CN102776198A - 在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法 - Google Patents

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王飞
许丽红
罗深恒
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Abstract

本发明涉及在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：将人骨形态发生蛋白(BMP)成熟肽基因片段克隆到改进的昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达载体上，共转染sf9昆虫细胞，制备带有BMP成熟肽基因片段的重组杆状病毒，然后侵染High5昆虫细胞，高效表达BMP成熟肽，再经Ni亲和柱纯化表达的BMP成熟肽。体外细胞碱性磷酸酶活性检测和小鼠体内肌袋包埋诱骨实验表明，表达的BMP2和BMP7均具有异位诱导骨生成的活性。利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统，每升培养昆虫细胞可获得纯化BMP2或BMP7成熟肽蛋白约40mg，比在CHO细胞中的成本降低至少10倍。

Description

在昆虫细胞中表达重组人骨形态发生蛋白的方法
技术领域
本发明涉及利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统在昆虫细胞中高效表达具有生物活性的重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7的新技术方法。
背景技术
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是1965年首次发现的一种能诱导常位及异位成骨的蛋白质，具有诱导间充质细胞和骨祖细胞分化为软骨细胞和成骨细胞从而诱导新骨生成的能力。目前已鉴定并克隆出20多种BMP，它们属于转化生长因子β(transforming growthfactor，TGF-β)超基因家族中的成员。BMP2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一。BMP7主要在骨和肾中表达，具有强大的骨诱导活性，能刺激未分化的间充质细胞增殖及其向成骨细胞或软骨细胞方向分化，并促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的分泌。由于骨形态发生蛋白BMP具有高效诱导成骨活性，因而有重要的临床应用价值，包括用于修复骨缺损；用于脊柱融合术；治疗股骨头坏死；修复牙槽骨缺损。
近年来基因重组的人骨形态发生蛋白BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7用于脊柱融合和骨缺损修复。但由于利用动物细胞制备的重组人骨形态发生蛋白表达量低，制备成本高，致使治疗成本高达6000-10000美元，从而大大限制了BMP在临床上的应用。
昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统由于其操作安全，表达量高，成本低，表达蛋白质经糖基化修饰易于折叠和产生高活性的特点，已被广泛应用于生产药用蛋白质。利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统高效表达生产重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7成熟肽，能够大大降低其制备成本。
发明内容
本发明的目的是利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统，高效、低成本地表达具有诱导成骨活性的重组人骨形态发生蛋白，特别是BMP2、BMP7成熟肽，使其在临床上得到广泛应用成为可能。
本发明提供一种利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统表达制备人骨形态发生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段克隆到昆虫细胞-杆状病毒表达载体上，共转染第一昆虫细胞，培养该细胞，制备带有人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段的重组杆状病毒；
(2)用步骤(1)制备的重组杆状病毒感染第二昆虫细胞，培养该细胞，获得表达的人骨形态发生蛋白；
(3)经亲和层析纯化步骤(2)获得的表达的人骨形态发生蛋白。
在一个实施方案中，所述骨形态发生蛋白为BMP2或BMP7。在另一个实施方案中，所述第一昆虫细胞为sf9昆虫细胞，所述第二昆虫细胞为High5昆虫细胞。
在一个优选实施方案中，上述方法的步骤(3)中进行的亲和层析在Ni-亲和柱上进行。在更优选的实施方案中，所述Ni-亲和柱纯化变性状态的BMP2或BMP7，并在纯化柱上直接复性BMP2或BMP7成熟肽。在更优选的实施方案中，上述步骤(3)还包括脱盐，例如经PD10柱脱盐。
附图说明
图1显示人BMP2、BMP7成熟肽的氨基酸序列与相应的核酸序列。所述序列也记载在序列表中。BMP2含114个氨基酸，BMP7含139个氨基酸。
图2是重组杆状病毒样品经PCR扩增后的凝胶电泳图，证实了制备的重组杆状病毒DNA包含编码BMP2或BMP7成熟肽的DNA片段。M，DNA Marker；1，阴性对照；2，BMP2阳性对照；3，含BMP2的病毒；4，BMP7阳性对照；5，含BMP7的病毒。
图3显示BMP2或BMP7成熟肽在昆虫细胞High5中的表达。M，蛋白Marker；d1，第1天；d2，第2天；d3，第3天。
图4显示BMP2或BMP7成熟肽的纯化。M，蛋白Marker；T，昆虫细胞总裂解物；P，纯化蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明。下述实施例是说明性的，而不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
在昆虫细胞中高效表达重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7成熟肽的方法步骤如下：
(1)重组杆状病毒的制备与鉴定
分别在人BMP2、BMP7成熟肽(图1)N-端加入6xHis标签，并将其基因片段以BamHI和EcoRI位点克隆到改进的昆虫-杆状病毒表达载体上，然后共转染sf9昆虫细胞，28℃培养5天后，收集转染上清培养液，用蛋白酶K裂解杆状病毒，以病毒基因组DNA为模板进行PCR，扩增出分别编码BMP2和BMP7成熟肽的DNA片段(图2)，表明已成功制备了带有BMP2或BMP7成熟肽基因片段的重组杆状病毒。
(2)重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7在昆虫细胞中的表达与纯化
将制备和鉴定的重组病毒上清液大量感染sf9昆虫细胞，28℃培养5天后，收集重组病毒上清液，再大量感染High5昆虫细胞，28℃培养2-3天后，2000rpm离心10min收集细胞，溶于裂解液(100mMNaH2PO4，8M尿素，pH8.0)。12000rpm离心20min后，上清液过Ni-亲和柱，用缓冲液(100mM NaH2PO4，8M尿素，20mM咪唑，pH8.0)清洗后，用洗脱液(100mM NaH2PO4，250mM咪唑，pH8.0)洗脱蛋白，蛋白洗脱液再经PD10柱脱盐。图3表明重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7在High5昆虫细胞28℃培养2天后便得到高效表达。昆虫细胞High5表达的BMP2成熟肽经纯化和复性后，以单体和二聚体形式存在。纯化和复性的BMP7主要是单体(图4)。经骨形态发生蛋白BMP含量测定，每1升培养的昆虫细胞可得纯化到BMP2或BMP7成熟肽蛋白约40mg。
(3)昆虫细胞表达的重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7的生物学活性检测
小鼠成纤维细胞MC3T3经以上制备的BMP处理后，细胞内的碱性磷酸酶活性显著升高，表明昆虫细胞表达的重组人骨形态发生蛋白BMP可促进MC3T3细胞继续成骨分化。将纯化的重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7各取10μg，分别与明胶海绵(0.5cm×1cm)复合后，包埋入小鼠肌肉内。14天后取材，甲醛固定，石蜡包埋，组织切片用甲苯胺蓝染色。结果显示，14天后肌肉组织中有明显的软骨细胞，表明昆虫细胞表达的重组人骨形态发生蛋白BMP2、BMP7均具有异位诱骨活性。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统成功地在昆虫细胞High5中高效表达和制备了重组人骨形态发生蛋白BMP2和BMP7成熟肽。体外细胞活性检测表明，昆虫细胞表达的重组人骨形态发生蛋白BMP2和BMP7均能显著提高小鼠成纤维细胞内的碱性磷酸酶活性。小鼠体内的肌袋包埋诱骨实验显示，昆虫细胞表达的BMP2和BMP7诱导肌肉组织中形成明显的软骨细胞，表明其具有异位诱导骨生成的活性。
(2)由于昆虫细胞培养基无需血清，培养温度为28℃且无需CO2，昆虫细胞High5生长速度快(12小时生长一代，而动物细胞一般为24小时)，大大降低了重组人骨形态发生蛋白BMP的生产成本。利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，每升培养昆虫细胞可得纯化BMP2、BMP7成熟肽蛋白各约40mg。按我们在昆虫细胞中制备BMP的费用计算，要比在CHO细胞中的成本降低至少10倍，从而使重组人骨形态发生蛋白BMP在临床上的广泛应用成为可能。
BMP本身具有高度诱导骨生成的能力，与种植体复合可提高其生物结合能力和诱骨活性，如将钛心多孔羟磷灰石涂层种植体与BMP复合，将制成的复合种植体植入动物体内，能较大程度地提高新骨的形成速度和成骨量，缩短种植体的骨整合时间。
Figure ISA00000493067100011

