CN104277118A - 重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法，方法包括以下步骤：利用融合PCR技术通过编码(GlyGlyGlyGlySer)₃的DNA片段将BMP7和BMP2基因连接，将融合基因插入pHis-NusA质粒中，构建重组质粒，重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃培养，0.5mM IPTG诱导表达，结果表明此方法高效表达BMP7/BMP2异源二聚体蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在，经过简便的包涵体纯化和复性即能得到大量复性蛋白，本方法获得BMP活性蛋白操作简单，极大地降低了制备成本，适合大规模发酵生产，为BMP在临床上治疗骨损伤的广泛应用提供了可能。

Description

重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法

技术领域

本发明涉及的是利用大肠杆菌原核表达系统高效表达BMP7/BMP2异源二聚体蛋白，并经过变性和透析复性，制备具有生物活性的重组人骨形态发生蛋白BMP7/BMP2异源二聚体的新方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是1965年首次发现的一种能诱导常位及异位成骨的蛋白质,具有诱导间充质细胞和骨祖细胞分化为软骨细胞和成骨细胞从而诱导新骨生成的能力。目前已鉴定并克隆出20多种BMP，它们属于转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)超基因家族中的成员，BMP2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一。BMP7主要在骨和肾中表达,BMP7具有强大的骨诱导活性,能刺激未分化的间充质细胞增殖及向成骨细胞或软骨细胞方向分化,并促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的分泌。由于骨形态发生蛋白BMP具有高效诱导成骨活性，因而具有重要的临床应用价值，包括用于修复骨缺损，用于脊柱融合术，治疗股骨头坏死，修复牙槽骨缺损等。

近年来，重组人骨形态发生蛋白BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组人骨形态发生蛋白BMP2，BMP7用于脊柱融合和骨缺损修复。但由于动物细胞制备的重组人骨形态发生蛋白表达量低，制备成本高，致使治疗成本高达6000-10000美元，从而大大限制了BMP在临床上的应用。

1990年，Sampath等从牛骨中分离出一种分子量为30kDa的蛋白，实验证明其具有明显的成骨能力，经分析发现这种蛋白由两个亚基构成，测序证明前者为BMP7，后者为BMP2，且糖基化与否对其活性无影响。这说明BMP异源二聚体在自然情况下即存在。AkiAono等研究证明，BMP异源二聚体比同源二聚体具有更高的诱导成骨活性。

目前BMP蛋白的取得方式一般为从牛骨中提取，这种方式成本高，纯度低且易污染。且高等动物对异源的BMP具有免疫作用，会削弱BMP的诱骨活性。而使用昆虫细胞或动物细胞培养时间长，培养条件苛刻，成本高，不利于大规模生产的进行。致使BMP蛋白的价格过高，增加了病人的负担，限制了其在临床上的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法，本发明利用大肠杆菌表达系统，高效、低成本地表达重组人骨形态发生蛋白BMP7/BMP2异源二聚体蛋白，这种异源二聚体蛋白是用一段柔性肽将BMP7和BMP2成熟肽相连，此蛋白具有比BMP2或BMP7同源二聚体更高的诱骨活性，经过简便的复性步骤，产生有诱骨活性的BMP蛋白，使其在临床上得到广泛应用成为可能。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白，所述蛋白从N端到C端的顺序是BMP7-连接肽-BMP2，所述连接肽是由3个GlyGlyGlyGlySer重复氨基酸序列组成。

表达重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白的基因工程菌，所述宿主菌为大肠杆菌感受态BL21(DE3)，所述表达载体为pHis-NusA，所述载体的目的序列为BMP7和BMP2成熟肽基因通过编码连接肽的DNA片段连接，获得编码BMP异源二聚体的核苷酸序列。

而且，所述表达载体为pHis-NusA的克隆位点为Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ。

而且，包括如下步骤：

⑴将BMP7和BMP2成熟肽基因通过编码连接肽的DNA片段连接，获得编码BMP异源二聚体的核苷酸序列；

⑵将步骤⑴所获得的DNA序列克隆到表达载体上；

⑶将重组质粒转化至宿主菌，诱导蛋白表达；

⑷离心收集菌体，用裂解液重悬菌体，超声破碎，离心收集沉淀；

⑸进行表达蛋白包涵体的洗涤纯化，并进行复性。

而且，所述步骤⑵中克隆位点为Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ，表达载体为pHis-NusA。

