CN102952817B

CN102952817B - 一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法

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Publication number: CN102952817B
Application number: CN201110235048.7A
Authority: CN
Inventors: 钱悦; 甘人宝; 侯永泰; 吴剑英; 张倩; 周庆玮; 冯宝山; 丁红珍; 杜鹏
Original assignee: SHANGHAI HAOHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI HAOHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2031-08-16
Also published as: CN102952817A

Abstract

本发明涉及一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子(hEGF)的方法。本发明将PL启动子、OmpA信号肽、hEGF基因串联构建分泌表达质粒，将所述分泌表达质粒转化原核生产菌株，利用该生产菌株进行hEGF生产。该方法表达效率高、表达周期短。

Description

一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及通过采用基因工程方法生产重组人表皮生长因子(rhEGF)。

背景技术

人表皮生长因子(Human epidermal growth factor，简称hEGF)，是一种由53个氨基酸组成的不含糖基的单链多肽，分子内有三对由6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域，其分子量为6,216道尔顿，等电点(PI)为4.6。

hEGF是人体中一个重要的细胞因子，是类EGF大家族的一个成员，具有多种生物功能，它可促进外胚层和中胚层细胞，如表皮细胞、成纤维细胞、神经细胞的增殖，并可维持其生长；在生物体发育中，EGF可促进新生儿齿、骨和各器官的生长；可促进肝细胞再生；可促进胃肠粘膜细胞生长和保护粘膜免受损伤等等。

rhEGF在临床上主要应用于：(1)促进烧伤、各种外科创伤和手术伤口的愈合；(2)促进外科溃疡的愈合，尤其是糖尿病性溃疡和老烂脚等愈合；(3)用于皮肤、角膜移植；(4)治疗角膜损伤和溃疡；(5)促进胃、十二指肠溃疡愈合。近年来，技术人员还将其用于鳞状细胞癌、皮肤癌的治疗，疗效显著。

由于EGF分子内含有三对二硫键，因此对酸、碱、热等理化因素均较为稳定，它是迄今发现的最稳定的多肽。基础研究表明，EGF具有对皮肤表皮基底层细胞的激活作用，能在分子水平上对细胞进行修复和调整，促进皮肤细胞的新陈代谢，并调节细胞中色素的平衡，可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。正是由于EGF具有上述特性和作用，因此近年来也被应用于化妆品和美容行业。

目前，大规模制备重组hEGF(rhEGF)多是采用基因工程的方法，所采用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统和酵母表达系统等。

本发明人在先前的研究中，主要将精力放在采用大肠杆菌表达系统分泌表达rhEGF的研究上，并取得了很好的效果，比如，将含有大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和信号肽的质粒pAE-8，转化大肠杆菌宿主菌YK537，得到工程菌株EE-8。该工程菌株在低磷条件下诱导表达rhEGF，最高表达量为150mg/l(中国专利号CN00127953.X)；又如，将化学合成全新设计的phoAspL10基因及其与hEGF的串联基因，构建表达质粒pBL10EGF(该质粒含有入噬菌体的P_L启动子)，进而以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞构建工程菌株BE-2，该菌株采用温度诱导的方式，分泌表达rhEGF至384mg/l(中国专利号CN200510025289.3)。

然而，鉴于市场对于hEGF的需求量很大，本领域还有必要进行更优化的研究，以期进一步提高重组hEGF的产量、简化生产过程或降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法；以及用于高效表达重组人表皮生长因子的构建物。

在本发明的第一方面，提供一种用于重组表达人表皮生长因子(hEGF)的构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件：

噬菌体P_L启动子，OmpA信号肽基因，人表皮生长因子基因。

在一个优选例中，所述的噬菌体P_L启动子来源于pBLGlu2；和/或

所述的OmpA信号肽基因和人表皮生长因子基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的噬菌体P_L启动子和OmpA信号肽基因之间具有限制性内切酶EcoRI酶切位点。

在另一优选例中，所述的人表皮生长因子基因的下游具有限制性内切酶HindIII酶切位点。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程菌，其包含前面任一所述的构建物。

在另一优选例中，所述的基因工程菌是大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的基因工程菌具有氨苄青霉素抗性。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达人表皮生长因子的方法，包括：培养所述的基因工程菌，从而表达人表皮生长因子。