Claims (7)

1.一种利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统表达制备人骨形态发生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段克隆到昆虫细胞-杆状病毒表达载体上，共转染第一昆虫细胞，培养该细胞，制备带有人骨形态发生蛋白成熟肽基因片段的重组杆状病毒；
(2)用步骤(1)制备的重组杆状病毒感染第二昆虫细胞，培养该细胞，获得表达的人骨形态发生蛋白；
(3)经亲和层析纯化步骤(2)获得的表达的人骨形态发生蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白为BMP2或BMP7。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一昆虫细胞为sf9昆虫细胞。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第二昆虫细胞为High5昆虫细胞。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述亲和层析在Ni-亲和柱上进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Ni-亲和柱纯化变性状态的人骨形态发生蛋白，并在纯化柱上直接复性人骨形态发生蛋白成熟肽。
7.一种利用昆虫细胞-杆状病毒蛋白质表达系统表达制备人骨形态发生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别在人BMP2、BMP7成熟肽基因N-端加入6xHis标签，并将该基因片段克隆到改进的昆虫-杆状病毒表达载体上，然后共转染sf9昆虫细胞，培养后收集转染上清培养液，用蛋白酶K裂解杆状病毒，以病毒基因组DNA为模板进行PCR鉴定，制备出带有BMP2或BMP7成熟肽基因片段的重组杆状病毒；
(2)将步骤(1)制备的重组病毒上清液大量感染sf9昆虫细胞，培养后收集重组病毒上清液，再大量感染High5昆虫细胞，培养后离心收集细胞，溶于裂解液中；
(3)离心步骤(2)获得的裂解液，上清液过Ni-亲和柱，用缓冲液清洗后，用洗脱液洗脱蛋白，蛋白洗脱液再经PD10柱脱盐，得到纯化的BMP2或BMP7。
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