而且，所述步骤⑶中宿主为大肠杆菌。

而且，所述步骤⑸中包涵体洗涤剂为：0.1M磷酸钠，250mM NaCl，4M urea，1％Triton X-100，1mM EDTA，PH＝7.4。

而且，所述步骤⑸中复性方法采用透析复性，复性过程尿素浓度梯度为8M-2M-1M-0M。

重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白的复性方法，所述方法包括以下步骤：

以编码BMP7和BMP2成熟肽的DNA为模版，通过融合PCR技术，将BMP7和BMP2基因以编码连接肽DNA的片段连接；将所获序列克隆到表达载体pHis-NusA上，构建重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌中，以0.5mM的IPTG为诱导剂，诱导表达蛋白；收集菌体，用裂解液重悬菌体，超声破碎，收集沉淀；用权利要求5中的包涵体洗涤液进行洗涤后，8M尿素变性，将上清转至透析袋，进行尿素浓度梯度复性，尿素浓度梯度为8M-2M-1M-0M,磁力搅拌器搅拌，每个浓度梯度复性3小时；收集上清，得到复性好的BMP异源二聚体蛋白。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1、本发明使用融合PCR的技术将BMP2和BMP7基因用编码柔性肽的DNA序列连接在一起。将融合基因克隆连接到表达载体pHis-NusA上，将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，表达BMP7/BMP2异源二聚体蛋白。经SDS-PAGE验证，此蛋白绝大部分存在于破碎菌体沉淀之中，以包涵体形式存在，在通过洗涤包涵体，加入8M尿素变性，透析复性获得BMP。本发明利用大肠杆菌原核表达系统大量的地表达和制备了重组人骨形态发生蛋白BMP7/BMP2异源二聚体，经过简便的复性步骤，即得到有活性的蛋白，体外细胞活性检测表明此蛋白能显著提高小鼠成纤维细胞及小鼠成肌细胞碱性磷酸酶活性。

2、本发明采用的大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，外源基因常能获得大量表达，且大肠杆菌表达BMP蛋白培养费用低，产量高，培养条件简单，适合大规模发酵生产,以极低的成本和常规的操作过程即能大量获得此蛋白。

3、本发明中大肠杆菌表达此蛋白以包涵体的形式存在，经过过一系列实验，申请人找到了十分简便的复性方法：经过简单的洗涤之后，包涵体即变得十分纯净，节省了以后繁琐的蛋白纯化步骤，大大节省了时间并节约了成本。本发明采用的复性步骤十分简单，复性过程使用的药品容易获得并且价格低廉，复性出的蛋白纯度较高，根据报道异源二聚体具有比同源二聚体更高的活性，大大降低了其使用量及生产成本，使重组人骨形态发生蛋白BMP在临床上得到广泛应用成为可能。

4、BMP本身具有高度诱导骨生成能力，与载体复合可提高其生物结合能力和诱骨活性，如将胶原海绵与BMP复合，制成复合体植入动物体内其缓慢降解，能较大程度地提高新骨的形成速度和成骨量，缩短种植体的骨整合时间。

5、大肠杆菌原核表达系统由于其操作简便，表达量高，成本低的特点，已被广泛应用于生产药用蛋白质，虽其不能进行糖基化修饰，但对BMP异源二聚体活性无影响，经过简便的包涵体洗涤与复性过程即能生产出大量有活性的BMP异源二聚体蛋白，大大降低了其制备成本。

附图说明

图1为本发明一轮PCR扩增BMP2，BMP7序列，laneM：Marker,lane1:BMP2序列PCR结果，lane2:BMP7序列PCR结果；

图2为本发明三轮PCR结果，laneM：Marker,lane1:三轮PCR结果

图3为本发明BMP7/BMP2异源二聚体蛋白在大肠杆菌中的表达，IPTG(-)未诱导，T：菌体裂解液，P：裂解液沉淀，S：裂解液上清；

图4为本发明包涵体的复性，T：全部复性蛋白，P：复性蛋白沉淀，S：复性蛋白上清；

图5为本发明MC3T3细胞处理之后茜素红染色的结果。图5A：加BMP7/BMP2异源二聚体蛋白处理的细胞茜素红染色结果；图5B：加BMP7蛋白处理的细胞茜素红染色结果；图5C：加PBS处理的细胞茜素红染色结果；

图6为本发明C2C12细胞处理之后茜素红染色的结果。图6A：加BMP7/BMP2异源二聚体蛋白处理的细胞茜素红染色结果；图6B：加BMP7蛋白处理的细胞茜素红染色结果；图6C：加PBS处理的细胞茜素红染色结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明提供一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白，具体为BMP7/BMP2异源二聚体蛋白，该蛋白从N端到C端的顺序是BMP7-连接肽-BMP2，连接肽是由3个GlyGlyGlyGlySer重复氨基酸序列组成。本发明BMP2，BMP7成熟肽核酸序列，BMP2含104个氨基酸，BMP7含139个氨基酸；

