CN107164333A - 稳定高效表达重组人bmp7的cho细胞株及医用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株及医用用途，采用改造鼠bmp7基因的方式构建bmp7基因序列，作为宿主的CHO细胞同样来源于鼠，其基因相容性和翻译效率大大提高，克服了利用CHO系统表达的BMP7蛋白的基因序列模板均来自人bmp7基因的现有技术存在的缺欠，避免了CHO细胞由于密码子偏好性难以高效转录和翻译人源基因序列；同时，本发明所采用的CHO‑S细胞是已经适应了无血清培养基的悬浮培养细胞，无需进行细胞株的悬浮驯化，有助于保持工程CHO细胞株的稳定性。本发明采用的技术手段对于BMP表达中以下关键性步骤：转录、翻译、折叠、前提切割、分泌、二硫键的配对和糖基化位点的糖型修饰，有明显效率提高的作用。

Description

稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株及医用用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株整合了经改造的鼠bmp7基因的CHO细胞株，为一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，同时还公开了其医用用途。

背景技术

骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs）是一类低种属特异性的蛋白质生长因子，具有多个亚型。BMPs能够诱导间充质细胞不可逆的分化为软骨和骨细胞。骨形态发生蛋白-7又称成骨蛋白-1（Osteogenic Protein-1，OP-1），在胚胎时期参与细胞的增殖、分化，调控肾、肠、骨等多种器官的形成和发育。成人BMP7主要在骨、肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达。

BMP7属于TGF-β超家族成员，其前体蛋白包括一个信号肽、一个前结构域和一个羧端结构域，经翻译后加工形成131个氨基酸残基的成熟肽，其活性形式为同源二聚体。除了形成同源二聚体，BMP7还会与其它同族BMPs形成异源二聚体，在诱导组织发育中具有重要作用。

研究表明，BMP7是一种多用途的蛋白，除了已经批准的胫骨骨折，BMP7的适应症可能还包括肾衰的治疗、中风后运动功能的恢复、矫形外科重建、口腔盖髓修复、骨质疏松症、软骨修复、帕金森病和Lou Gehrig氏疾病等。

天然BMP7以微量存在于皮质骨内，约为1-2μg/kg，其提取很困难且夹杂有其它物质。产量难以满足日益增长的科研和应用需要。

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是目前重组糖蛋白生产的首选体系，具有转录后修饰功能、胞外分泌功能、可悬浮驯化和较少的内原蛋白分泌等优势。但CHO细胞培养成本高，条件难掌握、易污染、表达水平较低。培养基中的血清成分是造成生产高成本的主要因素，血清价格昂贵、批间质量不一致、含动物源成分，大大增加下游纯化工艺的复杂性和成本。

发明内容

本发明的目的是提供一株整合了经改造的鼠bmp7基因的CHO细胞株，为一种高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，通过大规模培养该细胞株，可以表达和生产具有生物学活性的重组人BMP7蛋白。

本发明所述的一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，其特征在于能高效表达重组人BMP7蛋白，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.1所示。

所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，包括以下几个步骤：

1）RT-PCR法提取鼠bmp7基因，通过定点突变得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，插入到pCHO1.0载体的多克隆位点，得到重组质粒；

2）将质粒转入悬浮CHO细胞中；

3）在CD-Forti+Puromycin+MTX筛选培养基中进行加压筛选，得到混合克隆细胞；

4）挑选单克隆细胞株，筛选得到高效表达重组人BMP7蛋白的CHO细胞株。

所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，其特征在于所述步骤1）包括以下几个步骤：

1）鼠bmp7基因的获得：应用RT-PCR技术从乳鼠股骨组织扩增鼠bmp7基因_mbmp7，克隆至质粒pMD18T；

2）鼠bmp7基因的改造：，通过定点突变三个氨基酸编码序列：G266S、S287N、D359E，得到pMD/_mbmp7_m3；

3）pCHO1.0/r_mbmp7_m重组质粒的获得：将_mbmp7_m3克隆至表达载体pCHO1.0, 构建pCHO/_mbmp7_m3；

4）重组质粒的制备：采用无内毒素质粒提取试剂盒，提取pCHO/_mbmp7_m3。

所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，其特征在于所述步骤4包括以下几个步骤：

1）稳定转染：将CHO细胞复苏，常规传代至细胞达到适宜的浓度和活度，将转染试剂和pCHO-_mbmp7_m3质粒加入无血清培养基中，混匀，孵育后，缓慢滴加到细胞培养物中，振荡培养，转换筛选培养基进行静置培养，至细胞活力和密度恢复；

