CN1844391A - 人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途。一种分离的DNA分子,它编码人骨形态发生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。一种蛋白质:哺乳细胞及大肠杆菌表达人骨形态发生蛋白9重组蛋白质。一种载体:将编码BMP-9核苷酸序列基因段重组于质粒载体,当该质粒载体在哺乳细胞和大肠杆菌扩增时,重组BMP-9得以表达。一种宿主细胞:使重组BMP-9在其表达的哺乳细胞及大肠杆菌宿主细胞。人骨形态发生蛋白9重组蛋白质用于制备刺激成骨细胞分化和新骨形成、促进骨折愈合,治疗骨折、骨缺损疾病的药物。本发明的优点是:1.利用哺乳细胞和大肠杆菌首次成功表达人BMP-9重组蛋白质;2.BMP-9重组蛋白质具有刺激骨形成,促进骨缺损和骨折修复的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途。
背景技术
骨骼是一种高度特异化组织,骨组织的成分包括胶原蛋白,蛋白多糖,非胶原蛋白,酯类。贯穿一生的骨组织的更新与修复由特定的细胞来完成。骨骼的生长通过成骨细胞完成,而骨骼的重塑通过破骨细胞和成骨细胞共同完成。
在病理情况下,应用促进骨骼生长的因子可治疗骨折。这些因子可促进开放性骨折的愈合及改善人工关节的固定,修复先天性、创伤性颅骨缺损,应用于整容手术。此外,还可用于牙周或其他牙齿修复的治疗。
目前对于骨折、颅骨和牙周缺损的治疗方法是进行骨移植或置入人工化合物。自体移植的成功率很高,但其缺点是会造成手术创伤和可应用的的移植骨数量有限。也可应用异体骨。但其具有潜在传播疾病的风险。也可应用陶瓷或金属制品,但它们只是骨附着物,新骨只在其附近或正常骨周围生长。
因此,我们需要一种生理上可接受的生物制剂,它可在预知位点促进骨骼的形成。它可吸引、刺激成骨细胞或促进成骨细胞的前体细胞的分化。现在已发现了多种促进骨形成的生长因子,但获得纯化的骨生长因子的过程和技术仍不明朗,处于开始阶段。
因此,将高度纯化的哺乳细胞的骨生长因子应用在骨科疾病的研究、诊断和治疗过程中,还需要生物化学和生理学方面的深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途。
一种分离的DNA分子,它编码人骨形态发生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。
一种蛋白质:哺乳细胞及大肠杆菌表达人骨形态发生蛋白9重组蛋白质。
一种载体:将编码BMP-9核苷酸序列基因段重组于质粒载体,当该质粒载体在哺乳细胞和大肠杆菌扩增时,重组BMP-9得以表达。
一种宿主细胞:使重组BMP-9在其表达的哺乳细胞及大肠杆菌宿主细胞。
一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的生产方法,其特征在于:方法的步骤如下:
人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的生产方法的步骤如下:
在哺乳细胞:
1)利用RNA逆转录-多聚核苷酸链反应,合成人BMP-9的cDNA,RNA提取自人成骨细胞株U2-OS细胞,并逆转录成cDNA;
2)将cDNA克隆至pcDNA3载体,这一BMP-9/pcDNA3表达质粒适合BMP-9蛋白在哺乳细胞的表达;
3)利用DNA稳定转染的方法,将人BMP-9 cDNA转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞;
4)通过新霉素筛选和细胞克隆,获得稳定表达人BMP-9的单克隆细胞株,用Northern印渍的方法,测出人BMP-9在CHO细胞的表达;
5)收集培养CHO/BMP-9细胞的条件培养液,将此培养液加入到成骨细胞中测定BMP-9活性。
在大肠杆菌:
1)将人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG载体,然后转导至DH5α大肠杆菌中;
2)含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳和离子交换层析方法纯化,然后经过透析及复性处理冷冻干燥后,制成纯化的,有活性的人BMP-9重组蛋白质。
人骨形态发生蛋白9重组蛋白质用于制备刺激成骨细胞分化和新骨形成、促进骨折愈合,治疗骨折、骨缺损疾病的药物。
本发明的优点是:
1.利用哺乳细胞和大肠杆菌首次成功表达人BMP-9重组蛋白质;
2.人重组BMP-9蛋白质经复性处理后,具有完整性的生物活性;
3.BMP-9重组蛋白质具有刺激成骨细胞分化和骨形成的功能;
4.BMP-9重组蛋白质具有促进骨缺损和骨折修复的用途。