在另一优选例中，先在30℃±2℃(较佳地30±1℃)繁殖基因工程菌至菌体OD₆₆₀值超过30；之后升高培养温度至38.0±0.5℃(较佳地38.0±0.2℃)，使基因工程菌中所含噬菌体P_L启动子启动，诱导分泌表达人表皮生长因子。

在另一优选例中，诱导表达12±2小时；较佳地12±1小时。

在另一优选例中，发酵培养基配方为：

酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化钠1±0.2g/L，无水硫酸镁1±0.2g/L，氯化铵2±0.4g/L，硫酸铵2±0.4g/L，磷酸二氢钠·3H₂O 0.4125±0.1g/L，磷酸氢二钠·12H₂O 0.675±0.2g/L，氯化钙0.02±0.005g/L，1％维生素B10.2±0.05ml/L，葡萄糖10±2g/L；或

补料培养基配方为：葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。

在另一优选例中，在发酵前，进行种子培养，种子培养的条件是30℃±2℃(较佳地30±1℃)培养12±2小时(较佳地12±1小时)。

在另一优选例中，培养7±1小时后开始补料，第1小时补料50ml，第2小时补料70ml，第3小时补料100ml，第4小时补料150ml，第5小时补料220ml；之后开始诱导表达，同时恒速补料，补料速度240ml/小时。

在另一优选例中，诱导表达12±2小时(较佳地12±1小时)后发酵结束。

在另一优选例中，发酵结束后，还包括：从发酵液中分离人表皮生长因子。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、OmpA信号肽基因和人表皮生长因子(hEGF)基因串联基因。

图2、分泌表达质粒pBLOmpAEGF构建示意图。

图3、阳性克隆核酸电泳图。

其中，第1栏为DNA Marker，分子量由下至上分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp；第2栏为阴性对照；第3栏为阳性对照；第4栏为空白；第5栏为阳性克隆。

图4、工程菌株BLOE-3发酵曲线图。X轴为发酵时间，Y轴是菌浓度OD₆₆₀和EGF表达量(mg/L)。

具体实施方式

本发明人长期致力于改进人表皮生长因子(hEGF)的表达技术，经过深入的研究，揭示了一种新的重组表达方法，将P_L启动子、OmpA信号肽、hEGF基因串联构建分泌表达质粒，将所述分泌表达质粒转化原核生产菌株，利用该生产菌株进行hEGF生产。该方法表达效率高、表达周期短，表达量超过了450mg/L。

术语

如本文所用，所述的“表达构建体(或称DNA构建体)”指一种已经通过人为干预修饰，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。

如本文所用，“元件”是指对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建物(构建体)。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp，更佳地1-5bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区域”，代表本领域所共知的含义，表示一个基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶结合的DNA序列和转录的起始点。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

表达构建物

本发明提供了一种用于重组表达hEGF的构建物，所述构建物从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：噬菌体P_L启动子，OmpA信号肽基因，人表皮生长因子基因。

所述的噬菌体P_L启动子为一种温敏强启动子，其可在一定的诱导温度，如42℃下启动下游基因的表达。本发明人意外发现，同时应用噬菌体P_L启动子进行诱导表达以及应用OmpA信号肽来分泌表达，可实现高产hEGF的目的。

根据所公开的信息，进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如，在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列也可为这些所限定序列的互补序列。

本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

作为本发明的优选方式，所述的OmpA信号肽基因和人表皮生长因子基因的序列如SEQ ID NO：1所示，这是经过本发明人密码子优化的序列，以获得更高的表达效率。

构建物中各元件之间还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。作为本发明的优选方式，启动子P_L和OmpA信号肽基因之间存在限制性内切酶酶切位点EcoRI；在重组人表皮生长因子的下游存在限制性内切酶酶切位点HindIII。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

作为本发明的一种具体实施例，构建了一种分泌表达质粒pBLOmpAEGF，该质粒被用于直接分泌表达hEGF。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是大肠杆菌。本发明还提供了包含上述构建物的基因工程菌。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。作为一种优选的方式，可用预冷氯化钙处理宿主细胞再升温至42℃作短时处理的方法进行。