2）挑选单克隆：通过对悬浮细胞进行计数，将细胞进行连续稀释至适宜密度，再进行培养，取培养上清进行检测，选取单克隆细胞孔，继续扩大培养，待细胞密度活度适宜时冻存细胞。

本发明积极效果在于：

提供了一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，能高效表达重组人BMP7蛋白。本发明采用改造鼠bmp7基因的方式构建bmp7基因序列，作为宿主的CHO细胞同样来源于鼠，其基因相容性和翻译效率大大提高，克服了利用CHO系统表达的BMP7蛋白的基因序列模板均来自人bmp7基因的现有技术存在的缺欠，避免了CHO细胞由于密码子偏好性难以高效转录和翻译人源基因序列；同时，本发明所采用的CHO-S细胞是已经适应了无血清培养基的悬浮培养细胞，无需进行细胞株的悬浮驯化，有助于保持工程CHO细胞株的稳定性。与其他技术比较，本发明采用的技术手段对于BMP表达中以下关键性步骤：转录、翻译、折叠、前提切割、分泌、二硫键的配对和糖基化位点的糖型修饰，有明显效率提高的作用。本发明选用的CHO体系可以克服大肠杆菌体系表达BMP难以形成有效折叠和活性二聚体；可以克服酵母体系和昆虫细胞体系表达BMP的糖基化不同于天然BMP。本发明选用的CHO-S体系与同类CHO体系相比较，表达BMP的密码子偏好性更贴近表达体系，这将提高其转录翻译效率。

附图说明

图1是RT-PCR法从乳鼠股骨组织扩增鼠bmp7基因；其中1和2是第二轮PCR产物，3是DL15000 DNA marker；

图2是pCHO1.0/rmbmp7m3的电泳图谱，其中1是DL2000 DNA marker，2和3是线性化的pCHO1.0/rmbmp7m3质粒，4是DL15000 DNA marker；

图3是用ELISA法检测阳性克隆细胞培养上清中重组人成骨蛋白的表达量。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1、鼠bmp7基因的获得

取1日龄小鼠骨组织放入液氮中30分钟，取200mg放入研磨器中，加入2mlTRizol，在冰浴中研磨，悬液转入1.5ml离心管中，室温静置5分钟。取澄清的组织液1ml，加入200μl氯仿，剧烈震荡后冰上静置5分钟，4℃12000rpm离心10分钟，吸取上层水相0.6ml加入异丙醇0.6ml，充分混匀冰上静置10分钟，4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃12000rpm离心5分钟，室温放置干燥RNA沉淀，加入100μl无RNase水溶解。取1μlRNA，应用TaKaRa RNA PCR试剂盒反转录为cDNA。反转录条件为60℃30分钟、95℃5分钟。取反转录产物9μl、上下游引物各1μl（上引物1U26序列：TTACCTAGGATGCACGTGCGCTCGCT；下引物1L29序列：TAGGTATACAGCTAGTGGCAGCCACAGGC）、5×PCR缓冲液10μl、Ex Taq HS 0.3μl、水29.7μl置于PCR管中，按94℃30秒、68℃3分钟进行30个循环，72℃5分钟，产物进行0.8% 琼脂糖电泳，结果见图1。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，与pMD18-T载体进行TA克隆，构建pMD18-mbmp7。

2、点突变法改造鼠bmp7基因

应用PCR法引入突变，PCR扩增体系为：

550 nM突变引物：其中，

G266S位点突变引物：

1TU35AGTCCATCTCCGTAGTATCCGGTCCACGGGGAGTA，

1TL35CTCCCCGTGGACCGGATACTACGGAGATGGACTTC；

S287N位点突变引物：

2TU35TGAGGATGGCCAACGTGGCAGAAAACAGCAGCAGT，

2TL35GCTGCTGTTTTCTGCCACGTTGGCCATCCTCAGGG；

D359E位点突变引物：

3TU35TTCATCAACCCAGAGACAGTACCCAAGCCCTGCTG，

3TL35CAGGGCTTGGGTACTGTCTCTGGGTTGATGAAGTG；

40ng pMD18-mbmp7质粒模板，5μl 10×Ex Taq buffer(Mg2+ Free)，4μl dNTP，10 UEx Taq，补水至50 μl，混匀；PCR反应条件：94℃1分钟；94℃30秒，68℃3分钟，25个循环；72℃10分钟；在PCR体系中加入1μl DpnI，37℃静置2小时，取1以0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；经测序确定序列正确后，作为模板进行一下次突变。直至完成设计的三个突变，得到pMD18/mbmp7m3。

