CN102899331B - 一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用 - Google Patents
一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用。所述复合鸭α干扰素基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明经优化后的复合鸭α干扰素基因可在毕赤氏酵母基因工程菌中表达生产复合鸭α干扰素，所得到的复合鸭α干扰素纯度高：酵母表达的鸭α干扰素SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸭α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80%以上；抗病毒作用强：该新型基因组表达的蛋白与酵母表达的天然鸭α干扰素相比，有更好的抗病毒活性，其在鸭胚成纤维细胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了40倍。可用于制备治疗禽类病毒性疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及其在生产鸭α干扰素中的应用。
背景技术
干扰素（interferon，IFN）是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是动物机体最重要细胞因子之一，具有广谱、高效的抗病毒功能，对免疫系统起关键调节作用。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。
干扰素的作用具有物种局限性，不同物种的干扰素可能会有一定的交叉作用，如人干扰素在犬类应用也有一定效果，然而研究表明，大多数干扰素不能跨物种使用，干扰素用在本种动物才能发挥较好的抗病毒和免疫调控效果。
九十年代，美国安进公司研究出一种全新的人复合alpha干扰素：Infergen。这种复合干扰素是一种非自然的干扰素，166aa序列的获得是通过对几种天然alpha亚型干扰素序列的扫描，把最常见的氨基酸转移到各个相应的位置。为便于分子构造，还另改变了4个氨基酸。Infergen序列与alpha II型干扰素的同源性为88%，与beta干扰素的同源性为30%，且相似性较任何天然的α干扰素要高。实验证明：Infergen的抗多种病毒的活性较天然的干扰素高5倍，按WHO人源干扰素抗病毒策略为标准得到其抗病毒活性为l×109U/mg。
近年来，鸡干扰素(ChIFN)的研究与应用十分引人注目，尤其是其重组干扰素-α ( rChIFN-α) 在改善和治疗A 类传染病(新城疫和禽流感)，以及传染性法氏囊炎(IBD) 和传染性支气管炎(IB)等病毒性疾病方面效果显著，展示出了禽类干扰素的应用前景。禽类干扰素用于禽类疾病防制，可直接注射，也可通过饮水给药。Marcu等采用饮水给药的方法进行了重组ChIFN-α抗新城疫病毒的研究，雏鸡1日龄起每天给予不同浓度的重组ChIFN-α（10、100、500、1 000、2 000 IU/mL）饮水，在2日龄时进行新城疫病毒La Sota株的攻毒试验（点眼0.5 mL（5～10）×105 EID50/只），研究表明高剂量的重组ChIFN-α可以延迟病症的出现并且显著降低试验鸡的发病程度。在试验中，对照组鸡只在7日龄出现致死性症状及组织学病变，而饮用高剂量（1 000、2 000 IU/mL）重组ChIFN-α的鸡只则在整个试验期间（12 d）精神状态良好，与未攻毒的雏鸡相比，无大体病变及组织学病变出现，500 IU/mL的重组ChIFN-α足以缓和新城疫引起的病理变化。
与鸡相比，鸭干扰素方面的研究相对较少。1995 年,Schultz 等以ChIFN-α基因为探针，从绿头野鸭的基因组中克隆了鸭α-干扰素基因( DuIFN-α)，并在pET28A- E. coli和pcDNAI- COS7 表达系中进行了有效表达。Schult z 等发现重组鸭干扰素-α(rDuIFN -α)能抑制VSV、NDV和A型流感病毒(Flu- A) 的增殖，并建立了鸭病毒性肝炎 (DHBV) -干扰素实验系用于人类病毒性肝炎的模型研究[2]。
2004年，阮小飞[3]等从北京鸭( A nas p latyr hy nchos d oestica L innaeus)基因组中克隆了其干扰素-α基因克隆片段长486 bp，编码161个氨基酸的成熟肽。将该基因插入原核表达载体pQE30，在E.coli JM109工程菌中进行表达，重组蛋白以包涵体形式存在于E.coli.JM109工程菌中，在经过8M尿素变性、透析、复性后成为了具有抗病毒活性的重组鸭干扰素，抗水疱性口炎病毒( VSV) 活性高达7. 9×105IU/ mg。
陈斌[4]等克隆了北京麻鸭生物信息学分析表明，麻鸭α-干扰素的开放性阅读框有576个核苷酸组成，蛋白质相对分子质量为21kD，编码191个氨基酸，其中前28个氨基酸可能是信号肽部分，切割位点在28号氨基酸和29号氨基酸之间，基因序列中无内含子。继而陈斌将麻鸭α-干扰素插入质粒pcDNA3.1，将获得的重组质粒作为免疫调节剂研究对DPV/DVH弱毒苗免疫活性调节作用，结果表明，含有麻鸭α-干扰素基因的重组表达质粒在鸭体内具有表达活性，并在一定时间内能促进和提高免疫和体液免疫应答，发挥着有效的正向免疫调节作用。
以往干扰素的制备方法主要有两种：由诱生剂诱导动物细胞产生、原核表达。由诱生剂诱导产生鸭IFN-α，产生的干扰素产量少、成本高、纯化工艺复杂，因而价格昂贵，极大程度上限制了临床和科研的应用。原核表达系统中其产物主要以无生物活性的包涵体形式存在，若要想获得具有生物活性的重组蛋白必须对包涵体进行变性、复性等繁琐的后续处理工作，而后续处理工作中重组蛋白的损失量大而且对工作人员的技术水平要求也很高，这不利于工业化生产。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种复合鸭α干扰素基因。
本发明的另一个目的在于提供含有复合鸭α干扰素基因的克隆载体。
本发明的另一个目的在于提供含有复合鸭α干扰素基因的表达载体。