作为本发明的一种具体实施例，提供了一种将分泌表达质粒pBLOmpAEGF转化的大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，获得高产的细胞，本发明人将之命名为基因工程菌BLOE-3。该BLOE-3菌株被用于发酵培养和诱导分泌表达hEGF。较佳地，其还具有氨苄青霉素抗性。

表达方法

一种重组表达人表皮生长因子的方法，包括：培养含有所述构建物的基因工程菌，从而表达人表皮生长因子。

提高hEGF产量的关键在于找到合适的元件来支持其表达，本发明人反复试验后选择了噬菌体P_L启动子和OmpA信号肽基因来调控hEGF的表达，通过合适的温度诱导以及分泌表达，不仅大大提高了hEGF的产量，也简化了生产的过程，无需进行细胞破碎等程序。

只有生产者多了，后续hEGF的产量才会更高。为了获得大量生产hEGF的菌体，首先进行培养菌体使之大量繁殖的过程，该过程采取较低的温度，这样不会立即诱导噬菌体P_L启动子启动下游基因表达，有利于高效地繁殖菌株。而在获得了足够多的生产者(菌体)之后，再适当地升高发酵液的温度，从而使得菌体内的噬菌体P_L启动子被诱导，启动下游基因的表达，并由OmpA信号肽引导进行分泌表达。

在摸索最佳培养条件时，本发明人还发现，若将诱导温度直接升至42℃，由于P_L启动子属于强启动子，它的强势启动会使带OmpA信号肽的hEGF在短时间内大量表达，导致很多带OmpA信号肽的hEGF因信号肽酶来不及切除OmpA信号肽并将rhEGF转运到细胞膜外而堆积在周质中，只有那些被加工好的，与天然EGF构象完全一致的hEGF被分泌至培养基中。因此，调节这一表达、加工、转运过程达到平衡成了关键。本发明人通过细致科学的实验，找到了BLOE-3的较佳诱导温度和诱导时间，在38.0±0.5℃诱导表达人表皮生长因子，诱导表达12±2小时。在这样的诱导温度下hEGF的表达、加工、转运过程达到较好的平衡，被分泌至培养基中rhEGF表达量也很高，超过了450mg/L。

在诱导表达前，还包括了培养菌株使之大量繁殖的过程，该过程与接种的种子菌质量也相关。因此，本发明人在进行发酵接种前，进行种子培养，较佳地，种子培养的条件是30℃±2℃培养12±2小时。

作为本发明的优选方式，针对培养的需要，本发明人还优化了培养过程的培养基，发酵培养基配方为：酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨20±5g/L，氯化钠1±0.2g/L，无水硫酸镁1±0.2g/L，氯化铵2±0.4g/L，硫酸铵2±0.4g/L，磷酸二氢钠·3H₂O 0.4125±0.1g/L，磷酸氢二钠·12H₂O 0.675±0.2g/L，氯化钙0.02±0.005g/L，1％维生素B10.2±0.05ml/L，葡萄糖10±2g/L。补料培养基配方为：葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。上述的培养基配方，它含有足够的营养成份，配方合理，足以满足工程菌株的营养所需和生产所需，菌体生长和繁殖速率高，培养周期短即可达到高的菌体浓度和hEGF浓度。

培养基因工程菌的其它条件，如通气量、溶氧、搅拌速度等，可采用本领域已知的条件。

在发酵培养结束后，还可包括步骤：从发酵液中分离hEGF。从培养产物中分离或纯化hEGF可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用PhenylSepharose 6 Fast Flow(high sub)、Q Sepharose High Performance阴离子交换、Superdex 30 prep grade凝胶过滤三步法纯化；或采用调pH至hEGF等电点4.6后，加硫酸铵至35％饱和度，所得沉淀离心收集并溶解后再用Sephadex G50superfine纯化等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例中所用到的基因、引物的合成，DNA的抽提及回收，DNA测序等，均是上海生工生物工程技术服务有限公司的产品或提供的服务；酶、dNTPs和DNA Marker则采用了TaKaRa公司的产品；EGF表达量测定采用的是R&D公司的Quantikine试剂盒。