、pCHO1.0/rmbmp7m3重组质粒的构建

用Bstz17I和AvrII双酶切pMD18/mbmp7m3质粒和pCHO1.0载体，回收mbmp7m3基因片段和pCHO1.0载体大片段，以10:1比例进行连接，得到pCHO1.0/rmbmp7m3重组质粒，结果见图2。

、获得表达重组人成骨蛋白BMP7的CHO-S细胞株

4.1稳定转染

CHO-S细胞转染前按常规传代，当细胞浓度达到1×10⁶细胞/ml、细胞活度不低于95%时按照FreeeStyleTM MAX转染世界说明书操作进行转染。转染48h后以5×10⁵细胞/ml进行细胞传代并进行加压培养，维持压力帅选培养四周后待细胞活力和密度恢复后采用有限稀释法对混合克隆细胞进行克隆化以寻找到高表达单克隆细胞株。

4.2利用有限稀释法挑选单克隆

通过对悬浮细胞进行计数并将细胞稀释至每毫升5个，按照每孔200μl铺入96孔板，并在适宜温度、湿度和CO₂浓度下培养14天，取上清进行ELISA检测，根据检测结果选取高表达量单克隆孔细胞转入24孔板进行扩大培养，培养一周后转入6孔板进行培养，在依次转入50ml、150ml和1000ml摇瓶扩大培养，选取适宜细胞活度和密度进行冻存细胞。

4.3ELISA法筛选阳性单克隆

使用Cloud-Clone Corp.公司的骨成型蛋白7检测试剂盒进行ELISA检测。将收集细胞培养液上清作为样品，标准品和样品各100μl加入酶标版，覆膜后37℃孵育2h，弃液体并甩干，再每孔加入检测溶液A100μl，37℃孵育1h，洗板3次后每孔加入检测溶液B100μl，37℃孵育0.5h，洗板5次后每孔加入TMB底物90μl，37℃孵育10-20min，加入终止液50μl并用450nm波长酶标仪进行OD值测定，结果见图3。经过计算，筛选表达量高于160ng/ml阳性单克隆进行放大培养，冻存细胞作为工程细胞株，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.1所示。

本发明筛选的细胞株是生产用细胞株，它能够高效表达重组人BMP蛋白，可以掺入骨水泥，作为各种骨折的粘合剂；可以作为盖髓剂，应用于口腔盖髓修复；作为干细胞诱导剂，应用于组织工程技术，诱导多种组织的体外体内重建；可以作为治疗肾衰的注射剂等。