本发明所述的在大肠杆菌中大量表达BMP7/BMP2异源二聚体蛋白方法及复性产生有活性的重组BMP蛋白的主要方法，步骤如下：

⑴重组质粒的构建

①引物设计

利用BMP7和BMP2成熟肽序列作为模版，在BMP7基因的C端及BMP2基因的N端加上柔性肽DNA序列，柔性肽采用(GlyGlyGlyGlySer)₃，设计相应引物，引物设计如下：

BMP7:上游：5'-GGAATTCCATATGTCCACGGGGAGCAAACAGCG-3'

BMP7:下游：

5'-CGATCCTCCTCCTCCCGATCCTCCTCCTCCCGATCCTCCTCCTCCGTGGCAGCCACAGGCCCGGAC-3'

BMP2:上游：

5'-GGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGAGGATCGCAAGCCAAACACAAACAG-3'

BMP2:下游:5'-GGAATTCTTAGCGACACCCACAACCCTC-3'

②利用PCR技术构建基因序列

利用重叠PCR方法将两基因连接形成重组片段，PCR反应分三步进行：首先以BMP7成熟肽基因为模版，加入BMP7上下游引物引物扩增出BMP7基因片段，同时以BMP2成熟肽基因为模版，加入BMP2上下游引物扩增出BMP2基因片段。二者反应体系与反应条件相同，反应体系如下：

反应条件如下：

0.8％琼脂糖检测PCR结果，电泳如图1(lane1、2)所示。进行切胶回收，0.8％琼脂糖检测，条带大小正确。

第二轮PCR以两种第一轮PCR产物为引物，使之互补配对，进行扩增，不加入模板。反应体系如下：

反应条件如下：

第三轮PCR以第二轮PCR的产物为模版，以FB7、RB2为引物进行扩增反应体系如下：

反应条件如下：

0.8％琼脂糖检测PCR结果，电泳如图2(lane1)所示。进行切胶回收，0.8％琼脂糖检测，条带大小正确。

③目的基因克隆至载体

酶切过程：缓冲液10μL，三轮PCR回收产物35μL，NdeI酶2μL，EcoRI酶1μL,37℃酶切2小时，进行酶切产物纯化。

将重组片段以NdeI和EcoRI为位点克隆到pHis-NusA质粒(本实验室保存)上，构建重组表达质粒，连接体系如下：酶切产物12μL，酶切载体5μL，缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL,16℃连接过夜。

④重组质粒的扩增及验证

将连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10(本实验室保存)中。提取质粒进行PCR验证和酶切验证正确后进行测序，测序表明重组序列正确。

⑵重组人骨形态发生蛋白BMP7/BMP2异源二聚蛋白的表达

将重组质粒转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)(本实验室保存)中，涂布于含有氨苄和氯霉素抗性的固体LB培养基中，挑单菌落接种液体LB培养基进行培养。将种子液按照1:50的比例接种扩大培养，37℃培养至OD600值至0.6-0.8，加入0.5mM的IPTG进行诱导，诱导表达5小时后收集菌体，超声破碎。经12％的SDS-PAGE检验，发现表达的蛋白绝大部分以包涵体的形式存在于沉淀之中(图3)。

⑶包涵体的纯化及复性

经过包涵体洗涤之后，得到纯度很高的包涵体。加8M尿素变性液(8M尿素，0.1M磷酸钠，250mM NaCl，10％甘油，10mM DTT，PH＝7.4)之后，室温孵育3小时,离心，将上清装入透析袋，放入含有2M尿素的缓冲液中进行梯度复性，磁力搅拌器进行搅拌，每个梯度3小时,复性梯度为8M-2M-1M-0M，透析液配方如下：

2M：0.1M磷酸钠+250mM NaCl+10％甘油+2M尿素+4mM半胱氨酸+0.5mM胱氨酸PH＝7.4；

1M：0.1M磷酸钠+250mM NaCl+10％甘油+1M尿素+4mM半胱氨酸+0.5mM胱氨酸PH＝7.4；

0M：0.1M磷酸钠+250mM NaCl+10％甘油PH＝7.4。

透析结束后，将蛋白离心，收集上清，经SDS-PAGE检验并测定蛋白浓度，复性后蛋白浓度为0.1mg/mL(图4)

⑷BMP7/BMP2异源二聚体蛋白活性检测

小鼠成纤维细胞MC3T3细胞及小鼠成肌细胞C2C12细胞在BMP家族的作用下会横向分化为骨细胞，利用这两种细胞，采用细胞成骨早期表型碱性磷酸酶(ALP)及后期表型茜素红染色作为指标，测定BMP7/BMP2异源二聚体蛋白的成骨能力。