实施例1、设计并化学合成OmpA信号肽基因和人表皮生长因子(hEGF)基因串联基因

如图1所示设计OmpA信号肽基因和人表皮生长因子(hEGF)基因串联基因。该基因包含序列表SEQ ID NO：1中所示的DNA序列。本发明人在设计上述串联基因时，充分遵循了以下原则：选用大肠杆菌偏爱的密码子；AT、GC含量接近且分布均匀；片段内避免二级结构的产生。串联基因通过化学合成的方法来制备。

在上述串联基因的5’端，设计了限制性内切酶EcoRI酶切位点，而在串联基因的3’端，设计了限制性内切酶HindIII的酶切位点，便于构建分泌表达质粒。

实施例2、分泌表达质粒pBLOmpAEGF的构建

2.1起始载体pBLGlu2的EcoRI、HindIII双酶切处理

pBLGlu2为已知的载体，见中国专利号CN200510025289.3。

配制如下反应混合液：

1μg质粒pBLGlu2；

5μl10×M缓冲液；

2μl EcoRI限制性内切酶(15U/μl)；

2μl HindIII限制性内切酶(15U/μl)；

灭菌双蒸水补足50μl。

将上述反应混合液于37℃反应6小时，所得的反应混合液反应液进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下切下大条带，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，用50μl洗脱液洗脱。

2.2OmpA信号肽基因和hEGF基因串联基因的酶切处理

配制如下反应混合液：

1μg OmpA信号肽基因和hEGF基因串联基因；

5μl10×M缓冲液；

2μl EcoRI限制性内切酶(15U/μl)；

2μl HindIII限制性内切酶(15U/μl)；

灭菌双蒸水补足50μl。

将上述反应混合液于37℃反应过夜，然后进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下切下240bp左右的条带，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，用50μl洗脱液洗脱。

2.3连接

配制如下反应混合液：

5μl 2.1中经处理后的载体大片段；

5μl 2.2中经EcoRI、HindIII双酶切的基因；

2μl10×T₄DNA连接酶缓冲液；

1μl T₄DNA连接酶(350U/μl)；

灭菌双蒸水补足20μl。

将上述反应混合液于16℃反应过夜。

2.4感受态细胞的制备

将10μl TOP10甘油菌接种至3ml LB培养基中，37℃200rpm培养过夜，取100μl菌液再接入3ml LB培养基中，37℃200rpm培养至A₆₀₀0.3～0.4，然后4,000rpm离心10分钟，弃上清，菌体以预冷的钙溶液(0.1mol/l CaCl₂)洗涤，4,000rpm离心10分钟，菌体重悬于200μl的钙溶液中备用。

2.5转化

取2.3中的连接产物，加入2.4中制备的感受态细胞中，冰浴30分钟，然后于42℃热休克90秒，随后加入800μl LB培养基，于37℃，100rpm，振摇30分钟，取100μl涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板(琼脂含量为1.5％)，37℃倒置培养过夜。

2.6获得阳性克隆

合成P_L启动子基因、OmpA信号肽基因和hEGF基因串联基因的上游引物和下游引物，用于PCR反应筛选阳性克隆，引物序列如下：

上游引物(19bp)：

5’AGC ACA TCA GCA GGA CGC A 3’(SEQ ID NO：2)；

下游引物(22bp)：

5’CCC AAG CTT ATT AAC GCA GTT C 3’(SEQ ID NO：3)。

用无菌牙签挑取2.5中长出的若干菌落于3ml LB(其中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)中，在37℃，200rpm培养过夜，以菌落培养液作为模板进行PCR反应。每个菌落培养液试样按以下组合和反应条件进行PCR反应。

配制如下反应混合液：

0.25μl Ex Taq(5U/μl)；

5μl10×Ex Taq缓冲液；

4μl dNTP Mixture；

1μl上游引物；

1μl下游引物；

1μl菌落培养液；

灭菌双蒸水补足50μl。

反应条件：先94℃2分钟，再94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，共30个循环，然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。

PCR反应的阴性对照用1μl灭菌双蒸水代替菌落培养液，阳性对照用2.2中溶解的1μl OmpA信号肽基因和hEGF基因串联基因代替菌落培养液。取PCR反应液20μl进行1.5％琼脂糖电泳，在紫外灯下，菌落培养液试样的PCR反应产物于370bp左右处出现条带的即为阳性克隆，见图3。

2.7质粒的小量抽提

取阳性克隆的培养液10μl接种至3ml LB培养基(其中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)中，37℃200rpm培养过夜，用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒，抽提阳性克隆的质粒。

