CN113512537A - 高表达人促卵泡激素的重组cho细胞株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及助孕技术附属装置的技术领域，特别是涉及一种高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法，纯度高、成本低、生物活性稳定；包括CHO‑S细胞株、pCHO1.0载体、高表达元件和目的蛋白氨基酸序列。

Description

高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法

技术领域

本发明涉及助孕技术附属装置的技术领域，特别是涉及一种高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法。

背景技术

WHO统计显示，全球约有4500万~5200万名的夫妇受不孕不育影响，我国育龄夫妇中不孕不育率高达10%，累及人口达1000多万，其中因为排卵障碍而导致的不孕不育约占1/3，不孕不育已成为严重的社会问题，人促卵泡激素在治疗排卵障碍性疾病、体外受精和胚胎移植助孕技术有重要意义。

FSH是一种由脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白类促性腺激素，是调控哺乳动物生长、性成熟和繁殖的核心激素，与促黄体生成素、促甲状腺激素、绒毛膜促性腺激素共同组成糖蛋白激素家族，具有促进和维持正常性腺发育和生殖的功能。该家族是目前己知的结构最为复杂的蛋白质激素，它们虽然功能不同，结构却极为相似，均可由解离的α亚基和β亚基以非共价键结合形成异二聚体。在同一物种，4种激素的α亚基完全相同，由同一基因编码，而β亚基则是特异的，决定着激素的特定生理功能。一般认为α亚基负责信号转导作用，而β亚基是功能亚基，参与受体结合，后来发现α亚基和β亚基均参与受体结合及信号转导作用。

目前FSH制剂根据其来源及制备工艺主要分为三大类。第一类是从下丘脑垂体中得到的，简称垂体FSH，因其含量较低，纯度不高，杂质含量高，副作用较大，而逐渐被淘汰。第二类是从绝经后妇女的尿中提取出来的尿源FSH，但存在生物资源有限，个体及批间差异大，尿液中残留的蛋白成分导致FSH的生物学活性降低，且生产成本较高的问题。另一类是重组的人促卵泡素，根据其来源分为大肠杆菌原核表达的FSH,但因其不具有糖基化修饰功能，不能产生有活性的FSH，而且表达产物往往以包涵体的形式存在，二硫键不能正确折叠，无法形成完全正确的空间构象。酵母细胞表达的FSH，但由于巴氏毕赤酵母糖基化模式与哺乳动物细胞的差异，表达产物虽然具有类似的结合能力，但体外活性仅为天然产物活性的1/3。有学者尝试利用昆虫细胞及植物细胞表达FSH，但均存在与天然FSH糖基化差异较大，活性不高及产业化困难的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种纯度高、成本低、生物活性稳定的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株及其构建方法。

本发明的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，包括CHO-S细胞株、pCHO1.0载体、高表达元件和目的蛋白氨基酸序列。

本发明的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，FSHα亚基氨基酸序列为（92aa）：APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS。

本发明的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，FSHβ亚基氨基酸序列为（111aa）：NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE

本发明的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，pCHO1.0载体采用CMV启动子与人延伸因子EF-1/2启动子的杂合启动子。

本发明的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株的构建方法，包括以下方案：

（1）基于重组质粒pCHO1.0-Fα和pCHO1.0-Fβ共转染CHO细胞构建方案。

（2）基于双表达重组质粒pCHO1.0-Fα-Fβ转染CHO细胞构建方案。

与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明采用具有明确产权背景的CHO-S悬浮细胞株与pCHO1.0高表达载体组合，采用无血清CD培养基及大规模悬浮细胞培养工艺，筛选获得稳定、高表达工程细胞株。通过高表达元件、杂合启动子、信号肽、KOZAK序列的合理设计构建并筛选稳定、高表达的工程细胞株。建立的CHO-S工程细胞系支持高密度、无血清悬浮培养工艺，该工程细胞株筛选全程均采用无血清、无动物源成分的化学成分界定（CD）培养基，为后期工艺开发奠定基础。建立了高通量无血清培养基筛选平台，提高目标蛋白的表达量及蛋白质量，建立稳定高产的无血清细胞罐悬浮培养工艺。优选的工程细胞株经培养后，表达量不低于200mg/L，收集培养上清经纯化后采用SDS-PAGE、Western blot及N端氨基酸测序对目的产物进行初步确证，经大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)测定目的产物比活最高可达16036 IU/mg，达到国内外先进水平，该重组CHO细胞株支持从构建、筛选到培养全程无血清CD培养基工艺，全程无血清及蛋白成分，无动物来源成分，支持悬浮培养和生物反应器生产，更易于规模放大，方便产业化。

