estão presentes numa vasta gama de estirpes. A regulação negativa de FrpB é, de um modo preferido, combinada com a regulação negativa de PorA e OpA; PorA e OpC; OpA e OpC; PorA e OpA e OpC nas composições imunogénicas de vesícula da invenção.
Numa forma de realização alternativa da invenção, a FrpB é regulada negativamente em vesículas da membrana externa que foram preparadas a partir de estirpes de Neisseria não cultivadas em condições de limitação de ferro.
Desintoxicação de LPS
As vesículas nas composições imunogénicas da invenção podem ser destoxifiçadas através dos métodos para a desintoxicação de LPS que são divulgados no documento W001/09350. Em particular, os métodos para a desintoxicação de LPS da invenção envolvem a regulação positiva/deleção de enzimas htrB e/ou msbB que são divulgadas no documento WO01/09350. Os genes msbB e htrB de Neisseria são também denominados lpxLl e lpxL2, respectivamente (documento WO 00/26384) e mutações de deleção destes genes são caracterizados fenotipicamente pelo mutante LOS msbB- perdendo uma cadeia acilo secundária, e o mutante LOS htrB- perdendo ambas as cadeias acilo secundárias. Os documentos W093/14155 e WO 95/03327 descrevem equivalentes de péptido funcionais não tóxicos de polimicina B que podem ser utilizados em composições da invenção. 54
Esses métodos são, de um modo preferido, combinados com métodos de extracção de vesículas envolvendo níveis baixos de DOC, de um modo preferido, 0-0,3% DOC, de um modo mais preferido, 0,05%-0,2% DOC, de um modo ainda mais preferido, cerca de, ou exactamente, 0,1% de DOC.
Outros métodos de desintoxicação de LPS incluem adicionar às preparações de vesículas um péptido não típico funcional equivalente de polimixina B (de um modo preferido, SAEP 2) como descrito acima.
Polissacáridos de reacçao cruzada O isolamento de vesículas de membrana externa bacteriana de bactérias Gram-negativas encapsuladas resulta, frequentemente, na co-purificação de polissacárido capsular. Em alguns casos, este material "contaminante" pode demonstrar ser útil uma vez que o polissacárido pode aumentar a resposta imunitária conferida pelos outros componentes de vesículas. Noutros casos todavia, a presença de material polissacárido contaminante, em preparações de vesículas bacterianas, pode demonstrar ser prejudicial para a utilização das vesículas numa vacina. Por exemplo, foi demonstrado, pelo menos no caso de N. meningitidis, que o polissacárido capsular do serogrupo B não confere imunidade protectora e é susceptível de induzir uma auto-resposta adversa imunitária em humanos. Consequentemente, as vesículas da membrana externa da invenção podem ser isoladas a partir de uma estirpe bacteriana para a produção de vesículas, que foi modificada de modo a que sejam isentos de polissacárido capsular. As vesículas serão, então, adequadas para utilização em humanos. Um exemplo particularmente preferido dessa 55 preparação de vesículas é de um serogrupo B de N. meningitidis desprovido de polissacárido capsular.
Isto pode ser conseguido utilizando a produção de estirpes de vesículas modificadas em que os genes necessários para a biossíntese capsular e/ou exportar foram debilitados. A inactivação do gene que codifica a biossíntese capsular do polissacárido, ou exportação, pode ser conseguida por mutação (mutação, deleção ou inserção pontual) seja a região de controlo, a região codificante ou ambas (de um modo preferido utilizando as técnicas de recombinação homóloga descritas acima), ou através de quaisquer outros modos de diminuição da função enzimática desses genes. Além disso, a inactivação de genes da biossíntese capsular pode também ser conseguida através a sobre-expressão anti-sentido ou mutagénese de transposão. Um método preferido é a deleção de algum, ou de todos, os genes cps de Neisseria meningitidis necessários para a biossíntese e exportação de polissacárido. Para este objectivo, o plasmídeo de substituição pMF121 (descrito em Frosh et ai., 1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218) pode ser utilizado para distribuir uma mutação que elimina o grupo de genes cpsCAD (+ galE) . A segurança dos anticorpos criados para LPS L3 ou L2 foi questionada, devido à presença de uma estrutura semelhante ao grupo de oligossacárido de lacto-N-neotetraose (03ΐβ1-401οΝΑοβ1-3ΰ3ΐβ1-401οβ1-) presente em glicosfingolípidos humanos. Mesmo se um grande número de pessoas tiver sido vacinada com segurança com vacinas de vesículas extraídas com desoxicolato contendo uma quantidade residual de L3 LPS (G. Bjune et al., Lancet (1991), 338, 1093-1096; GVG. Sierra et al., NIPH ann (1991), 14, 195-210), a deleção da parte terminal do LOS sacarídico é vantajosa na prevenção de qualquer reacção cruzada com 56 estruturas presentes na superfície de tecidos humanos. Numa forma de realização preferida, a inactivação do gene lgtB resulta numa estrutura de LPS intermediária, em que os resíduos de galactose terminal e o ácido siálico estão ausentes (a mutação deixa uma estrutura 4Θ1οΝΑοβ1-303ΐβ1-401οβ1- em L2 e L3 LOS). Esses intermediários podem ser obtidos numa estirpe L3 e uma estirpe L2 LPS. Uma versão alternativa e menos preferida (curta) da LPS pode ser obtida desligando o gene lgtE. Uma outra versão alternativa e menos preferida do LPS pode ser obtida desligando o gene lgtA. Se for seleccionada uma mutação de lgtA-é preferido que também desligue a expressão de lgtC para prevenir o imunotipo não imunogénico LI a ser formado.
Os mutantes LgtB” são mais preferidos à medida que a requerente verificou que esta é a truncagem óptima para resolver o item da segurança enquanto ainda retém um epitopo de oligossacárido protector de LPS que pode ainda induzir uma resposta de anticorpo bactericida.
Deste modo, as composições imunogénicas da invenção compreendendo preparações de L2 ou L3 (sejam purificadas ou em vesículas isoladas) ou preparações de vesículas meningocócicas em geral, são vantajosamente derivadas a partir de uma estirpe de Neisseria (de um modo preferido, meningocócica) que foi geneticamente modificada para regular negativamente permanentemente a expressão do produto de gene funcional a partir do gene lgtB, IgtA ou lgtE, de um modo preferido desligando o gene, de um modo ainda mais preferido, eliminado a totalidade ou parte do promotor e/ou a grelha de leitura aberta do gene. 57
Quando as composições imunogénicas acima da invenção são derivadas de uma estirpe de meningococos B, é ainda preferido gue o polissacárido capsular (gue também contém estruturas de sacárido de tipo humano) seja também removido. Embora muitos genes possam ser desligados para alcançar este objectivo, a reguerente demonstrou, vantajosamente, que é preferido que a estirpe de produção de vesículas tenha sido geneticamente modificada para regular negativamente de forma permanente a expressão do produto do gene funcional a partir do gene siaD (i. e., regulando negativamente a actividade de oí-2-8 polisialiltransferase) , de um modo preferido, desligando o gene, de um modo ainda mais preferido, eliminando a totalidade ou parte do promotor e/ou da grelha de leitura aberta do gene. Essa inactivação é descrita no documento WO 01/09350. A referida mutação siaD (também conhecida como synD) é a mais vantajosa de muitas mutações que podem resultar na remoção do epitopo semelhante ao humano a partir do polissacárido capsular, porque é uma das únicas mutações que não possui efeito na biossíntese dos epitopos protectores de LOS, sendo assim vantajosos num processo que tem como objectivo utilizar em último caso LOS como um antigénio protector e tem um efeito mínimo no crescimento da bactéria. Um aspecto preferido da invenção é, deste modo, uma preparação imunogénica de vesícula como descrito acima que é derivada de um lgtE“ siaD-, um lgtA- siaD- ou, de um modo preferido, uma estripe lgtB“ siaD- de meningococos B. A própria estirpe é um outro aspecto da invenção.
Embora a mutação siaD- seja preferível pelas razões acima descritas, podem ser utilizadas outras mutações que desligam a síntese capsular do polissacárido de meningococos B. Assim, a estripe de produção de vesículas pode ser modificada geneticamente para regular negativamente, de uma forma 58 permanente a expressão do produto do gene funcional de um ou mais dos seguintes genes: genes ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (equivalente a synX e siaA) , synB (equivalente a siaB) ou synC (equivalente a siaC), de um modo preferido, desligando o gene, de um modo ainda mais preferido, eliminado a totalidade ou parte do promotor e/ou grelha de leitura aberta do gene. A mutação lgtE- pode ser combinada com uma ou mais destas mutações. De um modo preferido, a mutação lgtB- é combinada com uma ou mais dessas mutações. Um outro aspecto da invenção é deste modo uma preparação imunogénico de vesículas como acima descrito que é derivado de uma tal estirpe mutante combinada de meningococos B.
Um locus de Neisseria contendo vários genes Igt, incluindo lgtB e lgtE, e a sua sequência são conhecidos na técnica (ver M. P. Jennings et al., Microbiology 1999, 145, 3013-3021 e as referências aí citadas, e J. Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994]).
Quando é utilizado LOS de comprimento total (não-truncado) no produto final, é desejável que LOS não seja sialilado (como tal, LOS cria uma resposta imunitária contra as estirpes mais perigosas, invasivas de meningococos B que são também não sialilados). Nesse caso a utilização de uma estirpe de cápsula negativa que possui um gene synA eliminado (equivalente a synX e siaA), synB (equivalente a siaB) ou synC (equivalente a siaC) é vantajosa, como tal uma mutação também torna menB LOS incapaz de ser sialilada.
Nas preparações de vesículas, particularmente nas preparações extraídas com baixas concentrações de DOC de LPS podem ser utilizadas como um antigénio na composição imunogénica da invenção. É por isso vantajoso regular negativamente/eliminar/inactivar a função enzimática de lgtE, 59
IgtA (particularmente em combinação com lgtC) ou, de um modo preferido, genes lgtB/produtos de genes de modo a remover estruturas lacto-N-neotetraose de tipo humano. 0 locus de Neisseria (e suas seguências) compreendendo os genes lgt para a biossíntese de estrutura de oligossacárido de LPS é conhecido na técnica (Jennings et al., Microbiology 1999 145; 3013-3021 e as referências aí citadas, e J. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994]). A regulação positiva/deleção de lgtB (ou produto do gene funcional) é preferida uma vez que deixa o epitopo protector de LPS intacto.
Nas preparações de vesícula de N. meningitidis serogrupo B da invenção, a regulação positiva/deleção de ambos siaD e lgtB é preferida, (embora uma combinação de lgtB- com qualquer um de ctrA”, ctrB”, ctrCT, ctrD”, synA- (equivalente a synX- e siaA”) , synB- (equivalente a siaB”) ou synC- (equivalente a siaC-) numa estirpe de produção de vesícula de meningococos B podem também ser utilizada) conduzindo a uma preparação de vesículas com segurança ótima e retenção de epitopo protector de LPS.
Um outro aspecto da invenção é, deste modo, uma preparação imunogénica de vesícula como descrito acima que é derivada dessa estirpe mutante combinada de meningococos B.
As composições imunogénicas da invenção podem compreender pelo menos, um, dois, três, quatro ou cinco preparações de vesícula da membrana externa diferentes. Quando são incluídas duas ou mais preparações de OMV, pelo menos um antigénio da invenção é regulado positivamente em cada OMV. Essas preparações de OMV podem ser derivadas de estirpes de Neisseria da mesma espécie e serogrupo ou, de um modo preferido, de estirpes de Neisseria de diferente classe, serogrupo, sorotipo, subsorotipo 60 ou imunotipo. Por exemplo, uma composição imunogénica pode compreender uma ou mais preparações de vesículas da(s) membrana (s) externa (s) que contém LPS de imunotipo L2 e uma ou mais preparações da vesícula da membrana externa que contém LPS de imunotipo L3. As preparações de L2 ou L3 de OMV são, de um modo preferido, derivados de uma estirpe estável que possui variabilidade de fase mínima no locus do gene da síntese de oligossacárido de LPS.
Vesículas de membrana externa combinadas com composições de subunidade
As composições imunogénicas da invenção podem também compreender uma composição de subunidades e uma vesícula da membrana externa. Existem vários antigénios que são particularmente adequados para inclusão numa composição de subunidades devido à sua solubilidade. Exemplos dessas proteínas incluem; FhaB, NspA, dominio de passagem de Hsf, domínio de passagem de Hap, domínio de passagem de AspA, AspA, OMP85, TbpB, LbpB, PilQ. A preparação da vesícula da membrana externa deve possuir, pelo menos, um antigénio diferente seleccionado da seguinte lista que foi regulada positivamente de forma recombinante na vesícula da membrana externa: NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA (elevado), TbpA (baixo), LbpA, TbpB, LbpB, NadA, TspA, TspB, PilC, PilQ, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NM-ADPRT, Maf A,
MafB e PldA; e compreendem um ou ambos de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. 61
Composições imunogénicas específicas
Nas combinações específicas listadas a seguir, em que as combinações de antigénios estão presentes numa vesícula, essas combinações de antigénios devem ser reguladas positivamente como descrito acima.
Uma forma de realização da invenção compreende uma proteína de autotransporte e uma proteína de aquisição de ferro, que são Hsf e TbpA (elevado) e/ou TbpA (baixo). Essas composições imunogénicas podem, de um modo ainda mais preferido, compreender, pelo menos, um de OMP 85, LbpA, LbpB, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, TspA, NadA, TspB, PilQ, FhaC, NspA, PldA, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, FhaB, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NM-ADPRT, VapD e Hap. Todas as composições imunogénicas acima compreendem ainda LPS, imunotipo L3 .
Uma outra forma de realização da invenção compreende Hsf e um outro antigénio seleccionado de TbpA e Lipo28. A composição imunogénica acima compreende ainda LPS, imunotipo L3. Outras combinações divulgadas compreendem Hsf e OMP85 (opcionalmente com Hap, ou LbpB); Hsf e Hap (opcionalmente com LbpB ou OMP85); Hsf e FrpA (opcionalmente com um ou mais de Hap, LbpB ou OMP85); Hsf e LbpB (opcionalmente com uma ou mais de Hap, OMP85 ou FrpA) . Na medida em que Hsf é uma adesina e uma proteína de autotransporte, uma combinação particularmente preferida compreende Hsf, OMP85, TbpA, LPS imunotipo L3, de um modo preferido, numa preparação de vesícula multivalente, que possui membros de todos os cinco grupos de antigénios representados. De um modo preferido, estão presentes TbpA (baixo) e TbpA (elevado) . 62
Ainda outra composição imunogénica divulgada compreende FhaB e, pelo menos, um outro antigénio seleccionado do grupo consistindo em NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, TdfH, PorB, PldA, Hap,
IgA protease, AspA, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, NadA, PldA,
TbpA, Hsf, TspA e TspB, e qualquer um ou ambos os LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. Combinações preferidas compreendem FhaB e Hsf (opcionalmente com um ou mais de OMP85, LbpB, Hap ou FrpA) ; FhaB e OMP85 (opcionalmente com uma ou mais de LbpB, Hap ou FrpA) ; FhaB e LbpB (opcionalmente com um ou mais de Hap ou
FrpA); FhaB e Hap (opcionalmente com FrpA). Uma combinação preferida compreende FhaB, LbpB, Hsf (como um OMP) e FrpA que possui membros de todos os cinco grupos de antigénio representados.
Uma outra composição imunogénica divulgada compreende NspA e, pelo menos, um outro antigénio seleccionado do grupo consistindo em FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB,
TbpA, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, Hap, OMP85, PilQ, AspA, IgA protease, NadA, PldA, Hsf, Hap, TspA,
TspB, TdfH, PorB, e qualquer um ou ambos os LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. Combinações preferidas compreendem NspA e Hsf (opcionalmente com um ou mais de OMP85, Hap, LbpA ou TbpA); NspA e OMP85 (opcionalmente com um ou mais de Hap, LbpA ou TbpA) ; NspA e Hap (opcionalmente com um ou mais de LbpA ou TbpA) ; NspA e LbpA (opcionalmente com TbpA). Uma combinação particularmente preferida compreende NspA, Hsf, TbpA, LPS imunotipo L2 e/ou L3, de um modo preferido, numa preparação de vesícula multivalente, que possui membros de todos os cinco grupos de antigénios representados. De um modo preferido, estão presentes TbpA (baixo) e TbpA (elevado). 63
As composições imunogénicas com combinações individualizadas de antigénios divulgadas no documento WO 00/25811 não são reivindicadas nesta invenção. De um modo preferido, as composições imunogénicas ou vacinas não estão cobertas pela presente invenção se possuírem um teor antigénio que consiste apenas na proteína de ligação de transferrina e NspA (ou no caso de uma vacina de vesículas, possuírem um teor de antigénio regulado positivamente ou enriquecido que consiste apenas na proteína de ligação a transferrina e NspA), todavia, podem estar incluídas combinações específicas de antigénios (ou antigénios regulados positivamente) consistindo em, ou incluindo, NspA assim como ambos TbpA (elevado) e TbpA (baixo) . Opcionalmente, composições ou vacinas compreendendo uma combinação (subunidade) ou regulação positiva (vesícula) de proteína de ligação a transferrina e NspA não são reivindicados.
Outra composição imunogénica da invenção compreende NadA, TbpA, ou Lipo28 e LPS imunotipo L3.
Uma outra composição imunogénica da invenção compreende TbpA (baixo), NadA ou Hsf, e LPS imunotipo L3. Outras combinações divulgadas compreendem TbpA (baixo) e Hsf e LbpA; TbpA (baixo) e OMP85 (opcionalmente com qualquer um ou ambos LbpA e Hap) ; TbpA (baixo) e LbpA e Hap.
