CN106497973B

CN106497973B - 一种人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体、表达系统、制备方法和应用

Info

Publication number: CN106497973B
Application number: CN201611019369.2A
Authority: CN
Inventors: 王小引; 王天云; 张玺; 王俐; 李琴; 王芳; 张俊河; 林艳; 付笑笑
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: CN106497973A

Abstract

本发明公开了一种人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体、表达系统、制备方法和应用，属于基因工程与基因治疗技术领域。该附着体表达载体上插入有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的分段β‑干扰素MAR序列(或者与该序列95％以上同源的核苷酸序列)，相较包含全长MAR序列或387bp MAR序列的表达载体，该载体能高效、持续、稳定地表达外源目的基因，尤其是包含E段MAR序列的载体表达最佳，可用于基因治疗。在该载体中，分段MAR序列插入载体的多克隆位点也即eGFP下游处，一方面能克服转基因沉默，另一方面能提高目的蛋白的表达水平以及后续单克隆细胞株筛选的有效性。

Description

一种人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体、表达系统、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体，同时还涉及包含该附着体表达载体的表达系统、制备方法和应用，属于基因工程与基因治疗技术领域。

背景技术

基因治疗是向靶细胞中导入正常有功能的基因，以纠正或补偿致病基因产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的。有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中的高效、稳定表达，并且在很大程度上取决于所采用的载体系统。载体因进入宿主细胞方式的不同分为病毒载体和质粒载体，目前使用最多的是转染效率较高的病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒载体等。但是病毒载体转染进入宿主细胞后会与宿主细胞蛋白相互作用，易造成细胞病理改变，并存在潜在的致癌性和自身免疫原性。根据基因治疗载体能否进行自我复制可将其分为整合载体与非整合载体两类。整合载体转染宿主细胞后与宿主基因组的整合效应会引起插入突变甚至导致疾病的发生。在基因治疗中，理想的基因治疗载体不仅能提供治疗水平的基因表达，还能有效避免对宿主细胞或在遗传水平上的损害。

附着体表达载体是一种新型的非病毒表达载体，能够使外源基因以附着体的形式复制并分离到子代细胞中，从而使基因高效持续表达。核基质结合区(matrix attachmentregion，MAR)，亦称核骨架结合区(scaffold attachment region，SAR)序列，是真核生物细胞内染色质上可与细胞核基质结合的一段特殊DNA序列。作为真核生物一种新的顺式作用原件，1999年Piechaczek等研究人员用人类β-干扰素上的MAR序列替代SV40编码的大T抗原，成功构建了基于huIFNβ-MAR的载体pEPI，这是第一个完全由哺乳动物序列构建的非病毒附着体表达载体，其特异性依赖于MAR序列和其上游的转录单元。荧光原位杂交分析表明，pEPI载体在有丝分裂时期附着于宿主染色体外，以低拷贝数(5～10个拷贝/细胞)存在。但是pEPI载体也有许多不足之处，比如转基因沉默和稳定克隆形成率较低，等。

自第一代MAR介导的附着体表达载体pEPI被证实作用后，后续又开展了多项改进型研究，比如通过插入调控元件或减少细菌序列来弥补载体的不足。公布号CN102703503A公开了一种人类和哺乳动物附着体表达载体，该载体上插入有人工合成的β-干扰素特征性MAR序列(387bp，具体由人β-干扰素MAR序列2200bp和人β-珠蛋白MAR序列2150bp的特征性元件剪切拼接而成)，能够介导外源基因在哺乳动物细胞中表达，并且由于外源基因附着而非整合到宿主染色体上，因而还能克服传统载体整合效应带来的副作用，但是，研究也发现该表达载体驱动的转基因表达存在拷贝数低、表达不稳定和表达水平低等缺陷，导致研究本身与临床实际应用的差距增大。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体，该载体能驱动外源目的基因高效、持续、稳定表达。

同时，本发明还提供一种上述附着体表达载体的制备方法。

最后，本发明再提供一种包含上述附着体表达载体的真核细胞表达系统、制备方法和应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体，其上插入有如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示的分段β-干扰素MAR序列，或者与该序列95％以上同源的核苷酸序列。

所述附着体表达载体的出发载体为人类和其他哺乳动物细胞表达载体，如pEGFP-N1、pEGFP-N3、pEGFP-C1、pEGFP-C2、pEGFP-1、pEYFP-N1、pEYFP-C1、pDsRedN1、pDsRedC1、pDsRed2N1、pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1(-)、pCDNA3.1(neo+)或pCDNA3.1(zeo+)等。

上述附着体表达载体的制备可采用常规方法，将序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3插入出发载体中即可。具体制备步骤如下：