附图说明
图1是BMP-9cDNA核苷酸序列及BMP-9蛋白质氨基酸序列;
图2是BMP-9刺激成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性示意图;
图3是BMP-9刺激碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)和骨特异性转录调控因子Runx2 mRNA的表达示意图;
图4是BMP-9刺激成骨细胞骨小结的形成示意图;
图5是BMP-9刺激小鼠颅骨表面新骨形成示意图;
图6是BMP-9诱导小鼠异位骨形成示意图,左、中(a、b)图为X一光摄相,右(c)图为组织切片示意图;
图7a是BMP-9诱导大鼠颅骨骨缺损的下X-光摄相示意图;
图7b是BMP-9诱导大鼠颅骨缺损的组织切片示意图;
图8是BMP-9促成骨痂形成和骨折修复示意图。
具体实施方式
人骨形态发生蛋白-9(BMP-9)的cDNA序列和蛋白质氨基酸序列见图1。人BMP-9的cDNA含有1,942个核苷酸。5′端非编码序列有163个核苷酸,3′端非编码序列有489个核苷酸。人BMP-9含有429个氨基酸残基。
通过SDS-PAGE法测得的人BMP-9蛋白质的分子量约28,000-32,000道尔顿(28-32kDa),在SDS-PAGE还原状态中,该蛋白质的分子量约为14,000-22,000道尔顿(14-22kDa)。在本项发明中,我们首先利用RNA逆转录-多聚核苷酸链反应(RT-PCR)的技术,合成了人BMP-9的cDNA,RNA提取自人成骨细胞株U2-OS细胞,并逆转录成cDNA,然后将cDNA克隆至pcDNA3载体,这一BMP-9/pcDNA3表达质粒(Expression plasmid)适合BMP-9蛋白在哺乳细胞的表达。利用DNA稳定转染(Stable transfection)的方法,我们将人BMP-9 cDNA转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。通过新霉素筛选和细胞克隆,获得了稳定表达人BMP-9的单克隆细胞株。用Northern印渍(Northern blot)的方法,测出人BMP-9在CHO细胞的表达。然后我们收集了培养CHO/BMP-9细胞的条件培养液。将此培养液加入到原代大鼠成骨细胞中,我们发现该培养液可刺激大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性,骨钙素(Osteocalcin,OC)和骨特异性转录调控因子Runx2基因的表达和促进体外骨小结(Bone nodule)的形成。这些结果证实BMP-9具有刺激成骨细胞分化作用。
我们然后将人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG载体,然后转导(transform)至DH5α大肠杆菌中。含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳(Gel filtration)和离子交换层析(Ion Exchange)方法纯化后,经过透析及复性处理冷冻干燥后,制成纯化的,有活性的人BMP-9重组蛋白质。经离体与在体实验测定后,证明此重组蛋白质具有成骨功能活性。
BMP-9重组蛋白质的主要功能
1)骨折修复。人BMP-9可用于促进各类临床骨折的愈合。对于难愈合性骨折(Non-unionfracture),目前临床上尚无有有效的治疗方法,应用BMP-9,可有效地促进难愈合性骨折的愈合。重组BMP-9可注射于骨折部位或与I型胶原或聚丙烯等载体制成复合的生物材料敷于骨折部位,促进骨折的愈合。
2)骨缺损的修复。由骨肿瘤手术后或创伤后造成的大块骨缺损(Segmental bonedefect),在临床上,目前只有用骨移植的方法进行治疗,且疗效往往不成功。用人BMP-9与其载体制成的复合物填充于骨缺损部位,可诱导成骨细胞的增殖与分化,保进新骨的形成。颅骨或颌面骨的缺损也可用人BMP-9治疗。
3)用于脊柱融合。脊柱融合(Spinal fusion)是骨科常见手术,将BMP-9用于手术部位,可促进脊柱融合,加快手术后的愈合过程,大大缩短病人的住院时间和愈合时间。
4)牙周骨修复和根管疗法。中年以上的病人,尤其妇女,伴随全身骨组织的丢失,牙周骨也有不同程度的缺损,严重时,可致牙齿脱落。人BMP-9可与载体制成复合物,种植于牙周骨组织内,促进新骨形成。此一治疗可用于种植牙(Tooth implant)手术前。
