EA022993B1 - Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh) - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α- и β-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (FSH) соответственно, которые модифицированы в отношении использования кодонов в клетках CHO. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей такие последовательности нуклеиновых кислот, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, а также к их применению при получении рекомбинантного FSH человека. В заключение, настоящее изобретение также относится к способу получения клеток-хозяев, экспрессирующих фолликулостимулирующий гормон человека, посредством трансфицирования клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Description

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α- и β-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (Р8Н) соответственно, где последовательность нуклеиновой кислоты модифицирована в отношении использования кодонов в клетках СНО, по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты Р8Н человека дикого типа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей такие последовательности нуклеиновых кислот, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, а также к их применению при получении рекомбинантного Р8Н человека.

В заключение, настоящее изобретение также относится к способу получения клеток-хозяев, экспрессирующих фолликулостимулирующий гормон человека посредством трансфицирования клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Фолликулостимулирующий гормон (Р8Н) продуцируется гонадотропными клетками передней доли гипофиза и высвобождается в кровоток. Р8Н действует вместе с лютеинизирующим гормоном (ЬН) при регуляции созревания ооцитов у женщин и сперматогенеза у мужчин. Как Р8Н, так и ЬН принадлежат к семейству гетеродимерных гликопротеинов, которые состоят из двух нековалентно связанных α- и βцепей, которые кодируются отдельными генами. В то время как последовательности аминокислот α-цепи Р8Н и ЬН являются идентичными, последовательности аминокислот β-цепи у двух белков отличаются. Как α-, так и β-цепи являются гликозилированными. α-цепь Р8Н имеет два потенциальных аспарагинсвязанных сайта гликозилирования в положениях 52 и 78, в то время как β-цепь Р8Н имеет два потенциальных аспарагинсвязанных сайта гликозилирования в положениях 7 и 24 (О1ууе с1 а1. (1996) Мо1. Нит. Кергоб. 2(5): 371-382).

Р8Н человека используют для лечения женщин с отсутствием овуляции, для стимулирования мультифолликулярного развития (суперовуляции) и при подготовке к искусственному оплодотворению, такому как 1УР (оплодотворение ίη νίίτο), О1РТ (перенос гаметы в маточную трубу) или ΖΙΓΤ (перенос зиготы в маточную трубу). Кроме того, Р8Н человека используют для стимулирования созревания фолликул у женщин с низкой выработкой Р8Н или с его отсутствием и для стимулирования сперматогенеза у мужчин с врожденным или приобретенным гипогонадотропным гипогонадизмом.

Первоначально, Р8Н для медицинских использований очищали из постменопаузальной мочи человека. Однако этот очищенный Р8Н имеет тот недостаток, что он также содержит ЬН и другие загрязняющие белки человеческого происхождения. Кроме того, использование такого природного источника накладывает ограничения на доступность и однородность продукта.

С развитием технологии рекомбинантных ДНК стало возможным продуцирование Р8Н человека в культурах клеток, трансфицированных последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих α- и βцепи. Последовательности ДНК, кодирующие α- и β-цепи, и способы получения рекомбинантного Р8Н человека описываются, например, в νθ 88/10270, νθ 86/04589 и в ЕР 0735139.

В настоящее время на рынке в Германии имеются два коммерческих продукта рекомбинантного Р8Н человека, а именно ΟΟΝΛΕ-Р® и ΡυΚΕΟΟΝ®, оба из которых получают посредством экспрессии ДНК дикого типа, кодирующих α- и β-цепи в клетках СНО.

Однако по-прежнему сохраняется необходимость в оптимизации экспрессии цепей Р8Н для улучшения выхода и скорости экспрессии Р8Н для данного количества клеток. Таким образом, в основе настоящего изобретения лежит проблема создания последовательности нуклеиновой кислоты и рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, с помощью которых рекомбинантный Р8Н человека может быть получен в больших количествах в эукариотических клетках.

В соответствии с настоящим изобретением эта и другие задачи решены посредством признаков, представленных в независимом пункте формулы изобретения.

Преимущественные варианты осуществления охарактеризованы в зависимых пунктах формулы изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением молекулы нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих α- и β-цепи Р8Н человека, которые адаптированы в отношении использования кодонов в клетках яичников китайских хомячков (СНО), используют для трансфицирования клеток СНО и приводят к значительному увеличению продуцирования Р8Н в трансфицированных клетках СНО.

В контексте настоящего изобретения термин увеличение продуцирования Р8Н относится к ситуации, когда при экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты в клеткехозяине, в клетке-хозяине продуцируется большее количество Р8Н по сравнению с ситуацией, когда немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Р8Н с такой же последовательностью аминокислот, экспрессируется в таком же типе клеток-хозяев при сходных условиях, таких, например, как сравнимые процедуры трансфицирования, сравнимые векторы экспрессии и тому подобное.

- 1 022993

Генетический код является избыточным, поскольку 20 аминокислот определяются с помощью 61 триплетного кодона. Таким образом, большинство из 20 протеиногенных аминокислот кодируются с помощью нескольких основных триплетов (кодонов). Однако кодоны, которые описывают конкретную аминокислоту, не используются с такой же частотой в конкретном организме, но имеются предпочтительные кодоны, которые используются часто, и редкие кодоны, которые используются не так часто. Упоминаемые различия в использовании кодонов связываются с понижением селективного эволюционного давления и, в частности, эффективности трансляции. Одна из причин более низкой эффективности трансляции редко встречающихся кодонов могла бы заключаться в том, что соответствующие пулы аминоацил-ίΡΗΚ обеднены и по этой причине не являются более доступными для синтеза белка.

Кроме того, различные организмы предпочитают различные кодоны. Таким образом, например, экспрессия рекомбинантных ДНК, происходящих из клеток млекопитающих, в клетках Е.соП часто происходит только субоптимально. По этой причине замена редко используемых кодонов на часто используемые кодоны может улучшить экспрессию в некоторых случаях.

Для многих организмов последовательность ДНК большого числа генов является известной, и имеются таблицы, из которых может быть получена частота использования конкретных кодонов в соответствующем организме. Посредством использования упоминаемых таблиц последовательности белков могут быть относительно точно транслированы обратно, с образованием последовательностей ДНК, которые содержат кодоны, предпочтительные в соответствующем организме для различных аминокислот белка. Таблицы для использования кодонов могут, среди прочего, быть найдены на следующих интернет-адресах:

1П(р:/Лс\с\у.ка/и5а.огар./кодон/тбех.1Пт1 или

1П(р:/Лс\с\с.еп(е1ес1юп.сот/епбех.р1ю?1б=(оо15/тбех.

Имеются также программы, доступные для обратной трансляции последовательности белка, например последовательности белка α- или β-цепи ΡδΗ человека, с образованием вырожденной последовательности ДНК, подобные, например, программам на сайте

ЬЬЬр: //мим, епЬеТесЬоп. сот/епд/ЬаскЬгап51аЫоп ЬЬш!

Термин последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептиды, такие как пептиды, белки и тому подобное. Эти молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из ДНК, РНК или их аналогов. Однако молекулы из нуклеиновых кислот, получаемые из ДНК, являются предпочтительными.

Специалист в данной области, несомненно, знает, что модификация исходной нуклеотидной последовательности описывает процесс оптимизации по отношению к использованию кодона.

Если кодирующая последовательность чужого фермента дикого типа подбирается, например, для использования кодона клеток СНО, внесенные изменения могут легко идентифицироваться посредством сравнения модифицированной последовательности и исходной последовательности (см. фиг. 1а и 1Ь). Кроме того, обе последовательности будут кодировать одну и ту же последовательность аминокислот. Последовательность аминокислот α-цепи ΡδΗ человека показана в δΕΟ ГО Ио. 5 и последовательность аминокислот β-цепи ΡδΗ человека показана в δΕΟ ГО Ио. 6. Эти последовательности аминокислот соответствуют последовательности аминокислот α- и β-цепи ΡδΗ человека дикого типа, депонированным под номером доступа 1 00152 в базе данных ЕМВЬ и под номером доступа ИМ 000510 в базе данных ИСВ1 соответственно.

В случае α-цепи ΡδΗ человека исходная последовательность нуклеиновой кислоты показана в δΕΟ ГО Ио. 3, а в случае β-цепи ΡδΗ человека исходная последовательность нуклеиновой кислоты показана в δΕΟ ΙΌ Ио. 4.

В соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь ΡδΗ человека, модифицируется по отношению к использованию кодона в клетках ΟΗΟ по меньшей мере в 30 положениях, предпочтительно по меньшей мере в 40 положениях, особенно предпочтительно по меньшей мере в 50 положениях, также особенно предпочтительно по меньшей мере в 60 или 70 положениях, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 75 положениях по сравнению с исходной последовательностью.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь ΡδΗ человека, модифицируют по отношению к использованию кодона в клетках ΟΗΟ по меньшей мере в 25 положениях, предпочтительно по меньшей мере в 30 положениях, более предпочтительно по меньшей мере в 40 положениях, особенно предпочтительно по меньшей мере в 50 положениях, также особенно предпочтительно в 60 положениях, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 65 положениях по сравнению с исходной последовательностью.

Наиболее предпочтительно модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь ΡδΗ человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, приведенную в δΕΟ ГО Ио. 1, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в δΕΟ ГО Ио. 1, по меньшей мере на 98% по всей кодирующей области. В δΕΟ ГО Ио. 1 кодирующая область начинается с

- 2 022993 нуклеотида 56 и простирается до нуклеотида 442.

Наиболее предпочтительно оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь ΡδΗ человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, приведенную в 8ЕО ГО Νο. 2, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в 8ЕО ГО Νο. 2, по меньшей мере на 98% по всей кодирующей области. В 8ЕО ГО Νο. 2 кодирующая область начинается с нуклеотида 19 и простирается до нуклеотида 366.

Термины немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа или исходная последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая предназначена для использования для (сверх)экспрессии в клетке-хозяине и которая не адаптирована в отношении использования кодона в клетке-хозяине, но представляет собой действительную последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующую белок.

Термины модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты или оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относятся к последовательности, которая модифицирована для экспрессии в клетке-хозяине посредством адаптирования последовательности немодифицированной/исходной последовательности нуклеиновой кислоты в отношении использования кодона клетки-хозяина. Модифицированная или оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, имеющий такую же последовательность аминокислот, что и белок, кодируемый немодифицированной последовательностью.

Идентичность последовательностей определяют с помощью ряда программ, основанных на различных алгоритмах. В настоящем изобретении алгоритмы №еб1етап и УипксН или §тйй и \Уа1егтап дают особенно надежные результаты. Для сравнения последовательностей используют программу РбеИр (Репд апб БооШИе (1987) 1. Мо1. ЕуойШоп 25: 351-360; Н1дд1пк е1 а1. (1989) САВЮ8 5: 151-153) или программы Оар апб Век! РН (№еб1етап апб УипксН (1970) 1. Мо1. Βίο1. 48: 443-453 и διηίΐΐι апб \Уа1егтап (1981) Лбу. Арр1. Ма!Н. 2: 482-489), которые содержатся в пакете программного обеспечения ОСО (Оепебск Сотри!ег Огоир, 575 8с1епсе Опус. МабЖоп, УЖсопып И8А).

Значения идентичности последовательностей, приведенные в настоящем документе в процентах, определяют с помощью программы Оар по всей области последовательности со следующими настройками: Оар Уе1дЫ: 50, ЬепдЪ Уе1дЫ: 3, Ауетаде Ма1сй: 10000 и Ауегаде М1кта1сй: 0.000.

Если не указано иначе, указанные настройки используют как стандартные настройки для сравнения последовательностей.

Без намерения ограничиваться гипотезами, предполагается, что кодоноптимизированные последовательности ДНК позволяют более эффективную трансляцию и мРНК, полученные с их помощью, возможно, имеют более продолжительные периоды полужизни в клетке и по этой причине являются чаще доступными для трансляции.

Специалисты в данной области хорошо знакомы с методиками, которые позволяют преобразовывать исходную начальную последовательность нуклеиновой кислоты в модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептиды идентичных аминокислот, но с различным использованием кодонов. Это может достигаться, например, с помощью методик мутагенеза на основе цепной полимеразной реакции, с помощью обычных известных процедур клонирования, с помощью химического синтеза и тому подобное.

Также целью настоящего изобретения является рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь ΡδΗ человека, где модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО Νο. 1 и нуклеотидной последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 90%, с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, как показана в 8ЕО ГО Νο. 1, и где модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем промотора, который является активным в клетке-хозяине.

Термин промотор, который является активным в клетке-хозяине предназначается для обозначения того, что промотор в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты позволяет экспрессировать последовательность нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, в которой экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты является желательной. Активность промотора обычно определяется присутствием факторов транскрипции, которые способны связываться с промотором и активировать транскрипцию.

Промоторы, которые являются пригодными для экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих, хорошо известны специалистам в данной области и включают вирусные промоторы, такие как СМУ, 8У40, НТЬУ или главный поздний промотор аденовируса и другие промоторы, такие как промотор ЕР-1а- или промотор ИЬС.

Термин клетка-хозяин для целей настоящего изобретения относится к любой клетке, которая обычно используется для экспрессии, то есть для транскрипции и трансляции последовательностей нук- 3 022993 леиновых кислот для продуцирования, например, полипептидов. В частности, термин клетка-хозяин или организм относится к прокариотам, низшим эукариотам, клеткам растений, насекомых или к системам культур клеток млекопитающих. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, еще более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, которая имеет использование кодона, сходное с клетками СНО, а наиболее предпочтительно эта клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.

Линия клеток-хозяев СНО, используемая для экспрессии модифицированной последовательности и для продуцирования рекомбинантного Р8Н человека, представляет собой производную линию клеток СНО-К1 и имеет дефицит активности дигидрофолатредуктазы (бПГг). Линии клеток получают из ΌδΜΖ (Са!. Νο. АСС 126) и адаптируют для суспензии и условий отсутствия сыворотки в культуре.

Линия клеток СНО, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, и вторую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, была депонирована с 28 марта 2007 г. в ΌδΜΖ, ВгашъЛиусщ. под номером депозита ΌδΜ АСС2833.

Термин рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты в значении, используемом в настоящем изобретении, предназначается для включения в него всех видов молекул нуклеиновых кислот, которые способны вводиться в клетку-хозяина и осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин включает, среди прочего, векторы плазмид и вирусные векторы, такие как аденовирусный, лентивирусный и ретровирусный вектор, при этом векторы плазмид являются предпочтительными.

Примеры пригодных для использования векторов плазмид, которые могут использоваться для экспрессирования белков в клетках млекопитающих, хорошо известны и включают, например, ряд векторов рС1, ρδΐ (Рготеда), векторы ροΌΝΑ®, рСЕР4, рКЕР4, ρδНООΤΕΚ™, ρΖοοδΥ2 (1иу1!годеи), рВ1а§!, ρΜοηο, рЗЕРЕСТ, рУ!ТКО и рУ1УО (Ιη Ущодеи). Кроме промотора и последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна экспрессироваться, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты обычно содержит другие функциональные элементы, такие как последовательности полиаденилирования, гены прокариотической и/или эукариотической селекции, которые позволяют идентификацию положительно трансформированных прокариотических и/или эукариотических клеток, и источник репликации. Специалист в данной области знает, какие элементы, которые он должен выбирать для конкретной цели, и какой вектор плазмиды является пригодным для экспрессии конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в конкретной клетке-хозяине.

Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью стандартных способов молекулярной биологии, которые описаны в литературе(см., например, в δатЬ^οοк аиб Ки88е11 (2001) ΜοΚοιιΌγ ο1οηίη§ - а ΡιΟοηιΙοιύ таииа1, 3^гб ебйюи, С.о1б Зргшд ΒηΓόουΓ ^аЬο^а!ο^у Рге88, С.о1б Зргшд ΒηΓόουΓ, ΝΥ, υδΑ).

Предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит как модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь РδН человека, так и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь ΡδΚ

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, выбирается из оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей α-цепь РδН человека, которую выбирают из группы, состоящей из кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с δΕΟ ΙΌ Νο. 2, последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 85%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в δΕΟ ΙΌ Νο. 2, с кодирующей областью немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как показано в δΕΟ ΙΌ Νο. 3, и из последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 70%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в δΕΟ ΙΌ Νο. 3.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, может находиться под контролем того же промотора, что и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь РδН человека, например, посредством участка внутренней посадки рибосомы (ΙΡΕδ), или она может находиться под контролем отдельного промотора. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, находится под контролем отдельного промотора. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оптимизированную β-цепь РδН человека, находится под контролем промотора δν40, а последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, находится под контролем промотора ΘΜΥ. Наиболее предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в δΕΟ ΙΌ Νο. 7.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит рекомбинант- 4 022993 ную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, и которая дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, которую выбирают из модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО Νο. 2 и нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 85%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в 8ЕО ГО Νο. 2, и кодирующей областью немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в 8ЕО ГО Νο. 3, и последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 70%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в 8ЕО ГО Νο. 3.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь Р8Н человека, может присутствовать в той же рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, что и оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека, или она может вводиться в клеткихозяева на отдельной рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь Р8Н человека, присутствует в той же рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, что и оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека.