Uma outra composição imunogénica da invenção compreende TbpA (elevado) NadA, ou Hsf, e LPS imunotipo L3. Outras combinações divulgadas compreendem TbpA (elevado) e Hsf e LbpA; TbpA (elevado) e OMP85 (opcionalmente com qualquer um ou ambos de LbpA e Hap); TbpA (elevado) e LbpA e Hap. 64
Outra composição imunogénica divulgada compreende LbpA e, pelo menos, um outro antigénio seleccionado do grupo consistindo em NM-ADPRT, VapD, LbpB, TbpB, Hap, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, NadA, PldA, TbpA, Hsf, TspA, TspB, MafA, MafB, IgA protease, AspA, FhaB, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, TdfH, PorB e FhaB e qualquer um ou ambos de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. Combinações preferidas compreendem LbpA e Hsf (opcionalmente com Hap).
Uma composição imunogénica divulgada compreende LbpB e, pelo menos, um outro antigénio seleccionado do grupo consistindo em
FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpA, , TbpB, Hap, OMP 85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 , NadA, PldA, TbpA, Hsf, TspA, TspB, MafA, MafB, IgA protease, AspA, FhaB, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, TdfH, PorB e FhaB, e qualquer um ou ambos de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. Combinações preferidas compreendem LbpB e Hsf (opcionalmente com OMP85 ou Hap) ; LbpB e OMP85 (opcionalmente com Hap); LbpB e Hap.
Uma composição imunogénica divulgada compreende OMP85 e, pelo menos, um outro antigénio seleccionado do grupo consistindo em NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, Hap, IgA protease, AspA, Hsf,
NspA, PilC, Omp 2 6, NMB0315, NMB0995, NMB1119, MafA, MafB, NadA,
PldA, Hsf, TspA, TspB, PilQ, TdfH, PorB e FhaB, e qualquer um ou ambos de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3. Combinações preferidas compreendem OMP85 e Hsf (opcionalmente com qualquer um ou ambos de LbpA ou NspA) ; OMP85 e LbpA (opcionalmente com qualquer um ou ambos de Hap e NspA) ; OMP85 e Hap (opcionalmente com NspA). 65
Uma composição imunogénica divulgada compreende Hap e, pelo menos, um outro antigénio seleccionado do grupo que consiste em NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086, Lipo2 8, Sibp, NMB0964, NMB0293, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, NspA, IgA protease, AspA, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, MafA, MafB, NadA, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB e FhaB, e qualquer um ou ambos de LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3.
Uma divulgada composição imunogénica compreende um ou ambos os LPS imunotipo L2 e LPS imunotipo L3 e, pelo menos, um outro antigénio seleccionadas do grupo consistindo em LbpB, LbpA, ThpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, TspA, TspB, Hap, IgA protease, AspA, NadA, FhaB, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, MafA, MafB, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB e FhaB.
As combinações preferidas de antigénios numa composição imunogénica da divulgação inclui combinações compreendendo uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e FhaB; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e PilC; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e NadA; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e PilQ; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e TspA; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e TspB; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e NspA; de um modo mais preferido, compreendendo uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e Hap; uma proteína de aquisição de ferro, uma proteína de autotransporte e LbpB; uma proteína de aquisição de 66 ferro, uma proteína de autotransporte e OMP85 (D15). De um modo ainda mais preferido, OMP85 (D15) deve ser incorporado como parte de uma preparação da vesícula da membrana externa.
As composições imunogénicas da invenção que contêm LPS possuirão, de um modo preferido, a LPS conjugada com uma fonte de epitopos T-auxiliar, de um modo preferido, proteínas, e no caso de LPS em OMV, de um modo preferido, proteínas da membrana externa. Uma forma de realização particularmente preferida contém LPS que foram (de um modo preferido, intra-vesículas) conjugadas a OMP in situ na preparação da vesícula da membrana externa (por exemplo, como descrito acima).
As composições imunogénicas da invenção podem compreender antigénios (proteínas, LPS e polissacáridos) derivados de Neisseria meningitidis serogrupos A, B, C, Y, W-135 ou Neisseria gonorrhoeae.
De um modo preferido, as composições imunogénicas ou vacinas da invenção não consistem em e/ou compreendem as combinações particulares das SEQ ID listadas na tabela que se estende a partir da página 3, linha 18 até à página 52, linha 2 do documento WO 00/71725 e/ou qualquer combinação individual descrita nos exemplos 1-11 do documento WO 00/71725.
De um modo preferido, quaisquer combinações individualizadas divulgadas no documento WO 01/52885 não são reivindicadas nesta invenção. 67
Outras combinações A composição imunogénica da invenção pode ainda compreender polissacáridos capsulares bacterianos ou oligossacáridos. Os polissacáridos capsulares ou oligossacáridos podem ser derivados de um ou mais de: Neisseria meningitidis serogrupo A, C, Y, e/ou W-135, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococci do Grupo A, Streptococci do Grupo B, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.
Um outro aspecto da invenção são combinações de vacina compreendendo a composição antigénica da invenção com outros antigénios que são vantajosamente utilizados contra certos estados de doença incluindo aqueles associadas com vírus ou bactérias Gram positivas.
Numa combinação preferida, as composições antigénicas da invenção são formuladas com 1, 2, 3 ou, de um modo preferido, todas as 4 dos seguintes polissacáridos capsulares ou oligossacáridos meningocócicos que podem ser simples ou conjugados com um transportador de proteína: A, C, Y ou W-135. De um modo preferido, as composições imunogénicas da invenção são formuladas com A e C; ou C; ou C e Y. Uma tal vacina contendo proteínas de N. meningitidis, de um modo preferido, serogrupo B pode ser vantajosamente utilizado como uma vacina global de meningococos.
Numa outra forma de realização preferida, as composições antigénicas da invenção, de um modo preferido, formuladas com 1, 2, 3 ou todos os 4 dos polissacáridos capsulares simples ou conjugados meningocócicos ou oligossacáridos A, C, Y ou W-135 (como descrito acima), são formulados com um polissacárido 68 capsular conjugado com H. influenzae b ou oligossacárido, e/ou um ou mais polissacáridos capsulares ou oligossacáridos simples ou conjugados de pneumococos. Opcionalmente, a vacina pode também compreender uma ou mais antigénios de proteínas que podem proteger um hospedeiro contra infecção com Streptococcus pneumoniae. Uma tal vacina pode ser utilizada vantajosamente como uma vacina global de meningite.
Ainda noutra forma de realização preferida, a composição imunogénica da invenção é formulada com polissacáridos capsulares ou oligossacáridos derivados de um ou mais de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococci do Grupo A, Streptococci do Grupo B, Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epidermidis. Os antigénios de polissacárido capsular de pneumococos são, de um modo preferido, seleccionados de sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (de um modo ainda mais preferido, a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) . Uma outra forma de realização preferida pode conter os polissacáridos capsulares PRP de Haemophilus influenzae. Uma outra forma de realização preferida iria conter os polissacáridos capsulares de Tipo 5, Tipo 8 ou 336 de Staphylococcus aureus. Uma outra forma de realização preferida deveria conter os polissacáridos capsulares de Tipo I, Tipo II ou Tipo III de Staphylococcus epidermidis. Uma outra forma de realização preferida deveria conter os polissacáridos capsulares de Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II ou Tipo III do Grupo B de estreptococos. Uma outra forma de realização preferida deveria conter os polissacáridos capsulares de estreptococos do Grupo A, de um modo preferido, compreendendo ainda, pelo menos, uma proteína M e, de um modo mais preferido, múltiplos tipos de proteína M. 69
Esses polissacáridos capsulares podem ser não conjugados ou conjugados com uma proteína transportadora, tal como o toxoide do tétano, fragmento C do toxoide do tétano, toxóide de difteria, CRM197, pneumolisina, Proteína D (documento US6342224). 0 conjugado polissacárido pode ser preparado através de gualguer técnica de acoplamento conhecida. Por exemplo, o polissacárido pode ser acoplado através de um ligante tioéter. Este método de conjugação baseia-se na activação do polissacárido com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. 0 polissacárido activado pode ser assim acoplado directamente ou através de um grupo espaçador a um grupo amino na proteína transportadora. De um modo preferido, o éster de cianato é acoplado com hexano diamina e o polissacárido derivado de amino é conjugado com a proteína transportadora utilizando a química de heteroligação envolvendo a formação da ligação tioéter. Esses conjugados são descritos no pedido PCT publicado WO93/15760, Uniformed Services University.
Os conjugados pode também ser preparados por métodos de aminação redutiva directa como descrito nos documentos US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos nos documentos EP-0-161-188, EP-208375 e EP-0-477508. Um outro método envolve a acoplagem de um polissacárido activado com brometo de cianogénio derivado com hidrazida de ácido adípico (ADH) ao transportador da proteína por condensação de carbodiimida (Chu C. et al., Infect.
Immunity, 1983 245 256). Quando são incluídos oligossacáridos, é preferido que eles estejam conjugados.
Antigénios de proteínas de pneumococos preferidos são aquelas proteínas de pneumococos que são expostas à superfície 70 exterior dos pneumococos (capazes de serem reconhecidos pelo sistema imunitário de um hospedeiro durante, pelo menos, parte do ciclo de vida dos pneumococos) ou são proteínas que são segregadas ou libertadas pelos pneumococos. De um modo muito preferido, a proteina é uma toxina, adesina, transduto de sinal 2-componente, ou lipoproteina de Streptococcus pneumoniae ou seus fragmentos. Proteínas particularmente preferidas incluem, mas não estão limitadas a: pneumolisina (de um modo preferido destoxifiçadas por tratamento químico ou mutação) [Mitchell et al., Nucleic Acids Res. 11 de Julho de 1990; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al., Biochim Biophys
Acta 23 de Janeiro de 1989; 1007 (1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", documentos WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al.,) WO 99/03884 (NAVA)]; PspA e suas variantes de deleção de transmembrana (documento US 5804193 -
Briles et al., ) ; PspC e suas variantes de deleção de transmembrana (documento WO 97/09994 - Briles et al.,); PsaA e suas variantes de deleção de transmembrana (Berry & Paton, Infect Immun Dezembro de 1996; 64 (12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adesine essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); porteínas de ligação a colina de pneumococos e suas variantes de deleção de transmembrana; CbpA e suas variantes de deleção de transmembrana (documentos WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldeído-3-fosfato - desidrogenase (Infect Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (documento WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína tipo M, (documento EP 0837130) e adesina 18627, (documento EP 0834568). Outros antigénios de proteína de pneumococos preferidos são aqueles divulgados no documento WO 98/18931, particularmente 71 aqueles seleccionados nos documentos WO 98/18930 e PCT/US99/30390. A composição imunogénica/vacina da invenção pode também compreender, opcionalmente, preparações de vesícula da membrana externa produzidas a partir de outras bactérias Gram negativas, por exemplo Moraxella catarrhalis ou Haemophilus influenzae.
Preparações de vesícula de Moraxella catarrhalis
As composições imunogénicas da invenção podem compreender ainda preparações de OMV derivados de Moraxella catarrhalis.
Preparações modificadas de OMV podem ser derivadas de Moraxella catarrhalis como descrito no documento W001/09350. Um ou mais dos seguintes genes (que codificam antigénios protectores) são preferidos para a regulação positiva: OMP106 (documentos WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (documento PCT/EP99/03824) , PilQ (documento PCT/EP99/03823), OMP85 (documento PCT/EP00/01468), lipo06 (documento GB 9917977.2), lipolO (documento GB 9918208.1), lipoll (documento GB 9918302.2), lipol8 (documento GB 9918038.2), P6 (documento PCT/EP99/03038) , ompCD, CopB (Helminen ME, et al., (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010), D15 (documento PCT/EP99/03822), OmplAl (documento PCT/EP99/06781), Hly3 (documento PCT/EP99/03257), LbpA e LbpB (documento WO 98/55606), TbpA e TbpB (documentos WO 97/13785 & WO 97/32980), OmpE, UspAl e UspA2 (documento WO 93/03761), e Omp21. Eles são também preferidos como genes que podem ser introduzidos heterologamente noutras bactérias Gram-negativas.
Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação positiva: CopB, OMP106, OmpBl, TbpA, TbpB, LbpA e LbpB. 72
Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulaçao positiva: htrB, msbB e lpxK.
Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para a regulação positiva: pmrA, pmrB, pmrE e pmrF.
Preparações de vesículas de Haemophilus influenzae
As composições imunogénicas da invenção podem compreender ainda preparações de OMV derivados de Haemophilus influenza. Preparações modificadas de OMV podem ser derivadas de Haemophilus influenzae como descrito no documento W001/09350. Um ou mais dos seguintes genes (que codificam antigénios protectores) são preferidos para a regulação positiva: D15 (documento WO 94/12641), P6 (documento EP 281673), TbpA (documento WO96/40929; documento WO95/13370), TbpB (documento WO96/40929; WO95/13370), P2, P5 (documento WO 94/26304), OMP26 (documento WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, e Hif (todos os genes neste operão devem ser regulados positivamente de modo a regular positivamente a pilina). Eles são também preferidos como genes que podem ser introduzidos heterologamente noutras bactérias Gram-negativas.
Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação positiva: P2, P5, Hif, IgAl-protease, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, htrB, msbB e lpxK.
Um ou mais dos seguintes genes são preferidos para regulação positiva: pmrA, pmrB, pmrE e pmrF. 73 A composição imunogénica/vacina da invenção pode também compreender, opcionalmente, antigénios que proporcionam protecção contra uma ou mais infecções de Difteria, tétano e Bordetella pertussis. A componente de pertussis pode ser células totais mortas de B. pertussis (Pw) ou pertussis acelular (Pa) que contenha, pelo menos, um antigénio (de um modo preferido, 2 ou todos os 3) de PT, FHA e pertactina de 69 kDa. Tipicamente, os antigénios que proporcionaram protecção contra a Difteria e o tétano podem ser o toxoide da Difteria e o toxoide do tétano. Os toxóides podem ser toxinas quimicamente inactivadas ou toxinas inactivadas pela introdução de mutações pontuais. A composição imunogénica/vacina pode também compreender, opcionalmente, um ou mais antigénios que podem proteger um hospedeiro contra Haemophillus influenzae não tipável, RSV e/ou um ou mais antigénios que podem proteger um hospedeiro contra o virus influenza. Essa vacina pode ser vantajosamente utilizada como uma vacina global para otite média.
Antigénios de proteína de H. influenzae não tipáveis preferidos incluem proteína Fimbrina (documento US 5766608) e fusões compreendendo péptidos destes (eg Fusão LB1) (documento US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmwl, Hmw2, Hap e D15.
Antigénios de vírus influenza preferidos incluem vírus totais, vivos ou inactivados, vírus da gripe separados, cultivados em ovos ou em células MDCK, ou células Vero ou virossomas da gripe totais (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou suas proteínas purificadas ou recombinantes, tais como as proteínas HA, NP, NA, ou M, ou suas combinações. 74
Antigénios RSV preferidos (Vírus do Sincício Respiratório) incluem a glicoproteína F, a glicoproteína G, a proteína HN, a proteína M ou seus derivados.
As composições imunogénicas da invenção podem incluir proteínas de Moraxella catarrhalis incluindo TbpA (documento WO97/13785; W099/52947); TbpB (documento W097/13785; W099/52947; Mathers et al., FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236;
Myers et al., Infect Immun 1998 66; 4183-4192), LbpA, LbpB (Du et al., Infect Immun 1998 66; 3656-3665), UspAl, UspA2 (Aebi et al., Infect Immun. 1997 65; 4367-4377), OMP106 (documento US6214981), receptor dependente de Ton-B (documento WOOO/78968). CopB (Sethi et al., Infect. Immun. 1997 65; 3666-3671), e receptor HasR (documento WOOO/78968); proteínas de Haemophilus influenzae incluindo HMW (St Geme et al., Infect Immun 1998 66; 364-368), Hia (St Geme et al., J. Bacteriol. 2000 182; 6005-6013), Tbpl (documento WO96/40929; WO95/13370), Tbp2 (documento WO96/40929; WO95/13370; Gray-Owen et al., Infect
Immun 1995 63; 1201-1210), LbpA, LbpB (Schryvers et al., 1989,29:121-130), HasR, receptor dependente de TonB- (Fleishmann et al., Science 1995 269; 496-512), proteína de ligação à hemoglobina, HhuA (Cope et al Infect Immun 2000 68; 4092-4101),
HgpA (Maciver et al., Infect Immun 1996 64; 3703-3712), HgbA,
HgbB e HgbC (Jin et al., Infect Immun 1996 64; 3134-3141), HxuA (Cope et al., Mol Microbiol 1994 13; 863-873), HxuC (Cope et al., Infect Immun 2001 69; 2353-2363); proteínas de Neisseria meningitidis incluindo Tbpl, Tbp2, FbpA, FbpB, BfrA, BfrB (Tettelin et al., Science 2000 287; 1809-1815), LbpA, LbpB e
HmbR. 75
Formulações de Vacina
Uma forma de realização preferida da invenção é a formulação da composição imunogénica da invenção numa vacina que pode também compreender um excipiente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 fabrico de preparações de vesícula da membrana externa a partir de qualquer uma das estirpes acima mencionadas modificadas pode ser conseguido através de qualquer um dos métodos bem conhecidos do especialista na técnica. De um modo preferido, são utilizados os métodos divulgados nos documentos EP 301992, US 5597572, EP 11243 ou US 4271147. De um modo muito preferido, é utilizado o método descrito no documento WO 01/09350. A preparação da vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque).
As composições antigénicas da presente invenção podem ser adjuvantadas na formulação de vacina da invenção. Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tais como hidróxido de alumínio gel (alúm) ou fosfato de alumínio, mas podem também ser um sal de cálcio (particularmente carbonato de cálcio), ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacáridos cationicamente ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.