附图说明

图1是共转染重组质粒pCHO1.0-Fα和pCHO1.0-Fβ构建示意图；

图2是双表达重组质粒pCHO1.0-Fα-Fβ的构建示意图；

图3是目的蛋白SDS-PAGE及Western blot分析的示意图；

图4是目的蛋白HPLC纯度分析示意图；

图5是量反应平行线法检测目的蛋白比活性示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例：

一、人工合成hFSH α亚基及β亚基基因，克隆至pMD-18T载体，经酶切连接亚克隆至pCHO1.0载体，构建重组共转染质粒pCHO1.0-Fα、pCHO1.0-Fβ及重组双表达质粒pCHO1.0-Fα-Fβ，见图1，图2。转染CHO-S悬浮细胞，通过嘌呤霉素及MTX加压筛选，经FSH检测试剂盒测定表达量。通过多轮有限稀释法获得高表达重组阳性单克隆细胞株，并对细胞株进行产量评估，优选表达量高、活性好、表达稳定的细胞株作为工程细胞株。细胞株构建、筛选过程如下：

（1） 重组表达质粒的构建

①共转染重组质粒pCHO1.0-Fα和pCHO1.0-Fβ的构建方案

②双表达重组质粒pCHO1.0-Fα-Fβ的构建方案

（2）CHO-S细胞的转染及筛选：分别提取上述已成功构建共转染重组质粒pCHO1.0-Fα、pCHO1.0-Fβ及重组双表达质粒pCHO1.0-Fα-Fβ，转染前质粒均经NruI限制性内切酶进行线性化处理。复苏CHO-S细胞，监测细胞密度及活度，待细胞密度达到1-2×10⁶ viablecells/mL时，即进行细胞传代，根据细胞状态及密度，每2-3天传代一次。待细胞浓度及活度达到要求后，取对数期细胞进行转染，其中共转染质粒pCHO1.0-Fα与pCHO1.0-Fβ按质量比3:1共转染CHO-S细胞，双表达质粒pCHO1.0-Fα-Fβ直接转染CHO-S细胞，同时设立pCHO1.0空质粒对照组。振摇培养48 h后检测各组rhFSH瞬时表达量，作为初步评估。以不同浓度的嘌呤霉素和MTX进行两阶段加压，实时检测细胞浓度及活度，待细胞活度≥90%，活细胞密度≥1.0×10⁶ cells/mL，进行多克隆工程细胞产量评估，选取评估产量较高的多克隆细胞群，进行有限稀释，经96孔板、24孔板、6孔板、100mL摇瓶及250mL摇瓶逐步放大，选取rhFSH表达量高且表达稳定的单克隆细胞株作为优选工程细胞株。

（3）表达产物的鉴定及活性测定：收集细胞培养上清经纯化后采用SDS-PAGE法进行分子量大小检测，经Western blot进行鉴别分析，经HPLC法进行纯度检测，经大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)进行活性检测。

（4）重组细胞株表达及传代稳定性检测：重组细胞株在无MTX、无嘌呤霉素压力存在的条件下，连续传代20代（60天），分别取上清第0代、第5代、第10代、第15代及第20代细胞培养物上清检测目的产物表达量，并提取各代次细胞总RNA，经RT-PCR法扩增目的基因，并进行测序，评估细胞株的表达稳定性及遗传稳定性。

