CN101857865A - 重组人表皮生长因子工程菌的构建方法 - Google Patents
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Abstract
重组人表皮生长因子工程菌的构建方法，它涉及表皮生长因子工程菌的构建方法。它解决了现有重组人表皮生长因子的纯化困难、产量低和生物活性低问题。方法：一、根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列，合成序列并获得pMD-OmpA-hEGF；二、pMD-OmpA-hEGF和pSE分别经XhoI和EcorI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建质粒pSE-OmpA-hEGF；三、将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-Codon plusTM中，即完成。本发明中原核表达系统的遗传背景清楚，易于改造，工艺简单，成本低，流程短，产量高，获得的蛋白易于纯化，蛋白的纯度高和生物活性高。
Description
技术领域
本发明涉及表皮生长因子工程菌的构建方法。
背景技术
人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是由53个氨基酸组成的多肽，分子量约为6000Da。EGF(表皮生长因子)的生物学功能使其在制药和化妆品领域具有广泛的应用。EGF能刺激多种细胞生长，抑制胃酸分泌，因而可用于创伤和消化性溃疡的治疗，还能用于化妆品领域，具有护肤、抗皱、美白等作用，因此获得大量具有生物活性的EGF尤为必要。hEGF曾在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和家蚕杆状病毒中成功地表达。
重组人表皮生长因子应用方面尚有两个亟需解决的问题，即重组人表皮生长因子的产量和生物活性问题。目前，临床应用的hEGF产品有的是细胞内以融合蛋白形式表达，鉴于hEGF在胞内以包涵体形式存在，在分离中需破裂细胞，导致纯化困难、产量低；而另外一些产品虽然是分泌性表达目的蛋白，提高了产量，但其导入的信号肽为碱性磷酸酶，只能穿过细胞内膜分泌到细胞周质中，存在分离中需破裂细胞，而且生物活性降低。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有重组人表皮生长因子的纯化困难、产量低和生物活性低问题，而提供重组人表皮生长因子工程菌的构建方法。
重组人表皮生长因子工程菌的构建方法按以下步骤进行：一、根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列，然后合成重组OmpA-hEGF人工序列，再将重组OmpA-hEGF人工序列连接到质粒pMD上，合成出质粒pMD-OmpA-hEGF；二、质粒pMD-OmpA-hEGF和质粒pSE分别经XhoI和EcorI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建质粒pSE-OmpA-hEGF；三、将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-Codon plusTM中，即完成重组人表皮生长因子工程菌的构建；其中步骤一中根据大肠杆菌偏爱密码子设重组hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。
本发明中以BL21-Codon plusTM为宿主菌，选用分泌性表达载体pSE系列作为hEGF表达载体，同时导入信号肽OmpA序列，能同时穿过细胞内膜及外膜，使其表达为细胞外分泌性，避免了胞内以包涵体形式表达时所造成的纯化困难的弊端，且该系列载体C端含有6×His基因，所表达蛋白可利用商品化亲和层析柱快速纯化，蛋白的纯度高和生物活性高。
本发明中原核表达系统的遗传背景清楚，易于改造，工艺简单，成本低，流程短，产量高达50mg/L，获得的蛋白易于纯化，是表达外源基因的首选系统。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式重组人表皮生长因子工程菌的构建方法按以下步骤进行：一、根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列，然后合成重组OmpA-hEGF人工序列，再将重组OmpA-hEGF人工序列连接到质粒pMD上，合成出质粒pMD-OmpA-hEGF；二、质粒pMD-OmpA-hEGF和质粒pSE分别经XhoI和EcorI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建质粒pSE-OmpA-hEGF；三、将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-CodonplusTM中，即完成重组人表皮生长因子工程菌的构建；其中步骤一中根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。
本实施方式步骤一中合成重组OmpA-hEGF人工序列，再将重组OmpA-hEGF人工序列连接到质粒pMD上，合成出质粒pMD-OmpA-hEGF，是由上海超世生物科技有限公司完成。
本实施方式步骤二中pSE购买自invitrogen公司。
本实施方式步骤二中双酶切条件为37℃下酶切6小时。
本实施方式步骤三将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-CodonplusTM中完成构建，然后可以进行融合蛋白的诱导表达及纯化，即：取新鲜菌液按1∶100的体积接种于200mL含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基(10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠加入蒸馏水并定容至1000mL，pH＝7.4)，37℃振荡培养至菌液OD600＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养4h，离心收集上清液；将上清液经HisSrapTMFF亲和层析纯化后，纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析，brandford法测定蛋白浓度为50mg/L。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中 pMD-OmpA-hEGF双酶切的体系如下：
成分 用量
pMD-OmpA-hEGF 20μL
XhoI 2.5μL
EcorI 2.5μL
Buffer 10×H 2.0μL
H2O 20μL 。
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中pSE双酶切的体系如下：
成分 用量
pSE 10μL
XhoI 2.5μL
EcorI 2.5μL
Buffer 10×H 5.0μL
H2O 30μL。
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中连接的体系如下：
成分 用量
10×T4 DNA连接酶缓冲液 1.0μL
酶切后的pMD-OmpA-hEGF 1.0μL
酶切后的pSE 0.2μL
T4DNA连接酶 1.0μL
H2O 6.8μL 。
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
序列表
<110>黑龙江省科学院微生物研究所
<120>重组人表皮生长因子工程菌的构建方法
<160>1
<210>1
<211>241
