CN110184289A - 一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法，所述表达载体由甘油磷酸氧化酶表达载体构建而来，在核糖体结合位点与起始密码子之间插入基因表达调节元件。本发明的有益效果体现在：本发明构建的重组甘油磷酸氧化酶表达载体酶活高，极大的提高了甘油磷酸氧化酶的应用能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法。
背景技术
甘油磷酸氧化酶（glycerophosphate oxidase，GPO）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅因子的氧化酶，能够将L-α-glycerophosphate转化为磷酸二羟丙酮，并释放出过氧化氢。甘油磷酸氧化酶主要应用于临床生化诊断方面，与脂酶和甘油激酶共同作用，用于临床检测体内甘油三酯或丙三醇的含量，辅助监测心血管疾病的发生和发展。
甘油磷酸氧化酶来源广泛，包括链霉菌，粪球菌和乳酸杆菌等微生物内的甘油磷酸氧化酶基因已经完成鉴定。目前国内研究相对较少，大部分集中于从原始微生物中直接提取，例如张斯民等从支原体中进行了甘油磷酸氧化酶的克隆和酶学鉴定 [1] ；包凌晟等从粪肠球菌中进行了甘油磷酸氧化酶的提取[2]；余彩霞等进行了粪肠球菌的筛选和培育，并进行了发酵生产条件的优化[3]。尽管相关工作较多，但是由于相关生产菌株培养条件复杂，酶产量较低的问题，导致甘油磷酸氧化酶产品生产工艺复杂，价格较高，不能进行大规模发酵生产，直接制约了甘油磷酸氧化酶的应用。
大肠杆菌是酶制剂生产中最为常用的宿主菌株，具有培养条件简单，基因背景清楚，蛋白表达产量高和发酵技术成熟等特点。但是我们在进行甘油磷酸氧化酶的大肠杆菌表达过程中发现，使用现有的大肠杆菌表达体系，生产的甘油磷酸氧化酶活力显著低于原始菌株来源的酶产品活力。因此，需要进行表达系统的改进优化，以进一步提高甘油磷酸氧化酶在大肠杆菌中的表达活力。
[1]张斯民.绵羊肺炎支原体甘油-3-磷酸氧化酶基因的克隆、表达及重组产物的纯化[D].宁夏大学,2013。
[2]包凌晟,杜林方,李海林,聂宇,孟延发.产磷酸甘油氧化酶菌株的鉴定及其酶学性质研究[J].中国酿造,2008(11):15-18。
[3]余彩霞. 产磷酸甘油氧化酶菌种的筛选、鉴定及酶的分离纯化与性质研究[D].四川大学,2006。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体，所述表达载体由甘油磷酸氧化酶表达载体构建而来，在核糖体结合位点与起始密码子之间插入基因表达调节元件。
优选地，所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，包括如下步骤，
S1、甘油磷酸氧化酶表达载体的构建；
S11、合成甘油磷酸氧化酶基因片段，所述甘油磷酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示；
S12、选取pET系列表达质粒；
S13、将S11中的甘油磷酸氧化酶基因片段插入到S12中的表达质粒中；
S2、在所述S1构建的甘油磷酸氧化酶表达载体中采用定点突变的方式插入基因表达调节元件获得重组的甘油磷酸氧化酶表达载体；所述基因表达调控元件为胞嘧啶和鸟嘌呤组成的核苷酸序列。
优选地，所述S13中包括如下步骤：
S131、对S11中的甘油磷酸氧化酶基因片段及S12中的表达质粒进行双酶切；
S132、对经过酶切后的甘油磷酸氧化酶基因片段和表达质粒进行纯化；
S133、采用连接酶将纯化后的甘油磷酸氧化酶基因片段和质粒片段进行连接。
优选地，所述基因表达调节元件插入位点为核糖体结合位点与起始密码子之间，具体为插入到起始密码子5’端，所述核糖体结合位点的一端连接有T7启动子。所述T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGG，所述核糖体结合位点序列为AGAAGGAGA。
优选地，所述S11中甘油磷酸氧化酶基因来源于Aerococcus viridans菌株。
优选地，所述S12中pET系列表达质粒为pET28a或pET24d表达质粒。
优选地，所述S2中基因表达调节元件序列中包含5-7个碱基。
优选地，所述S2中基因表达调节元件序列为CCGGGG或GGCCGG。
优选地，所述S131中采用限制性内切酶进行双酶切。
优选地，本发明还提供了一种具有高表达活力甘油磷酸氧化酶的大肠杆菌重组菌株，将以上方法制得的重组甘油磷酸氧化酶表达载体转化至大肠杆菌宿主菌株中，所述大肠杆菌宿主菌株为BL21(DE3)菌株。
本发明的有益效果体现在：本发明构建的重组甘油磷酸氧化酶表达载体酶活高，极大的提高了甘油磷酸氧化酶的应用能力。
附图说明