1)以人外周血基因组DNA为模板，利用引物对E1/E2、D1/D2或C1/C2进行PCR扩增，得到扩增片段；

2)利用KpnⅠ和BamHⅠ酶双酶切上述扩增片段和出发载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，即得；

引物对E1/E2为：

E1：5′-ATCGGTACCTATCCATAGCTGATTGGTCT-3′；

E2：5′-TGAGGATCCCTATCAAGATATTTAAAGAAA-3′；

引物对D1/D2为：

D1：5′-ATCGGTACCTACCCCATGGGCTTCCTCCC-3′；

D2：5′-TGAGGATCCTCTCAATTTTGCTATGAACC-3′；

引物对C1/C2为：

C1：5′-ATCGGTACCCATGCCATCATGACTTCAGT-3′；

C2：5′-TGAGGATCCTATTTTTGATGACCTTGACA-3′。

真核细胞表达系统，包含上述附着体表达载体。

真核细胞表达系统的制备，包括以下步骤：

1)将外源目的基因插入上述附着体表达载体的启动子下游，构建得到重组表达载体；

2)将重组表达载体转染进入宿主细胞，经筛选得到真核细胞表达系统。

步骤2)中宿主细胞为人和其他哺乳动物细胞，如DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S等中的任意一种。

步骤2)中转染的方法包括磷酸钙法、电转法、脂质体转染法等。

上述附着体表达载体、真核细胞表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明中附着体表达载体上插入有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的分段β-干扰素MAR序列(或者与该序列95％以上同源的核苷酸序列)，相较包含全长MAR序列或387bp MAR序列的表达载体，该载体能高效、持续、稳定地表达外源目的基因，尤其是包含E段MAR序列的载体表达最佳，可用于基因治疗。在该载体中，分段MAR序列插入载体的多克隆位点也即eGFP下游处，一方面能克服转基因沉默，另一方面能提高目的蛋白的表达水平以及后续单克隆细胞株筛选的有效性。

附图说明

图1为重组质粒pMAR-In(A,B,C,D,E)的结构示意图；

图2为pMAR-In(A,B,C,D,E)载体、pMAR-In载体和pEGFP-C1-MAR载体转染CHO细胞的转染率；

图3为各载体转染CHO细胞eGFP表达水平；

图4为pMAR-In(A,B,C,D,E)载体转染CHO细胞eGFP表达稳定性；

图5为质粒还原酶切电泳图；

图6为荧光原位杂交图；

图7为ELISA检测EPO基因在转染CHO细胞中的表达水平。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

表达载体pMAR-InE的构建，具体步骤如下：

1)以人外周血基因组DNA为模板，利用引物对E1/E2进行PCR扩增，得到MAR片段；

引物对E1/E2为：

E1：5′-ATCGGTACCTATCCATAGCTGATTGGTCT-3′；

E2：5′-TGAGGATCCCTATCAAGATATTTAAAGAAA-3′；

扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，25μmol/L dNTP 2.0μL，5U/μL Taq酶0.5μL，100ng/μL模板DNA 1.0μL，10μmol/L引物E1/E2各1.0μL，ddH₂O 17.0μL，共计25μL；

扩增的反应程序为：95℃3min，94℃40s，56℃30s，72℃40s，30个循环，72℃3min；

2)利用KpnⅠ和BamHⅠ酶双酶切上述MAR片段和pEGFP-C1质粒DNA，凝胶回收酶切后的MAR片段和pEGFP-C1线性质粒DNA，连接后转化E.coli JM109菌株感受态细胞，鉴定，得到表达载体pMAR-InE；

MAR片段的双酶切体系为：1μg/μL MAR片段10μL，20×K buffer 1μL，10U/μL KpnⅠ/BamHⅠ酶各0.5μL，补足三蒸水至20μL；酶切条件为：37℃水浴酶切6h；

pEGFP-C1质粒双酶切体系为：0.8μg/μL pEGFP-C1质粒10μL，20×K buffer 1μL，10U/μL KpnⅠ/BamHⅠ酶各0.5μL，补足三蒸水至20μL；37℃水浴酶切6h；

连接的反应体系为：1μg/μL酶切后的MAR片段3μL，1μg/μL pEGFP-C1线性质粒DNA1μL，10×DNA ligase buffer 1μL，350U/μL T4连接酶0.5μL，补足三蒸水至20μL；连接条件为：16℃连接过夜。