二、以重组双表达质粒pCHO1.0-Fα-Fβ的构建、转染CHO-S细胞及有限稀释法筛选过程为例进行详细描述。

双表达重组质粒pCHO1.0-Fα-Fβ的构建

（1）FSHα亚基基因的克隆

①FSHα亚基基因合成及引物设计：根据GenBank中编码FSH蛋白α亚基（NM_000735）cDNA序列，合成目的基因序列（pMD18T-FA），并运用primer5.0软件设计引物，序列如下：FA(AvrII)： 5'- ATGCCCTAGGCCACCATGGATTACTACAGA -3'（下划线部分为AvrII酶切位点），RA(Bstz17I)：5'- CAGTGTATACTTAAGATTTGTGATAATAAC -3'（下划线部分为Bstz17I酶切位点），扩增片段大小为376 bp。目的基因及引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

②FSHα亚基基因的扩增及克隆：以pMD18T-FA质粒为模板，FA(AvrII)和RA(Bstz17I)为引物进行PCR扩增。反应体系为：10×Ex Taq buffer（Mg2+ plus）5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）4 μl，上下游引物（20 pmol/μl）各2 μl，模版DNA 0.5 μl，Ex Taq 0.5 μl，补加ddH2O至总体积50 μl。反应条件为：94℃预变性2 min；94℃ 30 s，43℃ 30 s，72℃ 22s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。回收目的基因片段，与载体pMD18-T连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒，经PCR及酶切鉴定后，经测序正确的质粒命名为pMD18T-Fα。

③重组表达质粒pCHO1.0-Fα的构建：将测序正确的pMD18T-Fα质粒经AvrII和Bstz1170I双酶切，回收Fα基因片段，与经同样酶酶切的pCHO1.0载体按体积比5:3于16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒，经PCR及酶切鉴定后，送吉林省库美生物科技有限公司测序，测序正确的质粒命名为pCHO1.0-Fα。

（2）FSHβ亚基基因的克隆

①FSHβ亚基引物设计及合成：根据GenBank中编码FSH蛋白β亚基（NM_001018080）cDNA序列，运用primer5.0软件设计引物，序列如下：FB(EcorV)：5'- ATGCGATATCGCCACCATGAAGACACTCCAGT -3'（下划线部分为EcoRV酶切位点），RB(PacI)：5'- CAGTTTAATTAATTATTCTTTCATTTCACCAA -3'（下划线部分为PacI酶切位点），扩增片段大小为418bp。

②FSH β亚基基因的扩增及克隆：以pMD18T-FB质粒为模板，FB(EcorV)和RB(PacI)为引物进行PCR扩增。反应体系为：10×Ex Taq buffer（Mg2+ plus）5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）4 μl，上下游引物（20 pmol/μl）各2 μl，模版DNA 0.5 μl，Ex Taq 0.5 μl，补加ddH2O至总体积50 μl。反应条件为：94℃预变性2 min；94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 23s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。回收目的基因片段，与载体pMD18-T连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒，经PCR鉴定后，送吉林省库美生物科技有限公司测序，测序正确的质粒命名为pMD18T-Fβ。

（3）重组表达质粒pCHO1.0-Fα-Fβ的构建

将测序正确的pMD18T-fβ质粒经EcoRV和PacI双酶切，回收Fβ基因片段，与经同样酶酶切的pCHO1.0-Fα质粒按体积比5:3于16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR及酶切鉴定正确后，送吉林省库美生物科技有限公司测序，测序正确的质粒命名为pCHO1.0-Fα-Fβ。