Os sistemas de adjuvante Thl adequados que podem ser utilizados incluem, Monofosforil lípido A, particularmente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado e uma combinação de 76 monofosforil lípido A, de um modo preferido, monofosforil lípido A 3-de-0-acilado (3D-MPL) em conjunto com um sal de alumínio (de um modo preferido, fosfato de alumínio). Um sistema melhorado envolve a combinação de uma monofosforil lípido A e um derivado de saponina particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgada no documento WO 94/00153, ou uma composição menos reactogénica em que QS21 é apagado com colesterol como divulgado no documento W096/33739. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21 3D-MPL e tocoferol numa emulsão óleo em água é descrita no documento WO95/17210 e é uma formulação preferida. A vacina pode compreender uma saponina, de um modo mais preferido, QS21. Pode também compreender uma emulsão óleo em água e tocoferol. CpG não metiladas contendo oligonucleótidos (documento WO 96/02555) são também indutores preferenciais de uma resposta TH1 e são adequados para utilização na presente invenção. A preparação de vacina da presente invenção pode ser utilizada para proteger ou tratar um mamífero susceptível a infecção, através de uma administração da referida vacina através de via sistémica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injecção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou através da administração a mucosas nos tractos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. Deste modo, é aqui divulgado um método de imunização de um hospedeiro humano contra uma doença causada pela infecção de uma bactéria gram-negativa, cujo método compreende uma administração ao hospedeiro de uma dose imunoprotectora da preparação OMV da presente invenção. 77 A quantidade de antigénio em cada dose de vacina é seleccionada numa quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos colaterais adversos significativos em vacinas típicas. Esta quantidade irá variar dependendo de quais imunogénicos específicos são empregues e como são apresentados. Geralmente, espera-se que cada dose compreenda 1-100 pg de proteína antigénio ou preparação OMV, de um modo preferido, 5-50 pg e, mais tipicamente, no intervalo de 5-25 pg.
Uma quantidade óptima para uma vacina particular pode ser certada por estudos convencionais envolvendo a observação de respostas imunitárias apropriadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
As vacinas da invenção são, de um modo preferido, imunoprotectora e não-tóxicas e adequados para utilização pediátrica ou em adolescentes.
Por utilização pediátrica entende-se a utilização em crianças com menos de 4 anos de idade.
Por imunoprotectora entende-se que o SBA e/ou modelo de protecção animal e/ou o ensaio de bloqueamento de adesão acima descrito são satisfatoriamente conseguidos.
Por não tóxico entende-se que não existe mais do que um nível satisfatório de actividade de endotoxina na vacina como medido pelo bem conhecido LAL e ensaios de pirogenicidade. 78
Polinucleótidos "Polinucleótido" refere-se, geralmente, a qualquer polirribonucleótido ou polidesoxribonucleótido, que podem ser ARN ou ADN não modificados ou ARN ou DNA modificados. "Polinucleótidos" incluem, sem limitação, ADN de cadeia simples e dupla, ADN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla, ARN de cadeia simples e dupla, e ARN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo ADN e ARN que podem ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla. Adicionalmente, "polinucleótido" refere-se a regiões de cadeia tripla compreendendo ARN ou ADN ou ambos ARN e ADN. 0 termo polinucleótido também inclui ADN ou ARN contendo uma ou mais bases modificadas e ADN ou ARN com estruturas modificadas para estabilidade ou por outras razões. As bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases não usuais como inosina. Foram feitas várias modificações ao ADN e ARN; deste modo, "polinucleótido" inclui formas de polinucleótidos quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas como tipicamente se encontram na natureza, assim como as formas químicas de ADN e ARN características de vírus e células. "Polinucleótido" também inclui polinucleótidos relativamente curtos, frequentemente referidos como oligonucleótidos.
Outro aspecto da presente divulgação refere-se a uma formulação imunológica/vacina que compreende um ou mais polinucleótido(s). Estas técnicas são conhecidas na técnica, ver, por exemplo, Wolff et al., Science, (1990) 247: 1465-8. 79
Estas vacinas compreendem um ou mais polinucleótido(s) que codificam uma pluralidade de proteínas correspondentes a combinações de proteína da invenção acima descritas. A expressão de proteínas a partir destes polinucleótidos estará sob o controlo de um promotor eucariótico capaz de conduzir a expressão numa célula de mamífero. 0 polinucleótido pode adicionalmente compreender a sequência que codifica outros antigénios. Exemplos de promotores eucarióticos que podem conduzir a expressão incluem promotores virais de vírus incluindo promotores adenovirais, promotores retrovirais. Alternativamente, os promotores de mamífero podem ser utilizados para conduzir a expressão.
Outros aspectos
Outro aspecto da presente divulgação envolve um método para tratamento ou prevenção de doença de Neisseria compreendendo a administração de uma dose protectora (ou quantidade eficaz) da vacina da invenção a um hospedeiro em necessidade deste. A infecção com Neisseria meningitidis serogrupos A, B, C, Y ou W135 e/ou Neisseria gonorrhoeae pode ser vantajosamente prevenida ou tratada. A invenção inclui a utilização da vacina da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de prevenção de infecção com Neisseria. De novo a infecção com Neisseria inclui a infecção por Neisseria meningitidis serogrupos A, B, C, Y, W-135 e/ou Neisseria gonorrhoeae. 80
Outro aspecto da divulgação é uma estirpe de Neisseria geneticamente manipulada a partir da qual pode ser derivada uma vesícula da membrana externa da invenção (possuindo, pelo menos, duas proteínas da invenção recombinantemente reguladas positivamente, como acima descrito). Estas estirpes de Neisseria podem ser Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae. A estirpe pode também ter sido manipulada (como acima descrito) para regular negativamente a expressão de outras proteínas de Neisseria incluindo a expressão de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito de LgtB, LgtE, SiaD, OpC, OpA, PorA, FrpB, msbB e HtrB. As combinações preferidas para a regulação negativa incluem a regulação negativa (de um modo preferido, deleção) de, pelo menos, LgtB e SiaD, regulação negativa de, pelo menos, PorA e OpC, regulação negativa de, pelo menos, PorA e OpA e regulação negativa de, pelo menos, PorA, OpA e OpC.
Outros aspectos da invenção são métodos de preparar a composição imunogénica ou vacina da invenção. Estes incluem um método compreendendo um passo de misturar em conjunto, pelo menos, dois antigénios ou proteínas de Neisseria isolados, que podem estar presentes na forma de vesículas derivadas das estirpes de Neisseria da invenção, para preparar uma composição imunogénica da invenção e um método de preparação da vacina da invenção compreendendo um passo de combinação da composição imunogénica da invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Estão também incluídos na invenção métodos de preparação de uma composição imunogénica da invenção compreendendo um passo de isolar as vesículas da membrana externa da invenção a partir da 81 cultura de Neisseria. Este método pode envolver um outro passo da combinação de, pelo menos, duas preparações de vesículas da membrana externa, de um modo preferido, em que, pelo menos, uma preparação da vesícula da membrana externa contém LPS do imunotipo L2 e, pelo menos, uma preparação da vesícula da membrana externa contém LPS de imunotipo L3. A invenção também inclui estes métodos, em que as vesículas da membrana externa são isoladas por extracção com uma concentração de DOC de 0 -0,5%. As concentrações DOC de 0,3%-0,5% são utilizadas para minimizar o conteúdo em LPS. Em preparações de OMV em que LPS é para ser conservado como um antigénio, as concentrações de DOC de 0-0,3%, de um modo preferido, 0,05%-0,2%, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 0,1% são utilizadas para extracção.
Vacinas de Células Fantasma ou Completas Mortas A requerente pretende que as melhorias acima na preparação de vesículas e vacinas possam ser facilmente estendidas a preparações e vacinas de células fantasma ou células completas mortas (com vantagens idênticas). As estirpes da invenção
Gram-negativa modificadas a partir das quais as preparações de vesículas são feitas podem, também, ser utilizadas para preparar preparações de células fantasma e completas mortas. Os métodos de fazer preparações de fantasma (células vazias com envelopes intactos) de estirpes Gram-negativas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, o documento WO 92/01791). Os métodos de células completas mortas para produzir preparações de células inactivadas para utilização em vacinas são também bem conhecidas. Os termos "preparações de vesículas [ou OMV]" e "vacinas de vesículas [ou OMV]" assim como os processos descritos ao longo deste documento são deste modo aplicáveis aos 82 termos "preparação de fantasmas" e "vacinas fantasmas", e "preparação de células completas mortas" e "vacina de células completas mortas", respectivamente, para os propósitos desta invenção.
Anticorpos e imunização passiva
Outro aspecto da invenção é um método de preparação de uma imunoglobulina para utilização na prevenção ou tratamento de infecção com Neisseria, compreendendo os passos de imunização de um receptor com a vacina da invenção e isolamento de imunoglobulina do receptor. Uma imunoglobulina preparada por este método é um outro aspecto da invenção. É aqui divulgada uma composição farmacêutica compreendendo a imunoglobulina da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável que pode ser utilizada na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença de Neisseria. Um método para o tratamento ou prevenção de infecção com Neisseria compreendendo um passo de administrar a um doente uma quantidade eficaz da preparação farmacêutica da invenção é um outro aspecto da divulgação.
Os inóculos para a produção de anticorpo policlonal são tipicamente, preparados por dispersão da composição antigénica num diluente fisiologicamente tolerável, tais como solução salina ou outros adjuvantes adequados para utilização humana para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunoestimuladora de inoculo é administrada a um mamífero e o mamífero inoculado é então mantido durante um tempo suficiente para a composição antigénica para induzir os anticorpos protectores. 83
Os anticorpos podem ser isolados na extensão desejada por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade (Harlow and Lane Antibodies; a laboratory manual 1988).
Os anticorpos podem incluir preparações antisoro a partir de uma variedade de animais normalmente utilizados e. g., cabras, primatas, macacos, suinos, cavalos, cobaias, ratos ou homem. Os animais são sangrados e os soros são recuperados.
Uma imunoglobulina produzida de acordo com a presente divulgação pode incluir anticorpos completos, fragmentos ou subfragmentos de anticorpo. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas completas de qualquer classe e. g., IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade dupla para dois ou mais antigénios da invenção. Estes podem também ser fragmentos e. g. F(ab')2, Fab',
Fab, Fv e semelhantes incluindo fragmentos híbridos. Uma imunoglobulina também inclui proteínas naturais, sintéticas ou geneticamente manipuladas que actuam como um anticorpo por ligação aos antigénios específicos para formar um complexo.
Uma vacina da presente invenção pode ser administrada a um receptor que actua, então, como uma fonte de imunoglobulina, produzida em resposta à exposição de vacinas específicas. Um indivíduo assim tratado será dador do plasma a partir do qual poderão ser obtidas hiperimunoglobulinaa via metodologia de fraccionamento de plasma convencional. A hiperimunoglobulina será administrada ao outro indivíduo de modo a transmitir resistência contra ou tratar infecção com Neisseria. As hiperimunoglobulinas da presente divulgação são particularmente úteis para tratamento ou prevenção de doença de Neisseria em crianças, indivíduos imunocomprometidos ou quando o tratamento é 84 necessário e não existe tempo para o indivíduo produzir anticorpos em response a vacinação. Um aspecto adicional da divulgação é uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais (ou seus fragmentos; de um modo preferido humano, ou humanizado) reactivo contra, pelo menos, dois constituintes da composição imunogénica da invenção, que pode ser utilizada para tratar ou prevenir a infecção por bactérias Gram negativas, de um modo preferido, Neisseria, de um modo mais preferido, Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae e, de um modo ainda mais preferido, Neisseria meningitidis serogrupo B.
Estas composições farmacêuticas compreendem anticorpos monoclonais que podem ser imunoglobulinas completas de qualquer classe e. g. IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quimérico ou anticorpos híbridos com especificidade para dois ou mais antigénios da invenção. Estes podem também ser fragmentos e. g., F(ab')2, Fab', Fab, Fv e semelhantes incluindo fragmentos híbridos.
Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Kohler e Milstein 1975 Nature 256; 495;
Antibodies - a laboratory manual Harlow e Lane 1988). Alternativamente, os fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos por rastreio de uma biblioteca de exposição em fagos adequada (Vaughan TJ et al., 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Os anticorpos monoclonais podem ser humanizados ou em parte humanizados por métodos conhecidos.
Todas as referências ou pedidos de patente aqui citados nesta descrição de patente são aqui incorporados por referência. 85
Os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende" são aqui entendidos pela requerente a ser opcionalmente substituíveis com os termos "consistindo em", "consistem em", e "consiste em", respectivamente, em cada caso. Método de Aplicação Industrial da Invenção
Os exemplos a seguir são realizados utilizando técnicas convencionais, que são bem conhecidas e de rotina para os especialistas na técnica, excepto se descrito de outra forma em detalhe. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam a invenção.
Exemplo 1: Métodos para a construção de estirpes de Neisseria meningitidis serogrupo B utilizadas nas preparações de vesículas da membrana externa 0 documento W001/09350 proporciona métodos detalhados para preparar vesículas da membrana externa e manipular as estirpes bacterianas a partir das quais as vesículas da membrana externa são derivadas. Quando as vesículas da membrana externa são para reter lipoproteínas, tais como TbpB e ou lipopolissacáridos, os métodos de isolamento com níveis de desoxicolato baixos ou inexistentes são preferidos. 86
Exemplo 2; Regulação positiva da proteína Hsf antigénio numa estirpe recombinante de Neisseria meningitidis serogrupo B sem genes cps funcionais mas que expressam PorA.
Como descrito nos exemplos do documento W001/09350, em certos países, a presença de PorA em vesículas da membrana externa pode ser vantajosa e pode fortalecer a eficácia da vacina de vesículas recombinantes melhoradas. No exemplo que se segue, utilizou-se um vector pCMK(+) modificado para regular positivamente a expressão da proteína Hsf antigénio numa estirpe sem genes cps funcionais mas que expressa PorA. 0 vector pCMK(+) original contém um promotor quimérico porA/lacO reprimido em hospedeiros E. coli que expressam laclq mas é transcricionalmente activo em Neisseria meningitidis. No pCMK(+) modificado, o promotor porA nativo foi utilizado para conduzir a transcrição do gene hsf. A codificação do gene para Hsf foi amplificada por PCR utilizando os oligonucleótidos iniciadores HSF 01-IVdeI e HSF 02-NheI, apresentados na tabela a seguir. Devido à sequência do iniciador de HSF Ol-Ndel a proteína Hsf expressa irá conter dois resíduos de metioninas na extremidade 5'. As condições utilizadas para amplificação por PCR foram as descritas pelo fornecedor (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Os ciclos térmicos foram os seguintes: 25 vezes (94 °C 1 min., 48 °C 1 min., 72 °C 3 min.) e 1 vez (72 °C, 10 min., 4 °C até recuperação). O amplicão correspondente foi subsequentemente clonado nos correspondentes sítios de restrição do vector de distribuição pCMK(+). Neste plasmídeo recombinante, designado pCMK(+)-Hsf, removeu-se o lacO presente no promotor quimérico porA/lacO através de uma estratégia de PCR recombinante. O plasmídeo pCMK(+)-Hsf foi utilizado como um molde para amplificar por PCR 2 fragmentos de ADN separados: 87 fragmento 1 contém a região 5' recombinogénica porA, o gene de resistência a Canamicina e o promotor porA. Os oligonucleótidos iniciadores utilizados, RPl(SacII) e RP2, estão apresentados na tabela a seguir. 0 iniciador RP1 é homólogo da sequência mesmo a montante do operator lac. fragmento 2 contém a sequência Shine-Dalgarno do gene porA, o gene hsf e a região recombinogénica 3' porA. Os oligonucleótidos iniciadores utilizados, RP3 e RP4(ApaI), são apresentados na tabela a seguir. 0 iniciador RP3 é homólogo da sequência mesmo a jusante do operador lac. A extremidade 3' do fragmento 1 e a extremidade 5' do fragmento 2 tem 48 bases de sobreposição. 500 ng de cada PCR (1 e 2) foram utilizados para uma reacção de PCR final utilizando os iniciadores RP1 e RP4. O amplicão final obtido foi subclonado no vector pSL1180 digerido com SacII e ApaI. 0 plasmideo modificado pCMK(+)-Hsf foi purificado em larga escala utilizando o QIAGEN maxiprep kit e 2 pg deste material foram utilizados para transformar uma estirpe de Neisseiria meningitidis serogrupo B sem genes cps funcionais. De modo a preservar a expressão de porA, a integração resultante de um única "crossing-over" foi selecionada por uma combinação de procedimentos de rastreio de PCR e transferência de Western. Os clones resistentes a canamicina testaram positivos por PCR especifico para porA- e transferência de western, foram armazenados a -70 °C como stocks de glicerol e utilizados para outros estudos. As bactérias (correspondente a cerca de 5,108 bactérias) foram ressuspensas em 50 mL de tampão PAGE-SDS, congeladas (-20 °C)/fervidas (100 °C) três vezes e, então, foram separadas por electroforese PAGE-SDS num gel 12,5%. A expressão de Hsf foi examinada em derivados 88 de lisados de células bacterianas completas (WCBL) de NmB [Cps-, PorA+] ou NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. A coloração com Coomassie detectou um aumento significativo na expressão de Hsf (no que respeita ao nível de Hsf endógeno) . Este resultado confirma que o vector pCMK(+)-Hsf modificado é funcional e pode ser utilizado com sucesso para regular positivamente a expressão de proteínas da membrana externa, sem abolir a produção da proteína principal PorA do antigénio da membrana externa.