实施例2

表达载体pMAR-InD的构建，除采用引物对D1/D2进行PCR扩增外，其他操作基本同实施例1；

引物对D1/D2为：

D1：5′-ATCGGTACCTACCCCATGGGCTTCCTCCC-3′；

D2：5′-TGAGGATCCTCTCAATTTTGCTATGAACC-3′。

实施例3

表达载体pMAR-InC的构建，除采用引物对C1/C2进行PCR扩增外，其他操作基本同实施例1；

引物对C1/C2为：

C1：5′-ATCGGTACCCATGCCATCATGACTTCAGT-3′；

C2：5′-TGAGGATCCTATTTTTGATGACCTTGACA-3′。

实施例4

真核细胞表达系统的构建，具体步骤如下：

1)合成人促红细胞生成素(EPO)序列

根据人的EPO基因cDNA序列(NCBI Reference Sequence：NM_000799.2)设计PCR引物P1和P2，为实现定向克隆，分别在引物的5′端引物HindⅢ/Kpn I酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P1：5′-ATCAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGTCC-3′；

P2：5′-TAAGGTACCTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3′；

取人外周血液，用DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增(扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，10μmol/L引物P1/P2各1.0μL，25μmol/LdNTP 2.0μL，100ng/μL模板DNA 1.0μL，5U/μL Taq酶0.5μL，ddH₂O补至25μL；反应条件为：95℃3min，94℃40s，60℃30s，72℃40s，30个循环，72℃3min)，琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与NCBI登录的EPO基因cDNA序列完全一致。

2)构建含EPO序列的pMAR-InE-EPO载体

利用HindⅢ/KpnⅠ双酶切EPO基因的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用HindⅢ/KpnⅠ双酶切pMAR-InE载体，采用常规的酶切方法，37℃酶切8h；琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收EPO基因序列片段和pMAR-InE线性质粒DNA。

EPO基因扩增产物的双酶切体系为：1μg/μL EPO基因的PCR扩增产物8μL，10×Mbuffer 2μL，10U/μL HindⅢ/KpnⅠ酶各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

pMAR-InE质粒的双酶切体系为：0.8μg/μL pMAR-InE质粒10μL，10×M buffer 2μL，10U/μL HindⅢ/KpnⅠ酶各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

酶切回收后的EPO基因cDNA序列片段与pMAR-InE线性质粒DNA按摩尔比1:5进行连接，16℃连接过夜；将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中转化，将转化菌液接种在含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜；挑取单菌落继代培养，用HindⅢ/KpnⅠ双酶切重组质粒载体，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pMAR-InE-EPO。

3)构建真核细胞表达系统

CHO细胞转染前处理：转染前1d细胞进行传代，吸去旧培养基，加入2.5mL(2～3mL均可)0.25％胰酶消化液，于37℃培养箱中放置4min(3～5min均可)；显微镜下观察细胞形态，80％细胞由多角形变为圆形时，吸去消化液，加入3mL完全培养基，接种于24孔培养板中，用吸管轻轻吹打细胞使其悬浮；按所需量吸取细胞悬液(1～2×10⁶cells/66mm培养皿)，放入一新的培养皿，加培养基5mL，于37℃、5％CO₂饱和湿度下培养，待细胞融合达80％(70％～80％均可)时进行转染。

细胞转染方法参照脂质体2000转染试剂盒说明书，具体为：取0.9μg上述载体加入到50μL不含血清和抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀；取2μL脂质体2000试剂，稀释于50μL不含血清和抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀，并室温放置5min；取50μL脂质体2000稀释液滴加到质粒DNA稀释液中，一边滴加一边混匀，室温孵育18min(15～20min均可)后，将约100μL脂质体2000/DNA复合物加入到每个孔中，并轻轻摇动使其混合，6h后将无血清培养基换为含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基。

转染24h后，用终浓度为800μg/mL的G418培养液加压筛选2周，每3d更换一次培养液，待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25％胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，分至96孔培养板继续培养，大约培养7d后，转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达80％～90％时，收集细胞即可。

试验例

1、表达载体pMAR-In(A,B,C,D,E)的构建

1.1分段MAR序列的PCR扩增

将长度为2201bp的人β-干扰素核基质结合序列(GenBank：M83137.1)大致均等的分为5段，分别用A、B、C、D、E表示，核苷酸序列分别为1～480、361～900、781～1320、1201～1740、1621～2201位碱基，每段序列重叠约120bp。

分别设计引物扩增每段序列，为实现定向克隆，引物设计时加入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点(见下划线处)，引物对A1/A2、B1/B2、C1/C2、D1/D2、E1/E2如下所示：

A段MAR序列的引物为：

A1：5′-ATCGGTACCGAATTCAGCAAGGTCGCCAC-3′；

A2：5′-TGAGGATCCTAGTGGAACATTCTTTCCCA-3′；

B段MAR序列的引物为：

B1：5′-ATCGGTACCTGTTCACCCCAAAAAAGCTG-3′；

B2：5′-TGAGGATCCGGTTTTTTAATTTTAAAAAT-3′；

C段MAR序列的引物为：

C1:5′-ATCGGTACCCATGCCATCATGACTTCAGT-3′；

C2:5′-TGAGGATCCTATTTTTGATGACCTTGACA-3′；

D段MAR序列的引物为：

D1:5′-ATCGGTACCTACCCCATGGGCTTCCTCCC-3′；

D2:5′-TGAGGATCCTCTCAATTTTGCTATGAACC-3′；

E段MAR序列的引物为：

E1:5′-ATCGGTACCTATCCATAGCTGATTGGTCT-3′；

E2:5′-TGAGGATCCCTATCAAGATATTTAAAGAAA-3′。

提取人外周血基因组DNA作为模板，PCR扩增分段MAR序列，扩增体系如下表1所示，扩增程序为：95℃3min，94℃40s，56℃30s，72℃40s，30个循环，72℃3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的分段MAR序列与GenBank登录的序列完全一致。

表1 PCR扩增体系

1.2pMAR-In(A,B,C,D,E)质粒载体的构建

1.2.1酶切反应

将扩增的分段MAR序列和pEGFP-C1质粒分别用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切，酶切体系如下表2、3所示，充分混匀后，分别于37℃下水浴6h。

表2分段MAR序列酶切体系

表3 pEGFP-C1质粒的双酶切体系

1.2.2琼脂糖凝胶电泳的鉴定和目的片段的回收

酶切结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切情况，凝胶回收酶切后的分段MAR片段和pEGFP-C1线性质粒DNA。

1.2.3分段MAR片段与pEGFP-C1线性质粒的连接、转化与鉴定

回收的分段MAR片段与pEGFP-C1线性质粒的连接体系如下表4所示，充分混匀后，于16℃下连接过夜。

表4连接体系

无菌状态下取新鲜制备的E.coli JM109菌株感受态细菌200μL转移至灭菌的1.5mL EP管中，加入10μL上述连接好的反应溶液进行转化，转化菌液接种在含卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃培养箱中过夜。从培养的平板上挑取阳性转化子于盛有3mL LK液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。提取重组质粒，对重组质粒进行酶切验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，将序列完全正确的载体命名为pMAR-In(A,B,C,D,E)，质粒图谱如图1所示。

2、附着体表达载体转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统的建立

用表达载体pMAR-In(A,B,C,D,E)、pMAR-In载体(含2201bp全长MAR，见GenBank：M83137.1)和pEGFP-C1-MAR(387bp MAR序列，见专利CN102703503A)转染CHO细胞。细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，根据实验设计转染共分为8组：未转染组，转染pMAR-In(A,B,C,D,E)载体组、pMAR-In载体组和pEGFP-C1-MAR载体组。

细胞稳定转染筛选：转染48h后，用终浓度为800μg/mL的G418培养液加压筛选，每3d(3～4d均可)更换培养液，一周后G418培养液改为维持浓度400μg/mL持续筛选2周，同样每3d(3～4d均可)更换一次培养液，大约14d待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25％胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，最后分至96孔培养板继续培养，大约培养7d后，转入培养瓶内继续培养，待瓶中细胞密度达80％(80％～90％均可)时，将细胞一分为二，一组加400μg/mL G418持续传代培养120d，一组不加G418传代培养120d。每间隔12d(10～15d均可)收集细胞，采用流式细胞术检测不同时间eGFP的表达量。

转染后48h，用流式细胞仪检测各组转染阳性率，结果显示：转染率最高的是pMAR-InE载体(87.15％)，接下来是pMAR-InD(83.50％)、pMAR-InC(80.04％)、pMAR-InA(31.05％)、pEGFP-C1-MAR(30.29％)、pMAR-InB(20.37％)和pMAR-In载体(15.70％)，表明含分段MAR的附着体载体的转染率均高于含全长MAR的pMAR-In载体(见图2)。

转染后14d，转染pMAR-In(C,D,E)载体的CHO细胞株eGFP的相对表达量明显高于pMAR-In(A,B)、pEGFP-C1-MAR和pMAR-In，表达量最高的是pMAR-InE。鉴于pMAR-InC、pMAR-InD和pMAR-InE 3个载体转染CHO细胞后eGFP表达量较高，接下来对转染这3个载体的CHO细胞进行单克隆化和筛选，经G418抗性稳定筛选或不加G418培养120d后，3个载体的报告基因eGFP表达量依然较高，尤其是pMAR-InE载体转染的CHO细胞(见图3)。从3个载体转染后稳定传代120天eGFP衰减率来看，pMAR-InE的衰减率明显低于pMAR-InA和pMAR-InB(见图4)。