5)用于伴有骨丢失的代谢性骨病。许多代谢性骨病伴有严重的骨丢失,其中最常见和最严重的是骨质疏松症(Osteoporosis)。骨质疏松症多发于绝经后妇女,其机体骨吸收大于骨形成而造成骨重塑(Bone remodeling)的负平衡。目前临床上常用的治疗骨质疏松病的药物为双磷酸盐类药物(Bisphosphonates),该药物可有效地抑制骨吸收,防止骨组织的进一步丢失。目前临床上尚无有效药物促进骨形成,使骨质疏松症病人的丢失的骨重新建立。动物实验发现BMP-9可逆转卵巢去除后造成的骨丢失,具有良好的治疗骨质疏松症的前景。BMP-9还可用于其它原因造成的全身性骨丢失,如肿瘤转移造成的骨丢失。
6)用于治疗软骨疾病。人BMP-9还有促进软骨细胞(Chondrocyte)的成熟和分化的功能。BMP-9可促进软骨细胞转化为肥大软骨细胞(Hypertrophic chondrocyte),促进软骨细胞特异性基因,如X型胶原(Type X collagen),MMP-9,骨桥蛋白(Osteopontin)等的表达。人BMP-9可用于治疗各类软骨发育不良综合症(Chondrodysplasia)。
7)用于糖尿病的治疗。近年来的动物实验,还发现BMP-9可升高血液中胰岛素(Insulin)的水平和降低血糖水平,纠正动物实验性糖尿病。因此,人BMP-9重组蛋白质还具有治疗糖尿病的临床用途。
实施例1、人骨形态发生蛋白-9的核苷酸和氨基酸序列。
克隆和表达的人骨形态发生蛋白-9(BMP-9)cDNA的核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列(图1)。
实施例2、用哺乳细胞表达人BMP-9。
为在哺乳细胞表达人BMP-9蛋白,将编码的全长人BMP-9 cDNA克隆至哺乳细胞表达载体pcDNA3中。转染方法为用lipofectamine plus试剂的方法。转染细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。由于pcDNA3质粒含有抗新霉素(Neomycin)的基因,在pcDNA3/BMP-9表达载体稳定转染至CHO细胞后,新霉素被加入到培养液中,表达BMP-9的细胞株具有抗新霉素的特性,其他细胞则被新霉素杀死。然后克隆此稳定转染的细胞。克隆细胞的方法为有限稀释(Limitingdilution)的方法。耐新霉素的细胞被稀释成1个细胞/200微升培养液并加入到96孔培养皿中(每孔200微升)。2-3周后,此单克隆细胞株长成细胞群。然后经蛋白酶(Trypsin)消化后,转至24孔板培养皿,后经6孔板培养皿及培养瓶(Flask)培养后,将该细胞株液氮保存。
活性测定:
收集不含血清的或含低浓度血清(1%)的表达人BMP-9的细胞株的条件培养液,经对倍稀释后,与成骨细胞培养24小时,检测此条件培养液对成骨细胞(Osteoblast)碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的刺激活性。此细胞株为小鼠C2C12细胞,实验证明CHO细胞表达的人BMP-9具有刺激成骨细胞碱性磷酸酶的活性,其活性在3-12倍之间,并呈计量依赖(Dose-dependent)的方式。该条件培养液对成骨细胞特异性基因表达的刺激作用由瞬时PCR(Real-time PCR)的方法测定。该条件培养液与成骨细胞培养后,成骨细胞的I型胶原(TypeI collagen),骨桥蛋白(Osteopontin)RNA的表达均显著增加。将此条件培养液与成骨细胞培养10天后,用福尔马林固定,经von Kossa染色后,表明此条件培养液对成骨细胞骨小结(Bone nodule)的形成有刺激作用。这些实验结果表明,用CHO细胞表达的人BMP-9的重组蛋白质具有刺激成骨细胞分化的活性。
实施例3、用大肠杆菌表达人BMP-9。
用PCR的方法扩增人BMP-9成熟片断的cDNA。
人BMP-9基因库存储号为AF188285,上游引物核苷酸序列为:caccatgagcgccggggctggcag和下游引物核苷酸序列为:ctacctgcacccacactctg。PCR试剂包括1微升上游引物(10nM),1微升下游引物(10nM),1微升cDNA模板和17微升PlatenumPCR Supermix。PCR条件为:95℃/5分钟;95℃/30秒,56℃/30秒,72℃/40秒,35个循环(cycles),72℃/2分钟。PCR产物(300-bp)经2%的琼脂胶分离后,由Qiagen DNA纯化试剂盒纯化,然后由20微升TE缓冲液再溶解。
克隆BMP-9 PCR产物至表达载体