Oligonucleótidos utilizados neste trabalho:
Oligonucleótidos Sequência Nota(s) Hsf01-Nde 5'- GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAA AATATACCGC-3* Sítio de clonagem Nde I Hsf 02-Nhe S’-GTA 6CT AGC TAG CTT ACC ACT GATAACCGAC-3* Sítio de clonagem Nhe I GFP-mut-Asn 5*'AAC TGC AGA ATT ΑΛΤ ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3’ Sítio de clonagem Asnl Compatível com iVdel GFP-Spe 5**GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG-3’ Sítio de clonagem SpeI Compatível com NheI RP1 (SaciI) 5’- TCC CCG CGG GCC GTC TGA ATA CATCCCGTC-3’ Sítio de clonagem SacII RP2 5’*CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA GGG CAA ACA CCC GAT ACG TCT TCA-3’ RP3 5*»AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG -3’ RP4(Apal) 5’-GGG TAT TCC CCG CCC TTC AGA CCG CCC AGC ACG -3’ 89
Exemplo 3: Regulação positiva do gene tbpA de N. meningitidis seroqrupo B por substituição do promotor. 0 objectivo da experiência foi substituir região do promotor endógeno do gene tbpA pelo promotor forte porA, de modo a regular positivamente a produção do antigénio TbpA. Para esse fim, foi construído um plasmídeo de substituição do promotor localizado a montante da sequência codificante de tbpA foi descoberto na base de dados privada Incyte PathoSeq da estirpe de Neisseria meningitidis ATCC 13090. Este ADN contém a sequência codificante para o antigénio TbpB. Os genes são organizados num operão. O gene tbpB será removido e substituído pela cassete do promotor CmR/porA. Para esse fim, um fragmento de ADN de 3218 bp, correspondente a 509 bp da região de flanco 5' do gene tbpB, a sequência codificante de 2139 bp de tbpB, a sequência intergénica de 87 bp e os primeiros 483 nucleótidos da sequência codificante de tbpA foi amplificado por PCR a partir do ADN genómico de Neisseria meningitidis serogrupo B utilizando os oligonucleótidos BAD16 (5'- GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC- 3') e BAD17 (5'-GGC CAA GCT TCC GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') contendo sequências de incorporação e Nhel e HindIII sítios de restrição (sublinhado). Este fragmento de PCR foi limpo com um High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Alemanha) e directamente clonado num vector pGemT (Promega, EUA) . Este plasmídeo foi submetido a mutagénese por PCR circular (Jones & Winistofer (1992)) de modo a (i) inserir sítios de restrição adequados permitindo a clonagem de uma cassete do promotor CmR/PorA e (i i) para remover 209 bp da sequência de flanco 5' tbpB e da sequência codificante de tbpB. O PCR circular foi efectuado utilizando os oligonucleótidos
BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3 ' ) & o BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA 90
AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G -3 ' ) contendo os sítios de restrição adequados Xmal, BglII e XhoI (sublinhado). A cassete de promotor CmR/PorA foi amplificada a partir do plasmídeo pUC D15/Omp85 previamente descrito, utilizando os iniciadores BAD21 (5'- GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’) & BAD20 (5'- TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') contendo os sítios de restrição adequados Xmal, Spel, BglII e XhoI (sublinhado) . Este fragmento de PCR foi clonado no plasmídeo do PCR circular. Este plasmídeo será utilizado para transformar as estirpes Neisseria meningitidis serogrupo B (cps-) e [cps- porA-]. A integração por dupla "crossing-over" na região a montante de tbpA dirigirá a inserção do promotor porA directamente a montante do ATG de tbpA.
Exemplo 4; Construção de uma estirpe de N. meningitidis serogrupo B positivamente regulada para a expressão de dois antigénios: TbpA e Hsf. 0 objectivo da experiência foi regular positivamente a expressão de TbpA e Hsf, simultaneamente na mesma estirpe de N. meningitidis serogrupo B. A produção de TbpA foi regulada positivamente pela substituição da sua região de promotor endógeno pelo forte promotor porA (substituição do promotor). Neste contexto, o gene tbpB, localizado a montante de tbpA é removido e a proteína TbpB deixa de estar present na membrana externa. A expressão de Hsf foi regulada positivamente por inserção (recombinação homóloga) de uma segunda cópia do gene correspondente no locus porA (distribuição de genes). Ambas as estirpes foram descritas numa patente separada referida como documento W001/09350. Os marcadores de seleção utilizados em 91 ambas as estratégias (CmR ou KanR) permitiram a combinação de ambas as integrações no mesmo cromossoma. 0 ADN genómico total foi extraído a partir da estirpe recombinante Nm.B cps-/TbpA+/PorA+ pelo protocolo do Genomic tip 500-G da Qiagen. Dez pg de ADN foram digeridos durante a noite com a enzima de restrição DralII e utilizados para transformar Neisseria meningitidis serogrupo B pelo protocolo de transformação clássico. As células utilizadas para a transformação foram a NmB cps-/Hsf+/PorA+ recombinante (recombinação homóloga por 1 "Crossing over" no locus porA) ou NmB cps-/Hsf+/PorA- recombinante (Troca alélica/recombinação homóloga por 2 "Crossing over" no locus porA). Estas foram plaqueadas durante a noite em agár GC contendo 200 pg/mL de canamicina, diluídas até OD65o= 0,1 no meio líquido GC com 10 mM de MgCl2 e incubadas 6 horas, a 37 °C, sob agitação vigorosa com 10 pg de ADN genómico digerido com DralII. Neisseria meningitidis recombinante resultante de um duplo evento de "Crossing over" (rastreio por PCR) foram selecionados em meio GC contendo 200 pg/mL de canamicina e 5 pg/mL de cloranfenicol e analisado pela expressão de TbpA e Hsf nas preparações de OMV. Como representado na Figura 1, a produção de TbpA e Hsf foi significativamente aumentada nas OMV preparadas a partir da estirpe recombinante TbpA/Hsf NmB quando em comparação com as OMV preparadas a partir das estirpes controlo NmB cps-. O nível de sobre-expressão de cada proteína no duplo recombinante é comparável com o nível de expressão obtido nos correspondentes recombinantes singulares. O nível de sobre-expressão de TbpA e Hsf foi comparável nas estirpes PorA+ e PorA- (dados não apresentados). Todos juntos, estes dados demonstram que: (i) a expressão de TbpA e Hsf pode ser conjunta e concomitantemente positivamente regulada em N. meningitidis e (i i) as vesículas 92 recombinantes enriquecidas em TbpA e Hsf podem ser obtidas e utilizadas para imunização.
Exemplo 5: Construção de uma estirpe de N. meningitidis serogrupo B positivamente regulada para a expressão de dois antigénios: TbpA e NspA. 0 objectivo da experiência foi regular positivamente a expressão de TbpA e NspA simultaneamente na mesma estirpe de N. meningitidis serogrupo B. A produção de TbpA foi regulada positivamente substituindo a sua região de promotor endógeno pelo forte promotor porA (substituição do promotor). A expressão de NspA foi regulada positivamente pela inserção (recombinação homóloga) de uma segunda cópia do gene correspondente no locus porA (distribuição de genes). Ambas as estirpes individuais foram descritas numa patente separada, documento W001/09350. Os marcadores de selecção utilizados em ambas as estratégias (CmR ou KanR) permitiram a combinação de ambas as integrações no mesmo cromossoma. 0 ADN genómico total foi extraído a partir da estirpe recombinante NmB cps-/TbpA+/PorA+ pelo protocolo do Genomic tip 500-G da Qiagen. Dez pg de ADN foram digeridos durante a noite com a enzima de restrição Aatll e utilizada para transformar Neisseria meningitidis sorogrupo B pelo protocolo de transformação clássico. As células utilizadas para a transformação foram NmB cps-/NspA+/PorA- recombinantes. Estas foram plaqueadas durante a noite no agár GC contendo 200 pg/mL de canamicina, diluídas para a OD65o = 0,1 em meio GC líquido com 10 mM de MgCl2, e incubadas 6 horas, a 37 °C, sob agitação vigorosa com 10 pg de ADN genómico digerido com AatlI. Neisseria 93 meningitidis recombinante resultante de um evento de duplo "Crossing over" (rastreio por PCR) foram selecionadas no meio GC contendo 200 pg/mL de canamicina e 5 pg/mL cloramfenicol e analisadas para a expressão de TbpA e NspA em preparações de OMV. A produção de TbpA e NspA foi significativamente aumentada nas OMV preparadas a partir da estirpe TbpA/NspA recombinante NmB guando em comparação com as OMV preparadas a partir das estirpes controlo NmB cps-, O nível de sobre-expressão de cada proteína nos recombinantes duplos é comparável com o nível de expressão obtido nos correspondentes recombinantes singulares. Todos juntos, estes dados demonstram que: (i) a expressão de TbpA e NspA pode ser conjunta e concomitantemente regulada positivamente em N. meningitidis e (i i) as vesículas recombinantes enriquecidas para TbpA e NspA podem ser obtidas e utilizadas para imunização.
Exemplo 6: Construção de uma estirpe de N. meningitidis serogrupo B positivamente regulada para a expressão de dois antigénios: NspA e D15/Omp85. O objectivo da experiência foi a regulação positiva da expressão de NspA e D15/Omp85 simultaneamente na mesma estirpe de N. meningitidis serogrupo B. A produção de D15/Omp85 foi regulada positivamente por substituição da região do seu promotor endógeno pelo promotor forte porA (substituição do promotor). A expressão de NspA foi positivamente regulada pela inserção (recombinação homóloga) de uma segunda cópia do gene correspondente ao locus porA (distribuição de genes). Ambas as estirpes foram descritas numa patente separada, documento W001/09350. Os marcadores de selecção utilizados em 94 ambas as estratégias (CmR ou KanR) permitiram uma combinação de ambas as integrações no mesmo cromossoma. 0 ADN genómico total foi extraído a partir da estirpe recombinante NmB cps-/D15-Omp85/PorA+ pelo protocolo da Qiagen Genomic tip 500-G. Dez pg de ADN foram digeridos durante a noite com a enzima de restrição Aatll e utilizada para transformar Neisseria meningitidis sorogrupo B pelo protocolo transformação clássico. As células utilizadas para a transformação foram NmB cps-/NspA+/PorA-recombinantes. Estas foram plaqueadas durante a noite em GC agár contendo 200 pg/mL de canamicina, diluídas até OD65o= 0,1 em meio líquido GC com 10 mM de MgCl2, e incubadas 6 horas, a 37 °C, sob agitação vigorosa com 10 pg de ADN genómico digerido com AatlI. A Neisseria meningitidis recombinante resultante de um duplo evento de "Crossing over" (rastreio por PCR) foram selecionados em meio GC contendo 200 pg/mL de canamicina e 5 pg/mL de cloranfenicol e analisado para a expressão de NspA e D15/Omp85 em preparações de OMV. A produção de NspA e D15/Omp85 foi significativamente aumentada nas OMV preparadas a partir da estirpe recombinante NspA/D15-Omp85 NmB quando em comparação com as OMV preparadas a partir das estirpes controlo NmB cps-. O nível de sobre-expressão de cada uma das proteínas no duplo recombinante é comparável com o nível de expressão obtido nos correspondentes recombinantes singulares. Todos juntos, estes dados demonstram que: (i) a expressão de NspA e Omp85 pode ser conjunta e concomitantemente regular positivamente na N. meningitidis e (ii) vesículas recombinantes enriquecidas para NspA e Omp85 podem ser obtidos e utilizados para imunização. 95
Exemplo 7: Produção e purificação de formas de Hsf recombinantes em E. coli A análise de computador da proteína tipo Hsf de Neisseria meningitidis divulga, pelo menos, quatro domínios estruturais. Considerando a sequência de Hsf da estirpe H44/76 como uma referência, o Domínio 1, compreendendo o aminoácido 1 a 51, codifica um péptido sinal dependente de sec característico da família de auto-transportadores, o Domínio 2, compreendendo os aminoácidos 52 a 473, codificam o domínio de passagem para provavelmente ser expostos à superfície e acessíveis ao sistema imunitário, o Domínio 3, compreendendo os aminoácidos 474 a 534, que codificam um domínio putativo enrolado-em rolo necessário para uma oligomerisação de proteína e uma charneira (pescoço), o Domínio 4, compreendendo os resíduos 535 ao terminal C, é deduzido como codificando cadeias beta para provavelmente montar uma estrutura tipo barril e para ser ancorado na membrana externa (Henderson et al., (1998), Trends Microbiol. 6: 370-378;
Hoiczyk et al., (2000), EMBO 22: 5989-5999). Uma vez que os domínios 2 e 3 são para provavelmente ser expostos à superfície, são bem conservados (mais do que 80% em todas as estirpes testadas; como descrito em Pizza et al., (2000), Science 287: 1816-1820), estes representam interessantes candidatos a vacinas. Para esse fim, o domínio 2 (referido como domínio de passagem de Hsf) e o domínio 2 + 3 (referido como Hsf pescoço + domínio enrolado-rolo) foram expressos em, e purificados, a partir de E. coli. Os fragmentos de ADN que codificam os aminoácidos 52-473 (Hsf de passagem) e 52-534 (Hsf n+cc) foram amplificados por PCR utilizando oligonucleótidos que adicionam os sítios de restrição terminais Real (iniciador directo) e Xhol (iniciador reverso). Os amplicões purificados foram digeridos com Real/Xhol nas condições recomendadas pelo fornecedor, e 96 foram subsequentemente clonadas nos sítios NcoI (compatíveis com RcaI)/XhoI do vector de expressão de E. coli pET24d (Novagen Inc., Madison WI). Os plasmídeos recombinantes foram seleccionados e utilizados para preparar plasmídeos recombinantes purificados. Para o estudo de expressão, estes vectores (pET-Hsf pas & pET-Hsf ncc) foram introduzidos na estirpe de Escherichia coli B121DE3 (Novagen) , em que, o gene para a polimerase de T7 é colocado sob o controlo do promotor lac regulável por isopropil-beta-D tiogalactósido (IPTG). As culturas líquidas (700 mL) da estirpe recombinante de E. coli Novablue (DE3) [pET-24bBASB029] foram cultivadas, a 37 °C, sob
agitação até a densidade óptica a 600 nm (D0600) atingir 0,6. Nesse ponto, foi adicionado IPTG a uma concentração final de 1 mM e a cultura foi cultivada por mais 4 horas. A cultura foi, então, centrifugada a 10000 rpm e o precipitado foi congelado a -20 °C durante, pelo menos, 10 horas. Após descongelar, o precipitado (680 mL de cultura) foi ressuspenso durante 30 minutos, a 22 °C, em 20 mM tampão fosfato pH 7,0 antes da lise das células por duas passagens através de um disruptor Rannie. As células lisadas foram precipitadas 30 min, a 15000 rpm, (Beckman J2-HS centrífuga, JA-20 rotor) a 4 °C. O sobrenadante foi aplicado a uma coluna Q-Sepharose de fluxo rápido (Pharmacia) equilibrada em 20 mM de Tris-HCl tampão pH, 8,0. Após passagem do fluxo, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão a 20 mM de Tris-HCl pH 8,0. A proteína recombinante foi eluída a partir da coluna com 250 mM de NaCl em tampão a 20 mM de Tris-HCl pH 8,0. As fracções positivas para o antigénio, foram misturadas e dialisadas durante a noite contra tampão 20 mM de fosfato a pH 7,0. Foram adicionados 0,5 M de NaCl e 20 mM de Imidazole à amostra dialisada. A amostra foi então aplicada numa coluna Ni-NTA Agarose (Qiagen) equilibrada em tampão a 20 mM de fosfato pH 7,0 contendo 500 mM de NaCl e 97 20 mM de Imidazole. Após passagem do fluxo, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão 20 mM de fosfato pH 7,0 contendo 500 mM de NaCl e 20 mM de Imidazole. Os contaminantes foram eluidos com 100 mM de Imidazole em tampão a 20 mM de fosfato pH 7,0. A proteína recombinante foi eluída a partir da coluna com 250 mM de Imidazole em tampão a 20 mM de fosfato pH 7,0. As fracções positivas para o antigénio foram misturadas e dialisadas versus tampão a 10 mM de fosfato pH 6,8 contendo 150 mM de NaCl. Como apresentado na figura 2, uma proteína tipo Hsf de passagem enriquecida (pureza estimada em mais do que 90% puro em SDS-PAGE corada com CBB), migra até por volta dos 47 kDa (massa molecular relativa estimada), foi eluída a partir da coluna. Este polipéptido foi reactivo contra um anticorpo monoclonal de murganho produzido contra o motivo de 5-histidinas. Em conjunto, estes dados indicam que os genes de Hsf de passagem e Hsf ncc podem ser expressos e purificados numa forma recombinante em E. coli.