图1：本发明的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的连接结构示意图。
图2：本发明为进一步示意重组甘油磷酸氧化酶表达载体的连接结构示意图。
图3：甘油磷酸氧化酶纯化SDS-PAGE电泳图谱，其中，M表示蛋白marker；1：菌体裂解液；2：粗酶液；3：未结合纯化柱的粗酶液；4：纯化柱清洗液；5：纯化后的甘油磷酸氧化酶。
图4：甘油磷酸氧化酶总酶活力测定。其中，1：含有基因表达调节元件的新型甘油磷酸氧化酶重组菌株；2：未添加基因表达调节元件的新型甘油磷酸氧化酶重组菌株。
具体实施方式
以下结合实施例及附图具体阐述本发明的技术方案，本发明揭示了一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法。
本发明所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆实验指南(第三版)》。
除非本文另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领的普通技术人员通常所理解的相同含义。
实施例1
一种重组甘油磷酸氧化酶表达质粒构建方法
（1）甘油磷酸氧化酶表达载体的构建
来源于Aerococcus viridans菌株的甘油磷酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，基因合成交由苏州金唯智生物技术有限公司合成，合成基因中含有NcoI和XhoI酶切位点。将合成的基因片段以及pET28a质粒使用NcoI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，使用琼脂糖凝胶电泳纯化酶切后的基因片段和载体片段，使用T4连接酶在25℃连接纯化的甘油磷酸氧化酶片段和pET28a片段，连接产物转化DH5α菌株，过夜培养。挑取单克隆菌落并进行培养，使用质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒，交由苏州金唯智生物技术有限公司进行基因测序，获得甘油磷酸氧化酶表达载体。
所述SEQ ID NO.1如下所示：
DNA sequence from Aerococcus viridans strain
1 ATGTCTAAAT TATCATTTAA GTATAGAAAA GAAACAGTCG AACAATTAAA AGAAAACCAA
61 TATGATTTAT TCATTATTGG AGGCGGTATC ACAGGTGCAG GTGTAGCGAT TCAAGCCGCT
121 GCATCAGGCC TAAAAACGGC CTTAGTGGAC ATGCAAGACT TCTCTGAAGG AACTTCAAGT
181 CGTTCAACTA AATTAGTACA CGGTGGTATC CGTTACTTGA AAAACTTCGA CCTAGAAGTG
241 GTTTCAGATA CAGTAACTGA GCGTGCAACT GTACATAACA TTGCACCACA TATCCCGCAA
301 CCAGATCCAA TGTTAATGCC TTTATATGAC GAACCAAAAG TGACTTTCAA TCCATTACGC
361 TTACAAATCG CTATGGATAT CTATGACTCA CTAGCTGGTG TAAAAGATTC ACAATACGCC
421 AACGAAATGT TGTCTAAAGA TGAAGTATTG AGCCGTCAAC CAGACTTAAT GGCTGAAGGT
481 TTAATCGGTG GTGGTAAATA CCTAGATTTC AACAACAATG ACTCACGTTT AGTGATTGAA
541 AATATCAAAC AAGCAAATGA TGATGGCGCT GATTTATTAA GCCACGCAAA GGTTGTTGGT
601 TTCGAATATG AAAATGACAA AATAGTTGCT GTTAAAGTTG AAGATTTACT ATCTGGTGAG
661 ACATTTACAG TGAAATCTCA TGTTGTGATT AACACGACTG GTCCTTGGTC AGATACAATC
721 CGTCAATTAG ACGGGTCTGA TAAGAAACCA GCGCAAATGC GTCCAACAAA AGGTGTGCAT
781 TTTGTCGTAG ATAAATCTAA ATTAACAGTA TCGCAACCAA TTTACTTTGA TACAGGCGAA
841 CAAGATGGCC GTATGGTCTT TGTTTTACCT CGTGAAAATA AAACCTACTT TGGTACAACA
901 GATACTGACT ACACAGGTGA CTTTGAACAC CCAACAGTGA CTCAAGAAGA CGTTGATTAC