本发明的另一个目的在于提供一种鸭α干扰素的生产方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种复合鸭α干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或是SEQ ID NO：1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸和/或末端修饰后具有同等活性的序列。
一种克隆载体，含有上述的复合鸭α干扰素基因。
一种表达载体，含有上述的复合鸭α干扰素基因。其出发载体为酵母表达载体pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。
一种鸭α干扰素的生产方法，包括将上述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到鸭α干扰素。
所述宿主细胞为毕赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168。
由以上方法生产得到的鸭α干扰素。
本发明的有益效果在于：
本发明经优化后的复合鸭α干扰素基因可在毕赤氏酵母基因工程菌中表达生产复合鸭α干扰素。该方法得到的复合鸭α干扰素与天然鸭α干扰素和用大肠杆菌表达的天然鸭α干扰素相比具有下几个优点：
（1）本发明的复合鸭α干扰素表达量大、纯度高：酵母表达的鸭α干扰素SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸭α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80%以上；
（2）抗病毒作用强：该新型基因组表达的蛋白与酵母表达的天然鸭α干扰素相比，有更好的抗病毒活性，其在鸭胚成纤维细胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了40倍；
（3）无毒害物质：酵母不会分泌像大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对鸭体细胞有毒害的毒素。
说明书附图
图1 质粒pPICZα-MDuIFNα质粒图谱；
图2 重组表达载体pPICZα-MDuIFNα的EcoRI和XbaI双酶切鉴定（M. DL5000 marker ；1. pPICZ α-MDuIFNα的EcoRI和XbaI双酶切产物）；
图3 重组毕赤酵母X-33/pPICZ α-MDuIFNα的PCR鉴定（1．DL5000marker；2-5. X-33/pPICZα-MDuIFNα；C.菌株X33作为阴性对照）；
图4 复合鸭α干扰素的诱导表达的SDS-PAGE（M.marker；1. X-33/pPICZα-MDuIFNα诱导表达上清；C. X33培养上清作为阴性对照）；
图5 复合鸭α干扰素和天然鸭α干扰素的诱导表达的SDS-PAGE（M. marker；1.天然鸭α干扰素诱导表达上清；2. X-33/pPICZ-MDuIFN α复合鸭α干扰素诱导表达上清）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1 材料
1.1复合鸭α干扰素基因
根据Genbank中的鸭α干扰素成熟蛋白的编码基因（Genbank登录号：EF053034），对其进行DNA核苷酸序列密码子优化设计，得到复合α鸭干扰素基因序列，如SEQ ID NO:1所示。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.2菌种、细胞和病毒
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris X33）、酵母表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5α株本实验室保存； 水疱性口炎病毒（VSV病毒）由本实验室保存。
1.3试剂
质粒小量提取试剂盒、酵母基因组DNA提取试剂盒、T4连接酶等试剂均购自TaKaRa公司。
2 方法与结果
2.1 含有复合鸭α干扰素基因酵母表达载体pPICZα-MDuIFNα的构建与鉴定
以下步骤所用到的引物见表1。
以人工合成的复合鸭α干扰素DNA为模板，用引物DuIFNA-F和引物DuIFNA-B PCR扩增（引物DuIFNA-F含EcoRI酶切位点；引物DuIFNA-B含XbaI酶切位点）。PCR产物与pPICZαA分别经EcoRI和XbaI双酶切后，T4 DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5α得到重组表达载体pPICZα-MDuIFNα（如图1所示）。重组子DH5α（pPICZα-MDuIFNα）提取质粒后，用EcoRI和XbaI双酶切鉴定。实验结果见图2，重组质粒载体pPICZα-MDuIFNα被切为约3.1kb和约0.5kb的两个片段，与预期相符，这表明目的基因已经成功插入。挑选酶切鉴定正确的质粒进行测序，测序结果与预期相符。
2.2毕赤酵母的转化和筛选
2.2.1 重组质粒pPICZα-MDuIFNα的线性化
20μg质粒pPICZα-MDuIFNα用SacI酶切之后，95℃5min终止反应，加200μL酚200μL氯仿抽提，12000×g离心10min；上清加2.5倍体积的乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠，－20℃放置10min，12000×g离心10min；沉淀用80%乙醇洗涤，12000×g离心5min后，倾去上清，风干后用10μL灭菌去离子水溶解。
2.2.2 常规方法制备毕赤酵母X-33感受态细胞
2.2.3 重组毕赤酵母X-33/pPICZα-MDuIFNα的制备
电转化法将经SacΙ酶线性化后的重组质粒pPICZα-MDuIFNα转化入酵母菌X-33感受态细胞中，然后取250 μL转化物涂在含有100μg/mLZeocin（博来霉素）抗性的YPDS培养基平皿上，置28℃恒温培养2-4天，将在YPDS培养基上生长的含有pPICZα-MDuIFNα的重组酵母菌落进行阳性鉴定。
2.3重组酵母菌株的筛选和菌落PCR鉴定