为引入与表达载体一致的适当的酶切位点(Restriction site)我们先将BMP-9的PCR产物克隆至pGEM T-Easy载体(Promega)。DNA连结反应的条件如下:10微升PCR产物,1微升PGER T-Easy载体,1.5微升T4 DNA连结酶缓冲液,1微升T4 DNA连结酶,加水至15微升。DNA连结反应为16℃,过夜。连结反应后,DNA经热休克的方法转导(Transform)至DH5α菌株。接种DH5α菌株的至接种板(Plate)含有IPTG和X-gal。经37℃过夜培养后,选出白色菌落(Colony),并接种于2ml含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB培养液中过夜培养。用Qiagen DNA纯化试剂盒纯化BMP-9/pGEM T-Easy质粒(Plasmid),纯化的质粒经EcoRI消化(37℃,1h)后,经2%的琼脂胶分离和纯化出300-bp的BMP-9 DNA片断。此一DNA片断的5’和3’端含有EcoR I的酶切位点。pGEM-GST-KG载体为BMP-9的表达载体,此一载体经EcoR I消化后,做脱磷酸处理,处理过的载体经纯化后与纯化的BMP-9 cDNA片断做连结反应(Ligation),反应条件如前叙。连结反应的产物导入(Transform)DH5α菌株,选择单克隆菌落(Colony)并培养于含氨苄青霉素的LB培养液。DNA纯化后,BMP-9在pGEM-GST-KG载体中的方向(Orientation)和核苷酸序列由DNA测序鉴定。
纯化BMP9-GST融合蛋白
1)将表达BMP-9的DH5α菌株在5ml的LB培养液中过夜培养(37℃),然后将此5ml的饱和菌液加入至50毫升LB培养液中在室温下培养至OD600值在0.6-0.7,然后加入IPTG(0.1mM)诱导BMP-9表达,IPTG诱导培养的条件为30℃,3小时。培养结束时的OD600值应为1.2-1.3。然后将培养细胞离心6,000xg,10分钟。
2)将细胞在-80℃低温冰箱中冷冻1小时,然后化解细胞并加入酶蛋白抑制剂,超声裂解细胞4-6次,每次10秒,间隔45秒,加入Triton X-100试剂(终浓度为1%),震荡20分钟,离心细胞裂解物(10,000xg,15分钟)后,将上清(Supernatant)转移至一干净试管中。
3)加1毫升75%的Glutathione Sepharose匀浆洗净上清液。震荡2小时(4℃),使蛋白与Glutathione Sepharose结合,通过离心(500xg,2分钟)去除未结合的蛋白,用冷PBS-T溶液洗树脂(Resin)2次和用冷PBS溶液洗树脂1次。
4)用1毫升的洗脱缓冲液(Elution buffer)[(100mM Tris,pH8.5-9.0;20mM还原的谷胱甘肽(Glutathione)]与树脂培养10分钟,离心树脂和收集上清液。用SDS-PAGE胶纯化的蛋白并用Coomassie blue染色方法检测BMP-9的蛋白的表达。
用含有20%甘油(Glycerol)的PBS透析(Dialysis)和复性处理洗脱的蛋白,并将此蛋白粗提物冻存于-80℃低温冰箱。含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳(Gelfiltration)和离子交换层析(Ion Exchange)方法纯化后,经冷冻干燥后,制成纯化的、有活性的人BMP-9重组蛋白质。
实施例4、重组BMP-9刺激成骨细胞分化。
将原代大鼠颅骨成骨细胞接种(Plate)于24孔培养皿中,细胞培养液为αMEM和10%小牛血清。当细胞达到70%融合时,在培养液中加入BMP-9,培养24小时后,用0.05%的Triton X-100试剂提取细胞溶解产物(Cell lysate),然后用Sigma碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。BMP-9刺激成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性(图2)。
将BMP-9与原代大鼠颅骨成骨细胞(Osteoblast)培养4和8天后,从细胞中提取RNA并用Northern印渍的方法检测成骨细胞标志基因mRNA表达的变化。BMP-9可促进成骨细胞碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(Osteocalcin,OC)和骨特异性转录调控因子Runx2 mRNA的表达(图3)。
此外,将原代大鼠颅骨成骨细胞接种(Plate)于24孔培养皿中,细胞培养液为αMEM和10%小牛血清。待细胞融合(Confluence)后(此时定为零天),细胞培养液换为αMEM/5%小牛血清/5mM β-磷酸甘油(β-glycerophosphate)/100μg/ml维生素C(Ascorbic Acid)及不同剂量的BMP-9(50和200ng/ml)。细胞培养于CO2温箱中,每两天换一次培养液,每天在显微镜下观察细胞变化和骨小结(Bone nodule)是否形成。细胞培养中止于10天。经福尔马林固定后,用von Kossa方法染色,然后用连接于显微镜的计算机和OsteoMeasure软件系统计算骨小结的形成量,BMP-9呈剂量依赖的方法促进骨小结的形成(图4)。