（4）CHO-S细胞的转染及加压

采用去内毒素试剂盒提取已构建成功的共转染质粒pCHO1.0-Fα、pCHO1.0-Fβ、双表达质粒pCHO1.0-Fα-Fβ及pCHO1.0空质粒。转染时质粒经NruI线性化处理。复苏CHO-S细胞，确定细胞密度及活度，细胞密度达到1-2×10⁶ viable cells/mL，即进行细胞传代，根据细胞状态及密度，每2-3天传代一次。转染前24 h，以5-6×10⁵ viable cells/mL接种于含有30 mL CD Forti AGT CHO完全培养基，在37℃，含8% CO2，相对湿度为70-80%，转速为120 rpm的摇床培养细胞；转染当天，确定细胞活度不低于95%，活细胞密度为1×10⁶viable cells/mL左右；将60 μg DNA加入终体积1.5 mL的 OptiPROTM SFM (1×)培养基中进行稀释，轻轻混匀，其中共转染质粒pCHO1.0-Fα与pCHO1.0-Fβ按质量比均为1:1、3:1各做两组，pCHO1.0-Fα-Fβ做一组，以线性化空载体pCHO1.0作为阴性对照，未转染细胞CHO-S作为空白对照；吸取50 μl Freestyle MAX reagent，加入终体积为1.5 mL的 OptiPRO SFM(1×)培养基稀释转染试剂,轻轻混匀；立即将转染试剂稀释液加入DNA稀释液中，轻轻混匀，室温放置15 min；逐滴、分区、缓慢地将DNA-转染试剂混合物加入含细胞液中，摇床培养细胞，48 h后检测各组rhFSH瞬时表达量。静态加压至第7-10天，细胞计数，若恢复至5.0×10⁵ viable cells/mL，待细胞活度增加至30%-50%时，以3.0×10⁵ viable cells/mL转移至摇瓶中，37℃，8% CO2，相对湿度70-80%，120 rpm条件下培养至活度≥85%，活细胞密度≥1.0×10⁶ cells/mL，第一阶段加压结束，检测各组rhFSH表达量。待第一阶段加压完毕，提高嘌呤霉素及MTX浓度进行第二阶段加压筛选，每3-4天，以3.0×10⁵ viable cells/mL传代，至活度≥90%，第二阶段加压结束，进行多克隆的产量评估，于第3、5、7、9、12、14天取样，每次取样后需按以下比例补加葡萄糖：第3天，补加终浓度至4g/L glucose；第5天，补加终浓度至4g/L glucose；第7天，补加终浓度至6g/L glucose；以确定细胞密度、活度和产量直至细胞活度下降至50%或培养的第14天结束培养。

（5）有限稀释法筛选单克隆工程细胞株

评估合格后经两轮有限稀释法进行单克隆工程细胞株的筛选，以确保单克隆细胞株的单一来源，按0.5-1个细胞/孔，铺96孔板，经24孔板、6孔板、100mL摇瓶及250mL摇瓶逐步放大，选取rhFSH表达量高且表达稳定的单克隆细胞株作为优选工程细胞株。

（6）表达产物的鉴定及活性测定

收集细胞培养上清经纯化后采用SDS-PAGE法进行检测可见预期位置的目的条带，Western blot检测可见特异性反应条带，见图3；经HPLC检测纯度不低于99%，见图4；可达经大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)测定目的产物比活最高可达16036 IU/mg，见图5。测得比活 PT= 16036IU/mg；可信限率为 FL= 21.743%；可信限范围为14176～18564 IU/mg。

（7）重组细胞株表达及传代稳定性检测

重组细胞株在无MTX、无嘌呤霉素压力存在的条件下，连续传代20代（60天），分别取上清第0代、第5代、第10代、第15代及第20代细胞培养物上清检测目的产物表达量，未见目的蛋白明显下降，证实该重组细胞株能够稳定表达目的产物；同时提取各代次细胞总RNA，经RT-PCR法扩增目的基因，测序结果显示均与目的基因序列一致，表明该细胞株在传代过程中未发生基因变异，传代稳定性良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，包括CHO-S细胞株、pCHO1.0载体、高表达元件和目的蛋白氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，FSHα亚基氨基酸序列为（92aa）：APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS。

3.如权利要求2所述的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，FSHβ亚基氨基酸序列为（111aa）：NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE。

4.如权利要求3所述的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株，其特征在于，pCHO1.0载体采用CMV启动子与人延伸因子EF-1/2启动子的杂合启动子。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的高表达人促卵泡激素的重组CHO细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下方案：

（1）基于重组质粒pCHO1.0-Fα和pCHO1.0-Fβ共转染CHO细胞构建方案，

（2）基于双表达重组质粒pCHO1.0-Fα-Fβ转染CHO细胞构建方案。

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