CN111072764A - 一种重组人Activin A的制备方法 - Google Patents

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李晓平
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杨佩
许玉丽
李文佳
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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组人Activin A的制备方法。该方法首先筛选获得SPH2信号肽，并对信号肽及人Activin A前体氨基酸序列进行密码子优化，构建表达人Activin A的重组质粒。其次采用CHO细胞为宿主用于构建表达重组人Activin A的工程细胞株，然后工程细胞株在无血清培养基中进行高效表达重组蛋白。本发明采用阴离子填料捕获重组蛋白，并进一步使用反相柱精纯获得纯度高于95％的重组人Activin A。该制备方法简单快捷，生产条件温和、分离提取方便、整个过程工艺简单，具有明显的产业化应用前景，且制备得到的重组人Activin A纯度和活性均较高。

Description

一种重组人Activin A的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组人Activin A的制备方法。
背景技术
激活素(Actvin，ACT)，又名活化素，是Vale等和Ling等首先从猪卵泡液中分离纯化出来的一种糖蛋白激素，因能与抑制素(Inhibin，INH)分别特异性促进和抑制垂体细胞分泌卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)而得名，属于转化生长因子β超家族成员。激活素主要是由卵巢颗粒细胞和胎盘合成分泌，由于其具有特异性地促进垂体细胞分泌及合成卵泡刺激素的生物学活性，因而被命名为激活素。ACT同INH均为两个亚基构成的二聚体。ACT由β亚单位构成，包括同源二聚体ACTA(βA-βA)和ACTB(βB-βB)或异源二聚ACTAB(βA-βB)。其中βA亚基含量最多。三种分子结构的激活素具有类似的生物学活性，其作用的特异性与其与受体作用后信号传导的组织差异有关。因ACTA(Actvin A)的生理作用更为广泛，对机体整个生命过程均有重要的作用，成为近年来备受关注的新型细胞因子，故目前对ACTA的研究较多。
现有技术中，重组人Activin A表达主要是采用哺乳动物细胞和酵母表达，采用哺乳动物细胞表达重组人Activin A时，使用含有血清的培养基，由于血清批间差异较大，成分不能保持一致,另外存在一定病毒表达风险，造成重组蛋白稳定性差，且不利于工业化。采用酵母表达重组人Activin A时会引入外源标签，外源标签的未完全切割可能影响天然蛋白的结构和功能，使重组蛋白活性丧失或赋予非目的功能。因此，基于现有技术表达的重组人Activin A用于后续多能干细胞定向分化均会存在一定的风险。
另外，制备重组人Activin A的现有纯化工艺主要使用凝胶过滤-阳离子-反相和抗体捕获的方式，该工艺不利于后续放大。
专利EP0960118A1报道人Activin A的核酸和氨基酸序列，与公布的氨基酸序列(NCBI ACCESSION NUMBER:NP_002183)差异较大，且不完整。到目前为止，未见专利和文献报道重组CHO细胞株使用无血清培养基制备重组人Activin A。开发使用无血清培养基制备重组人Activin A不仅能够降低产品的风险，而且为用于多能干细胞定向分化提供保障。
因此，急需开发一种工艺过程简单、纯度和活性高、适于工业化生产的重组人Activin A的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人Activin A的制备方法。该方法首先筛选获得SPH2信号肽，并对信号肽及人Activin A前体氨基酸序列进行密码子优化，构建表达人Activin A的重组质粒。其次采用CHO细胞为宿主用于构建表达重组人Activin A的工程细胞株，然后工程细胞株在无血清培养基中进行高效表达重组蛋白。本发明采用阴离子填料捕获重组蛋白，并进一步使用反相柱精纯获得纯度高于95％的重组人Activin A。该制备方法简单快捷，生产条件温和、分离提取方便、整个过程工艺简单，具有明显的产业化应用前景，且制备得到的重组人Activin A纯度和活性高。本发明的上述技术目的是通过下述技术方案实现：
一种重组人Activin A的制备方法，在进行重组人Activin A表达时，采用CHO细胞和无血清培养基进行培养及重组蛋白的表达。
在本发明的一些实施方案中，在进行重组人Activin A的纯化阶段，采用阴离子填料捕获重组人Activin A。在本发明的一些实施方案中，所述的阴离子填料是Q BestaroseFF。
在本发明的一些实施方案中，在进行重组人Activin A的纯化阶段，采用C8反相柱对重组人Activin A进一步精纯。
在本发明的一些实施方案中，在构建重组表达质粒时，所采用的载体是pcDNA3.1(+)。