实施例5、重组BMP-9刺激骨形成。
BMP-9(500μg BMP-9/公斤体重)连续5天皮下注射于一月龄的ICR Swiss小鼠的颅骨表面。注射完成两周后,将动物处死,将颅骨取出,经福尔马林固定,用12%EDTA脱钙两周后,用石蜡(Paraffin)包埋,经组织切片,H&E染色后,观察颅骨表面的新骨形成,并用OsteoMeasure软件系统测量新骨的骨量。实验证明,重组BMP-9促进小鼠新骨的形成(图5)。
实施例6、重组BMP-9诱导小鼠异位骨形成。
将1mg纯化的BMP-9与I型胶原溶液混和后,冰冻干燥,种植于一月龄小鼠股骨附近的肌肉内,一个月后,做X光照相,并将动物处死后,将移植部位组织用福尔马林固定和12%EDTA脱钙,经石蜡包埋后,做组织切片和H&E染色。BMP-9诱导小鼠异位骨形成(图6)。
实施例7、重组BMP-9促进骨缺损的修复。
由骨肿瘤手术后或创伤后造成的大块骨缺损(Segmental bone defect),在临床上,目前只有用骨移植的方法进行治疗,且疗效往往不成功。用人BMP-9与其载体制成的复合物填充于骨缺损部位,可诱导成骨细胞的增殖与分化,保进新骨的形成。将BMP-9与脱钙骨基质混和后,将二月龄大鼠颅骨表皮做手术切开,用特制的手术电钻制成1cm的圆形骨缺损。将BMP-9/脱钙骨基质混合物种植于骨缺损处。对照组大鼠种植不含BMP-9的脱钙骨基质。8周后,将大鼠处死,做X光照相,取出颅骨组织,福尔马林固定,脱钙,石蜡包埋,组织切片处理后做H&E染色。BMP-9可诱导颅骨骨缺损的修复,在骨缺损处可观察到新骨和骨髓腔的形成(图7)。
实施例8、重组BMP-9促进骨折修复。
对于难愈合性骨折(Non-union fracture),目前临床上尚无有有效的治疗方法,应用BMP-9,可有效地促进难愈合性骨折的愈合。将二月龄的小鼠用Thomas-Einhorn装置制成股骨骨折后,将BMP-9(0.5mg)连续7天注射于骨折部位,观察动物骨折2-3周后骨痂形成和骨折愈合的情况,对照组为注射等量生理盐水。BMP-9对动物骨折愈合有明显的促进作用(图8)。
Claims (6)
1.一种分离的DNA分子,其特征在于:它编码人骨形态发生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。
2.一种蛋白质,其特征在于:哺乳细胞及大肠杆菌表达人骨形态发生蛋白9重组蛋白质。
3.一种载体,其特征在于:将编码BMP-9核苷酸序列基因段重组于质粒载体,当该质粒载体在哺乳细胞和大肠杆菌扩增时,重组BMP-9得以表达。
4.一种宿主细胞,其特征在于:使重组BMP-9在其表达的哺乳细胞及大肠杆菌宿主细胞。
5.一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的生产方法,其特征在于:方法的步骤如下:
在哺乳细胞:
1)利用RNA逆转录-多聚核苷酸链反应,合成人BMP-9的cDNA,RNA提取自人成骨细胞株U2-OS细胞,并逆转录成cDNA;
2)将cDNA克隆至pcDNA3载体,这一BMP-9/pcDNA3表达质粒适合BMP-9蛋白在哺乳细胞的表达;
3)利用DNA稳定转染的方法,将人BMP-9 cDNA转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞;
4)通过新霉素筛选和细胞克隆,获得稳定表达人BMP-9的单克隆细胞株,用Northern印渍的方法,测出人BMP-9在CHO细胞的表达;
5)收集培养CHO/BMP-9细胞的条件培养液,将此培养液加入到成骨细胞中测定BMP-9活性。
在大肠杆菌:
1)将人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG载体,然后转导至DH5α大肠杆菌中;
2)含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳和离子交换层析方法纯化,然后经过透析及复性处理冷冻干燥后,制成纯化的,有活性的人BMP-9重组蛋白质。
6.一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的用途,其特征在于:它用于制备刺激成骨细胞分化和新骨形成、促进骨折愈合,治疗骨折、骨缺损疾病的药物。
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Legal Events
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |