CN101302516A - 经修饰的猪α-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种经修饰的猪α－干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法。经修饰后的猪α－干扰素基因序列表如SEQ IDNO：1所示，本发明同时公开了其蛋白的制备方法，具体涉及猪α－干扰素密码子的改造、基因的克隆及在毕赤酵母中高效表达等步骤，尤其是关于猪α－干扰素密码子对酵母密码子偏嗜性的匹配、改造、高效生产猪α－干扰素的培养方法、避免污染的措施、确定加甲醇的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验、蛋白含量以及活性测定、扩大培养条件等操作方法的改进。本发明方法简单易行，成本较低，实现了猪α－干扰素在毕赤酵母中得到稳定高效的表达，使干扰素的抗病毒活性提高了300倍。

Description

经修饰的猪α-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种猪α-干扰素基因的修饰、表达载体的构建、在毕赤酵母中的高效表达及其蛋白的制备方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒及抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分。大量体外和体内试验表明，猪干扰素对生产中具重大威胁的病毒传染病均具有防御和抑制作用。干扰素以其作用广泛，残留小等特点，有较广阔的应用前景。但是由于干扰素成本价格高和动物经济价值的问题，在兽医临床的应用还主要局限于宠物疾病的治疗，在产业动物的治疗主要局限在试验阶段，而且主要辅助治疗病毒病和寄生虫病。

目前，利用酵母和大肠杆菌表达干扰素的工作取得了一些成果，例如专利申请号200310109820.6公开了一种含大肠杆菌偏嗜密码子的猪α-干扰素。

虽然利用酵母表达干扰素的工作取得了一些成果，但是对于如何修饰干扰素基因，致使其与酵母的偏嗜性匹配，以提高干扰素的表达量；表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以及活性的测定等均有较大的差异，没有形成一个稳定的、完整的技术方案，不利于发展猪α-干扰素的工业化生产，不能从根本上解决猪α-干扰素的成本问题，影响其推广应用。为了提高猪α-干扰素在毕赤酵母中的表达水平，降低生产成本，形成工业化生产条件，有必要对猪α-干扰素基因进行修饰、确定修饰位点、修饰数量，有必要对其诱导表达的关键条件进行改进和优化设置。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种经修饰的可与毕赤酵母匹配的猪α-干扰素基因、建立一种可在毕赤酵母中稳定、高效表达猪α-干扰素的技术方法，为企业化生产猪α-干扰素，提高生产效率、降低生产成本奠定技术基础。

鉴于密码子的兼并性和酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，本发明对猪α-干扰素基因的6个关健密码子进行了修饰，使其能满足酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，但并没有改变干扰素蛋白的氨基酸和氨基酸的排列顺序，从而大大地提高了该基因在毕赤酵母中的表达水平。本发明对猪α-对干扰素的表达条件进行了优化，其中包括溶氧量的控制，减少污染的措施，甲醇的添加时间和添加量，诱导表达的温度和收获蛋白的时间，蛋白含量的测定方法，蛋白活性的测定扩大培养条件等。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供一种经修饰的猪α-干扰素基因，其序列表如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述经修饰的猪α-干扰素基因，是对猪α-干扰素基因的6个关健密码子进行了修饰，所述6个关健密码子为Leu的密码子TTG，Glu的密码子GAA，Gln的密码子CAA，Ser的密码子TCC，Ala的密码子GCT和精氨酸的密码子AGA。

本发明同时提供了所述经修饰的猪α-干扰素表达载体的构建，使用了分泌型的表达载体PpICZαC，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOX1启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽和如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala氨基酸序列组成，lys-ArgC端由膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。

本发明还提供了所述经修饰的猪α-干扰素蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据猪α-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成猪α-干扰素基因；

(2)将猪α-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZαC中，用Zeocin+YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验；

(3)收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；

(4)测定蛋白的含量及活性。

步骤(1)所述引物的上游引物P1在其3’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，下游引物P2在其5’端加入了Xba I限制性内切酶位点和终止密码子TGA；所述EcoR I酶切位点GAATTC后补加一个碱基C。

引物序列如下：

上游引物P1：5′-GCG AAT TCC TGT GAC CTG TCT C-3′

下游引物P2：5′-CCC TCT AGA TCA CTC CTT CTT CC-3′

步骤(2)包括以下步骤：

(a)用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28～30℃，200转/min振荡过夜，至OD600＝2～6，细胞处于对数生长期；

(b)将(a)3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5ml的BMMY中，控制溶氧量和防止污染，在15ml的试管中继续振荡培养；

(c)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，加入量为每毫升加20微升，进行诱导培养。

步骤(b)所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY、采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5～20％。

步骤(2)所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，包括直接涂片镜检或用复红染色镜检。

步骤(3)所述收获蛋白为培养96～120h后室温下1500～3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于-70℃保存；步骤(3)所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。

本发明对溶氧量的控制和减少污染的措施，是在实验表达过程中，不断摸索在保证酵母不受污染的情况下如何能更好地保持酵母的通气的前提下，通过采用四层干净纱布外加两层报纸包裹摇瓶口或试管口，既保证了通气性又保证了酵母不受污染。在摇床使用过程中还需经常进行酒精喷雾消毒以尽可能保证外界环境的无菌。同时，培养基的体积只能占培养器皿的5～20％，最高不能超过20％。

本发明对无菌检验的方法的改进包括：蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，乳白色是酵母菌正常的颜色；在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，可以直接涂片镜检，也可以用复红染色镜检。在显微镜下，没有染色的酵母菌是白色圆型的菌体，染色的酵母菌是红色圆型的菌体，没有其它形态的菌体出现，这说明培养的酵母菌没有污染。收获过程中闻酵母发酵的味道，甜的是没有污染的，如果出现很臭的味道，并且菌液颜色是暗黑的，则说明在培养过程中污染了大肠杆菌；用SDS-PAGE进行检测，干扰素蛋白只有1条20KD左右的条带，如果污染了除了目的条带之外还会出现很多其它的蛋白条带。

本发明对甲醇的添加时间和添加量的控制是，每间隔24h加一次甲醇，加100％甲醇至终浓度为1％，即每毫升加20μl。

本发明对诱导表达的温度和收获蛋白的时间的改进，为28～30℃震荡培养96～120h就可以收获蛋白，蛋白收获的方法是室温下1500～3000转/min离心5min收集上清，弃菌体。这样减少了培养时间相应的减少生产成本；本发明对蛋白含量的测定方法为，采用分光光度计根据吸光值计算，计算公式为：

蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.55×A280nm-0.76×A260nm)×稀释倍数。

本发明对蛋白活性的测定采用细胞病变抑制法测定，参照现有技术进行。

本发明对扩大培养条件进行改进，挑选合适的培养容器，按照1∶50～1∶100的比例稀释，相应扩大甲醇的添加量，提高震荡培养的速度。具体的改进如下：

在扩大培养表达的过程中按照1∶50～1∶100的比例进行诱导表达，即挑5～6个菌落在55～65ml BMGY中激活，30℃200转/min震荡培养16～18h，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，少量的甘油不会影响蛋白的表达，并且减少一次离心，减少污染的几率。为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，稀释之后甲醇的添加量仍然按照小量诱导表达的添加量，即每间隔24h加一次甲醇，加100％甲醇至终浓度为0.5～1％，即每毫升加10～20μl；诱导过程中容器的选择，不能使用容量过大的三角瓶，如果超过2L则加大操作的难度以及增加污染的几率，因此，扩大培养使用1L的三角瓶，培养体积为500ml左右，30℃300转/min震荡培养96～120h收获蛋白。虽然菌体培养基体积为容器总容积的50％，但是因为接种的比例为1∶50～1∶100，所以仍然能够满足表达需要的溶氧量，收获的蛋白活性可以达到10⁶U/ml。