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据大肠杆菌偏爱密码子设计hEGF序列的基因序列。
<400>1
ccctcgagtt aacgcagttc ccaccatttc aggtcacggt actggcaacg ttcaccgatg 60
taaccaacaa cacagttgca cgcgtatttg tccagagctt cgatatacat gcaaacacca 120
tcgtgtaggc agtaaccgtc gtgagacagc gggcattcag agtcggaatt ggcctgcgct 180
acggtagcga aaccagccag tgccactgca atcgcgatag ctgtcttttt catgaattcc 240
g 241
Claims (4)
1.重组人表皮生长因子工程菌的构建方法，其特征在于重组人表皮生长因子工程菌的构建方法按以下步骤进行：一、根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列，然后合成重组OmpA-hEGF人工序列，再将重组OmpA-hEGF人工序列连接到质粒pMD上，合成出质粒pMD-OmpA-hEGF；二、质粒pMD-OmpA-hEGF和质粒pSE分别经XhoI和EcorI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建质粒pSE-OmpA-hEGF；三、将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-Codon plusTM中，即完成重组人表皮生长因子工程菌的构建；其中步骤一中根据大肠杆菌偏爱密码子重组hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。
2.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子工程菌的构建方法，其特征在于步骤二中pMD-OmpA-hEGF双酶切的体系如下：
成分 用量
pMD-OmpA-hEGF 20μL
XhoI 2.5μL
EcorI 2.5μL
Buffer 10×H 2.0μL
H2O 20μL。
3.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子工程菌的构建方法，其特征在于步骤二中pSE双酶切的体系如下：
成分 用量
pSE 10μL
XhoI 2.5μL
EcorI 2.5μL
Buffer 10×H 5.0μL
H2O 30μL。
4.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子工程菌的构建方法，其特征在于步骤二中连接的体系如下：
成分 用量
10×T4 DNA连接酶缓冲液 1.0μL
酶切后的pMD-OmpA-hEGF 1.0μL
酶切后的pSE 0.2μL
T4DNA连接酶 1.0μL
H2O 6.8μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201010195640A CN101857865A (zh) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | 重组人表皮生长因子工程菌的构建方法 |
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| CN101857865A true CN101857865A (zh) | 2010-10-13 |
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| CN201010195640A Pending CN101857865A (zh) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | 重组人表皮生长因子工程菌的构建方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN101857865A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102952817A (zh) * | 2011-08-16 | 2013-03-06 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法 |
| RU2521515C2 (ru) * | 2011-03-02 | 2014-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОСНОВА" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА СЛИТОГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗЫ (GST-hEGF) И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAS007, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ GST-hEGF В КЛЕТКАХ Escherichia coli |
| CN107308441A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-11-03 | 江苏迈健生物科技发展股份有限公司 | 干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用 |
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2010
- 2010-06-09 CN CN201010195640A patent/CN101857865A/zh active Pending
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| RU2521515C2 (ru) * | 2011-03-02 | 2014-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОСНОВА" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА СЛИТОГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗЫ (GST-hEGF) И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAS007, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ GST-hEGF В КЛЕТКАХ Escherichia coli |
| CN102952817A (zh) * | 2011-08-16 | 2013-03-06 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法 |
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| CN107308441A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-11-03 | 江苏迈健生物科技发展股份有限公司 | 干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101013 |