3、质粒还原试验

采用Hirt裂解法提取转染120d后pMAR-InE载体的附着体质粒：向收集的细胞中加入2mL Hirt裂解缓冲液，室温静置20min，使充分裂解；加入1/4体积(0.5mL)5mol/L NaCl，4℃放置过夜(8～20h均可)；次日，15000rpm离心40min，取上清，加RNase A(2g/L)125μL，于37℃水浴60min；用25:24:1的酚氯仿异戊醇抽提2次，再用氯仿抽提1次；取上清，加入5mL-20℃预冷的异丙醇于10mL离心管中，-20℃放置过夜；次日，12000rpm离心30min，加入1mL无水乙醇吹打白色沉淀使其悬浮于1.5mL EP管内，无水乙醇洗涤2次，空气中干燥后加入20μLElution Buffer缓冲液溶解附着体质粒。

无菌状态下取新鲜制备的感受态细胞250μL转移至灭菌的4mL离心管中，加入10μL提取的附着体质粒进行转化，将转化的菌液均匀地涂布于整个含卡那霉素的琼脂平板表面，于37℃培养箱中过夜培养，直至阳性转化子长出；从培养的平板上挑取阳性转化子置于装有3mL LK液体培养基的试管中，37℃摇床过夜培养；采用常规方法提取质粒，并进行酶切鉴定。结果表明，从转染pMAR-InE的CHO细胞中还原出的质粒经KpnⅠ/BamHⅠ双酶切能切出大小为581bp的MAR片段，与转染原质粒pMAR-InE的酶切结果一致(见图5，图中M：DL5000，1：原质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切，2：还原质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切)。

4、荧光原位杂交

培养细胞中期染色体的制备：当细胞系的融合达到约80％(75％～90％均可)时，于每5mL的培养基细胞中加入40μL秋水仙素，继续培养2h收集细胞；加入10mL 37℃水浴预热的0.075mol/L KCl溶液于15mL离心管中，用力吹打散开，37℃水浴低渗30min，约每8min用吸管吹打一次，使细胞充分分散悬浮于溶液中；向离心管中加1.5mL固定液并用吸管轻轻吹匀，预固定10min；2000rpm离心5min，弃上清液；固定I：沿管壁慢慢加入固定液6mL，用吸管吹打成细胞悬液后，37℃水浴20min；1000rpm离心10min，弃上清液；固定II：操作步骤同固定I；1000rpm离心10min离心，弃上清液，留下上清液的量使得细胞保持牛奶状细胞团(一般是0.5～1mL)，用吸管吹打成细胞悬液；滴片：用吸管吸取少量细胞悬液，高度35cm(30～40cm均可)，垂直滴在预冷的载玻片上，室温晾干；老化：染色体片子37℃老化3d(1～7d均可)。使用前玻片于60℃温箱孵育3～4小时。

将4mL(3～5mL均可)变性液置于74±1℃水浴(或杂交仪)平衡至少30min。(注意容器内的温度和实际温度)，将玻片浸入杂交液中4min(2～5min均可)，依据玻片的制备时间每增加一周，时间增加2min。梯度脱水：立即放入冰冷70％酒精中3min，然后依次置于85％、100％酒精缸中脱水，各1min。使用前置40℃(37～45℃均可)温箱中备用。将探针置于PCR仪内变性，程序设为：77℃5min、37℃2min，将变性后的探针加在完全干燥的玻片上(注意避光)，Rubber胶封片，杂交过夜(12～18h均可)。准备2缸洗液。1缸置于72℃，另一缸置于室温。将玻片置于72℃缸至少30min，轻轻揭去玻片上的胶，如果不好揭开或者避免干燥，可以先放在常温洗液里。将玻片放入72℃缸，洗涤2min；常温缸洗涤2min。将玻片依次放入75％、85％、100％酒精缸中，脱水各1min，脱水后空气中干燥。复染并观察结果：加二氨基苯基吲哚(DAPI)20μL复染，加盖玻片。置于暗处20min，荧光显微镜观察结果并采集图像。结果表明：pMAR-InE载体在CHO细胞的有丝分裂期以附着于染色体外的形式存在(见图6)。

5、重组表达载体在CHO细胞中表达EPO蛋白水平的比较

采用与实施例4相同的方法构建含EPO的pMAR-In-EPO载体和pEGFP-C1-MAR-EPO载体。CHO于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞转染方法参照脂质体2000转染试剂盒说明书。转染24h后，用终浓度为800μg/mL的G418培养液加压筛选2周，每3d更换一次培养液，待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25％胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，分至96孔培养板继续培养，大约培养7d后，转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达80％～90％时，收集细胞以备检测。