Клетка-хозяин может выбираться из системы культур клеток млекопитающих, таких как клетки №Н3Т3, клетки СНО, клетки СО8, клетки 293, клетки 1игка1. клетки ВНК и клетки НеЬа. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, которая имеет использование кодона, сходное с клеткой СНО, а наиболее предпочтительно эта клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.

Также объектом настоящего изобретения является культура клеток, содержащая клетки-хозяева, содержащие рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь, может выбираться из группы, состоящей из немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты и модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как определено выше, в подходящей культурной среде.

Культуру клеток получают посредством культивирования клеток-хозяев в подходящей культурной среде в условиях, которые поддерживают рост клеток-хозяев.

Термин культивирование клеток должен пониматься как означающий, что клетки поддерживаются ίη νίνο при условиях, которые делают возможными пролиферацию, нормальный метаболизм клеток и образование рекомбинантного белка. Это означает, что клетки снабжаются всеми необходимыми питательными веществами, а также кислородом, и поддерживаются при соответствующем рН и при соответствующей осмолярности. Клетки могут культивироваться любым пригодным для этого образом. Предпочтительно клетки культивируют как суспензионные культуры, например, в колбах или во вращающихся колбах. Термин культивирование включает периодическое культивирование, культивирование с подпиткой, а также перфузионные культуры и другие соответствующие способы культивирования.

Культивирование в суспензии означает, что клетки не прилипают к поверхности, а распределяются в культурной среде.

Периодическое культивирование, как используется в настоящем изобретении, представляет собой способ культивирования, при котором культурная среда не добавляется и не удаляется во время культивирования.

Способ с подпиткой, как используется в настоящем изобретении, представляет собой способ культивирования, при котором культурную среду добавляют во время культивирования, но культурная среда не удаляется.

Перфузионное культивирование в рамках настоящего изобретения представляет собой способ культивирования, при котором среда культивирования удаляется и новую культурную среду добавляют во время культивирования.

Культурная среда предпочтительно имеет только низкое содержание сыворотки, например максимальное содержание (об./об.) сыворотки 1%; наиболее предпочтительно среда не содержит сыворотки. Примеры соответствующих культурных сред представляют собой минимальные среды, такие как ΚΡΜΙ 1640, ΌΜΕΜ, Р12, РгоСНО5 или еКЭР, которые могут смешиваться друг с другом и с добавками, в соответствии с потребностями клеток. В дополнение к глюкозе и аминокислотам среда может содержать хелаторы, такие как ауринтрикарбоновая кислота (АТА), неорганические соли, такие как фосфатные соли, полиамины и их предшественники, такие как путресцин, гормоны, такие как инсулин, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, и смеси витаминов, предшественники липидов, такие как этаноламин, и защищающие клетки вещества, такие как Р1игошс Р68. Специалисты в данной области знают, какую культурную среду используют для культивирования конкретного типа клеток. Предпочтительно культурная среда представляет собой РгоСНО5.

- 5 022993

Также объектом настоящего изобретения является способ, в котором клетки-хозяева в соответствии с настоящим изобретением сначала культивируют в подходящей культурной среде в течение определенного периода времени, а затем супернатант культуры клеток собирают.

Супернатант культуры клеток представляет собой культуральную среду для клеток, которая находится в контакте с клетками в течение определенного периода времени и которую затем отделяют от клеток. Супернатант культуры клеток содержит рекомбинантный белок, продуцируемый клетками. Клетки могут отделяться от супернатанта с помощью обычных методик разделения, таких как фильтрование и центрифугирование. В долговременных культурах супернатант клеток-хозяев в соответствии с настоящим изобретением содержит концентрации Р8Н по меньшей мере 500 нг/мл, предпочтительно по меньшей мере 1000 нг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 1500 нг/мл и наиболее предпочтительно по меньшей мере 2000 нг/мл.

Рекомбинантный Р8Н человека может быть очищен от супернатанта культур клеток с помощью одной или нескольких стадий очистки. Подходящие способы очистки известны специалистам в данной области и включают ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, хроматографию на гидроксиапатите, афинную хроматографию и гельпроникающую хроматографию. Способы очистки рекомбинантного Р8Н человека описаны, например, в \УО 00/63248, \УО 2006/051070 и \УО 2005/063811.

Для введения в качестве лекарственного средства очищенный рекомбинантный Р8Н человека смешивают с одним или несколькими наполнителями с получением композиции, которую можно вводить пациентам. Соответствующие композиции для рекомбинантного Р8Н человека описываются, среди прочего, в ЕР 0853945, ЕР 1285665, ЕР 0974359, ЕР 1188444 и ЕР 1169349.

Клетку-хозяина по настоящему изобретению получают посредством трансфицирования клетки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которая содержит либо только модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, либо также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая α-цепь, могут присутствовать на отдельных рекомбинантных молекулах нуклеиновых кислот, которые вводят в клетку-хозяина либо одновременно, либо последовательно.

Подходящие способы трансфицирования известны специалистам в данной области и включают в себя, например, осаждение с фосфатом кальция, трансфицирование, опосредуемое ИЕЛЕ-декстраном, электропорацию и липофекцию. Могут также использоваться коммерчески доступные наборы для трансфицирования, такие как 8ирегРес1, Ро1уРес1, Ейсс1еие (Οίαβοη). ТтапзРак!™, РтоРесИоп®, ТгапПес1аш® (Рготеда) и ТтаикРакк™ (ИЕВ). Предпочтительно клетки трансфицируют в то время, когда они находятся в суспензии, и они трансфицируются в условиях отсутствия сыворотки.

Для получения рекомбинантного Р8Н человека в промышленном масштабе клетки обычно стабильно трансфицируют, что означает, что успешно трансформированные клетки отбирают после трансфицирования посредством агента селекции, который уничтожает нетрансфицированные клетки, в то время как трансфицированные клетки, содержащие ген устойчивости, продолжают расти. Подходящие реагенты включают антибиотики, такие как зеоцин, неомицин и пуромицин, и другие лекарственные средства, такие как метотрексат.

Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих далее примеров, которые не должны пониматься как ограничивающие.

Примеры

1. Клонирование рекомбинантной молекулы из нуклеиновой кислоты, содержащей оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие α- и β-цепь Р8Н человека.

Используют основную цепь вектора рИС18, которая уже содержит сайт полиаденилирования 8У40 и сайт сплайсирования, и кассету гена бЫт, состоящую из промотора К8У, гена дигидрофолиатредуктазы мыши и сайта полиаденилирования и сплайсирования 8У40. Ген дигидрофолиатредуктазы делает возможной селекцию положительно трансфицированных клеток и амплификацию трансфицированного гена с помощью лекарственного средства метотрексата.

Немодифицированные последовательности α- и β-цепей Р8Н человека получают из Р1ббе8 апб Сообтап (1979) ИаШте 281: 351-356, и Типеюп е1 а1. (1988) Мо1. Епбостшо1. 2(9): 806-815 соответственно. Эти последовательности оптимизируют, при этом кодирующие области адаптируют для использования кодона в часто используемых генах СНО.

Кроме того, вводят дополнительный стоп-кодон для обеспечения эффективного завершения трансляции.

Оптимизированные нуклеотидные последовательности для β- и α-цепи показаны в 8ЕО ГО Ио. 1 и 2 соответственно, и сравнение последовательности дикого типа и модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты показано на фиг. 1а и 1Ь. Сравнение последовательностей показывает, что модифицированная и немодифицированная последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие α-цепь Р8Н человека, идентичны на 80%, в то время как модифицированная и немодифицированная последова- 6 022993 тельности нуклеиновых кислот, кодирующие β-цепь Р5Н человека, идентичны на 85%.

Модифицированные последовательности инсертируют по отдельности в две копии основной цепи риС18 посредством разрезания их с помощью ферментов рестрикции 8ас11 и Ναοί и последующего лигирования.