2.3.1 含有100μg/mLZeocin（博来霉素）抗性的YPD平板上长出的单菌落，用灭菌牙签接分别种至含250，500，和1000μg/mLZeocin的YPD平板，筛选具有较高zeocin抗性的菌株。
2.3.2 重组酵母菌株的菌落PCR鉴定
接种环刮取筛选到的毕赤酵母菌落，置于1.5mL离心管里，加上20 μL TE，振荡，盖上盖子。如果是菌液, 则分别取1.5mL于13000r/min离心15s，彻底倒尽上清液。用含0.1%SDS的TE洗涤一次，13000r/min 离心15s，甩干，悬浮在 20 μL左右残存液体里,盖上盖子，在沸水中煮3min。13000r/min 离心 2min。上清取1μL为模板，以引物5’AOX1和3’AOX1为特异性引物，进行PCR扩增。扩增体系为Premix rTaq DNA Polymerase 12.5μ L，引物（10μM）各1μL，ddH2O 9.5μL，上述模板1μL。PCR反应程序为95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。预期PCR产物长度为1089bp。PCR鉴定结果见图3，与预期结果相符。
2.4 重组酵母的诱导表达
挑取单菌落在10mL YPD培养液中30℃，300rpm培养1-2天后，再接种于100mL的BMGY培养基中，30℃培养至OD600为3，1500×g离心15分钟收集菌体，再用50mL BMMY培养基重悬，继续培养，并每间隔24hr加入终浓度为1％的甲醇，72hr后离心收集培养物上清液，取20μL上清液做SDS-PAGE分析，得到清晰的目的条带，条带大小与预期相符，如图4所示。经薄层扫描显示，重组酵母鸭α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80%以上。与天然鸭α干扰素基因（Genbank登录号：EF053034）在毕赤酵母中的表达相比，由于经过密码子改造，复合鸭α干扰素的表达量明显较大，如图5所示。
2.5复合鸭α-干扰素的效价测定
收集经甲醇诱导表达的酵母培养物用3000×g离心10分钟，取上清液用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，采用细胞病变抑制法在鸭胚成纤维细胞-水疱性口炎病毒系统上测定鸭α-干扰素的抗病毒活性。在96孔板上每孔加入2倍倍比稀释的鸭α-干扰素50μL（用细胞培养液稀释），再加入由10-12日龄鸭胚制备的原代鸭胚成纤维细胞1.8×106-2.2×106个/mL的悬液50μL，在37℃、5％CO2条件下孵育约24小时后，吸去含鸭α-干扰素的细胞培养液，每孔加入100μL含100个TCID50的 VSV病毒稀释液。同时设立病毒对照孔（只加同样剂量的病毒，不加干扰素）和细胞对照孔（只加细胞培养液，不加干扰素）。37℃、5％CO2条件下培养24小时后，待病毒对照孔的细胞病变90％-100％时观察结果。用以上方法分别测定未经过序列优化的天然鸭α-干扰素和经过序列优化复合鸭α-干扰素的表达产物，比较其效价。实验结果表明未经过序列优化的天然鸭α-干扰素效价为1×105U/mL，而经过序列优化复合鸭α-干扰素效价为4×106U/mL，效价差别为40倍。
<110> 广东省农业科学院兽医研究所
<120> 一种复合鸭α干扰素基因、其重组载体及应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaattctgct ctcctttgag attgcatgat tctgcttttg cctgggactc tttgcagttg 60
ttgagaaaca tggctccatc tccaacccaa ccatgtccac aacagcatgc accatgttct 120
ttcccagaca cattgttgga cacaaacgac actcaacagg ctgcacacac cgccttgcac 180
ttgttgcagc atttgttcga caccttgtct tctccttcta ccccagctca ctggttgcat 240
acagcaagac acgatttgtt gaaccaattg caacaccaca tccaccactt ggaaagatgt 300
tttcctgctg atgccgcaag attgcacaga agaggtccaa gaaatttgca cttgtctatt 360
aacaagtact tcggatgcat tcagcacttc ttgcagaacc acacatactc tccatgcgct 420
tgggaccacg ttagattgga ggcccatgcc tgtttccaga gaatccacag attgactaga 480
acaatgagat aatctaga 498
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggaattctg ctctcctttg agattg 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatctagatt atctcattgt tctagtc 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaaatggca ttctgacatc c 21
Claims (5)
1.一种复合鸭α干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种克隆载体，含有权利要求1所示的基因。
3.一种表达载体，含有权利要求1所示的基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，出发载体为酵母表达载体pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。
5.一种鸭α干扰素的生产方法，包括将权利要求3或4所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到鸭α干扰素；所述宿主细胞为毕赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168。
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