961 CTATTACGTG TTGTTAACCA CCGCTTCCCA AATGCCAACT TATCTATCAA TGATATTGAA
1021GCTTCCTGGG CAGGCTTACG TCCCTTAATC GATTCTAATA ACGCCTCTGA CTACAATGGT
1081GGTGACGCTG GTCGTTTATC AGAACGTACA TTTGACGAAT TAGTGGCTTT ATTCGATGAC
1141TACAGCAAAG ATAAAGTTGA ACGTAGTACT GTTGAAGATA AGTTGCAAGA TTTAGGTTCT
1201AATACATCAG AACGTGGTGA TGGCAGTCCA TCAAGCGTAT CTCGAGGATC TGATTTATCA
1261GTAGCTCCAT CAGGTCTATT CACTCTTGCT GGTGGTAAAA TTACTGACTA CCGAAAAATG
1321GCTAAAGGGG CAATGGAAAG AATTATACCT GTTGTAACTG ACATCACAGG TAAATCTTAC
1381GAATTGGTTC AGTCATCAAC TTACCCTATA TCTGGTGGTC AATTTGATCC AAATAGCTAT
1441GAAACTGCTA TGGAAAAATT TGCAAATGTG GGAGTAGCTC GTGGTTTAAC TTATGGTCAA
1501TCACTTAATT TAGCTAAGTT ATATGGTTCA AATATGAACC GTGTGATTTC ATACCTACCA
1561GTAGCCAAAG AATATGCAGC TAAATATGAC TATCCAGTTG ATATTGCTGT CAGTCTAATT
1621TATGCCTTAG AGGAAGAAGG GGTATACACA CCATTAGACT TCTTCGCTCG TCGTACAACC
1681TTCATGCTGT TCCAACATGA CAAAATGCTT GCAGTTAAAG AGGCGGTTAG CCAAACGATT
1741GTCGATTACT TTGGTTTAGA TCAAGCCACT GCGGATCAAC AGAAAACAGC ACTAGATGAA
1801 GAAATTGCTA AGGCTGAATT ACAGTACTTA AAA
（2）基因表达调节元件的插入
采用定点突变的方式插入设计的基因表达调节元件，设计的引物为P1：5’-aagaaggagatataccccggggatgggcagcagccatc-3’；
P2：5’-ggtatatctccttcttaaagttaaacaaaatt-3’，
其中划线序列为添加的序列，以S1构建的甘油磷酸氧化酶表达载体为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增质粒。扩增条件为95℃预变性5分钟，然后按照以下条件循环30次：95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸3分钟。最后使用72℃继续延伸10分钟，以保证基因扩展的完整性。得到的PCR产物使用DpnI限制性内切酶于37℃酶切1小时，以消化模板质粒，纯化酶切后产物，转化DH5α菌株，过夜培养。挑取单克隆菌落并进行培养，使用质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒，交由苏州金唯智生物技术有限公司进行基因测序，筛选构建正确的重组甘油磷酸氧化酶表达载体。
实施例2
一种能够提高表达高活力甘油磷酸氧化酶的大肠杆菌重组菌株的构建方法
（1）含有基因表达调节元件的新型甘油磷酸氧化酶表达载体的转化
将DNA构建产物导入宿主细胞的技术包括有感受态的制备和转化，一般的转化的方法是本领域已知的按照常规方法（如《分子克隆实验指南》中介绍的方法），转化完成的菌株涂布在LB固体培养基中，37℃过夜培养，可获得含有甘油磷酸氧化酶表达载体的重组菌株菌落。
（2）高活性甘油磷酸氧化酶的大肠杆菌重组菌株的筛选
挑取上述重组菌株单菌落50个，使用液体LB培养基培养至OD600为0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.1mM，于25℃中诱导培养6小时后离心收集菌体，重悬于50mM Tris buffer（pH8.0）中，超声破碎，使用14000rpm转速离心30分钟，获得上清即为粗酶液，测定甘油磷酸氧化酶总酶活力。以未插入基因表达调节元件的甘油磷酸氧化酶表达菌株为对照，其中未插入基因表达调节元件的甘油磷酸氧化酶表达菌株构建方法于实施例2步骤（1）一致。通过比较不同单菌落的总酶活力，获得高活性甘油磷酸氧化酶的大肠杆菌重组菌株。
实施例3
甘油磷酸氧化酶的纯化