Промотор СМУ и промотор 5У40 амплифицируют из соответствующего шаблона ДНК с помощью следующих праймеров, одновременно вводя сайт рестрикции Акс1 и Рас1 (подчеркнут в следующих праймерах):

Праймер Акс-СМУ-Р

5' - ССССССССТ ТТТ ОСТ САС АТС ОСТ СС - 3'(ЗЕф ГО Νο. 8)

Праймер Рас-СМУ-К

5' - ССТ ТАА ТТА АСА ОСТ СТА АТТ САА СТО ОСА СТО - 3' (5ЕС ГО Νο. 9)

Праймер Акс-8У40-Р

5' - ССС ССС ССС САТ АСС ССС АТС ТС - 3' (5ЕС ГО Νο. 10)

Праймер Рас-5У40-К

5' - ССТ ТАА ТТА АСТ ТСС АСА СТО ТТС ТОТ САС ААС А - 3' (5ЕС ГО Νο. 11)

Промотор СМУ вводят в плазмиду, содержащую α-цепь Р5Н человека, посредством разрезания плазмиды с помощью ферментов рестрикции Акс1 и Рас1 и лигирования, и промотор 5У40 вводят в плазмиду, содержащую β-цепь Р5Н человека, посредством разрезания плазмиды с помощью ферментов рестрикции Акс1 и Рас1 и лигирования.

Наконец, кассету экспрессии для β-цепи Р5Н человека, содержащую промотор 5У40, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь, и сигнал полиаденилирования 5У40 амплифицируют с помощью следующих праймеров, одновременно вводя сайт рестрикции Νοΐί, как на 5', так и на 3' конце амплификата (подчеркнуто в следующих праймерах):

Праймер ΡβίΗ-ΝοίΙ-Ρ

5' - ССС ССС ССА ТАС ССС САТ СТО С - 3' (5ЕС ГО Νο. 12)

Праймер ΡβίΗ-ΝοίΙ-Κ.

5' - ССС ССС ССТ САС ТСА ТТА ССС АСС ССА СС - 3' (5ЕС ГО Νο. 13)

Затем амплификат вставляют в разрезанную с помощью Νοΐί плазмиду, содержащую α-цепь Р5Н человека. Полученная плазмида, содержащая как оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь, так и оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь, показана на фиг. 2. Последовательность плазмиды с обеими оптимизированными последовательностями нуклеиновых кислот показана в 8ЕС ГО Νο. 7.

2. Транзиентная трансфекция клеток СНО рекомбинантными молекулами нуклеиновых кислот, содержащими различные сочетания α- и β-цепей Р5Н человека.

Плазмиды, содержащие либо оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь, либо оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую βцепь, в сочетании с соответствующей β-цепью или α-цепью дикого типа, или содержащие обе оптимизированные последовательности, получают, как описано в 1), выше. ДНК смешивают со средой РгоСНО5 (Εοη/а). содержащей 8 мМ глютамина без НТ (5-гидрокситритамина), до получения общего объема 200 мкл. Затем 20 мкл реагента 5ирегРес1 (01адсп) добавляют к раствору ДНК и перемешивают. Затем эту смесь инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре.

Аликвоты, содержащие 1,68х10⁶ клеток СНО, центрифугируют (5 мин, 800 об/мин, 18-25°С), супернатант удаляют и клетки повторно суспендируют в 1,1 мл культурной среды РгоСНО5, содержащей 8 мМ глютамина без НТ. Затем суспензию переносят в смесь ДНК, затем смесь ДНК инкубируют в течение 5-10 мин, перемешивают и переносят в лунки 6-луночного планшета. Клетки инкубируют в течение 3 ч при 37°С, это инкубирование приводит к прилипанию клеток. Супернатант удаляют, клетки промывают три раза 1 мл РВ5, а затем добавляют свежую культурную среду (2 мл РгоСНО5, содержащую 8 мМ глютамина без НТ). После 2 дней инкубирования при 37°С супернатант удаляют и центрифугируют. Супернатант концентрируют (коэффициент концентрирования 16,67) и концентрацию Р5Н определяют с помощью устройства для считывания ЕЫ5А (Ληο^η). Результаты этого измерения показаны на фиг. 3.

Результаты показывают, что введение модифицированной α-цепи в сочетании с β-цепью дикого типа приводит к уменьшению экспрессии почти на 50% по сравнению с сочетанием двух цепей дикого типа. В противоположность этому введение модифицированной β-цепи в сочетании с α-цепью, как дикого типа, так и модифицированной, приводит к транзиентной экспрессии Р5Н, которая усиливается с коэффициентом 1,5-3 по сравнению с сочетанием α-цепи дикого типа и β-цепи дикого типа. По этой причине, в частности, использование модифицированной β-цепи приводит к значительному усилению экспрессии Р5Н после транзиентного трансфицирования, в то время как модифицированная α-цепь не влияет положительно на продуцирование Р5Н.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Сравнение немодифицированных и модифицированных последовательностей нуклеиновых

- 7 022993 кислот, кодирующих α-цепь и β-цепь Р8Н человека

a) сравнение последовательностей модифицированной и немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей α-цепь Р8Н человека, рХМ17зз#6: часть плазмиды, содержащая модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека (8Ер Ιϋ Νο. 2),

У α Р8Н: немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь Р8Н человека (8Ες Ιϋ Νο. 3).

Инициирующий кодон и стоп-кодоны показаны выделенными буквами.

b) Сравнение последовательностей для модифицированной и немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей β-цепь Р8Н человека рпегу: немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека (8Ер Ιϋ Νο. 4),

8иЬ]есР модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека (8Ер Ιϋ Νο. 1).

Инициирующие кодоны и стоп-кодоны показаны выделенными буквами.

Фиг. 2. Карта рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей как модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, так и модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека.

Фиг. 3. Анализ экспрессии различных сочетаний α- и β-цепей после транзиентной экспрессии в клетках СНО.

Показана относительная экспрессия Р8Н по отношению к клеткам, экспрессирующим сочетание αи β-цепей дикого типа.

у/у: немодифицированная α- и β-цепь, з/у: модифицированная α-цепь и немодифицированная β-цепь, у/з: модифицированная β-цепь и немодифицированная α-цепь, з/з: модифицированная α- и β-цепь.

Список последовательностей <110> В1одепег1х АС <120> ГЗН-Клон <130> В 8700 / ΚΝ <150> ЕР07111257 <151> 28.06.2007 <160> 13 <170> РаЬепЫп уегз±оп 3.3 <210> 1 <211> 471 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Модифицированная Сета цепь <400> 1

аддаЬссссд	ддьассьссс	сдсддддадд	сдсдссссЬЬ	ааЬЬаадссд	ссассаЬдаа	60
дасссьдсад	ЬЬсЬЬсЬЬСС	ьдььсьдсьд	сьддааддсс	аЬсЬдсьдса	асадсЬдсда	120
дсЬдассаас	аьсассаьсд	ссаьсдадаа	ддаддадьдс	аддЬЬсЬдса	Ьсадсаьсаа	180
сассассьдд	ьдсдссддаь	асЬдсьасас	садддассьд	дЬдЬасаадд	ассссдссад	240
дсссаадаЬс	садаадассЬ	дсассЬЬсаа	ддадсЬддьд	Ьасдадассд	ьдадддьдсс	300
сддсЬдсдсс	сассасдссд	асадссЬдЬа	сассЬасссс	дЬддссассс	адЬдссасЬд	360
сддсаадЬдс	дасадсдаса	дсассдасЬд	сассдЬдадд	ддссЬдддсс	ссадсЬасЬд	420
садсЬЬсддс	дадаЬдаадд	адЬааЬдасс	аЬддсаьдсд	адсьсдааЬЬ	с	471

<210> 2 <211> 372 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Модифицированная альфа цепь <400> 2

сЬЬааЬЬаад	ссдссадсаь	ддасЬасЬас	аддаадЬасд	ссдссаЬсЬЬ	ссьддьдасс	60
сЬдадсдьдЬ	ЬссьдсасдЬ	дсЬдсасадс	дссссадасд	ЬдсаддасЬд	ссссдадЬдс	120
асссьдсадд	адаасссаЬЬ	сЬЬсадссад	сссддадссс	ссаьссЬдса	дЬдсаЬдддс	180
ьдсьдсььса	дсадддссЬа	ссссассссс	сЬдаддадса	адаадассаь	дсЬддЬдсад	240
аадаасдьда	ссадсдадад	сассЬдсЬдС	дЬддссаада	дсЬасаасад	ддЬдассдЬд	300
аьдддсддсЬ	ЬсааддЬдда	даассасасс	дссЬдссасЬ	дсадсассьд	сЬасЬассас	360
аададсЬааЬ	да					372

- 8 022993 <210> 3 <211> 369 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 3

сЬЬааЬЬаад	ссдссадсаЬ	ддаЬЬасЬас	адааааЬаЬд	садсЬаЬсЬЬ	ЬсЬддЬсаса	60
ььдьсддьдь	ЬЬсьдсаЬдЬ	ьсьссаььос	дссссЬдаьд	ЬдсаддаЬЬд	сссадааЬдс	120
асдсьасадд	аааасссаЬЬ	сЬЬсЬсссад	ссдддЬдссс	сааЬасЬЬса	дЬдсаЬдддс	180
ЬдсЬдсЬЬсь	сьададсаьа	ЬсссасЬсса	сЬааддЬсса	адаадасдаЬ	дЬЬддЬссаа	240
аадаасдЬса	ссЬсададЬс	сасЬЬдсЬдЬ	дЬадсЬаааЬ	саЬаьаасад	ддЬсасадЬа	300
аьддддддьь	ЬсааадЬдда	даассасасд	дсдЬдссасЬ	дсадьасььд	ЬЬаЬЬаЬсас	360

<210> 4 <211> 474 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 4

аддаЬссссд	ддсЬассЬсс	ссдсддддад	дсдсдссссЬ	ЬааЬЬаадсс	дссассаЬда	60
адасасЬсса	дЬЬЬЬЬсЬЬс	сЬЬЬЬсЬдЬЬ	дсЬддааадс	ааЬсЬдсЬдс	ааЬадсЬдЬд	120
адсьдассаа	саьсассаЬЬ	дсааЬадада	аадаадааЬд	ьсдЬЬЬсЬдс	аЬаадсаЬса	180
асассасЬЬд	дЬдЬдсЬддс	ЬасЬдсЬаса	ссадддаЬсЬ	ддЬдЬаЬаад	дасссадсса	240
ддсссааааЬ	ссадааааса	ЬдЬассЬЬса	аддаасьддь	аЬаЬдаааса	дьдададЬдс	300
ссддсЬдЬдс	ЬсассаЬдса	даЬЬссЬЬдЬ	аЬасаЬассс	адьддссасс	садЬдЬсась	360
дЬддсаадьд	Ьдасадсдас	адсасЬдаЬЬ	дЬасЬдЬдсд	аддссьдддд	сссадсЬасЬ	420

дсЬссЬЬЬдд ЬдаааЬдааа дааСааасаЬ дссаЬддсаЬ дсдадсЬсда аЬЬс <210> 5 <211> 116 <212> РКТ <213> Ното зарДепз <400> 5

МеЬ Азр Туг Туг Агд Ьуз Туг А1а А1а 11е РНе Деи Уа1 ТНг Деи Зег 15 10 15

Уа1 РНе Деи Ηίδ Уа1 Деи Ηίδ Зег А1а Рго Азр Уа1 С1п Азр Суз Рго

С1и Суз ТНг Деи С1п С1и Азп Рго РНе РНе Зег С1п Рго С1у А1а Рго

- 9 022993 <210> 7 <211> 8983 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Плазмида <400> 7

ддааЬаадаа	адсддссдсь	сасьсаььад	дсассссадд	сСССасасСС	СаСдссьссд	60
дсьсдсаЬдЬ	ьдьдсддааь	ЬдЬдадсдда	СаасааСССс	асасаддааа	садсСаСдас	120
аЬдаЬЬасда	аЬЬсдадсЬс	ддсасссддд	даСссадаса	СдасаадаСа	саССдаьдад	180
СЕЛддасааа	ссасаасьад	ааСдсадСда	ааааааСдсС	ССасьСдСда	ааСССдСдаС	240
дсЬаЬЬдсЬС	ЬаЬЬСдЬаас	саССаСаадс	СдсааСааас	аадссаасаа	саасааССдс	300
асссассьса	СдССЬсаддС	Ссадддддад	дСдСдддадд	ССССССааад	саадСаааас	360
сСсьасаааС.	дСддьаСддс	сдассасдас	ссссадСсаа	ддсасСаСас	аЬсааасасс	420
ссьСаЬЬаас	сссЬСЬасаа	ассааааадс	саааддсаса	сааСССССда	дсаСадсьаС	480
ЬааЬадсада	сасЬсЬаЬдс	сСдСдСддад	Саадаааааа	садСаСдССа	СдаССаСаас	540
ЬдЬСаСдссЬ	асПаЬааад	дССасадааС	аСССССссаС	аассссессд	сасадсадСд	600
садсьььььс	сСЬЬдЬддЬд	СаааСадсаа	адсаадсаад	адСьсСаССа	сЬааасасад	660
саьдасЬсаа	аааасьсадс	аассссдаад	дааадсссСС	ддддСсССсС	ассССьсСсС	720
ЬсСССН.Ьдд	аддадсадаа	СдЕСдададС	садсадСадс	сСсаЬсаСса	сьадаьддса	780
ьььсььсьда	дсаааасадд	ССССссСсаС	СаааддсаСС	ссассасСдс	ссссасссаь	840
садЬЬссаЬа	ддЬСддааЬс	СааааСасас	ааасааССад	ааСсадсадс	ССаасасаСС	900
асасасЬЬаа	аааСЛЬСаЬа	СССассССад	адсьССаааС	сСсСдСаддС	адСССдСсса	960
аЬЬабдЬсас	ассасадаад	ъааддСЛссС	ссасааадаС	сссасьасад	аадсааСсСа	1020
садьсьсьаь	ЬдсадСЬЬдЬ	аасссссСсс	сссьсссссс	СССааСасСд	ааЬдадаСсд	1080
ааЬдЬСаддС	ссаСдсадЬЬ	сССддСсааС	дССаасдааа	дСссаасдСС	ссдЬЬсдсдс	1140
ддддасадсс	сдЬссдсааа	дсддддсадс	ссдсаддсдд	ссссСсдадд	ЬсдасддЬаЬ	1200
сдаьаадсЬС	ддЬассдадс	ссддаСссас	Садсаасддс	сдссадьдСд	сЬддааЬЬсд	1260
дсЬЬдадсЬс	аддсдСсЬЬс	ссадсаСддс	СсСдСсссСд	адСССааадс	ЬдсЬсСсЬда	1320
асдсЬСссЬд	сьсьдддссс	Ссаадьсддс	ссСдСдасаь	ссьсадаСсС	сададсьдсЬ	1380
сЬсЬддасад	СЬссисЬддс	сссСдадаСд	СсаьСдссдд	сасьддадСд	СссаЬддСса	1440
иьасСссЬЬс	аЬсьсдссда	адссдсадса	дсСддддссс	аддссссСса	сддСдсадьс	1500
ддЬдсьдссд	сСдСсдсась	СдссдсадСд	дсасьдддСд	дссасддддС	аддЬдЬасад	1560
дсЬдЬсддсд	ьддьдддсдс	адссдддсас	ссСсасддьс	СсдСасасса	дсЬссЬЬдаа	1620
ддЬдсаддьс	ЬСсЬддаьсь	сдддсссддс	ддддСссьСд	сасассаддс	сссЬддЬдЬа	1680
дсадЬаьссд	дсдсассадд	СддСдССдаС	дссдаСдсад	аассСдсасС	ссЬссЬЬсЬс	1740
даЬддсдаЬд	дьдаьдььдд	Ссадсьсдса	дссдссдсад	садаСддссь	ьссадсадса	1800
даасаддаад	аадаасЬдса	дддСсССсаС	ддСддсддсС	СааССаадСС	сдадасЬдЬС	1860
дьдьсадаад	ааСсаадсьь	СССдсаааад	ссСаддссСс	саааааадсс	ЬссссасЬас	1920
ььсьддааьа	дсьсададдс	сдаддсддсс	СсддссСсСд	саСааасааа	аааааЫгадь	1980
садссаьддд	дсддадааСд	ддсддаасСд	ддеддадсса	ддддсдддаС	дддсддадСЬ	2040
аддддсддда	сЬаСддЬЬдс	сдасСааССд	адаСдсаСдс	СССдсаСасс	ЬсЬдссСдсЬ	2100
ддддадссьд	дддасьььсс	асассьддСС	дссдасьааС	сдадаСдсаС	дсььедЬаЬа	2160
сЬЬсСдссЬд	сЬддддадсс	СддддасССС	ссасасссСа	асьдасасас	аЬЬссасадс	2220
ьддььсьььс	сдссьсадаа	ддсассСаас	саадССссСс	СССсададдС	СаЬСЬсаддс	2280
саЬддЬдсЬд	сдсадаСсдс	ддссдсСааа	ссааддсдсд	ссССССдсСс	асаСддсЬсд	2340
асадаЬсЬЬс	ааСаСЬддсс	аССадссаСа	ССаССсаССд	дССаСаСадс	асаааьсааЬ	2400
аьсддсьаСЬ	ддссаЬСдса	СасдССдСаС	сСаСаСсаСа	асасдсасас	ЬЬаЬаЬЬддс	2460
ЬсаЬдЬссаа	ьаЬдассдсс	аСдССддсаС	сдаССаССда	сСадССаССа	аСадСааЬса	2520
аСЬасддддЬ	саььадьсса	Садсссасаь	аСддадсСсс	дсдССасаСа	асьЬасддСа	2580
ааЬддсссдс	сЬддсьдасс	дсссаасдас	ссссдсссас	СдасдСсааС	ааьдасдьаЬ	2640
дЬЬсссаЬад	ьаасдссааЬ	адддаесссс	сассдасдсс	ааЬдддСдда	дЬаЬСЬасдд	2700
ьааасьдссс	асСЬддсадЬ	асаСсаадСд	СаСсаСаСдс	саадьссдсс	сссЬаЬЬдас	2760
дЬсааьдасд	дьаааЬддсс	сдссСддсаС	СаСдсссадь	асаСдассСС	асдддасСЬЬ	2820
ссЬасЬЬддс	адЬасаЬсба	сдСаССадСс	ассдссасса	ссаСддьдас	дсддьсльдд	2880
садьасасса	аСдддсдьдд	аСадсддССС	дасСсасддд	даСССссаад	СсЬссасссс	2940
аььдасдьса	аЬдддадСЬЬ	дССССддсас	сааааЬсаас	дддасСССсс	ааааьдьсдь	3000
аасаасьдсд	аьсдсссдсс	ссдССдасдс	ааасдддсдд	Саддсдсдса	сддьдддадд	3060
ЬсСаСаЬаад	сададсЬсдЬ	ССадСдаасс	дСсадаСсас	СадаадсССь	аЬЬдсддЬад	3120
ЪЬЬаЬсасад	ЫаааСЬдсь	аасдсадСса	дсдсССсьда	сасаасадСс	ьсдаасЬЬаа	3180
дсЬдсадьда	сьсСсССаад	дСадссьСдс	адаадссддс	сдсдаддсас	ьдддсаддьа	3240
адьаЬсаадд	ЬЬасаадаса	ддсссаадда	дассааСада	аасСдддсСС	дьсдадасад	3300
адаадасЬсЬ	ЬдсдСЬЬсЬд	асаддсассС	аССддСсССа	сСдасассса	сЬЬЬдссЬЫ:	3360
сЬсЬссасад	дЬдЬссассс	ссадьссаас	сасадсссьс	аассаадссд	ссадсаЬдда	3420
сЬасЬасадд	аадсасдссд	ссаЬсССссС	ддСдасссСд	адсдсдсссс	ьдсасдьдсь	3480
дсасадсдсс	ссадасдьдс	аддасСдссс	сдадЬдсасс	сСдсаддада	асссаЬЬсЬЬ	3540

садссадссс	ддадссссса	СссСдсадСд	саСдддсСдс	СдсССсадса	дддссСассс	3600
сассссссьд	аддадсаада	адассасдсс	ддсдсадаад	аасдСдасса	дсдададсас	3660
сьдсьдсдСд	дссаададсС	асаасадддс	дассдСдасд	ддсддсССса	аддсддадаа	3720
ссасассдсс	СдссасСдса	дсассСдсСа	сСассасаад	адсСааСдас	саСддасасС	3780
ссадСдссад	сааСдасаСс	ьсаддддсса	даддаассдс	ссадададса	асСсСдадаС	3840
ссааддасдс.	сасадддсса	асССдадддс	ссададсадд	аадсасссад	ададсадссс	3900
СааасСсадд	дасададсса	ьдсСдддаад	асдсссдадс	Ссаадссдаа	ссссадсаса	3960
сСддсддссд	ССасСадСдд	аСссдадсСс	ддСассаадс	ССаСсдагас	сдСсдассСс	4020
даддддссдс	сСдсдддсьд	ссссдсСССд	сддасдддсС	дсссссдсдс	даасддаасд	4080
ссддассссс	дССаасаССд	ассаадаасс	дсаСддассС	аасаССсдас	сСсаССсадс	4140
ассааадддд	ддадддддад	ддддССасаа	асСдсааСад	адасСдсада	ььдсььседь	4200
адСдддаСсь	ССдСдаадда	ассССасССс	СдсддсдСда	саСааССдда	сааасЬассЬ	4260
асададаССЬ	ааадсСсСаа	ддСаааСаСа	ааасссссаа	дСдСасааСд	ЬдЬЬааасСа	4320
ссдаССсьаа	ссдсссдсдс	аССССадасС	ссаассСасд	дааесдасда	аЬдддадсад	4380
СддСддааСд	сссссаасда	ддаааассСд	ССССдсСсад	аадаааСдсс	аЬсЬадЬдаЬ	4440
дасдаддсса	сСдсСдасСс	ЬсаасаССсС	асСссСссаа	аааадаадад	аааддЬадаа	4500
дассссаадд	асСССссССс	адааССдсСа	адССССССда	дСсаСдсСдС	дЬЬЬадЬааЬ	4560
адаасСсССд	сССдсСССдс	СаСССасасс	асаааддааа	аадсСдсасС	дсЪаьасаад	4620
аааас саСдд	ааааасассс	СдсаассССС	асаадсаддс	аСаасадсса	СааСсаЬаас	4680
аСассдьССС	ССсССасСсс	асасаддсаС	ададсдСссд	сСаССааСаа	сЬаСдсЬсаа	4740
ааассдсдса	ссСССадсСС	сссаасссдс	аааддддсса	асааддааса	ССЬдаСдЬаЬ	4800
адСдссССда	сСададаСса	СааСсадсса	СассасаССС	дСададдССС	ЬасЬЬдсЬЬЬ	4860
аааааасссс	ссасассьсс	сссСдаассС	дааасаЬааа	аСдааСдсаа	ьсдььдььдь	4920
саасссдссс	ассдсадссс	аСааСддССа	саааСааадс	ааСадсаСса	саааЫЬсас	4980
аааСааадса	СССССССсас	СдсаСссСад	ссдсддсссд	сссааассса	ЬсааьдьаСс	5040
ССаСсаСдьс	сддасссссд	ддСассдадс	СсдааССсдС	ааСсаСдСса	ЬадсЬдЬЬЬс	5100
сСдСдСдааа	ССдьСаСссд	сСсасааССс	сасасаасаС	асдадссдда	адсаЬааадЬ	5160
дСааадссСд	дддсдсссаа	СдадСдадсс	аасСсасасс	аассдсдссд	сдсЪсасьдс	5220
ссдсьССсса	дСсдддааас	ссдСсдСдсс	адсСдсаССа	аСдааСсддс	саасдсдсдд	5280
ддададдсдд	СССдсдЬаСС	дддсдсСсСС	ссдсССссСс	дсссасСдас	ссдссдсдсс	5340
сддСсдСьсд	дсСдсддсда	дсддСаСсад	сссасьсааа	ддсддСааСа	сддььаьсса	5400
садааСсадд	ддаСаасдса	ддааадааса	СдСдадсааа	аддссадсаа	ааддссадда	5460
ассдСааааа	ддссдсдССд	ссддсдсссс	Ссеасаддсс	ссдссссссь	дасдадсаЬс	5520
асаааааСсд	асдсСсаадС	сададдеддс	дааасссдас	аддасСаСаа	адаЬассадд	5580
сдссьссссс	СддаадсСсс	сСсдСдсдсС	сСссСдССсс	дасссСдссд	сьъассддаь	5640
асссдсссдс	сСССсСсссС	Ссдддаадсд	СддсдсСССс	СсаСадсСса	сдсьдЪаддь	5700
аьсссадССс	ддСдСаддСс	дССсдсСсса	адсСдддсСд	СдСдсасдаа	ссссссдСЕс	5760
адсссдассд	сСдсдссССа	СссддСаасС	аСсдСсССда	дСссаасссд	дьаадасасд	5820
асССаСсдсс	асСддсадса	дссассддса	асаддаССад	сададсдадд	ЬаЬдьаддсд	5880
дСдсСасада	дССсьСдаад	СддСддссСа	асСасддсСа	сасСадаада	асадЬаЬЬЬд	5940
дСаСсСдсдс	СсСдсСдаад	ссадссассС	Ссддааааад	адссддсадс	ссьсдаьссд	6000
дсааасааас	сассдсСддС	адсддСддСС	СССССдСССд	саадсадсад	аььасдсдса	6060
дааааааадд	аСсСсаадаа	даСссСССда	СсССССсСас	ддддСсСдас	дсЬсадСдда	6120
асдаааасьс	асдССааддд	ассссддсса	сдадассасс	аааааддасс	ССсассьада	6180
сссссссааа	ССааааасда	адссссааас	саасссааад	СаЬасасдад	СааасЬЬддЬ	6240
сСдасадССа	ссааьдсССа	ассадсдадд	сассСаСссс	адсдаСссдС	сЬаСЬЬсдЬЬ	6300
сасссаьадС	сдсссдасСс	сссдСсдсдс	адасаассас	дасасдддад	ддсСЬассаь	6360
сСддссссад	сдсСдсааСд	аСассдсдад	асссасдсСс	ассддсСсса	даЬСЬаЬсад	6420
сааСааасса	дссадссдда	адддссдадс	дсадаадсдд	СссСдсаасС	ЬЬаЬссдссь	6480
ссаСссадСс	саССааСЬдс	Сдссдддаад	сСададСаад	СадССсдсса	дсьааЬадЬЬ	6540
СдсдсаасдС	СдьСдссаСС	дсСасаддса	ссдСддСдсс	асдсссдьсд	ЬЬС.ддС.аЬдд	6600
сьссасссад	сСссддССсс	саасдаСсаа	ддсдадССас	аСдаСссссс	аьдЬЬдьдса	6660
ааааадсддС	СадсСссССс	ддСссСссда	СсдССдСсад	аадСаадССд	дссдсадСдь	6720
сассасСсаС	ддьСаСддса	дсасСдсаСа	асссссссас	сдСсаСдсса	Ьссдьаадаь	6780
дсССССсСдС	дасСддСдад	сасссаасса	адСсасСссд	адаасадсдс	асдсддсдас	6840
сдадссдссс	ССдсссддсд	ссаасасддд	асаасассдс	дссасасадс	адаасЬЬЬаа	6900
аадСдсСсаС	саССддаааа	сдссссссдд	ддсдаааасс	сСсааддаСс	ССассдсьдь	6960
Сдадасссад	сссдасдсаа	сссасссдсд	сасссаасСд	аСссссадса	ЬсЬЬЬСасЬЬ	7020
ссассадсдС	ССсСдддьда	дсааааасад	дааддсаааа	сдссдсаааа	аадддааЬаа	7080
дддсдасасд	дааасдссда	асасСсасас	сссссесссс	ссаасассас	ЬдаадсаЫхЬ	7140
аСсадддССа	ССдСсСсаСд	адсддаСаса	СаСССдааСд	сасссадааа	ааЬааасааа	7200
СаддддССсс	дсдсасаССС	ссссдаааад	Сдссасссда	сдсссаадаа	ассаЬЬаЬЬа	7260
ссасдасасс	аассСаСааа	аасаддедСа	ссасдаддсс	сСССсдссСс	дсдсдЬСЬсд	7320
дсдаСдасдд	СдаааассСс	СдасасаСдс	адсСсссдда	дасддСсаса	дсССдСсЬдь	7380

аадсддаЕдс	сдддадсада	саадсссдЕс	адддсдсдЕс	адсдддЕдЕХ	ддсдддЕдЕс	7440
ддддсЕддсЕ	ЕаасЕаЕдсд	дсаЕсададс	адаЕЕдЕасЕ	дададЕдсас	саЕаЕдсдад	7500
ссаадасхдс	сасЕдсасхс	садссЕддЕЕ	сссааЕадас	ссХдааддсс	схасаддххд	7560
ЕсЕЕсссаас	схдссссххд	сЕссаЕасса	сссдссЕсса	ссссахааха	ЕХаХасаадд	7620
асассЕадЕс	ааасааааЕд	аЕдсаасЕЕа	аЕЕЕЕаЕХад	дасааддсЕд	дХдддсасХд	7680
дадЕадсасс	ЕЕссасдасс	аддададдса	сЕддддаддд	дЕсасаддда	Хдссасссдд	7740
дсадсЕадаа	дссасадсЕд	садЕЕадЕсЕ	ЕЕсЕЕсЕсдЕ	адасЕЕсааа	сХЕаХасЕХд	7800
аЕдссЕЕЕЕЕ	ссЕссЕддас	сЕсадададд	асдссЕдддЕ	аЕЕсЕдддад	аадХХЕаХаХ	7860
ЕЕссссаааЕ	сааЕЕЕсЕдд	дааааасдЕд	ЕсасЕЕЕсаа	аЕЕссЕдсаЕ	даЕссЕХдХс	7920
асааададЕс	ЕдаддЕддсс	ЕддЕЕдаЕЕс	аХддсЕЕссЕ	ддЕааасада	асхдссХссд	7980
асЕйЕССааа	ссаЕдЕсЕас	ЕЕЕасЕЕдсс	ааЕЕссддСЕ	дЕЕсааЕаад	Есххааддса	8040
Есахссааас	ЕЕЕЕддсаад	ааааЕдадсЕ	ссЕсдхддЕд	дЕХсХЕХдад	ххсхсхасхд	8100
адаасЕаЕаЕ	ЕааЕЕсЕдЕс	сЕЕЕаааддЕ	сдаЕЕсЕЕсЕ	саддааЕдда	даассаддЕЕ	8160
ЕЕссЬассса	ЕааЕсассад	аЕЕсЕдЕ ЕЕа	ссЬЕссасЕд	аададдЕЕдЕ	ддЬсаХЕсЕХ	8220
ЕддаадЕасЕ	ЕдаасЕсдЕЕ	ссЕдадсдда	ддссадддЕа	ддЕсЕссдЕЕ	сХХдссааХс	8280
сссаЕаЕЕЕЕ	дддасасддс	дасдаЕдсад	ХЕсааХддЕс	даассаЕдаЕ	ддаадсХЕдд	8340
аддЕдсасас	сааЕдЕддЕд	ааЕддЕсааа	ЕддсдЕЕЕаЕ	ЕдЕаЕсдадс	хаддсасЕХа	8400
ааЕасааЕаЕ	сЕсЕдсааЕд	сддааЕЕсад	ЕддЕЕсдЕсс	ааЕссаЕдЕс	адасссдХсХ	84 60
дЕЕдссЕЕсс	ЕааЕааддса	сдаЕсдЕасс	ассЕЕасЕЕс	сассааЕсдд	саХдсасддХ	8520
дсЕЕЕЕЕсЕс	ЕссЕЕдЕаад	дсаЕдЕЕдсЕ	аасЕсаЕсдХ	ЕассаЕдЕЕд	саадасХаса	8580
ададСаЕЕдс	аЕаадасЕас	аХХЕсссссХ	сссХаХдсаа	аадсдааасЕ	асХахаХссХ	8640
даддддасЕс	сЕаассдсдЕ	асаассдаад	ссссдсЕЕЕЕ	сдссЕаааса	сасссХадХс	8700
сссЕсадаЕа	сдсдЕаЕаЕс	ЕддсссдЕас	аЕсдсдаадс	адсдсаааас	дссЕаасссЕ	8760
аадсадаххс	ЕЕсаЕдсааЕ	ЕдЕсддЕсаа	дссЕЕдссЕЕ	дЕЕдЕадсЕЕ	аааХХХХдсЕ	8820
сдсдсасЕас	ЕсадсдассЕ	ссаасасаса	адсадддадс	адаЕасЕддс	ххаасхаЕдс	8880
ддсаЕсадад	садаЕЕдЕас	ЕдададЕдса	ссаЕаЕддЕд	сасЕсЕсадЕ	асааХсЕдсХ	8940
сЕдсадаЕсЕ	ддссЕссдсд	ссдддЕЕЕЕд	дсдссЕсссд	сдд		8983

<210> 8 <211> 26 <212> ДНК <21 3> Искусственная <220>

<223> Азс-СМУ-Г Праймер <400> 8 ддсдсдссХХ ХХдсХсасаХ ддсХсд 26 <210> 9 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Рас-СМУ-К Праймер <400> 9 ссХХааХХаа дадсХдХааХ ЕдаасХддда дхд 33 <210> 10 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Азс-ЗУ40-Г Праймер <400> 10 ддсдсдссдс аЕасдсддаЕ сЕд 23 <210> 11 <211> 34 <212> ДНК < 213 > Искусственная <22 0>

<223> Рас-5У40-К Праймер <400> 11 ссЕЕааЕЕаа дЕЕсдадасЕ дЕЕдЕдЕсад аада 34 <210> 12 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЬеЕа-ΝοΕΙ-Γ Праймер <400> 12 дсддссдсаЕ асдсддаЕсЕ дс 22 <210> 13 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЬеЕа-ΝοΕΙ-Κ Праймер <400> 13 дсддссдсЕс асЕсаЕЕадд сассссадд 2'

Claims (21)

1. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую β-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (ΡδΗ), которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 1 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 98% кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 1, где нуклеотидная последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 1 модифицирована в соответствии с кодонами, предпочтительными для использования в клетках яичников китайских хомячков (ΟΗΟ).