Exemplo 8: Produção e purificação de Hap de passagem recombinante em E. coli A análise computorizada da proteína tipo Hap de Neisseria meningitidis divulga, pelo menos, três domínios estruturais. Considerando a sequência do tipo Hap da estirpe H44/76 como uma referência, o Domínio 1, compreendendo o aminoácido 1 a 42, codifica um péptido sinal dependente de sec característico da família de auto-transportadores, o Domínio 2, compreendendo os aminoácidos 43 a 950, codificam o domínio de passagem para provavelmente ser exposta à superfície e estar acessível ao sistema imunitário, o Domínio 3, compreendendo os resíduos 951 até ao terminal C (1457), é deduzido como codificando cadeias 98 beta para provavelmente montar uma estrutura tipo barril e para ser ancorado na membrana externa. Uma vez que o dominio 2 é para provavelmente, ser exposto à superfície, é bem conservado (mais do que 80% em todas as estirpes testada) e pode ser produzido como antigénios de subunidade em E. coli, representa um interessante candidato a vacinas. Uma vez que os domínios 2 e 3 são, provavelmente, para ser expostos à superfície, são bem conservados (mais do que 80% em todas as estirpes testadas; como descrito em Pizza et ai., (2000), Science 287: 1816-1820), estes representam interessantes candidatos a vacinas. Para esse fim, o domínio 2 (referido como domínio de passagem de Hap foi expresso em e purificado a partir de E. coli. Um fragmento de ADN que codifica os aminoácidos 43-950 (Hap de passagem) foi amplificado por PCR utilizando oligonucleótidos que adicionam os sítios de restrição terminais iVcol (iniciador directo) e Xfrol (iniciador reverso). os amplicões purificados foram digeridos com Ncol/ Xhol nas condições recomendadas pelo fornecedor e foram subsequentemente clonadas nos sítios Ncol / Xhol do vector de expressão em E. coli pET24d (Novagen Inc., Madison WI). Os plasmídeos recombinantes foram seleccionados e purificados em larga escala. Para o estudo de expressão, estes vectores (pET-Hap pass) foram introduzidos na estirpe de Escherichia coli B121DE3 (Novagen), em que, o gene para a polimerase T7 é colocado sob o controlo do promotor lac regulável por isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG).
Cultura de E. coli BL21[pET-Hap pass] em fermentador: Uma alíquota da fracção (100pL) da cultura mãe foi espalhada em placas FEC013AA (Peptona de soja A3 20 g/L, extracto de levedura a 5 g/L, NaCl a 5 g/L, Agar a 18 g/L, H20 destilada até 1 L) e cultivada 20 horas a 37 °C. A camada bacteriana foi recolhida e ressuspensa em água estéril contendo NaCl a 0,9%. Esta solução 99 foi utilizada para inocular um fermentador de 20 L utilizado no modo descontinuo em meio FEC011AC (Peptona de Soja 24 g/L, Extracto de levedura 48 g/L, MgS04/7H20 0,5 g/L, K2HP04 2 g/L,
NaH2P04/2H20 0, 45 g/L, Glicerol (87%) 40 g e H20 destilada até 1 L) . Temperatura (30 °C) , pH (6,8, NaOH a 25% /H3P04 a 25%), pressão (500 mbar) foram mantidos constantes e o arejamento foi fixado em 20 L/min. Nestas condições a pressão de dissolução de oxigénio foi mantida a 20% fixando a agitação em (100 a 1000 rpm) . O indutor (IPTG, 1 mM) foi adicionado após 8 horas de crescimento (DO = 27,8). As amostras (6 L) foram recolhidas após 6 horas (DO = 49,2) e 16H30 (DO = 48,6), a biomassa foi colhida por centrifugação e os precipitados correspondentes armazenados a -20 °C.
Purificação de Hap de passagem: O HAP de passagem foi purificado a partir de um fermentador em modo descontinuo. Foi desenvolvido um esquema de purificação (ver a seguir).
Prensa Francesa (Tris a 50 mM/EDTA a 5 mM, pH 8,0) 30' a 10000 rpm (JA10) 1 solubilizar precipitado em Pi a 20 mM/ureia a 8 M, pH 7,0
1 H em agitação à TA
I 30' a 10000 rpm (JA10)
I 100
SP-Sepharose-XL
Pi a 20mM/Ureia a 8 M; eluição +/-50 mM de NaCl
I
Sepharose-FF-Cu++ quelante
Pi a 20 mM/NaCl a 0,5M/Ureia a 8 M; eluição + /- 100 mM de imidazole
I
Diálise (PBS pH 6,8/arginina a 0,5M)
I filtração estéril A maior parte do Hap de passagem é recuperada no precipitado da centrifugação após ruptura das células. A solubilização foi tornado possível com 8 M de ureia. Apesar da cauda de His N-terminal, IMAC não esteve operacional como Io passo, mas bem após um primeiro passo no trocador catiónico SP-XL. Nesta SP-Sepharose-XL, a proteína é eluída quantitativamente no meio de um gradiente linear de NaCl (0-250 mM) . A IMAC foi realizada com Sepharose FF Quelante com Cu++, como for FHAb. Desta vez, contrariamente a FHAb, a IMAC mostra um significativo factor de purificação. Em SDS-PAGE ο HAP2/3 parece puro após IMAC. O pico de HAP2/3 foi no entanto muito largo em gradiente 0-200 mM de imidazole, de modo que se tentou a eluição por passos de imidazole (10 mM-100 mM) ; o modo do gradiente parece, no entanto, mais eficiente em termos de pureza. Como passo final, tentou-se a troca do tampão ureia-para-arginina através de permeação em gel, no entanto, neste caso a proteína eluiu em dois picos. Estes dois picos mostram um perfil comparável em SDS-PAGE; desde modo pode ser colocada a hipótese de que é devido a um rearranjo parcial do HAP de passagem. Voltou-se, então, à diálise clássica como passo final para a troca de tampão. A análise de SDS-PAGE mostra uma boa pureza do material 101 final (ver na figura 3). A pureza do HAP de passagem é ainda confirmada por WB anti-his. É reconhecido por anti-E. coli. É encontrado um peso molecular de 96,1 KD.
Exemplo 9: Produção e purificação de formas de FrpA/C recombinantes em E. coli
Neisseria meningitidis codifica duas proteínas RTX, referidas como FrpA & FrpC segregadas após limitação de ferro (Thompson et al. , (1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompson et al., (1993) Infect. Immun. 61:2906-2911). A família de proteínas RTX (Repetição de ToXina) tem, em comum, uma série de 9 aminoácidos repetidos próximo do seu terminal C com o consenso: Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa.
(LXGGXGN/dDX) . Supõe-se gue as repetições em E. coli HlyA são o sítio de ligação de Ca2+. Como representado na Figura 4, as proteínas meningocócicas FrpA e FrpC, como caracterizadas na estirpe FAM20, partilham uma extensa semelhança de aminoácidos na sua região central e C-terminal mas uma semelhança muito limitada (se alguma) no terminal N. Além disso, a região conservada entre FrpA e FrpC exibe algum polimorfismo devido a repetição (13 vezes em FrpA e 43 vezes em FrpC) de um motivo de 9 aminoácidos. Para avaliar o potencial da vacina de FrpA & FrpC, produziu-se recombinantemente em E. coli regiões de proteína conservadas entre FrpA e FrpC. Com esse fim, um segmento de ADN cobrindo os aminoácidos 277 a 1007 (no que respeita à sequência peptídica de FAM20 de N. meningitidis) foi amplificado por PCR a partir do genoma de N. meningitidis serogrupoB H44/76 utilizando (o iniciador directo FrpA-19 (5'-CTCGAGACCATGGGCAAA TAT CATGTCTACGACCCCCTCGC-3' ) e o iniciador reverso FrpA-18 (3'-GTG 102 CATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3') . Três amplicões de respectivamente -1530 bp (3 repetições), -2130 bp (13 repetições) e 2732 bp (23 repetições) foram obtidos e digeridos com as endonucleases de restrição iVcol e Sal I. Estes fragmentos foram, então, inseridos nos sítios Ncol/Xhol (compatíveis com Sall) de pET24d e os plasmídeos recombinantes (pET-Frp3, pET-Frpl3 e pETFrp23 respectivamente) foram seleccionados e utilizados para transformar células de E. coli BL21DE3. Como representado na figura 5, todas as três construções produziram domínios conservados recombinantes de FrpA/C após indução. Além disso, o aumento do número de repetições aumentou a solubilidade da proteína recombinante, como determinado por análise de fraccionamento de células (dados não apresentados).
Purificação do domínio conservado de FrpA/C contendo 23 repetições do nonapéptido LXGGXGN/DDX (911 aa no total): Foram cultivadas 3,5 litros de E. coli B121DE3[pET-Frp23] e induzidas durante 4 horas por adição de 2 mM de IPTG quando a DO atingiu 0,6. As células foram colhidas por centrifugação e o precipitado correspondente foi rebentado por pressão, clarificado por centrifugação e o correspondente sobrenadante aplicado numa coluna de afinidade com o ião metálico Ni2+ (Ni-NTA-agarose, Qiagen GmBh). Foi utilizado imidazole 0 para eluição e foi finalmente removido por diálise extensa contra 10 mM de fosfato de Na pH 6,8, 150 mM de NaCl. 103
Exemplo 10: Produção e purificação de formas de FHA recombinante em E. coli
Clonaqem de uma FhaB truncada de N.meningitidis 0 AND genómico foi extraído a partir de IO10 células de estirpe de N. meningitidis serogrupo B H44/76 utilizando o kit de extracção do ADN genómico da QIAGEN (Qiagen Gmbh). Este material (1 pg) foi, então, submetido a amplificação de ADN por Reacção de Polimerização em Cadeia utilizando os seguintes iniciadores específicos do gene FhaB: JKP: 5ΆΑΤ GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CAT CGC ATT ATC3 ' e 57JKP 5'CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTG T3' . Um fragmento de AND de cerca de 4200 bp, que codifica os primeiros 1433 aminoácidos N-terminais da proteína, foi obtido, digerido pelas endonucleases de restrição Ndel/Spel e inseridas nos sítios correspondentes do MCS de pMG (derivado de pMG, Proc Natl Acad Sei USA 1985
Jan;82(1):88-92) utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Segunda Edição, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989) . ) · A sequência de AND do fragmento FhaB clonado foi determinada utilizando o Big Dye Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer) e um sequenciador de ADN ABI 3 73A/PRISM (ver fig. 1) . O plasmídeo pMG-FhaB recombinante (1 pg) foi, então, submetido a amplificação de ADN por Reacção de Polimerização em Cadeia utilizando os iniciadores específicos FhaB (XJKP03 5'AATGGAATACATArGAATAAAGGTTTAC ATCGCATTATCTTTAG3' e XJKP5702 5'GGGGCCACrCGAGGTTTTTCGCTACTTGGAGCTGTTTCAG ATAGG3'). Foi obtido um fragmento de ADN de 4214 bp, digerido pelas endonucleases de restrição Ndel/Xhol e inserido nos sítios correspondentes do vector de clonagem/expressão pET-24b (Novagen) utilizando técnicas de biologia molecular convencionais (Molecular Cloning, 104 a Laboratory Manual, Second Edition, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). A sequenciação de confirmação do pET-24b recombinante contendo o FhaB truncado (pET24b/FhaB2/3) foi efectuada utilizando utilizando o Big Dyes kit (Applied biosystems) e análise num sequenciador de ADN ABI 373/A nas condições descritas pelo fornecedor. A sequência de nucleótidos resultante é apresentada na Figura 6.
Expressão e Purificação de proteína FhaB recombinante truncada em Escherichia coli. A construção do vector de clonagem/expressão pET24b/FhaB2/3 foi descrita acima. Este vector comporta o gene FhaB truncado isolado a partir da estirpe H44/76 em fusão com uma cadeia de 6 resíduos de Histidina (no terminal C do produto recombinante), colocado sob o controlo do forte promotor do bacteriófago T7 gene 10. Para o estudo da expressão, este vector foi introduzido na estirpe de Escherichia coli Novablue (DE3) (Novagen), nas quais, o gene para a polimerase T7 é colocado sob o controlo do promotor lac regulável pela isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG). As culturas líquidas (100 mL) da estirpe de E. coli Novablue (DE3) [pET24b/FhaB2/3] recombinante foram cultivadas a 37 °C, sob agitação, até a densidade óptica a 600 nm (DO 600) atingir 0,6. Nesse ponto, foi adicionado IPTG a uma concentração final de 1 mM e a cultura foi cultivada por mais 4 horas. A cultura foi então centrifugada a 10000 rpm e o precipitado foi congelado, a -20 °C, durante, pelo menos, 10 horas. Após descongelar, o precipitado foi ressuspendido durante 30 min, a 25 °C, em tampão A (6 M de cloridrato de guanidina, 0,1 M de NaH2P04, 0,01 M de Tris, pH 8,0), passado três-vezes através de uma agulha e clarificado por centrifugação (20000 rpm, 15 min). 105 A amostra foi então aplicada a uma taxa de fluxo de 1 mL/min numa coluna Hitrap com Ni2+ (Pharmacia Biotech). Após passsagem do fluxo, a coluna foi lavada sucessivamente com 40 mL de tampão B (8 M de Ureia, 0,1 M de NaH2P04, 0,01 M de Tris, pH 8,0), 40 mL de tampão C (8 M de Ureia, 0,1 M de NaH2P04, 0,01 M de Tris, pH 6,3) . A proteína FhaB2/3/His6 recombinante foi então eluída da coluna com 30 mL de tampão D (8 M de Ureia, 0,1 M de NaH2P04, 0,01 M de Tris, pH 6,3) contendo 500 mM de imidazole e foram recolhidas fracções de 3 mL. Como apresentado na figura 7, uma proteína FhaB-2/3/His6 altamente enriquecida, que migra por volta dos 154 kDa (massa molecular relativa estimada), foi eluída da coluna. Este polipéptido foi reactivo contra um anticorpo monoclonal de murganho produzido contra o motivo 5-histidina. Em conjunto, estes dados indicam que a FhaB2/3 pode ser expressa e purificada sob uma forma recombinante em E.coli.
Imunização de murganhos com FhaB2/3/His recombinantes A proteína FhaB2/3/His6 recombinante parcialmente purificada expressa em E. coli foi injectada três vezes em murganhos Balb/C nos dias 0, 14 e 29 (10 animais/grupo). Os animais foram injectados pela via subcutânea com cerca de 5 pg de antigénio em duas diferentes formulações: adsorvidas em 100 pg de A1P04 ou formuladas em emulsão SBAS2 (emulsão SB62 contendo 5 pg de MPL e 5 pg de QS21 por dose). Um grupo controlo negativo consistindo em murganhos imunizados com apenas a emulsão SBAS2 foi, também, adicionado na experiência. Os murganhos foram sangrados nos dias 29 (15 dias Pós II) e 35 (6 dias Pós III) de modo a detectar anticorpos anti-FhaB específicos. Os anticorpos anti-FhaB específicos foram medidos em soros misturados (de 106 10 murganhos/grupo) por ELISA na FhaB2/3/His recombinante purificada.
Exemplo 11: Actividades de blogueamento de adesão de soros de murganho e de coelho produzidas contra os antigénios FHA, Hap e Hsf
As proteínas homólogas com as tipo FHAB, tipo Hsf e tipo Hap meningocócicas foram descritas previamente como sendo importantes determinantes de virulência e para mediar a adesão bacteriana de Bordetella pertussis (FHA) e Haemophilus influenza (Hap e Hsf) . A adesão a células epiteliais e endoteliais é conhecida como sendo crucial para a colonização das nasofaringes e cruzamento da barreira hemato-cefálica pelo meningococos. Deste modo, a interferência com a adesão de N. meningitidis representa uma abordagem valiosa para controlar a colonização e infecção meningocócica. Aqui testou-se se os antisoros dirigidos contra os antigénios meningocócicos FHAB 2/3rd, tipo Hap e tipo Hsf foram capazes de interferir com a adesão de Neisseria meningitidis a células endoteliais. Foi utilizado o seguinte procedimento experimental:
Inibição da adesão a HUVECs: a estirpe meningocócica de teste utilizada neste estudo foi um derivado não capsulado, não piliado, Opa- e Opc- da estirpe NmA8013. As células meningocócicas (2.10E5 unidades formadoras de colónias (CFU) do derivado NmA8013) foram incubadas durante 30 minutos, a 37 °C, num meio composto por 400 pL de RPMI, 50 pL de soro fetal de bovino e 50 pL do soro a ser testado para as propriedades de bloqueio de adesão. Esta mistura foi depois colocada num poço contendo monocamadas confluentes das células endoteliais de veia 107 umbilical humana (HUVECs) cujo meio de cultura foi previamente removido. As bactérias e as células HUVEC foram incubadas durante 4 horas a 37 °C, sob 5% de C02. As monocamadas de células foram, depois, lavadas três vezes com soro RPMI fresco e subsequentemente raspadas da placa. As CFU associadas às células HUVEC foram depois determinadas por diluição seriada e plaqueamento do lisado de células em placas GC. As placas foram incubadas durante 48 horas, a 37 °C, para permitir a recuperação e crescimento de meningococos associados a células.
Actividades de adesão-bloqueio de soros de murganho e de coelho produzidos contra FHAB2/3rd recombinante, antigénios Hap & hsf: anticorpos anti-FHA 2/3, anti-Hsf de comprimento total (descrito no documento W099/58683) e anti-Hap de comprimento total (documento W099/55873), assim como anti-soros dirigidos contra os correspondentes Hsf & domínio de passagem de Haps, interferem com a adesão meningocócica a células HUVEC endoteliais. A Figura 8 mostra que anticorpos específicos induzidos por FHA 2/3 formulados em AIPO4 foram capazes de inibir a adesão de Neisseria meningitidis B a células HUVEC em comparação com apenas o adjuvante. Quando comparado com o adjuvante SBAS2 isolado (sem antigénio, grupo 4), o abs anti-FHA 2/3 (formulação SBAS2) é ainda eficaz, mas menos potente do que AIPO4. 0 adjuvante SBAS2 isolado (sem antigénio) não induz anticorpos capazes de interferir com a adesão. Comparado com o grupo 4, os anticorpos anti-Hap (grupo 1) podem ter um ligeiro efeito de inibição. No grupo 5; quando é testada a mistura de anticorpos anti-FHA 2/3, anti-Hsf e anti-Hap, inibição da adesão é mais forte do que com anti-FHA 2/3 isolado, sugerindo um efeito sinergético dado pelos anticorpos anti-Hap e anti-Hsf. Numa segunda experiência de inibição (Fig 2), um antissoro 108 específico de coelho dirigido contra anti OMV que sobre-expressam Hsf (como uma proteína candidata) foi capaz de inibir parcialmente a fixação de Neisseria meningitidis B às células endoteliais em comparação com o controlo negativo (grupo 3 vs 4) . Foi demonstrado que este antissoro de coelho continha um titulo de anticorpo anti-Hsf especifico. Os anticorpos contra Hsf rec (Hsf de passagem e Hsf de comprimento total) são também capazes de inibir a adesão de bactérias em células HUVEC. Isto é verdade com soros de murganho (grupos 5-6) assim como com soros de coelho (numa extensão laser) (grupos 7-8). Nesta segunda experiência, anticorpos específicos anti-rec FHA 2/3 (grupo 1) já testados na primeira experiência confirmam o seu efeito inibidor muito elevado. Estes resultados indicam que estes antigénios específicos (Hap, FHA2/3 e Hsf), isolados ou em combinação, são antigénios de vacina interessantes.