ALP能水解有机磷酸酯，促进磷酸钙沉淀在胶原纤维丝上，完成细胞外基质矿化过程，形成骨结节。ALP是成骨细胞分化的早期标志物。其测定原理为：ALP催化对硝基苯酚磷酸盐水解成对硝基苯酚与磷酸盐，磷酸盐转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇受体上，游离的对硝基苯酚在碱性条件下分子重排形成黄色醌，在405nm处有最大吸收值，测定其吸光值即能测定细胞的ALP活性。

碱性磷酸酶(ALP)活性的测定：两种细胞都按照如下方法处理：按照4×10³个细胞/孔的密度接种96孔板，待细胞铺展完全后，加入不同浓度的蛋白，设置空白对照组及加BMP7单体对照组，加入蛋白的第一天设为第一天，在第四天测定ALP活性。

测定方法：将细胞用PBS洗涤3次，加入100μL1％的TritonX-100，4℃放置1小时，反复冻融3次，加入50μL反应底物PNPP，37℃孵育1小时，加入50μL1.25M的NaOH结束反应。根据测定，细胞ALP值与蛋白浓度有关，在浓度为20ng/μL的蛋白浓度下，细胞ALP值最高。与对照相比，BMP7/BMP2异源二聚体蛋白具有明显的成骨活性，且高于BMP7单体。

茜素红染色测定细胞成骨能力：

茜素红染色原理：在成骨诱导过程中钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，即形成钙结节。茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，即能直观的反应成骨的程度。

测定方法：两种细胞按照5×10⁴的密度铺6孔板，待细胞贴壁后，加入BMP7/BMP2蛋白，设置空白对照组及BMP7单体对照组，培养21天后进行茜素红染色。将细胞用PBS洗涤1遍，加入2mL/孔的PH＝7.2、浓度为0.5％的茜素红溶液于37℃的温度下染色1小时，PBS洗涤3遍后，观察，较空白对照，实验组有明显的钙结节生成(图5，图6)，说明蛋白具有明显的成骨活性。

Claims (9)

1.一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白，其特征在于：所述蛋白从N端到C端的顺序是BMP7-连接肽-BMP2，所述连接肽是由3个GlyGlyGlyGlySer重复氨基酸序列组成。

2.表达权利要求1所述蛋白的基因工程菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌感受态BL21(DE3)，所述表达载体为pHis-NusA，所述载体的目的序列为BMP7和BMP2成熟肽基因通过编码连接肽的DNA片段连接，获得编码BMP异源二聚体的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：所述表达载体为pHis-NusA的克隆位点为Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ。

4.高效表达生产如权利1所述的异源二聚体蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：

⑴将BMP7和BMP2成熟肽基因通过编码连接肽的DNA片段连接，获得编码BMP异源二聚体的核苷酸序列；

⑵将步骤⑴所获得的DNA序列克隆到表达载体上；

⑶将重组质粒转化至宿主菌，诱导蛋白表达；

⑷离心收集菌体，用裂解液重悬菌体，超声破碎，离心收集沉淀；

⑸进行表达蛋白包涵体的洗涤纯化，并进行复性。

5.根据权利要求4所述的表达生产如权利1所述的异源二聚体蛋白的方法，其特征在于：所述步骤⑵中克隆位点为Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ，表达载体为pHis-NusA。

6.根据权利要求4所述的表达生产如权利1所述的异源二聚体蛋白的方法，其特征在于：所述步骤⑶中宿主为大肠杆菌。

7.根据权利要求4所述的表达生产如权利1所述的异源二聚体蛋白的方法，其特征在于：所述步骤⑸中包涵体洗涤剂为：0.1M磷酸钠，250mM NaCl，4Murea，1％Triton X-100，1mM EDTA，PH＝7.4。

8.根据权利要求4所述的表达生产如权利1所述的异源二聚体蛋白的方法，其特征在于：所述步骤⑸中复性方法采用透析复性，复性过程尿素浓度梯度为8M-2M-1M-0M。

9.权利要求1所述的重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白的复性方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

以编码BMP7和BMP2成熟肽的DNA为模版，通过融合PCR技术，将BMP7和BMP2基因以编码连接肽DNA的片段连接；将所获序列克隆到表达载体pHis-NusA上，构建重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌中，以0.5mM的IPTG为诱导剂，诱导表达蛋白；收集菌体，用裂解液重悬菌体，超声破碎，收集沉淀；用权利要求5中的包涵体洗涤液进行洗涤后，8M尿素变性，将上清转至透析袋，进行尿素浓度梯度复性，尿素浓度梯度为8M-2M-1M-0M,磁力搅拌器搅拌，每个浓度梯度复性3小时；收集上清，得到复性好的BMP异源二聚体蛋白。