<110> 长春生物制品研究所

<120> 稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株及医用用途

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 1293

<212> DNA

<213>经改造的鼠bmp7基因

<400> 1

ATGCACGTGC GCTCGCTGCG CGCTGCGGCG CCACACAGCT TCGTGGCGCT CTGGGCGCCT 60

CTGTTCTTGC TGCGCTCCGC CCTGGCCGAT TTCAGCCTGG ACAACGAGGT GCACTCCAGC 120

TTCATCCACC GGCGCCTCCG CAGCCAGGAG CGGCGGGAGA TGCAGCGGGA GATCCTGTCC 180

ATCTTAGGGT TGCCCCATCG CCCGCGCCCG CACCTCCAGG GAAAGCATAA TTCGGCGCCC 240

ATGTTCATGT TGGACCTGTA CAACGCCATG GCGGTGGAGG AGAGCGGGCC GGACGGACAG 300

GGCTTCTCCT ACCCCTACAA GGCCGTCTTC AGTACCCAGG GCCCCCCTTT AGCCAGCCTG 360

CAGGACAGCC ACTTCCTCAC TGACGCCGAC ATGGTCATGA GCTTCGTCAA CCTAGTGGAA 420

CATGACAAAG AATTCTTCCA CCCTCGATAC CACCATCGGG AGTTCCGGTT TGATCTTTCC 480

AAGATCCCCG AGGGCGGAGC GGTGACCGCA GCCGAATTCA GGATCTATAA GGACTACATC 540

CGGGAGCGAT TTGACAACGA GACCTTCCAG ATCACAGTCT ATCAGGTGCT CCAGGAGCAC 600

TCAGGCAGGG AGTCGGACCT CTTCTTGCTG GACAGCCGCA CCATCTGGGC TTCTGAGGAG 660

GGCTGGTTGG TGTTTGATAT CACAGCCACC AGCAACCACT GGGTGGTCAA CCCTCGGCAC 720

AACCTGGGCT TACAGCTCTC TGTGGAGACC CTGGATGGGC AGAGCATCAA CCCCAAGTTG 780

GCAGGCCTGA TTGGACGGCA TGGACCCCAG AACAAGCAAC CCTTCATGGT GGCCTTCTTC 840

AAGGCCACGG AAGTCCATCT CCGTAGTATC CGGTCCACGG GGAGTAAGCA GCGCAGCCAG 900

AATCGCTCCA AGACGCCAAA GAACCAAGAG GCCCTGAGGA TGGCCAACGT GGCAGAAAAC 960

AGCAGCAGTG ACCAGAGGCA GGCCTGCAAG AAACATGAGC TGTACGTCAG CTTCCGAGAC 1020

CTTGGCTGGC AGGACTGGAT CATTGCACCT GAAGGCTATG CTGCCTACTA CTGTGAGGGA 1080

GAGTGCGCCT TCCCTCTGAA CTCCTACATG AACGCCACCA ACCACGCCAT CGTCCAGACA 1140

CTGGTTCACT TCATCAACCC AGAGACAGTA CCCAAGCCCT GCTGTGCGCC CACCCAGCTC 1200

AACGCCATCT CTGTCCTCTA CTTCGACGAC AGCTCTAATG TCATCCTGAA GAAGTACAGA 1260

AACATGGTGG TCCGAGCCTG TGGCTGCCAC TAG 1293

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(26)

<223>

<400>2

TTACCTAGGATGCACGTGCGCTCGCT 26

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(29)

<223>

<400>3

TAGGTATACAGCTAGTGGCAGCCACAGGC 29

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(35)

<223>

<400>4

AGTCCATCTCCGTAGTATCCGGTCCACGGGGAGTA 35

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(35)

<223>

<400>5

CTCCCCGTGGACCGGATACTACGGAGATGGACTTC 35

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(35)

<223>

<400>6

TGAGGATGGCCAACGTGGCAGAAAACAGCAGCAGT 35

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(35)

<223>

<400>7

GCTGCTGTTTTCTGCCACGTTGGCCATCCTCAGGG 35

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(35)

<223>

<400>8

TTCATCAACCCAGAGACAGTACCCAAGCCCTGCTG 35

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(35)

<223>

<400>9

CAGGGCTTGGGTACTGTCTCTGGGTTGATGAAGTG 35

Claims (5)

1.一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，其特征在于能高效表达重组人BMP7蛋白，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，包括以下几个步骤：

1）RT-PCR法提取鼠bmp7基因，通过定点突变得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，插入到pCHO1.0载体的多克隆位点，得到重组质粒；

2）将质粒转入悬浮CHO细胞中；

3）在CD-Forti+Puromycin+MTX筛选培养基中进行加压筛选，得到混合克隆细胞；

4）挑选单克隆细胞株，筛选得到高效表达重组人BMP7蛋白的CHO细胞株。

3.如权利要求2所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，其特征在于所述步骤1）包括以下几个步骤：

1）鼠bmp7基因的获得：应用RT-PCR技术从乳鼠股骨组织扩增鼠bmp7基因_mbmp7，克隆至质粒pMD18T；

2）鼠bmp7基因的改造：，通过定点突变三个氨基酸编码序列：G266S、S287N、D359E，得到pMD-_mbmp7_m3；

3）pCHO1.0/r_mbmp7_m重组质粒的获得：将_mbmp7_m3克隆至表达载体pCHO1.0, 构建pCHO-_mbmp7_m3；

4）重组质粒的制备：采用无内毒素质粒提取试剂盒，提取pCHO-_mbmp7_m3。

4.如权利要求2所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，其特征在于所述步骤4）包括以下几个步骤：

1）稳定转染：将CHO细胞复苏，常规传代至细胞达到适宜的浓度和活度，将转染试剂和pCHO-_mbmp7_m3质粒加入无血清培养基中，混匀，孵育后，缓慢滴加到细胞培养物中，振荡培养，转换筛选培养基进行静置培养，至细胞活力和密度恢复；

2）挑选单克隆：通过对悬浮细胞进行计数，将细胞进行连续稀释至适宜密度，再进行培养，取培养上清进行检测，选取单克隆细胞孔，继续扩大培养，待细胞密度活度适宜时冻存细胞。

5.如权利要求1所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株在制备重组人成骨蛋白中用途。