本发明的有益效果是：

(1)本发明解决了控制污染和添加甲醇的时间以及添加甲醇的量等关键技术，从而使猪α-干扰素在毕赤酵母中得到稳定高效的表达，干扰素的抗病毒活性提高了300倍。

(2)本发明方法简单易行，成本较低。

附图说明

图1本发明实施中猪α-干扰素基因毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果

图2本发明实施中猪α-干扰素基因毕赤酵母表达的Western-bloting分析结果

图3本发明实施中猪α-干扰素基因密码子改造前后毕赤酵母表达产物的薄层扫描结果

图4本发明实施中猪α-干扰素基因密码子改造前后的表达产物的SDS-PAGE分析结果

图5本发明实施中猪α-干扰素基因密码子改造前后的表达产物的Western-blotting分析结果

图6本发明中薄层扫描仪对猪α-干扰素基因密码子改造前后的干扰素蛋白区带进行扫描的结果

具体实施方式

下面结合附图和具体实施来进一步详细说明本发明。

实施例1

(1)根据猪α-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成猪α-干扰素基因；

本发明根据公开的从猪新鲜肝脏中获得的猪α-干扰素的核苷酸序列(谢海燕，2003)，序列表如SEQ ID NO：3所示，设计合成一对引物，上游引物在其3′端加入了EcoRI限制性内切酶位点，命名为P1；下游引物5′端加入了Xba I限制性内切酶位点和终止密码子TGA，命名为P2。上、下游引物的理论跨幅为501bp，包含终止密码子TGA的猪α-IFN基因完整开放阅读框架(ORF)。猪α-干扰素基因克隆、测序正确后，再对至关重要的6种氨基酸密码子进行改造，改造的位点主要是：Leu的密码子是TTG，Glu的密码子是GAA，Gln的密码子是CAA，Ser的密码子TCC，Ala的密码子是GCT，精氨酸(Arg)的密码子AGA，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

获得的一组新的与毕赤酵母密码子匹配的猪α-干扰素基因，序列表如SEQ ID NO：1所示。修饰后的基因并没有改变氨基酸的数量、氨基酸的顺序，氨基酸总数仍为501，MW＝19400，Max ORF：1～498，501 AA，MW＝19400。

载体pPICZ αC在多克隆位点处有一个特殊性，在1205位碱基G，

1206位碱基C与紧接其后的Cla I酶切位点第一个碱基A组成Ala氨基酸，依次类推，EcoR I酶切位点GAATTC将余下TC与接下来的目的片断第一个碱基组合，这样，就造成目的片断被错读，表达载体的物理图谱，参考Invitrogen的毕赤酵母操作手册(www.invitrogen.com)。所以，在引物设计时必须在EcoR I酶切位点GAATTC后补加一个碱基C，以保证目的片断的完整ORF。本发明实施中表达载体的多克隆位点示意图参考Invitrogen的毕赤酵母操作手册(www.invitrogen.com)中给出的。

(2)将猪α-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZαC中，用Zeocin+YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验；

具体步骤如下：

(a)用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，28～30℃，200转/min振荡过夜，至OD600＝2～6，此时细胞处于对数生长期。

(b)3000转/min室温离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5ml的BMMY中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在15ml的试管中振荡培养。

(c)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养。(3)收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；

(c)步骤培养96～120h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE分析或置于-70℃保存。

图1所示是本发明实施例猪α-干扰素基因毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果，其中M为预染Marker，1为pPICZαC-IFN转化的重组酵母，2为pPICZαC转化的酵母，3为空白菌株X33。

(4)测定蛋白的含量及活性。

(1)制胶与跑胶：参照《蛋白质技术手册》(汪家政等，2000)进行。配制12％分离胶，10.01毫升：

30％丙烯酰胺贮存液     4.0mL

4×分离胶缓冲液        2.5mL

10％过硫酸铵           100μL

TEMED                  10μL

双蒸水                 3.4mL

在安装好的玻璃平板中，缓缓加入分离胶溶液至距离玻璃板顶端约1.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1.0cm的水层，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用，约30min凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水冲洗凝胶上部几次后用滤纸尽可能吸干凝胶顶端的水。

灌制4％浓缩胶，4.008ml：

30％丙烯酰胺贮存液     0.54mL

4×浓缩胶缓冲液        1.0mL

10％过硫酸铵           80μL

TEMED                  8μL

双蒸水                 2.38mL

缓缓加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，快速插入梳子，避免产生气泡，约30min浓缩胶聚合后，小心拔出梳子。加入适量Tris-甘氨酸电泳缓冲液，上样前用电泳缓冲液冲洗梳子孔。组装好电泳设备，将蛋白样品与2×样品缓冲液(10μL+10μL)在一个Eppendorf管中混合，用移液器小心加入样品孔中。接通电源，恒压电泳：堆积胶阶段120V，分离胶阶段150V，直至染料前沿迁移至凝胶底部。(2)染色与脱色：

电泳完毕后，小心剥离电泳胶，用至少5倍凝胶体积的考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色摇床上缓慢振摇1h，取出凝胶在水中漂洗数次，再用考马斯亮蓝脱色液中脱色1h，为了脱色完全，其间需更换脱色液2～3次。蛋白条带清晰后，观察结果。如果在相应分子量处只有1条蛋白条带，说明干扰素蛋白得到表达，并且没有污染；如果在目的条带以外还有其它蛋白条带，说明干扰素蛋白污染了，那么这些蛋白就不能使用了，使用的话也没有效果，只会增加对畜体的刺激。

图2所示是本发明实施例猪α-对干扰素基因毕赤酵母表达产物的Western-bloting分析结果，其中M为预染Marker，1为pPICZαC-IFN转化的重组酵母，2为pPICZαC转化的酵母。

(3)蛋白含量的测定

蛋白浓度测定：将待测蛋白溶液适当稀释，用GeneRAYUV-Photometer核酸蛋白质分光光度计上分别测出波长A260nm和A280nm处的值，根据以下公式计算蛋白浓度：

蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.55×A280nm-0.76×A260nm)×稀释倍数，

(4)活性的检测

具体步骤如下：

1、铺板：弃去Vero细胞培养瓶中的培养液，用胰酶消化收集细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，37℃、5％CO₂条件下培养过夜，使细胞贴壁为单层。

2、制备干扰素溶液：取表达上清经青霉素、氯霉素室温处理半小时后，接种于无任何抗生素的LB培养液中，作无菌检验。检验合格后用细胞维持液作连续4倍梯度稀释。

3、加样：取预先培养好的Vero 96孔细胞培养板，将不同稀释度的干扰素样品移入96孔细胞培养板，每孔100μL。每个浓度作6个重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。37℃、5％CO₂条件下培养过夜。

4、制备病毒液：攻毒剂量100μL TCID50，取保存的VSV用细胞维持液稀释至工作浓度。

5、攻毒：弃去Vero96孔细胞培养板培养液，甩干，加入工作浓度的病毒液，每孔100μL。细胞对照孔不加病毒液，37℃、5％CO₂条件下培养约24h至36h。

6、细胞病变判定：待病毒对照孔出现完全细胞病变时，判断结果，并根据细胞的病变程度，按5分级制进行打分，记录不同浓度时的保护性。

细胞病变的保护程度划为5等分：

4：无明显的细胞病变

3：细胞病变在25％左右

2：有约50％的细胞病变

1：细胞病变在75％左右

0：有100％病变

7、结果计算：根据Reed-Muench法计算。50％细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为1个干扰素单位。

(5)扩大培养

(a)用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的5个单菌落，挑于5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200转/min振荡培养16～18h，至OD600＝2～6，此时细胞处于对数生长期。

(b)在无菌条件下，将未经离心的含有菌体的5毫升BMGY液体培养基，直接加入到500ml BMMY中，瓶口用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在1L的三角瓶中300转/min振荡培养。

(c)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养，即500ml BMMY中添加甲醇10ml。

(d)培养至96h收集蛋白，放置于4℃冰箱备用。

将干扰素密码子改造前后的蛋白的SDS-PAGE及Western-blotting分析。图3所示是本发明猪α-干扰素基因密码子改造前后的表达产物的SDS-PAGE分析结果，其中M为非预染Marker，1为改造前的重组质粒pPICZαC-IFN转化的重组酵母菌，2为改造后的重组质粒pPICZαC-IFN转化的重组酵母菌，3为pPICZαC/X33转化的重组酵母。

图4所示是本发明实施例猪α-对干扰素基因密码子改造前后的表达产物的Western-bloting分析结果，M为预染Marker III，1为改造前的重组质粒pPICZ αC-IFN转化的重组酵母菌，2为改造后的重组质粒pPICZαC-IFN转化的重组酵母菌，3为pPICZαC/X33转化的重组酵母。

(6)密码子改造之后的干扰素含量测定

电泳后，用薄层扫描仪对干扰素蛋白区带进行扫描，然后与Bradford蛋白总量测定的方法结合。结果表明，基因修饰后，猪α干扰素融合蛋白的含量为0.3975mg/mL，与没有经过改造的菌株表达量0.08mg/mL比较，干扰素的蛋白含量有了明显的提高。

图5所示是本发明实施例猪α-干扰素基因薄层扫描仪对干扰素蛋白样品进行扫描的结果，其中1，2，3为BSA标准对照，M为非预染蛋白质Marker，4和5为20∶1浓缩的改造后的干扰素样品，6和7为50∶1浓缩的改造前的干扰素样品，8为30∶1浓缩的改造前的干扰素样品，9为10∶1浓缩的改造前的干扰素样品。