如图7所示，ELISA分析结果显示：载体pMAR-InE-EPO转染的CHO细胞中EPO蛋白的表达量高达42.13mg/L，明显高于pMAR-In-EPO载体(22.05mg/L)和pEGFP-C1-MAR-EPO载体(18.56mg/L)。以pEGFP-C1-MAR-EPO载体EPO的表达量设为1，转染pMAR-InE-EPO载体的EPO蛋白的表达量是pEGFP-C1-MAR-EPO的2.27倍，是pMAR-In-EPO载体的1.91倍。

实施例及试验例中所用pEGFP-C1质粒载体、细胞系、工具酶和试剂等均为市售商品。其中pEGFP-C1质粒载体购自于美国Clontech公司，中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary，CHO)细胞购自于中国科学院上海细胞库。

<110> 新乡医学院

<120> 一种人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体、表达系统、制备方法和应用

<170> PatentIn version 3.5

<211> 540

<212> DNA

<213> 序列

<221> C段MAR序列

<222> (1)..(540)

<400> 1

CATGCCATCA TGACTTCAGT GTAGAGAAAA ATTTCTTATG ACTCAAAGTC CTAACCACAA 60

AGAAAAGATT GTTAATTAGA TTGCATGAAT ATTAAGACTT ATTTTTAAAA TTAAAAAACC 120

ATTAAGAAAA GTCAGGCCAT AGAATGACAG AAAATATTTG CAACACCCCA GTAAAGAGAA 180

TTGTAATATG CAGATTATAA AAAGAAGTCT TACAAATCAG TAAAAAATAA AACTAGACAA 240

AAATTTGAAC AGATGAAAGA GAAACTCTAA ATAATCATTA CACATGAGAA ACTCAATCTC 300

AGAAATCAGA GAACTATCAT TGCATATACA CTAAATTAGA GAAATATTAA AAGGCTAAGT 360

AACATCTGTG GCAATATTGA TGGTATATAA CCTTGATATG ATGTGATGAG AACAGTACTT 420

TACCCCATGG GCTTCCTCCC CAAACCCTTA CCCCAGTATA AATCATGACA AATATACTTT 480

AAAAACCATT ACCCTATATC TAACCAGTAC TCCTCAAAAC TGTCAAGGTC ATCAAAAATA 540

<211> 540

<212> DNA

<213> 序列

<221> D段MAR序列

<222> (1)..(540)

<400> 2

TACCCCATGG GCTTCCTCCC CAAACCCTTA CCCCAGTATA AATCATGACA AATATACTTT 60

AAAAACCATT ACCCTATATC TAACCAGTAC TCCTCAAAAC TGTCAAGGTC ATCAAAAATA 120

AGAAAAGTCT GAGGAACTGT CAAAACTAAG AGGAACCCAA GGAGACATGA GAATTATATG 180

TAATGTGGCA TTCTGAATGA GATCCCAGAA CAGAAAAAGA ACAGTAGCTA AAAAACTAAT 240

GAAATATAAA TAAAGTTTGA ACTTTAGTTT TTTTTAAAAA AGAGTAGCAT TAACACGGCA 300

AAGTCATTTT CATATTTTTC TTGAACATTA AGTACAAGTC TATAATTAAA AATTTTTTAA 360

ATGTAGTCTG GAACATTGCC AGAAACAGAA GTACAGCAGC TATCTGTGCT GTCGCCTAAC 420

TATCCATAGC TGATTGGTCT AAAATGAGAT ACATCAACGC TCCTCCATGT TTTTTGTTTT 480

CTTTTTAAAT GAAAAACTTT ATTTTTTAAG AGGAGTTTCA GGTTCATAGC AAAATTGAGA 540

<211> 581

<212> DNA

<213> 序列

<221> E段MAR序列

<222> (1)..(581)

<400> 3

TATCCATAGC TGATTGGTCT AAAATGAGAT ACATCAACGC TCCTCCATGT TTTTTGTTTT 60

CTTTTTAAAT GAAAAACTTT ATTTTTTAAG AGGAGTTTCA GGTTCATAGC AAAATTGAGA 120

GGAAGGTACA TTCAAGCTGA GGAAGTTTTC CTCTATTCCT AGTTTACTGA GAGATTGCAT 180

CATGAATGGG TGTTAAATTT TGTCAAATGC TTTTTCTGTG TCTATCAATA TGACCATGTG 240

ATTTTCTTCT TTAACCTGTT GATGGGACAA ATTACGTTAA TTGATTTTCA AACGTTGAAC 300

CACCCTTACA TATCTGGAAT AAATTCTACT TGGTTGTGGT GTATATTTTT TGATACATTC 360

TTGGATTCTT TTTGCTAATA TTTTGTTGAA AATGTTTGTA TCTTTGTTCA TGAGAGATAT 420

TGGTCTGTTG TTTTCTTTTC TTGTAATGTC ATTTTCTAGT TCCGGTATTA AGGTAATGCT 480

GGCCTAGTTG AATGATTTAG GAAGTATTCC CTCTGCTTCT GTCTTCTGAA AGAGATTGTA 540

GAAAGTTGAT ACAATTTTTT TTTCTTTAAA TATCTTGATA G 581

<211> 2201

<212> DNA

<213> 序列

<221> MAR序列

<222> (1)..(2201)