将筛选的甘油磷酸氧化酶重组菌株以及未插入基因表达调节元件的甘油磷酸氧化酶表达菌株分别使用4L体积的LB培养基进行培养，37℃下培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.1mM，于25℃下过夜培养。6000rpm离心收集菌体，使用200ml的20mM Trisbuffer（pH8.0）悬起，高压破碎，14000rpm离心40分钟，去掉沉淀。使用GE公司的HiTrap预装柱纯化：使用5倍柱体积的20mM Tris buffer（pH8.0）平衡纯化柱，按照2ml/min的流速上样，上样完成后使用20mM Tris buffer（pH8.0）进行清洗，最后使用含有250mM咪唑的20mMTris buffer（pH8.0）进行洗脱，收集蛋白组分透析去掉多余咪唑，使用SDS-PAGE进行纯度鉴定，结果如图3所示，获得的甘油磷酸氧化酶分子量大小为70kDa左右，蛋白纯度较高。
实施例4
甘油磷酸氧化酶的酶活力检测
甘油磷酸氧化酶酶活测定反应体系包括： 100mmol/L L-α-甘油磷酸，50mmol/L Tris缓冲液， pH8.0，2mmol/L 4-安替比林，5mmol/L 苯酚，5U辣根过氧化物酶以及一定量的甘油磷酸氧化酶粗酶液，总体积为0.2ml。混合完成后立即测定505nm的吸光度变化，根据每分钟吸光度变化幅度定量甘油磷酸氧化酶的酶活力，每单位酶活定义为每分钟产生一分子过氧化氢所需要的酶量，其酶活测定如图4所示。
当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
序列表
<110> 桐乡杜创三众生物技术有限公司
<120> 一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1833
<212> DNA
<213> 甘油磷酸氧化酶(Aerococcus viridans strain)
<400> 1
atgtctaaat tatcatttaa gtatagaaaa gaaacagtcg aacaattaaa agaaaaccaa 60
tatgatttat tcattattgg aggcggtatc acaggtgcag gtgtagcgat tcaagccgct 120
gcatcaggcc taaaaacggc cttagtggac atgcaagact tctctgaagg aacttcaagt 180
cgttcaacta aattagtaca cggtggtatc cgttacttga aaaacttcga cctagaagtg 240
gtttcagata cagtaactga gcgtgcaact gtacataaca ttgcaccaca tatcccgcaa 300
ccagatccaa tgttaatgcc tttatatgac gaaccaaaag tgactttcaa tccattacgc 360
ttacaaatcg ctatggatat ctatgactca ctagctggtg taaaagattc acaatacgcc 420
aacgaaatgt tgtctaaaga tgaagtattg agccgtcaac cagacttaat ggctgaaggt 480
ttaatcggtg gtggtaaata cctagatttc aacaacaatg actcacgttt agtgattgaa 540
aatatcaaac aagcaaatga tgatggcgct gatttattaa gccacgcaaa ggttgttggt 600
ttcgaatatg aaaatgacaa aatagttgct gttaaagttg aagatttact atctggtgag 660
acatttacag tgaaatctca tgttgtgatt aacacgactg gtccttggtc agatacaatc 720
cgtcaattag acgggtctga taagaaacca gcgcaaatgc gtccaacaaa aggtgtgcat 780
tttgtcgtag ataaatctaa attaacagta tcgcaaccaa tttactttga tacaggcgaa 840
caagatggcc gtatggtctt tgttttacct cgtgaaaata aaacctactt tggtacaaca 900
gatactgact acacaggtga ctttgaacac ccaacagtga ctcaagaaga cgttgattac 960
ctattacgtg ttgttaacca ccgcttccca aatgccaact tatctatcaa tgatattgaa 1020
gcttcctggg caggcttacg tcccttaatc gattctaata acgcctctga ctacaatggt 1080