图6所示是本发明薄层扫描仪对猪α-对干扰素基因密码子改造前后的干扰素表蛋白区带进行扫描的结果，其中1为Marker，2为对样品泳道4的扫描，3为对样品泳道5的扫描，4为对样品泳道6的扫描，5为对样品泳道7的扫描，6为对样品泳道8的扫描，7为对样品泳道9的扫描。

(7)表达产物的活性检测

诱导上清液经VSV/WISH系统检测，基因修饰后的干扰素抗病毒活性为1.370×10⁹IU/mL，而未经修饰的干扰素的抗病毒活性为4.04×10⁶IU/mL。两者相比，基因修饰后，干扰素的抗病毒活性提高了300倍。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学，广州粤丰动物保健有限公司

<120>经修饰的猪α干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>501

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(498)

<400>1

tgt gac ttg cca caa acc cac tcc ctg gct cac acc aga gcc ttg agg     48

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1               5                   10                  15

ttg ttg gca caa atg aga aga atc tcc ccc ttc tcc tgc ttg gac cac     96

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

            20                  25                  30

aga aga gac ttt gga ttc cca caa gag gct ttg ggg ggc aac caa gtc    144

Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val

        35                  40                  45

caa aag gct caa gct atg gct ttg gtg cat gag atg ttg cag caa acc    192

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr

    50                  55                  60

ttc caa ttg ttc tcc aca gag ggc tcc gct gct gcc tgg gat gag tcc    240

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser

65                  70                  75                  80

ttg ttg cac caa ttc tgc act gga ttg gat caa caa ttg agg gac ctg    288

Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

                85                  90                  95

gaa gct tgt gtc atg caa gag gct ggg ttg gaa ggg acc ccc ttg ttg    336

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

            100                 105                 110

gag gag gac tcc atc ttg gct gtg aga aaa tac ttc cac aga ctc acc    384

Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

        115                 120                 125

ttg tat ttg caa gag aag tcc tac tcc cca tgt gct aga gag atc gtc    432

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Arg Glu Ile Val

    130                 135                 140

aga gct gaa gtc atg aga tcc ttc tcc tcc tcc aga aac ttg caa gac    480

Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp

145                 150                 155                 160

aga ttg aga aag aag gag tga                                        501

Arg Leu Arg Lys Lys Glu

                165

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

            20                  25                  30

Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

            100                 105                 110

Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Arg Glu Ile Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Lys Lys Glu

                165

<210>3

<211>501

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgtgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa     60

atgaggagaa tctccccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg attcccccaa    120

gaggccttgg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg    180

ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg ggatgagagc    240

ctcctgcacc agttctgcac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc    300

atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg    360

aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc    420

cgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga tccttctctt cctccagaaa cctgcaagac    480

agactcagga agaaggagtg a                                              501

Claims (10)

1、一种经修饰的猪α-干扰素基因，其特征在于其序列表如SEQID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、根据权利要求1所述经修饰的猪α-干扰素基因，其特征在于对猪α-干扰素基因的6个关健密码子进行了修饰，所述6个关健密码子为Leu的密码子TTG，Glu的密码子GAA，Gln的密码子CAA，Ser的密码子TCC，Ala的密码子GCT和精氨酸的密码子AGA。

3、一种权利要求1所述经修饰的猪α-干扰素表达载体的构建，其特征在于使用了分泌型的表达载体PpICZ αC，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOX1启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽和如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

4、根据权利要求3所述表达载体的构建，其特征在于所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala氨基酸序列组成，lys-ArgC端由膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。

5、一种权利要求1所述经修饰的猪α-干扰素蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据猪α-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成猪α-干扰素基因；

(2)将猪α-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZαC中，用Zeocin+YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验；

(3)收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；

(4)测定蛋白的含量及活性。

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述引物的上游引物P1在其3’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，下游引物P2在其5’端加入了Xba I限制性内切酶位点和终止密码子TGA；所述EcoR I酶切位点GAATTC后补加一个碱基C。

7、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(2)包括以下步骤：

(a)用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28～30℃，200转/min振荡过夜，至OD600＝2～6，细胞处于对数生长期；

(b)将(a)3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5ml的BMMY中，控制溶氧量和防止污染，在15ml的试管中继续振荡培养；

(c)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，加入量为每毫升加20微升，进行诱导培养。

8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(b)所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY、采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5～20％。

9、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，包括直接涂片镜检或用复红染色镜检。

10、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述收获蛋白为培养96～120h后室温下1500～3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于-70℃保存；步骤(3)所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。

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