2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую α-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (ΡδΗ), которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 2 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 98% кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 2, где нуклеотидная последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 2 модифицирована в соответствии с кодонами, предпочтительными для использования в клетках яичников китайских хомячков (ΟΗΟ).

3. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, раскрытую в п.1, под контролем промотора, который является активным в клетке-хозяине.

4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, раскрытую в п.2.

5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 3 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 70% кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 3, где нуклеотидная последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 3 представляет собой немодифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь ΡδΗ человека.

6. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.4 или 5, в которой дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем отдельного промотора.

7. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-6, в которой нуклеотидная последовательность, раскрытая в п.1, и/или дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем вирусного промотора.

8. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, в которой нуклеотидная последовательность, раскрытая в п.1, находится под контролем промотора δν40.

9. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, в которой дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем промотора СМV.

10. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-9, имеющая нуклеотидную последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 7.

11. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-10.

12. Клетка-хозяин по п.11, представляющая собой клетку млекопитающего.

13. Клетка-хозяин по п.11 или 12, представляющая собой клетку яичника китайского хомячка ^ΗΟ).

14. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п.3 и дополнительную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности, раскрытой в п.2, и нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 3, указанной в п.5.

15. Линия клеток яичников китайских хомячков, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую кодирующую область нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ Ио. 1, и кодирующую область нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ Ио. 2, и имеющая номер депозита ΌδΜ АСС2833.

16. Культура клеток, содержащая клетку-хозяина по любому из пп.11-14 или линию клеток по п.15 в подходящей культуральной среде.

17. Способ получения рекомбинантного ΡδΗ человека, включающий культивирование клеткихозяина по любому из пп.11-14 или линии клеток по п.15 в подходящей культуральной среде и сбор супернатанта культуры клеток.

18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию очистки рекомбинантного ΡδΗ человека от супернатанта культуры клеток.

19. Способ получения клетки-хозяина по любому из пп.11-13, включающий трансфицирование клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-10.

20. Способ получения клетки-хозяина по п.14, включающий трансфицирование клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по п.3 и дополнительной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности, раскрытой в п.2, и нуклеотидной

- 13 022993 последовательности 8ЕР ΙΌ Νο. 3, указанной в п.5.

21. Применение нуклеотидной последовательности 8ЕР ΙΌ Νο. 1 и/или 8ЕР ГО Νο. 2 для получения рекомбинантного Р8Н человека.

рХМ17вз 3398 3457 \νί α Р5Н 65 124 рХМ17зз 3458 3517 \γ| а Р8Н 125 184 рХМ17зз 3518 3577 \νΐ аР5Н 185 244 рХМ17аз 3578 3637 ννΐ а Р5Н 245 304 рХМЗ.733 3638 3697

М пР8Н 305 364

РХМ1733 3698

3757 \νί а Р5Н 365 424 рХМ17зе 3758 «4 а Р8Н 425 ссЬаа^Саадссдссадсж^сгдассасЬасаддаадСасдссдссаЬсЬСссСддСдасс

ΙΙΙΠΙΠΙ.ΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ IIIIIIII II II II II ΙΙΙΙΙ ПП и с£СааЬСаадссдссадса£дда££.асЬасадаааа1:а1:дсадсЬа1:с1СС.сСдд£саса сСдадсдедЪЬсеЬдсасдСдседсасадсдссссадасдЬдсаддас^дссссдадЬдс

Π ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ Π Π И III Η II I Η Η III I ΗΙ I К III

ЬЪдСсдд£д1Х£<:ьдсаСдС£с£ссаЬ.1;ссдсЬссС.даЪдЪдсаддаЫ1дсссадаа1:дс асссЪдсаддадаасссаеьсСЪсадссадсссддадсссссаЬсс^дсадСдсаСдддс

II Π III Π ΙΙΙΙΙ I ПН И НИН II ΙΙΙΙΙ II II ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙ асдс£асаддаааасссаС£с££с1;сссадссдддЪдссссаа£ас£.Ьсад£дса1:дддс

ЬдсСдсСЬсадсадддссЬассссассссссЪдаддадсаадаадасса^дсЪддЬдсад

ΙΠΙΙΗΙΙ И И II ΙΙΙΙΙ II И III ΙΙΙΗΙΙΠ III ни и

СдсСдсЫхсЬсЬададсаСаСсссасСссасЬааддЪссаадаадасдаЬдЪЬддЬссаа аадаасдедассадсдададсассСдсЬдсдЬддссаададсм; асаасадддЪдассд£д

ИНПП III III III ΙΙΙΙΙ И II И II IIIIIIII И II аадаасдесассРсададСссасХЪдсСдЬдСадс^аааРсаеаСаасадддЬсасадСз аСдддсддсъьсааддСддадаассасассдссЬдссасЪдсадсассСдсСас^ассас

ШИ И ΙΙΙΙΙ II НН I ПП III II ΙΙΙΠΙΠΗΙ II II II II III аСддддддЫ:1:сааадЬддадаассасасддсд1:дссасРдсадЬасЬЁдС.СаЫ:аЬсас аададсЪааЪда 3769

II III ааа^сбЬаа 433

Фиг. 1а

Оиегу; ЗЬ^СЬ:

Оиехгу:

ЗЪ^СЬ : Оиегу:

5Ь]СЬ:

Оиегу:

ЗЬ]сЬ;

Оиегу;

5Ъ}С£:

Оиегу:

8Ь]Сб:

Оиегу;

ЗЬдсЬ:

З^СС :

1 аддаЬссссдддсЬассЬссссдсддддаддсдсдссссбЪаабЬаадссдссассаЪда

II1111IIII11 ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΗΙΗΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙ

2 аддасссссддд-ъассЬссссдсддддаддсдсдсссссьаансаадссдссассаЪда

61 адасасЪссадссСССс&СссеьъссСдЪЬдсЬддааадсааЬсЬдсбдсааЪадсбдбд

НИ II ΙΙΙΙΙ IΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙΙ II ΙΙΙΙΙΙΙ ΙΗΙ ΙΙΙΙΙ I

61 адасссъдсадЬЬсЫдсЬСсссдЪЬсЬдседсСддааддссаСссдсЬдсаасадсСдсд

121 адсидассаасассассассдсаасададааадаадааЬдЬсд^сЪссдсаСаадсабса

II111IIII11111IIIII II II ΙΙΙΙΙ II II II I ΙΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙ

121 адс£дассаасаЬсасса£сдссаЪсдадааддаддадЪдсадд£ЬсЬдсабсадсаЬса

181 асассасбЪддсдСдсСддсбасЪдсСасассадддаЬсСддСдбаСааддасссадсса

181 асассассбддрдсдссддабасСдсСасассадддассЬддРдЁасааддассссдсса

241 ддсссааааСссадаааасаЬдСасссьсааддаасСддбаСасдааасадЬдададгдс

ΙΙΙΙΙΙΙ IIIIIIII II II 1111IIIIIII ΙΙΙΙΙ II II II ΙΙΙΙΙ ιιιι

241 ддсссаадабссадаадассбдсассЪЬсааддадсГддСдЪасдадассдСдадддбдс

301 ссддсЬдЬдсРсассабдсадаЬЪссСЬдбабасаЪасссадЁддссасссадрдбсасЬ

301 ссддсгдсдсссассасдссдасадссьдбасасссассссдеддссасссадсдссас!:

361 дсддсаадбд^дасадсдасадсассдассдсассдсдсдаддссгддддсссадсСасг

I ΙΙ1ΙΗΗ ΙΠΙΠΙΙΙΙΙΙΙΙ II Η II III I ΙΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΗΙΙΙΙΙ

361 дсддсаадСдсдасадсдасадсассдасСдсассд^даддддссСдддссссадссас!:

421 дсессбъеддСдааабдааадааЪааасаСдссабддсаЬдсдадсбсдааСЛс 474

120

120

180

180

240

240

300

300

360

360

420

420

421 дсадсЫзсддсдадабдааддадЪавСда--ссабддсаЬдсдадсЬсдааСЬс 472

Фиг. 1Ь

ЯасП - 8981 ΝοΑ -13

Фиг. 2

ΝαΛ - 3770

- 14 022993

Конструкция вектора Фиг. 3