Exemplo 12: Efeito protector de OMV Recombinantes no modelo de exposição em murganho Várias OMV recombinantes foram avaliadas em murganhos Balb/C para o seu efeito protector após exposição letal. Este modelo de imunização activa envolveu injecção intraperitoneal de meningococos de várias estirpes (ressuspensas em meio TSB sem ferro) em murganhos adultos Balb/C ou 0F1 (6 - 8 semanas de idade), após uma série de imunização pela via subcutânea. 0 dextrano de ferro, utilizado como uma fonte externa de ferro parece ser necessário manter bacteriemia e induzir a mortalidade num animal infectado. Embora este modelo IP em murganho tenha mostrado ser eficaz para avaliar a virulência, a protecção imunitária e o papel do ferro na infecção, estes não incorporam 109 a fase de transporte faríngico, que precede a bacteriemia e a meningite em humanos. Este modelo foi utilizado para rastrear os vários candidatos OMV que sobre-expressam NspA, TbpA ou Hsf. Nas experiências que se seguem, murganhos Balb/C (consanguíneos) ou OF 1 (não relacionados) foram imunizados três vezes nos dias 0, 14 e 28 pela via subcutânea com 3 (PV00N049) a 5 pg (experiências PV00N035 e PV00N043) de OMV rec. que sobre-expressam Hsf, NspA ou TbpA formulados em A1(0H)3 (100 pg AI(OH)3/animal) (PV00N035 e PV00N043) ou em A1P04 (100 pg de AlP04/animal). Depois, os animais são sangrados nos dias 28 (dia 14 passado II) e 35 (dia 7 passado III) para avaliação específica de Ab. No dia 35, 10 mg de dextrano de ferro são injectados intraperitonealmente uma hora antes da exposição. As exposições foram efectuadas com as estirpes H44/76 (B:15:P1.7,16) ou CU-385 (B:4:PI.19,15) , com cerca de 1,10 e7 CFU/animal (ver a tabela de resultados para as exactas doses de exposição). As estirpes heterólogas preparadas com a estirpe CU-385 é mais restringente do quando se utiliza a estirpe homóloga. As mortalidades foram registadas desde os dias 1 a 5. A tabela 1 ilustra a seguir que quando em comparação com OMV porA (-) e com OMV porA (+) numa menor extensão, existe já uma melhor protecção observada com OMV TbpA (+) (1/10 e 3/5 para porA(-) e 9/10 e 3/5 para porA ( + ) ) , com OMV NspA ( + ) (4/10 e 4/5) e com OMV Hsf ( + ) (3/10, 2/10 e 3/5). Isto é a observação global que se pode fazer nestas três experiências. Estes dados mostram que os antigénios TbpA, Hsf e NspA, expressos à superfície das vesículas, são de interesse para uma futura vacina menB. 110
Tabela 1: Actividade protectora no modelo de murganho de vesículas de membrana externa recombinante. A tabela resume os resultados obtidos durante três experiências (PV00N35, PV00N043 & PV00N049) OMV (vesículas) Rec OMV (H44/76 de fundo = por A P1.17, 16) Taxa de sobrevivência (no dia da protecção activa em murganho Abs Imunoespecíficos por Médias de Elisa - PV00N049 apenas PV00N035 em murganhos 0F1 PV00N043 em murganhos Balb/c PV00N049 em murganhos OFl Estirpe de exposição (+ H44/76 (B:15:P1.7, 1.27 H44/76 (8 :15:PI.7, 1.0 CTJ-385 (B:4:P1.19,1 1.1 OMV porA(-) 1/10 0/10 1/5 / OMV por A (+) 2/10 9/10 4/15 / OMV TbpA porA(+) NT 9/10 3/5 < OMV TbpA porA (-) NT 1/10 3/5 < OMV NspA porA (-) 1/10 4/10 4/5 155 - (< OMV Hsf PorA(-) 3/10 2/10 3/5 7802 - (5496) OMV Hsf Por A( + ) NT 9/9 NT / Sem antigénio 0/10 0/10 1/5 / NT : Não testada. 111
Exemplo 13: Efeito protector de antigénios de subunidade recombinantes no modelo de exposição em murganho Várias proteínas recombinantes purificadas foram avaliadas em murganhos Balb/C para o seu efeito protector após exposição letal. Este modelo de imunização activa envolveu a injecção intraperitoneal de meningococos de várias estirpes (ressuspensas em meio TSB sem ferro) em murganhos adultos Balb/C ou OF 1 (6 -8 semanas de idade) após uma série de imunizações por via subcutânea. 0 dextrano de ferro, utilizado como uma fonte externa de ferro parece ser necessário para manter a bacteriemia e induzir a mortalidade num animal infectado. Embora este modelo IP em murganho tivesse mostrado ser eficaz para avaliar a virulência, protecção imunitária e o papel do ferro na infecção, estes não incorporam a fase de transporte faríngico, que precede a bacteriemia e meningite em humanos. Este modelo foi utilizado para rastrear vários candidatos a vacinas de subunidade menB como as moléculas recombinantes FrpC, TbpA, FHA2/3 e Hap.
Nesta experiência, os murganhos 0F1 (não relacionados) foram imunizados três vezes nos dias 0, 14 e 28 pela via subcutânea com 5 pg (PV00N050) destas proteínas formuladas em A1P04 (100 pg) na presença de 10 pg de MPL (por animal).
Depois, os animais são sangrados nos dias 28 (dia 14 passado II) e 35 (dia 7 passado III) para avaliação específica de Ab, enquanto são expostos no dia 35. No dia da exposição, 10 mg de dextrano de ferro são injectados intraperitonealmente uma hora antes da exposição. As exposições foram efectuadas com as estirpes CU-385 (B:4:PI.19,15), que são heterólogas neste caso, 112 de facto, as sequências dos antigénios que vêm da H44/76 (B: 15 :P1.7,16) , excepto para o TbpA do qual a sequência vem da estirpe B16B6 (B:2a:P1.2).
Os resultados ilustrados na tabela 2 indicam que FrpC, TbpA, FHAB2/3rd, Hap induzem protecção significativa neste modelo: de 2 a 4 em 5 murganhos sobreviveram após exposição, em comparação com apenas 1/5 com o adjuvante isolado. Em todos os grupos, menos um, o título do anticorpo específico foram elevados (título de anti-TbpA específico foi moderado). Todos estes dados apoiam que o domínio conservado de FrpC, FrpA, FrpA/C, TbpA, FHAB2/3rd, Hap apresenta como antigénios de subunidade, isolados ou em combinação, são de interesse para o desenvolvimento de uma vacina menB. 113
Tabela 2: Actividade protectora no modelo de murganho de vesículas de membrana externa recombinante. A tabela resume os resultados obtidos durante uma experiência (PV00N050).
Antigénios de subunidade Antigénios subunidade rec (a partir da sequência de H44/76 Ag) Taxa de sobrevivência (no dia 5) Modelo de Murganho De Protecção Activa PV00N050 (em murganho 0F1) Ab ImunoEspecífica pela Média em Elisa - (GMT) Estirpe de exposição (+ dose) CU-385 (B:4:pl.19, 15) 1,4 10e7 Tratado com FrpC Ca2++ 3/5 31477- (27068) FHAB 2/3 rearranjado 2/5 98200 - (73220) FHAB 2/3 não rearranjado 3/5 55939 - (35347) Hap N-ter 4/5 9960 - (12811) recTbpA em SBAS4 3/5 875 - (520) SBAS4 1/5 /
Exemplo 14: Método para mostrar o efeito sinergético de combinações de antigénios de vacina
Diferentes OMV recombinantes disponíveis (OMV porA (+) rmp-LbpB, OMV porA (-) TbpA ( + ) Hsf ( + ), OMV porA (-) TbpA ( + ), OMV porA (-) NspA ( + ) , OMV porA (-) Hsf ( + ) , OMV porA (-) TbpA ( + ) NspA ( + ) ) podem ser testados isolados ou em combinação para determinar estatisticamente as melhores combinações, em termos de detecção de um efeito sinergético destas combinações de 114 candidatos a vacinas. Este trabalho pode também ser efectuado com combinações de antigénios de subunidade, assim como combinação de antigénios de subunidade + OMV recombinantes. 32 grupos de 5 murganhos OFl/gripo podem ser injectados e testados para actividade bactericida & opsónica no soro, protecção activa e passiva no modelo de murganho (se houver necessidade de utilizar quantidades sub-óptimas de antigénios individuais). Uma indicação de combinações de antigénios sinergisticas é se o nível de protecção conferido após imunização combinada é superior ao da soma dos antigénios individuais.
Exemplo 15: Análise SDS-PAGE do conteúdo em Hsf e TbpA das Vesículas da Membrana Externa corado com azul de Coommassie 15 pg de proteína em preparações de vesícula da membrana externa com regulação positiva de Hsf ou TbpA ou de Hsf e TbpA, foram diluídas num tampão de amostra contendo β-mercaptoetanol e aquecidas, a 95 °C, durante 10 minutos. As amostras foram, depois, separadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (Novex 4-20% de Tris-glicina 1,5 mm 2Dwell SDS Page) , corados em azul de Coomassie durante uma hora e descorados em várias lavagens de descoloração. Os resultados são apresentados na Figura 9, que mostram que o nível de Hsf e TbpA são consideravelmente maiores em preparações de vesícula da membrana externa, derivadas de N. meningitidis em que o nível de expressão foi melhorado. 115
Exemplo 16: Imunogenicidade de OMV com regulação positiva de
Hsf e/ou TbpA
Grupos de 20 murganhos foram imunizados três vezes com OMV pela via intramuscular nos dias 0, 21 e 28. Cada inoculação foi constituída por 5 pg (conteúdo em proteína) de OMV formulados em AIPO4 com MPL. As OMV foram derivadas da estirpe de N. meningitidis H44/76, manipulada de modo a que os polissacáridos capsulares e PorA fossem regulados negativamente. Uma comparação foi efectuada com OMV em que Hsf, TbpA, Hsf e TbpA ou nenhum foram regulados positivamente. No dia 41, foram retiradas amostras de sangue para análise por ELISA ou por ensaio bactericida em soro. ELISA para detectar anticorpos contra Hsf
Microplacas de 96 poços (Nunc, Maxisorb) foram revestidas durante a noite, a 4 °C, com 100 pL de 1 pg/mL de antigénio específico em PBS. Após lavagem com NaCl a 150 mM de Tween 20 a 0,05%, as placas foram saturadas com 100 pL de PBS-BSA a 1% sob agitação, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. Entre cada passo (efectuados sob agitação à temperatura ambiente durante 30 min e com PBS-BSA a 0,2% como tampão diluente) , os reagentes em excesso foram removidos por lavagem com NaCl-Tween 20. Cem microlitros de amostras diluídas em soro foram adicionados por micropoço. Os anticorpos ligandos foram reconhecidos por uma Ig anti-murganho biotinilada (Prosan) (1/2000). O complexo antigénio-anticorpo foi divulgado por incubação com estreptavidina- conjugado de peroxidase biotinilada (Amersham) (1/4000). 0rtoFenilenoDiamina/H202 (4 mg/10 mL de tampão citrato 0,1 M pH 4,5 + 5 pL de H2O2) é utilizada para divulgar o ensaio. 116
As placas foram incubadas, durante 15 min, à temperatura ambiente no escuro antes da interrupção da reacção por adição de 50 pL de 1 N de HC1. A absorvência foi lida a 490 nm.
Ponto Médio da Titulação (em soros misturados) gl, vesículas TbpA-HSF, IM 15471 g2, vesículas TbpA, IM 15, 41 g3, vesículas HSF, IM 14508 g4, vesículas CPS(-)PorA(-), IM - g5, MPUAIP04, IM -
Os resultados apresentados na tabela acima, mostram que títulos de anticorpo elevados e equivalentes contra Hsf foram produzidos por imunização com OMV com requlação positiva de Hsf ou Hsf e TbpA. Virtualmente, nenhum anticorpo contra Hsf pode ser detectado em soros produzidos após inoculação com adjuvante isolado ou OMV em que nem Hsf nem TbpA foram requlados positivamente ou OMV em que apenas TbpA foi requlado positivamente.
Exemplo 17: Actividade Bactericida no Soro de antisoros produzidos contra OMV com requlação positiva de Hsf e/ou TbpA A actividade bactericida no soro de antisoros dos murganhos inoculados com OMV com regulação positiva de Hsf, TbpA, Hsf e TbpA ou sem regulação positiva foram comparados em ensaios utilizando a estirpe homóloga H44/76 ou as estirpes heterólogas Cu385. O ensaio bactericida em soro foi apresentado para mostrar boa correlação com a protecção e é deste modo uma boa indicação 117 de quão eficaz uma composição candidata será na estimulação de uma resposta imunitária protectora.
As estirpes de tipo selvagem de Neisseria meningitidis de serogrupo B (estirpe H44/76 =B:15.PI.7,16 L3,7,9 e estirpe CU385 =B: 4 Pl.19,15 L3,7,9) foram cultivadas durante a noite em placas de Petri com MH + 1% Polyvitex + 1% soro de cavalo, a 37 °C, + 5% de CO2. Estas foram subcultivadas durante 3 horas num meio TSB liquido suplementado com 50 μΜ de Desferal (Quelante de ferro) a 37 °C sob agitação para atingir uma densidade óptica de aproximadamente 0,5 a 470 nm.
Os soros misturados ou individuais foram inactivados durante 40 min a 56 °C. As amostras de soro foram diluídas 1/100 em HBSS-BSA a 0,3% e, depois, serialmente diluídas em duas vezes (8 diluições) numa volume de 50 μL em microplacas de fundo redondo.
As bactérias, com a DO apropriada, foram diluídas em HBSS-BSA a 0,3% para produzir 1,3 10e4 CFU por mL. Foram adicionados 37,5 pL desta diluição às diluições do soro e as microplacas foram incubadas durante 15 minutos, a 37 °C, sob agitação. Depois, 12,5 pL de complemento de coelho foram adicionados a cada poço. Após 1 hora de incubação, a 37 °C, e sob agitação, as microplacas foram colocadas em gelo para interromper a morte.
Utilizando o método inclinado, 20 pL de cada poço foram plaqueados em placas de Petri de MH + 1% Polyvitex + 1% de soro de cavalo e incubadas durante a noite, a 37°C +CO2. As CFU foram contadas e a percentagem de mortalidade foi calculada. O título do soro bactericida é a última diluição produzindo A 50% de morte. 118 Η44/76 CU385 0MV GMT % de GMT % de responsivos responsivos CPS(-) PorA (-) 93 30% 58 5% CPS(-) PorA (-) Hsf 158 40% 108 20% CPS(-) PorA (-) TbpA 327 60% 147 30% CPS(-) PorA (-) Hsf - TbpA 3355 100% 1174 80%
Os resultados semelhantes aos apresentados na tabela acima foram obtidos em duas outras experiências semelhantes.
Um aumento dramático nos títulos bactericidas (GMT) contra a estirpe homóloga e as estirpes heterólogas foram observadas após vacinação com OMV em que Hsf e TbpA foram regulados positivamente. Por comparação, os GMT bactericidas medidos em murganhos vacinados com OMV com Hsf ou TbpA regulados positivamente foram semelhantes aos obtidos com murganhos vacinados com OMV de controlo. 0 beneficio da dupla regulação positiva foi também claramente observado na percentagem de murganhos que produziram um nivel significativo de anticorpos bactericidas (títulos superiores a 1/100), particularmente nas experiências utilizando as estirpes heterólogas. 119
Exemplo 18: Efeito da mistura de soros anti-Hsf e anti-TbpA na actividade bactericida
Os grupos de 20 murganhos foram imunizados três vezes com OMV pela via intra-muscular nos dias 0, 21 e 28. Cada inoculação foi constituída por 5 pg (conteúdo em proteína) de OMV formulados em A1P04 com MPL. As OMV foram derivadas da estirpe N. meningitidis H44/76, manipulada de modo a que os polissacáridos capsulares e PorA foram regulados negativamente. Um grupo de murganhos foi imunizado com OMV controlo em que não existiu regulação positiva de proteínas. Num segundo grupo, a expressão de Hsf foi regulada positivamente, num terceiro grupo a expressão de TbpA foi regulada positivamente e num quarto, a expressão de ambos Hsf e TbpA foi regulada positivamente.
Os soros foram misturados, utilizando soros de murganhos no mesmo grupo ou por mistura de soros isolados a partir do grupo com Hsf isolado ou TbpA isolado foram regulados positivamente. A actividade bactericida no soro foi medida para cada um dos soros misturados e os resultados são apresentados na tabela a seguir. SBA efectuado em soros misturados de murganhos imunizados com Título de SBA Vesículas TbpA-Hsf 774 Vesículas TbpA 200 Vesículas Hsf 50 Vesículas CPS(-) PorA(-) 50 Mix de soros anti-TbpA + anti-Hsf 1162 120
Os resultados na tabela acima mostram que a mistura de antisoros anti-Hsf e anti-TbpA resultaram numa muito maior actividade bactericida no soro do que foi conseguido pelos antisoros individualmente. 0 efeito sinergistico parece ser conseguido pela presença de anticorpos contra Hsf e TbpA.