<400> 4

GAATTCAGCA AGGTCGCCAC GCACAAGATC AATATTAACA ATCAGTCATC TCTCTTTAGC 60

AATAAAAAGG TGAAAAATTA CATTTTAAAA ATGACACCAT AGACGATGTA TGAAAATAAT 120

CTACTTGGAA ATAAATCTAG GCAAAGAAGT GCAAGACTGT TACCCAGAAA ACTTACAAAT 180

TGTAAATGAG AGGTTAGTGA AGATTTAAAT GAATGAAGAT CTAAATAAAC TTATAAATTG 240

TGAGAGAAAT TAATGAATGT CTAAGTTAAT GCAGAAACGG AGAGACATAC TATATTCATG 300

AACTAAAAGA CTTAATATTG TGAAGGTATA CTTTCTTTTC ACATAAATTT GTAGTCAATA 360

TGTTCACCCC AAAAAAGCTG TTTGTTAACT TGTCAACCTC ATTTCAAAAT GTATATAGAA 420

AGCCCAAAGA CAATAACAAA AATATTCTTG TAGAACAAAA TGGGAAAGAA TGTTCCACTA 480

AATATCAAGA TTTAGAGCAA AGCATGAGAT GTGTGGGGAT AGACAGTGAG GCTGATAAAA 540

TAGAGTAGAG CTCAGAAACA GACCCATTGA TATATGTAAG TGACCTATGA AAAAAATATG 600

GCATTTTACA ATGGGAAAAT GATGATCTTT TTCTTTTTTA GAAAAACAGG GAAATATATT 660

TATATGTAAA AAATAAAAGG GAACCCATAT GTCATACCAT ACACACAAAA AAATTCCAGT 720

GAATTATAAG TCTAAATGGA GAAGGCAAAA CTTTAAATCT TTTAGAAAAT AATATAGAAG 780

CATGCCATCA TGACTTCAGT GTAGAGAAAA ATTTCTTATG ACTCAAAGTC CTAACCACAA 840

AGAAAAGATT GTTAATTAGA TTGCATGAAT ATTAAGACTT ATTTTTAAAA TTAAAAAACC 900

ATTAAGAAAA GTCAGGCCAT AGAATGACAG AAAATATTTG CAACACCCCA GTAAAGAGAA 960

TTGTAATATG CAGATTATAA AAAGAAGTCT TACAAATCAG TAAAAAATAA AACTAGACAA 1020

AAATTTGAAC AGATGAAAGA GAAACTCTAA ATAATCATTA CACATGAGAA ACTCAATCTC 1080

AGAAATCAGA GAACTATCAT TGCATATACA CTAAATTAGA GAAATATTAA AAGGCTAAGT 1140

AACATCTGTG GCAATATTGA TGGTATATAA CCTTGATATG ATGTGATGAG AACAGTACTT 1200

TACCCCATGG GCTTCCTCCC CAAACCCTTA CCCCAGTATA AATCATGACA AATATACTTT 1260

AAAAACCATT ACCCTATATC TAACCAGTAC TCCTCAAAAC TGTCAAGGTC ATCAAAAATA 1320

AGAAAAGTCT GAGGAACTGT CAAAACTAAG AGGAACCCAA GGAGACATGA GAATTATATG 1380

TAATGTGGCA TTCTGAATGA GATCCCAGAA CAGAAAAAGA ACAGTAGCTA AAAAACTAAT 1440

GAAATATAAA TAAAGTTTGA ACTTTAGTTT TTTTTAAAAA AGAGTAGCAT TAACACGGCA 1500

AAGTCATTTT CATATTTTTC TTGAACATTA AGTACAAGTC TATAATTAAA AATTTTTTAA 1560

ATGTAGTCTG GAACATTGCC AGAAACAGAA GTACAGCAGC TATCTGTGCT GTCGCCTAAC 1620

TATCCATAGC TGATTGGTCT AAAATGAGAT ACATCAACGC TCCTCCATGT TTTTTGTTTT 1680

CTTTTTAAAT GAAAAACTTT ATTTTTTAAG AGGAGTTTCA GGTTCATAGC AAAATTGAGA 1740

GGAAGGTACA TTCAAGCTGA GGAAGTTTTC CTCTATTCCT AGTTTACTGA GAGATTGCAT 1800

CATGAATGGG TGTTAAATTT TGTCAAATGC TTTTTCTGTG TCTATCAATA TGACCATGTG 1860

ATTTTCTTCT TTAACCTGTT GATGGGACAA ATTACGTTAA TTGATTTTCA AACGTTGAAC 1920

CACCCTTACA TATCTGGAAT AAATTCTACT TGGTTGTGGT GTATATTTTT TGATACATTC 1980

TTGGATTCTT TTTGCTAATA TTTTGTTGAA AATGTTTGTA TCTTTGTTCA TGAGAGATAT 2040

TGGTCTGTTG TTTTCTTTTC TTGTAATGTC ATTTTCTAGT TCCGGTATTA AGGTAATGCT 2100

GGCCTAGTTG AATGATTTAG GAAGTATTCC CTCTGCTTCT GTCTTCTGAA AGAGATTGTA 2160

GAAAGTTGAT ACAATTTTTT TTTCTTTAAA TATCTTGATA G 2201