2.8DNA序列测定

以2.6中的上游引物作为测序引物，对阳性克隆进行DNA序列测定。测序结果表明，在分泌表达质粒pBLOmpAEGF中，P_L启动子基因、OmpA信号肽基因和hEGF基因的串联基因DNA序列与设计完全一致。

通过上述步骤，本发明人完成了表达质粒pBLOmpAEGF的构建工作。构建重组质粒的过程以及获得的重组质粒见图2。

实施例3、工程菌株BLOE-3的发酵培养

从实施例2获得的分泌表达质粒pBLOmpAEGF，按照实施例2的2.4-2.5中的方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，如此获得了重组菌株BLOE-3；通过正交实验获得了种子最佳培养条件，即30℃，12小时；以及获得了发酵培养时最佳诱导温度和诱导时间，即38.2℃诱导12小时。

以下列举一种工程菌株BLOE-3的发酵培养的方法：

种子培养基为LB培养基。

发酵培养基配方如下(g/L)：

酵母抽提物20g/L，蛋白胨，20g/L，氯化钠1g/L，无水硫酸镁1g/L，氯化铵2g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钠·3H₂O 0.4125g/L，磷酸氢二钠·12H₂O0.675g/L，氯化钙0.02g/L，1％维生素B10.2ml/L，葡萄糖10g/L。

补料配方：葡萄糖650g/L，水解酪蛋白100g/L。

以5N氢氧化钠调节pH在7.0。

取100μl工程菌株BLOE-3甘油菌，接入30ml LB培养基中(氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)，于30℃、250rpm培养12小时，再以3％(v/v)的接种量转接到800ml LB培养基中(氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)，同样条件下培养12小时，然后按4％的接种量接入到装有20升发酵培养基的40升发酵罐中进行发酵。

初始培养条件设置为：培养温度30℃，通气量为5slpm(标准公升每分钟流量值；stard liter per minute)，pH 7.0，搅拌转速200rpm，溶氧30％。随着菌浓度不断增加，逐增大通气量至30slpm，搅拌转速控制为200-500rpm。

接种7小时后开始补料，第1小时补料50ml，第2小时补料70ml，第3小时补料100ml，第4小时补料150ml，第5小时补料220ml。接种后12小时(菌体OD₆₆₀值超过30)，开始升温诱导表达，将温度设定至38.2℃，同时开始恒速补料，补料速度控制在240ml/小时。诱导开始后，在不同的时间点取样测定hEGF的表达量，每2小时取样一次。培养24小时后放罐，按常规方法从发酵液中纯化hEGF。

整个培养过程中菌株的OD值以及hEGF的表达量如图3所示，培养基中的rhEGF最高表达量可以达到452mg/L。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种重组表达人表皮生长因子的方法，包括：在发酵前，进行基因工程菌种子培养，种子培养的条件是30℃±2℃培养12±2小时；

之后，发酵培养基因工程菌，从而表达人表皮生长因子；先在30℃±2℃繁殖基因工程菌至菌体OD₆₆₀值超过30；之后升高培养温度至38.0±0.5℃，使基因工程菌中所含噬菌体P_L启动子启动，诱导分泌表达人表皮生长因子，诱导表达12±2小时；发酵培养7±1小时后开始补料，第1小时补料50ml，第2小时补料70ml，第3小时补料100ml，第4小时补料150ml，第5小时补料220ml；之后开始诱导表达，同时恒速补料，补料速度240ml/小时；

所述的基因工程菌包含构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件：来源于pBLGlu2的噬菌体P_L启动子，OmpA信号肽基因，人表皮生长因子基因；

培养时，发酵培养基配方为：酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化钠1±0.2g/L，无水硫酸镁1±0.2g/L，氯化铵2±0.4g/L，硫酸铵2±0.4g/L，磷酸二氢钠·3H₂O0.4125±0.1g/L，磷酸氢二钠·12H₂O0.675±0.2g/L，氯化钙0.02±0.005g/L，1%维生素B10.2±0.05ml/L，葡萄糖10±2g/L；

补料培养基配方为：葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的OmpA信号肽基因和人表皮生长因子基因的序列如SEQ ID NO:1所示。