Exemplo 19: Proteínas Hsf truncadas podem combinar
sinergisticamente com TbpA
Uma série de construções de Hsf truncado foram preparadas utilizando procedimentos convencionais de biologia molecular. Estes incluem uma construção que codifica os aminoácidos 1 a 54 que contém a sequência sinal de Hsf e os aminoácidos 134 a 592 de Hsf (TrlHsf). Um segundo Hsf truncado continha os aminoácidos 1-53 da sequência sinal de Hsf seguida por os aminoácidos 238-592 de Hsf (Tr2Hsf) . Estas duas construções de Hsf truncado e o Hsf de comprimento total foram introduzidos em N. meningitidis B estirpe MC58 siaD-, Opc-, PorA-, de modo a que a sua expressão possa ser regulada positivamente e as vesículas da membrana externa foram produzidas utilizando os métodos acima descritos.
As preparações de vesícula da membrana externa foram adsorvidas em A1(0H)3 e injectadas em murganhos nos dias 0, 21 e 28. No dia 42, os murganhos foram sangrados e os soros preparados. Os soros foram misturados com soros de murganhos vacinados com OMV que regularam positivamente TbpA e os ensaios de soros bactericidas foram efectuados como acima descrito. 121
Resultados Títulos no Soro Bactericida Grupo H44/76 CU3 85 MC58 PorA+ siaD+ 25600 25600 MC58 PorA- siaD- Hsf 1530 800 MC58 PorA- siaD- TrlHsf 1015 1360 MC58 PorA- siaD- Tr2Hsf 50 50 Controlo negativo 50 50 TbpA + MC58 PorA+ siaD+ 25600 24182 TbpA + MC58 PorA- siaD- Hsf 2595 1438 TbpA + MC58 PorA- siaD- TrlHsf 4383 2891 TbpA + MC58 PorA- siaD- Tr2Hsf 1568 742 TbpA + Controlo negativo 778 532
Os resultados apresentados na tabela acima divulgam que a primeira truncagem (TrlHsf) estimula uma resposta imunitária que é capaz de combinação com antisoros contra TbpA para produzir uma maior actividade bactericida no soro do que quando o Hsf de comprimento total é utilizado. No entanto, a extensão da truncagem é importante e a truncagem produzida em Tr2 tem um efeito prejudicial em comparação com o Hsf de comprimento total. A actividade bactericida melhorada de TrlHsf foi observada contra ambas as estirpes utilizadas.
Exemplo 20: Actividade no soro bactericida de anticorpos contra TbpA, Hsf e uma terceira proteína meningocócica A estirpe de N. meningitidis H66/76 em que PorA e os polissacáridos capsulares foram regulados negativamente como acima descrito, foi utilizada como a estirpe de fundo para 122 regular positivamente TbpA e Hsf, LbpB, D15, PilQ ou NspA utilizando o procedimento acima descrito. As vesículas de membrana externa foram preparadas a partir de cada estirpe como acima descrito. FHAb, FrpC, FrpA/C e Hap recombinantes foram preparados utilizando técnicas aqui descritas anteriormente e conhecidas na técnica (como descrito nos documentos PCT/EP99/02766, W092/01460 e WO98/02547).
As preparações de vesícula da membrana externa e proteínas recombinantes foram adsorvidas em Al(OH)3 e injectados em murganhos nos dias 0, 21 e 28. No dia 42, os murganhos foram sangrados e os soros preparados. Os soros contra TbpA e Hsf que regularam positivamente as OMV foram misturados com soros de murganhos vacinados com OMV contendo LbpB, D15, PilQ ou NspA OMV ou recombinante FHAb, FrpC, FrpA/C ou Hap regulados positivamente e o ensaio de soros bactericidas foram efectuados como acima descrito.
Resultados
Os resultados são apresentados na tabela a seguir. Em ensaios utilizando a estirpe homóloga H44/76, a adição de anticorpos contra um terceiro antigénio meningocócico, com a excepção FrpC, não produz um título no soro bactericida mais elevado do que o produzido utilizando anticorpos contra TbpA e Hsf isolado.
No entanto, a adição de anticorpos contra um terceiro antigénio foi vantajosa num ensaio de soros bactericidas utilizando uma estirpe heteróloga. Os anticorpos contra D15 123 (ΟΜΡ85), Hap, FrpA/C e LbpB foram particularmente eficazes no aumento do titulo no soro bactericida contra a estirpe CU385. r Mix de Antisoros Título do Soro H44/76 Bactericida CU3 8 5 anti-TbpA-Hsf e soros não imunes 5378 2141 anti-TbpA-Hsf e anti-FHA 5260 2563 anti-TbpA-Hsf e anti-Hap 4577 5150 anti-TbpA-Hsf e anti-FrpA/C 5034 4358 anti-TbpA-Hsf e anti-LbpB 5400 4834 anti-TbpA-Hsf e anti-D15 4823 4657 anti-TbpA-Hsf e anti-PilQ 4708 2242 anti-TbpA-Hsf e anti-NspA 4738 2518 anti-TbpA-Hsf e anti-FrpC 6082 2300
Exemplo 21: Efeito de FrpB KO em vesículas da membrana externa e na sua capacidade para estimular uma resposta imunitária bactericida em estirpes homólogas e heterólogas
Duas estirpes de N. meningitidis H44/76 foram utilizadas para preparar preparações de vesícula da membrana externa como descrito no documento W001/09350, utilizando uma extracção com 0,1% de DOC, de modo que o conteúdo em LOS foi cerca de 20%. A estirpe B1733 é siaD(-), PorA (-) , tem regulação positiva de e Trl Hsf (exemplo 19) e lgtB está anulado. A estirpe B 1820 B1733 é siaD(-), PorA(-), tem regulação positiva de Trl Hsf, lgtB está anulado e FrpB está também anulado. Ambas as estirpes foram cultivadas em meios suplementados com 60 μΜ de Desferal de modo a que as proteínas reguladas pelo ferro tal como LbpA/B e TbpA/B são reguladas positivamente. 124
As preparações de vesículas foram adsorvidas em A1(0H)3 e 5 pg foram injectados intramuscularmente em grupos de 30 murganhos no dia 0 e dia 21. As amostras de sangue foram retiradas no dia 28.
Os ensaios bactericidas dos soros foram efectuados em três estirpes L3 (a estirpe homóloga do tipo selvagem H44/76 e duas estirpes L3 heterólogas; NZ124 e M97250687), como descrito no exemplo 17.
Resultados
Vesículas utilizadas H44/76 M97250687 NZ124 para inoculação GMT SC GMT SC GMT SC BI 733 1518 30/30 151 11/30 70 4/29 BI 8 2 0 781 19/30 1316 24/30 276 19/30 GMT indica média geométrica do titulo dos soros no SBA. SC indica o número de murganhos soroconversores (titulo de SBA>1/100).
Os resultados mostram, claramente, que vesículas FrpB KO (B1820) induzem uma melhor resposta heteróloga bactericida cruzada do que as vesículas FrpB( + ) (B 1733) . Os títulos de SBA foram mais elevados e a maior proporção de murganhos soroconverteram-se em estirpes M97250687 e NZ124. Os resultados na estirpe homóloga não foram tão bons como quando FrpB foi removido. Estes dados sugerem que FrpB conduz a resposta imunitária, mas uma vez que esta proteína da membrana externa é altamente variável, os anticorpos contra esta proteína são apenas capazes de induzir a morte da estirpe homóloga.
Lisboa, 31 de Maio de 2013 125

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica compreendendo: (i) um antigénio de proteína de auto-transporte de Neisseria que é NadA ou Hsf; (ii) um antigénio de proteína de aquisição de Fe de Neisseria que é Lipo28 ou TbpA; e (iii) uma composição vesícula da membrana externa compreendendo LPS imunotipo L3; e em que os referidos antigénios, quando presentes numa vesícula da membrana externa, foram recombinantemente regulados positivamente na vesícula da membrana externa.
  2. 2. Composição imunogénica da reivindicação 1, em que o antigénio da proteína de autotransporte de Neisseria e o antigénio da proteína de aquisição de Fe de Neisseria são isolados.
  3. 3. Composição imunogénica da reivindicação 1 ou 2, em que a referida composição imunogénica compreende uma composição de subunidades e a composição de vesícula da membrana externa.
  4. 4. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que a composição de vesícula da membrana externa compreende LPS imunotipo L3,7,9. 1
  5. 5. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que a composição de vesícula da membrana externa compreende uma concentração de LPS imunotipo L3 que é obtenível utilizando extracção com 0,02-0,4% de desoxicolato.
  6. 6. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que, pelo menos, um dos antigénios é derivado de Neisseria meningitidis.
  7. 7. Composição imunogénica da reivindicação 6, em que todos os antigénios são derivados de Neisseria meningitidis.
  8. 8. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, compreendendo, ainda, um ou mais polissacáridos bacterianos capsulares ou oligossacáridos.
  9. 9. Composição imunogénica da reivindicação 8, em que os polissacáridos capsulares ou oligossacáridos são derivados de bactérias seleccionadas do grupo consistindo em: Neisseria meningitidis serogrupo A, C, Y e W-135.
  10. 10. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, compreendendo, ainda, um adjuvante.
  11. 11. Composição imunogénica da reivindicação 10, em que o adjuvante compreende um sal de alumínio.
  12. 12. Composição imunogénica da reivindicação 11, em que o sal de alumínio é hidróxido de alumínio gel. 2
  13. 13. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que o antigénio da proteína de autotransporte de Neisseria é NadA.
  14. 14. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que o antigénio da proteína de aquisição de Fe de Neisseria é Lipo28.
  15. 15. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, compreendendo, ainda, um antigénio que é uma proteína associada a membrana de Neisseria.
  16. 16. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, que compreende, ainda, um antigénio seleccionado do grupo consistindo em: GNA1870, Hap, LbpB e Omp85.
  17. 17. Composição imunogénica da reivindicação 15 ou 16, em que o antigénio adicional é isolado. Lisboa 31 de Maio de 2013 3
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Families Citing this family (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ532665A (en) 1998-05-01 2005-11-25 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions
GB9823978D0 (en) * 1998-11-02 1998-12-30 Microbiological Res Authority Multicomponent meningococcal vaccine
US10967045B2 (en) * 1998-11-02 2021-04-06 Secretary of State for Health and Social Care Multicomponent meningococcal vaccine
DK1228217T3 (da) 1999-04-30 2013-02-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Konserverede neisseria-antigener
CA2929348A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-30 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Combination neisserial compositions
GB9918319D0 (en) * 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
ES2559317T3 (es) 1999-10-29 2016-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Péptidos antigénicos de Neisseria
GB9928196D0 (en) 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
HUP0300696A3 (en) * 2000-01-25 2004-10-28 Univ Queensland Brisbane Proteins comprising conserved regions of neisseria meningitidis surface antigen nhha
PT1947187E (pt) 2000-02-28 2011-07-04 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressões híbridas de proteínas de neisseria
JP5511117B2 (ja) 2000-07-27 2014-06-04 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド 髄膜炎菌に起因する疾患に対する広域防御のためのワクチン
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
ATE469915T1 (de) 2001-07-27 2010-06-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Antikörper gegen das meningokokken adhäsin app
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
DK2255826T3 (en) * 2002-08-02 2016-06-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens.
GB0220194D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
BRPI0315228A8 (pt) * 2002-10-11 2018-04-03 Chiron Srl Vacinas de polipeptídeo para ampla proteção contra linhagens meningocócicas hipervirulentas
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
GB0316560D0 (en) 2003-07-15 2003-08-20 Chiron Srl Vesicle filtration
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
NZ546601A (en) 2003-09-19 2010-07-30 Epitopix Llc Compositions comprising at least six isolated metal regulated polypeptides obtainable from campylobacter spp
ES2397923T3 (es) 2003-10-02 2013-03-12 Novartis Ag Vacunas líquidas para múltiples serogrupos meningocócicos
GB0323709D0 (en) * 2003-10-09 2003-11-12 Health Prot Agency Modified whole cell,cell extract and omv-based vaccines
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
WO2005064021A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
JP5174457B2 (ja) * 2004-05-11 2013-04-03 デ スタート デール ネーダーランデン, フェルテヘンウォールディヒィト ドール デ ミニステール ファン フォルクスヘーゾンドハイド, フェルザイン アン スポルト アジュバントとしての髄膜炎菌lgtBLOS
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
GB0419408D0 (en) * 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
GB0419627D0 (en) * 2004-09-03 2004-10-06 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
GB0428381D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Isis Innovation Vaccine
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2431382A1 (en) 2005-01-21 2012-03-21 Epitopix, LLC Yersinia SPP, polypeptides and methods of use
LT2682126T (lt) * 2005-01-27 2017-02-27 Children`s Hospital & Research Center at Oakland Gna1870 pagrindu gaminamos pūslelių pavidalo vakcinos, skirtos plataus spektro apsaugai nuo neisseria meningitidis sukeltų ligų
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
SI1896065T2 (sl) * 2005-06-27 2014-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Postopek za pripravo cepiv
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7955817B2 (en) 2005-09-02 2011-06-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine protection assay
EP2208999B1 (en) * 2005-09-05 2014-08-27 GlaxoSmithKline Biologicals SA Serum bactericidal assay for N. meningitidis specific antisera
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
WO2007066226A2 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Universita Degli Studi Di Padova Methods and compositions relating to adhesins as adjuvants
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
NZ569168A (en) 2005-12-22 2012-02-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Streptococcus pneumoniae polysaccharide conjugate vaccine comprising 19F-DT conjugate
CU23549A1 (es) * 2005-12-29 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Composiciones farmacéuticas que contienen la proteína nma0939
EA020459B1 (ru) 2006-03-30 2014-11-28 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Иммуногенная композиция
JP5275982B2 (ja) * 2006-06-12 2013-08-28 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
US20080280818A1 (en) 2006-07-21 2008-11-13 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
EA016417B1 (ru) 2006-09-07 2012-04-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Способ получения вакцины
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
BRPI0809670A8 (pt) 2007-04-03 2018-12-18 Biogenerix Ag métodos para aumentar a produção de célula tronco, para aumentar o número de granulócitos em um indivíduo, para prevenir, tratar e aliviar a mielossupressão que resulta de uma terapia contra o câncer, para tratar uma condição em um indivíduo, para tratar neutropenia e trombocitopenia em um mamífero, para expandir células tronco hematopoiéticas em cultura, para aumentar a hematopoiese em um indivíduo, para aumentar o número de célulars progenitoras hematopoiéticas em um indivíduo, e para fornecer enxerto estável da medula óssea, e, forma de dosagem oral.
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
BRPI0813307C1 (pt) 2007-06-26 2021-05-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina
JP2010535019A (ja) * 2007-08-02 2010-11-18 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム リポオリゴ糖(los)生合成に関わる遺伝子の有無の決定によるナイセリア属菌株の分子タイピング
CA2695467A1 (en) * 2007-08-02 2009-03-26 Children's Hospital & Research Center At Oakland Fhbp- and lpxl1-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
CA2925217A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Novartis Ag Meningococcal vaccine formulations
ES2532946T3 (es) * 2008-02-21 2015-04-06 Novartis Ag Polipéptidos PUfH meningocócicos
DK2257311T3 (da) 2008-02-27 2014-06-30 Novo Nordisk As Konjugerede Faktor VIII-Molekyler
KR101208778B1 (ko) 2008-03-03 2012-12-05 노파르티스 아게 Tlr 활성 조정제로서의 화합물 및 조성물
NZ589812A (en) * 2008-05-30 2012-08-31 U S A As Represented By The Secretary Of The Army On Behalf Of Walter Reed Army Inst Of Res Meningococcal multivalent native outer membrane vesicle vaccine, methods of making and use thereof
KR101042541B1 (ko) * 2008-07-25 2011-06-17 한국생명공학연구원 외막소체를 생산하는 재조합 g(-) 박테리아 및 이를이용한 다가항원이 실린 외막소체의 제조방법
WO2010027729A2 (en) * 2008-08-25 2010-03-11 Creatv Microtech, Inc. Gonococcal vaccines
GB0816447D0 (en) * 2008-09-08 2008-10-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
CN101759781B (zh) * 2008-12-25 2013-04-03 上海市第六人民医院 一种细菌表层黏附蛋白及其用途
ES2616533T3 (es) 2008-12-25 2017-06-13 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Vacuna recombinante para la rinitis infecciosa aviar y proceso para producir la misma
EP2208787A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-21 Université de Liège A recombinant alpha-hemolysin polypeptide of Staphylococcus aureus, having a deletion in the stem domain and heterologous sequences inserted
EP2411044A2 (en) * 2009-03-24 2012-02-01 Novartis AG Combinations including pneumococcal serotype 14 saccharide
EP3017826A1 (en) 2009-03-24 2016-05-11 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
SI2411048T1 (sl) 2009-03-24 2020-08-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Meningokokni faktor H vezavni protein uporabljen kot adjuvans
NZ597008A (en) * 2009-05-14 2013-03-28 Sanofi Pasteur Meningococcal vaccine based on lipooligosaccharide (los) and neisseria meningitidis protein
NZ597007A (en) 2009-05-14 2013-09-27 Sanofi Pasteur Meningococcus vaccine containing lipooligosaccharide (los) from modified strains of l6 immunotype neisseria meningitidis
NZ597004A (en) * 2009-05-14 2013-03-28 Sanofi Pasteur Method for admixing the lipopolysaccharide (lps) of gram-negative bacteria
WO2010134225A1 (ja) * 2009-05-20 2010-11-25 国立大学法人鳥取大学 部分糖鎖エピトープを用いた、病原性ナイセリア属細菌感染の検出方法およびそれら細菌に対するワクチン
CN102762226A (zh) 2009-06-10 2012-10-31 诺华有限公司 含苯并萘啶的疫苗
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
US8858958B2 (en) 2009-08-27 2014-10-14 Novartis Ag Adjuvant comprising aluminum, oligonucleotide and polycation
CN102596240B (zh) 2009-08-27 2015-02-04 诺华股份有限公司 包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽
WO2011027956A2 (ko) 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 박테리아에서 유래한 세포밖 소포체 및 이를 이용한 질병 모델
EP2494865A4 (en) 2009-09-01 2014-05-14 Aeon Medix Inc EXTRACELLULAR VESICLES OBTAINED FROM THE DARMFLORA, AND METHOD FOR SEARCHING FOR A DISEASE MODEL, VACCINE AND CANDIDATE AND DIAGNOSTIC METHOD THEREFOR
JO3257B1 (ar) 2009-09-02 2018-09-16 Novartis Ag مركبات وتركيبات كمعدلات لفاعلية tlr
ES2443952T3 (es) 2009-09-02 2014-02-21 Novartis Ag Composiciones inmunógenas que incluyen moduladores de la actividad de TLR
GB0917002D0 (en) * 2009-09-28 2009-11-11 Novartis Vaccines Inst For Global Health Srl Improved shigella blebs
GB0917003D0 (en) 2009-09-28 2009-11-11 Novartis Vaccines Inst For Global Health Srl Purification of bacterial vesicles
CA2776004A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
WO2011051893A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Novartis Ag Modified meningococcal fhbp polypeptides
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
JP6166042B2 (ja) * 2009-11-06 2017-07-19 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド T細胞刺激タンパク質bおよび使用方法
MX339146B (es) 2009-12-15 2016-05-13 Novartis Ag Suspension homogenea de compuestos inmunopotenciadores y usos de los mismos.