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物A1

<222> (1)..(29)

<400> 5

ATCGGTACCG AATTCAGCAA GGTCGCCAC 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物A2

<222> (1)..(29)

<400> 6

TGAGGATCCT AGTGGAACAT TCTTTCCCA 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物B1

<222> (1)..(29)

<400> 7

ATCGGTACCT GTTCACCCCA AAAAAGCTG 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物B2

<222> (1)..(29)

<400> 8

TGAGGATCCG GTTTTTTAAT TTTAAAAAT 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物C1

<222> (1)..(29)

<400> 9

ATCGGTACCC ATGCCATCAT GACTTCAGT 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物C2

<222> (1)..(29)

<400> 10

TGAGGATCCT ATTTTTGATG ACCTTGACA 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物D1

<222> (1)..(29)

<400> 11

ATCGGTACCT ACCCCATGGG CTTCCTCCC 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物D2

<222> (1)..(29)

<400> 12

TGAGGATCCT CTCAATTTTG CTATGAACC 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物E1

<222> (1)..(29)

<400> 13

ATCGGTACCT ATCCATAGCT GATTGGTCT 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物E2

<222> (1)..(30)

<400> 14

TGAGGATCCC TATCAAGATA TTTAAAGAAA 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P1

<222> (1)..(29)

<400> 15

ATCAAGCTTA TGGGGGTGCA CGAATGTCC 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P2

<222> (1)..(29)

<400> 16

TAAGGTACCT CATCTGTCCC CTGTCCTGC 29

Claims

1.人类和其他哺乳动物细胞附着体表达载体，其特征在于：该载体上插入有如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的分段β-干扰素MAR序列。

2.根据权利要求1所述的附着体表达载体，其特征在于：所述附着体表达载体的出发载体为人类和其他哺乳动物细胞表达载体。

3.根据权利要求2所述的附着体表达载体，其特征在于：所述出发载体为pEGFP-N1、pEGFP-N3、pEGFP-C1、pEGFP-C2、pEGFP-1、pEYFP-N1、pEYFP-C1、pDsRedN1、pDsRedC1、pDsRed2N1、pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1(-)、pCDNA3.1(neo+)或pCDNA3.1(zeo+)。

4.如权利要求1~3中任一项所述附着体表达载体的制备方法，其特征在于：将序列SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3插入出发载体中，即可。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：

1）以人外周血基因组DNA为模板，利用引物对E1/E2、D1/D2或C1/C2进行PCR扩增，得到扩增片段；

2）利用KpnⅠ和BamHⅠ酶双酶切上述扩增片段和出发载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，即得；

引物对E1/E2为：

E1：5′-ATCGGTACCTATCCATAGCTGATTGGTCT-3′；

E2：5′-TGAGGATCCCTATCAAGATATTTAAAGAAA-3′；

引物对D1/D2为：

D1：5′-ATCGGTACCTACCCCATGGGCTTCCTCCC-3′；

D2：5′-TGAGGATCCTCTCAATTTTGCTATGAACC-3′；

引物对C1/C2为：

C1：5′-ATCGGTACCCATGCCATCATGACTTCAGT-3′；

C2：5′-TGAGGATCCTATTTTTGATGACCTTGACA-3′。

6.包含如权利要求1~3中任一项所述附着体表达载体的真核细胞表达系统。

7.如权利要求6所述表达系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将外源目的基因插入上述附着体表达载体的启动子下游，构建得到重组表达载体；

2）将重组表达载体转染进入宿主细胞，经筛选得到真核细胞表达系统。

8.如权利要求1~3中任一项所述附着体表达载体、权利要求6所述表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。