ggtgacgctg gtcgtttatc agaacgtaca tttgacgaat tagtggcttt attcgatgac 1140
tacagcaaag ataaagttga acgtagtact gttgaagata agttgcaaga tttaggttct 1200
aatacatcag aacgtggtga tggcagtcca tcaagcgtat ctcgaggatc tgatttatca 1260
gtagctccat caggtctatt cactcttgct ggtggtaaaa ttactgacta ccgaaaaatg 1320
gctaaagggg caatggaaag aattatacct gttgtaactg acatcacagg taaatcttac 1380
gaattggttc agtcatcaac ttaccctata tctggtggtc aatttgatcc aaatagctat 1440
gaaactgcta tggaaaaatt tgcaaatgtg ggagtagctc gtggtttaac ttatggtcaa 1500
tcacttaatt tagctaagtt atatggttca aatatgaacc gtgtgatttc atacctacca 1560
gtagccaaag aatatgcagc taaatatgac tatccagttg atattgctgt cagtctaatt 1620
tatgccttag aggaagaagg ggtatacaca ccattagact tcttcgctcg tcgtacaacc 1680
ttcatgctgt tccaacatga caaaatgctt gcagttaaag aggcggttag ccaaacgatt 1740
gtcgattact ttggtttaga tcaagccact gcggatcaac agaaaacagc actagatgaa 1800
gaaattgcta aggctgaatt acagtactta aaa 1833
Claims (9)
1.一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体，其特征在于：所述表达载体由甘油磷酸氧化酶表达载体构建而来，在核糖体结合位点与起始密码子之间插入基因表达调节元件。
2.如权利要求1所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤，
S1、甘油磷酸氧化酶表达载体的构建；
S11、合成甘油磷酸氧化酶基因片段，所述甘油磷酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示；
S12、选取pET系列表达质粒；
S13、将S11中的甘油磷酸氧化酶基因片段插入到S12中的表达质粒中；
S2、在所述S1构建的甘油磷酸氧化酶表达载体中采用定点突变的方式插入基因表达调节元件获得重组的甘油磷酸氧化酶表达载体；所述基因表达调控元件为胞嘧啶和鸟嘌呤组成的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述S13中包括如下步骤：
S131、对S11中的甘油磷酸氧化酶基因片段及S12中的表达质粒进行双酶切；
S132、对经过酶切后的甘油磷酸氧化酶基因片段和表达质粒进行纯化；
S133、采用连接酶将纯化后的甘油磷酸氧化酶基因片段和质粒片段进行连接。
4.如权利要求2所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述基因表达调节元件插入位点为核糖体结合位点与起始密码子之间。
5.如权利要求2所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述S11中甘油磷酸氧化酶基因来源于Aerococcus viridans菌株。
6.如权利要求2所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述S12中pET系列表达质粒为pET28a或pET24d表达质粒。
7.如权利要求2所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述S2中基因表达调节元件序列中包含5-7个碱基。
8.如权利要求7所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述S2中基因表达调节元件序列为CCGGGG或GGCCGG。
9.如权利要求2所述的重组甘油磷酸氧化酶表达载体的构建方法，其特征在于：所述S131中采用限制性内切酶进行双酶切。
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