BR112012022688A2 (pt) * 2010-03-10 2018-05-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa proteína de fusão, vesícula da membrana externa isolada, polinucleotídeo, composição farmacêutica, vacina, método para tratamento ou prevenção de infecção ou doença por neisseria, uso e método para fabricar uma proteína de fusão
US9365624B2 (en) * 2010-03-11 2016-06-14 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Vaccine
WO2012020326A1 (en) 2010-03-18 2012-02-16 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus
EA031379B1 (ru) 2010-03-23 2018-12-28 Новартис Аг Соединения (липопептиды на основе цистеина) и композиции в качестве агонистов tlr2, применяемые для лечения инфекционных, воспалительных, респираторных и других заболеваний
AU2013202310C1 (en) * 2010-03-29 2017-01-05 Nationwide Children's Hospital, Inc. Compositions and methods for the removal of biofilms
MX2012010793A (es) * 2010-03-29 2013-05-09 Univ Southern California Composiciones y metodos para la eliminacion de biopeliculas.
US10478483B2 (en) 2010-06-25 2019-11-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinations of meningococcal factor H binding proteins
US20120128701A1 (en) 2010-09-09 2012-05-24 Nationwide Children's Hospital, Inc. Compositions and methods for the removal of biofilms
AU2011300418B2 (en) * 2010-09-10 2016-05-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Meningococcus overexpressing NadA and/or NHBA and outer membrane vesicles derived therefrom
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
PL2622078T3 (pl) * 2010-09-28 2015-05-29 Abera Bioscience Ab Białko fuzyjne dla ekspresji białka wydzielniczego
WO2012054879A1 (en) * 2010-10-22 2012-04-26 Duke University Compositions and methods for the treatment of septic arthritis, osteomyelitis, and bacteremia
US20150147356A1 (en) 2011-05-12 2015-05-28 Alan Kimura Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines
SI2729167T1 (sl) 2011-07-07 2018-09-28 De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws Proces za detergent-prosto proizvodnjo veziklov zunanje membrane gram-negativne bakterije
CA2862247A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2809785B1 (en) 2012-02-02 2017-11-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Promoters for increased protein expression in meningococcus
JP5698693B2 (ja) * 2012-03-13 2015-04-08 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 髄膜炎菌特異的抗血清に対する血清殺菌アッセイ
MX357538B (es) 2012-06-14 2018-07-13 Novartis Ag Vacunas para meningococo de serogrupo x.
CN104602705A (zh) 2012-09-06 2015-05-06 诺华股份有限公司 血清组b脑膜炎球菌和d/t/p的联合疫苗
RU2662970C2 (ru) 2012-09-18 2018-07-31 Новартис Аг Везикулы наружной мембраны
JP2016507543A (ja) 2013-02-07 2016-03-10 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 小胞を含む医薬組成物
WO2014138290A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-12 Trudeau Institute, Inc. Compositions and methods for treating bacterial infections
US11274144B2 (en) 2013-06-13 2022-03-15 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for the removal of biofilms
US9745366B2 (en) 2013-09-23 2017-08-29 University Of Southern California Compositions and methods for the prevention of microbial infections
US10233234B2 (en) 2014-01-13 2019-03-19 Trellis Bioscience, Llc Binding moieties for biofilm remediation
US11248040B2 (en) 2013-09-26 2022-02-15 Trellis Bioscience, Llc Binding moieties for biofilm remediation
AU2015222121B2 (en) 2014-02-28 2018-01-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified meningococcal fHbp polypeptides
WO2016091902A1 (en) * 2014-12-09 2016-06-16 Sanofi Pasteur Compositions comprising n. meningitidis proteins
AU2016262823A1 (en) 2015-05-18 2017-12-07 Universita' Degli Studi Di Trento Immunogenic compositions containing bacterial outer membrane vesicles and therapeutic uses thereof
CA2993009A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Peptides and antibodies for the removal of biofilms
EP3365027B1 (en) 2015-10-14 2022-03-30 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Hu specific antibodies and their use in inhibiting biofilm
KR101825439B1 (ko) 2016-04-15 2018-02-05 배재대학교 산학협력단 염산 처리에 의한 그람양성 박테리아 고스트의 제조 방법
AU2018206552A1 (en) 2017-01-04 2019-07-18 Research Institute At Nationwide Children's Hospital DNABII vaccines and antibodies with enhanced activity
US11746136B2 (en) 2017-03-15 2023-09-05 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Composition and methods for disruption of bacterial biofilms without accompanying inflammation
EP3607967A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Modified meningococcal fhbp polypeptides
CN112996538A (zh) * 2018-11-06 2021-06-18 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
US20220125908A1 (en) * 2019-02-14 2022-04-28 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Honeybee commensal snodgrassella alvi vaccine against pathogenic neisseriaceae
FR3099160B1 (fr) * 2019-07-23 2022-05-06 Univ Grenoble Alpes Anticorps dirigé contre la protéine oprf depseudomonas aeruginosa, son utilisation en tant que médicament et composition pharmaceutique le contenant
WO2023097652A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 National Center For Nanoscience And Technology An engineered cell and application thereof
GB202203250D0 (en) 2022-03-09 2022-04-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4239746A (en) * 1973-06-30 1980-12-16 Dezso Istvan Bartos Complement fixation test employing reactants in a disposable package
DE2744721A1 (de) 1977-10-05 1979-04-19 Veba Chemie Ag Pulverfoermige ueberzugsmittel und deren anwendung
DE2848965A1 (de) 1978-11-11 1980-05-22 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung von membranproteinen aus neisseria meningitidis und diese enthaltende vaccine
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
US4271147A (en) 1980-01-10 1981-06-02 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US20020146764A1 (en) * 1985-03-28 2002-10-10 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
DE3622221A1 (de) * 1986-07-02 1988-01-14 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur gentechnologischen gewinnung von proteinen unter verwendung gramnegativer wirtszellen
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
RU2023448C1 (ru) 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
ES2160570T3 (es) 1988-12-16 2001-11-16 Nederlanden Staat Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.
US7118757B1 (en) * 1988-12-19 2006-10-10 Wyeth Holdings Corporation Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
CU22302A1 (es) * 1990-09-07 1995-01-31 Cigb Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales
ATE242784T1 (de) 1990-07-16 2003-06-15 Univ North Carolina Mit der familie der hämolysin-toxine verwandte antigene eisen-ubnterdrückende proteine des n. meningitis
DE4023721A1 (de) 1990-07-26 1992-01-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von vakzinen und ihre verwendung
US5912336A (en) 1990-08-23 1999-06-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis
DE69133622D1 (de) 1990-08-23 2009-10-01 Univ North Carolina Transferrin bindende Proteine aus Neisseria-Gonorrhoeae und Neisseria-Meningitidis. Ihre Verwendung in einem Impfstoff
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
US5371186A (en) 1991-02-11 1994-12-06 Biosynth S.R.L. Synthetic peptides for detoxification of bacterial endotoxins and for the prevention and treatment of septic shock
US5652211A (en) 1991-02-11 1997-07-29 Biosynth S.R.L. Peptides for neutralizing the toxicity of Lipid A
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
ES2127217T3 (es) * 1991-03-14 1999-04-16 Imclone Systems Inc Epitopos de porina hibridos de recombinacion.
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
FR2682041B1 (fr) 1991-10-03 1994-01-14 Pasteur Merieux Serums Vaccins Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis.
EP0621886A1 (en) 1992-01-13 1994-11-02 Akzo Nobel N.V. Crosslinking of rubbers with engineering plastics
DE69333107T2 (de) 1992-02-11 2004-01-29 Jackson H M Found Military Med Dualer träger für immunogene konstrukte
FR2692592B1 (fr) 1992-06-19 1995-03-31 Pasteur Merieux Serums Vacc Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant.
DK0761231T3 (da) 1992-06-25 2000-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
NL9201716A (nl) * 1992-10-02 1994-05-02 Nederlanden Staat Buitenmembraanvesikel dat voorzien is van een groep polypeptiden welke ten minste de immuunwerking van aan membraan gebonden buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk buitenmembraanvesikel omvat.
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
EP1300156A3 (en) 1993-05-18 2003-05-07 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US6361779B1 (en) 1993-11-08 2002-03-26 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor genes
NZ275772A (en) 1993-11-08 1998-04-27 Connaught Lab Haemophilus transferrin receptor genes and proteins including production and use
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP1167378B1 (en) 1994-07-15 2011-05-11 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5545553A (en) 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US6287574B1 (en) * 1995-03-17 2001-09-11 Biochem Pharma Inc. Proteinase K resistant surface protein of neisseria meningitidis
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
US6265567B1 (en) 1995-04-07 2001-07-24 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated FrpB nucleic acid molecule
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
EA199800046A1 (ru) 1995-06-07 1998-06-25 Байокем Вэксинс Инк. Полипептид, последовательность днк, вакцинная композиция (варианты), антитело или его фрагмент, вакцина, применения указанных полипептида, последовательности днк и антитела или его фрагмента
US6007838A (en) 1995-06-07 1999-12-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Process for making liposome preparation
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
ATE261313T1 (de) * 1995-09-18 2004-03-15 Us Army Medical Res Materiel C Verbesserte verfahren zur herstellung von nichtkovalent komplexierten und multivalenten impfstoffen gegen proteasomen-untereinheiten
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
US6440701B1 (en) 1996-03-08 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor genes of Moraxella
EP0912608B1 (en) 1996-05-01 2006-04-19 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
FR2751000B1 (fr) 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
CA2271720A1 (en) 1996-10-31 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
BR9809914A (pt) 1997-06-03 2001-09-18 Connaught Lab Genes de moracella receptores de lactoferrina
US6764686B2 (en) 1997-07-21 2004-07-20 Baxter International Inc. Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
AU4773697A (en) 1997-07-31 1999-02-22 Wilo Gmbh Latent heat storage device for use in a vehicle
DE69836333T2 (de) 1997-08-15 2007-04-19 Rijksuniversiteit Utrecht Neisseria lactoferrin-bindendes protein
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6914131B1 (en) * 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
GB9726398D0 (en) * 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
EP2278011A3 (en) * 1998-01-14 2012-03-07 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisseria meningitidis antigens
CA2264970A1 (en) 1998-03-10 1999-09-10 American Cyanamid Company Antigenic conjugates of conserved lipolysaccharides of gram negative bacteria
IL138798A0 (en) 1998-04-07 2001-10-31 Medimmune Inc Vaccines and antibodies against bacterial pneumococcal infection
GB9808734D0 (en) 1998-04-23 1998-06-24 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9808866D0 (en) * 1998-04-24 1998-06-24 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
NZ532665A (en) * 1998-05-01 2005-11-25 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions
US20070026021A1 (en) * 1998-05-01 2007-02-01 Chiron S.R.I. Neisseria meningitidis antigens and compositions
GB9809683D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810285D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810276D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9811260D0 (en) 1998-05-26 1998-07-22 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US6248329B1 (en) * 1998-06-01 2001-06-19 Ramaswamy Chandrashekar Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof
DE69933444T2 (de) 1998-06-03 2007-03-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteine und gene aus moraxella catarrhalis, antigene, antikörper, und verwendungen
GB9812163D0 (en) 1998-06-05 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812440D0 (en) 1998-06-09 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9814902D0 (en) 1998-07-10 1998-09-09 Univ Nottingham Screening of neisserial vaccine candidates against pathogenic neisseria
US6951652B2 (en) 1998-07-29 2005-10-04 Biosynth S.R.L. Vaccine for prevention of gram-negative bacterial infections and endotoxin related diseases
GB9818004D0 (en) * 1998-08-18 1998-10-14 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9820003D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9820002D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
EP1144998A3 (en) * 1998-10-09 2002-08-07 Chiron Corporation Neisseria genomic sequences and methods of their use
DE69926647T2 (de) 1998-10-16 2006-11-09 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Durch molekulares pathogenicid vermittelte krankheitsresistenz in pflanzen
DK1535928T3 (da) 1998-10-22 2008-10-20 Univ Montana Vaccinesammensætninger indeholdende Omp85-proteiner af Neisseria gonorrhoeae og Neisseria meningitidis
US6610306B2 (en) * 1998-10-22 2003-08-26 The University Of Montana OMP85 protein of neisseria meningitidis, compositions containing the same and methods of use thereof
US20030215469A1 (en) * 1998-11-02 2003-11-20 Microbiological Research Authority Multicomponent meningococcal vaccine
GB9823978D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Microbiological Res Authority Multicomponent meningococcal vaccine
EP1127137B2 (en) 1998-11-03 2013-12-25 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Lps with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
BR0010361A (pt) * 1999-04-30 2003-06-10 Chiron Corp Seq ências genÈmicas de neisseria e uso destas
DK1228217T3 (da) * 1999-04-30 2013-02-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Konserverede neisseria-antigener
GB9911683D0 (en) * 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
CA2929348A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-30 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Combination neisserial compositions
WO2000078968A2 (en) 1999-06-18 2000-12-28 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Nucleotide sequences of moraxella catarrhalis genome
GB2351515B (en) 1999-06-29 2002-09-11 Pandrol Ltd Adjustable railway rail fastening assembly and methods for use therewith
GB9917977D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918038D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918208D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB9918302D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US6531131B1 (en) 1999-08-10 2003-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate vaccine for Neisseria meningitidis
AUPQ275799A0 (en) * 1999-09-10 1999-10-07 Luminis Pty Limited Recombinant bacterium expressing an oligosaccharide receptor mimic
WO2001038350A2 (en) 1999-11-29 2001-05-31 Chiron Spa 85kDa NEISSERIAL ANTIGEN
DK2289545T3 (en) * 2000-01-17 2016-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Supplemented OMV vaccine against meningococcus
HUP0300696A3 (en) * 2000-01-25 2004-10-28 Univ Queensland Brisbane Proteins comprising conserved regions of neisseria meningitidis surface antigen nhha
PT1947187E (pt) 2000-02-28 2011-07-04 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressões híbridas de proteínas de neisseria
GB0007432D0 (en) * 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
GB0011108D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
JP5511117B2 (ja) 2000-07-27 2014-06-04 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド 髄膜炎菌に起因する疾患に対する広域防御のためのワクチン
GB0103424D0 (en) * 2001-02-12 2001-03-28 Chiron Spa Gonococcus proteins
GB0108024D0 (en) * 2001-03-30 2001-05-23 Chiron Spa Bacterial toxins
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
CA2452720C (en) * 2001-07-26 2012-04-17 Chiron S.R.L. Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine
GB0118249D0 (en) * 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) * 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
ATE469915T1 (de) * 2001-07-27 2010-06-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Antikörper gegen das meningokokken adhäsin app
CA2462646C (en) 2001-10-03 2013-02-12 Chiron Corporation Adjuvanted meningococcus compositions
DK2255826T3 (en) * 2002-08-02 2016-06-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens.
BRPI0315228A8 (pt) * 2002-10-11 2018-04-03 Chiron Srl Vacinas de polipeptídeo para ampla proteção contra linhagens meningocócicas hipervirulentas
PT1587537E (pt) * 2003-01-30 2012-05-30 Novartis Ag Vacinas injetáveis contra múltiplos serogrupos meningocócicos
GB0315021D0 (en) * 2003-06-26 2003-07-30 Chiron Srl Immunogenic gonococcal compositions
GB0323103D0 (en) * 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
ES2397923T3 (es) * 2003-10-02 2013-03-12 Novartis Ag Vacunas líquidas para múltiples serogrupos meningocócicos
GB0408977D0 (en) * 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0409748D0 (en) * 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Lactoferrin cleavage
AU2007263531B2 (en) * 2006-06-29 2012-03-15 J. Craig Venter Institute, Inc. Polypeptides from neisseria meningitidis

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CA2493977A1 (en) 2004-02-19
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