在本发明的一些实施方案中，在构建重组人Activin A表达质粒时，所优选的信号肽是SPH2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施方案中，构建的重组人Activin A表达质粒包含优化后的重组人Activin A前体核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施方案中，重组人Activin A前体氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明中，重组人Activin A前体蛋白通过工程细胞株在无血清培养基中表达并经工程细胞株加工为成熟的重组人Activin A，成熟的重组人Activin A为两个单体通过一对链间二硫键连接形成同源二聚体，单体氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一些实施方案中，在构建表达人Activin A细胞株时，宿主采用CHO细胞株；在本发明的一些实施方案中，在构建表达人Activin A细胞株时，所采用的CHO细胞株为CHO DG44，并利用G418加压筛选。
在本发明的一些实施方案中，无血清培养基表达重组人Activin A的过程如下：以驯化后的表达重组人ActivinA的工程细胞株进行复苏，培养3～4天后，至细胞密度达到2～4×106cells/mL进行传代，然后培养至细胞密度达到2～4×106cells/ml，获得种子液；将获得的种子液按接种后细胞密度为0.3～0.8×106cells/ml接种到含有无血清培养基的摇瓶中，35～37℃、140r/min、8.0％CO2培养，培养过程每天按1％～7％的比例补料营养培养基Cell Boost 7a和氨基酸TCT混合液，补料培养一定时间后(8～12天)收集细胞发酵上清液。
在本发明的一些实施方案中，所述的无血清培养基是CD OptiCHOTM Medium或Cellvento CHO化学限定培养基(含8mM L-glutamine和1.8％PluronicTM F-68)。
在本发明的一些实施方案中，所述的驯化后的工程细胞株，是将经筛选与鉴定得到的工程细胞株梯度驯化至无血清培养基Cellvento CHO-200中。
在本发明一些实施方案中，一种重组人Activin A的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建一种重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A；
(2)表达重组人Activin A的阳性细胞株筛选；
(3)重组人Activin A CHO细胞无血清培养基高效表达；
(4)重组人Activin A分离纯化；
(5)重组人Activin A活性检测。
在本发明的一些实施方案中，所述的重组蛋白的纯化过程包括如下步骤：
(1)阴离子填料进行重组人Activin A蛋白捕获；
(2)C8反相柱精纯重组人Activin A蛋白。
本发明所述的“G418”是指遗传霉素(Geneticin)，用于筛选阳性细胞株。
本发明所述的阴离子填料“Q Bestarose FF”是指季氨基型离子交换琼脂糖凝胶。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
1)本发明使用CHO细胞表达和无血清培养基制备重组人Activin A，培养成分简单，重组蛋白受污染风险小，生产工艺稳定，利于工业化生产，不仅能够降低产品的风险，而且为用于多能干细胞定向分化提供保障；
2)本发明采用阴离子填料捕获目的蛋白，并进一步使用C8反相柱精纯的方法对重组蛋白进行纯化，纯化步骤简单，纯化后的重组蛋白纯度高(95％以上)，活性也高；
3)本发明重组蛋白的制备方法简单快捷、生产条件温和、分离提取方便，整个工艺过程简单，具有明显的产业化应用前景。
附图说明
图1为重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A的示意图；
图2为阳性细胞基因组PCR鉴定示意图；
图3为反相纯化得到重组人Activin A样品SDS-PAGE鉴定示意图；
图4为反相纯化得到重组人Activin A样品质谱鉴定示意图；
图5为重组人Activin A阳离子纯化电泳结果示意图；
图6为重组人Activin A的生物学活性测定结果示意图
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A的构建
1.重组人Activin A的全基因合成
根据NCBI公布的Activin A前体氨基酸序列(共426aa)，按照中国仓鼠卵细胞(CHO)的优化原则，对核酸序列进行优化。同时对序列中的酶切位点进行严格限定，优化的序列中不能含有Hind III、EcoR I和Pvu I酶切位点，同时对序列的5＇端添加Hind III和Kozak序列(GCCGCCACC)，对序列3＇端添加双终止密码子(TGATGA)和EcoR I，获得编码Activin A前体核苷酸序列，核苷酸序列是委托通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，其编码Activin A前体的核苷酸序列通过化学合成获得的。所获得的合成序列通过双酶切后插入至pUC57载体筛选获得pUC57-Activin A质粒。
2.SPH2信号肽筛选
根据SignalP-5.0筛选获得SPH2信号肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，按照中国仓鼠卵细胞(CHO)的优化原则，对核酸序列进行优化。
3.重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A的构建
以获得的质粒pUC57-Activin A为模板，通过上游引物F：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGCTGGGCCTGCGGTGGGTGTTCCTGGTGGCCATCCTGGAGGGCGTGCAGTGCTCCCCCACCCCTGGCAGCGA，含有Hind III酶切位点；下游引物R：CCGGAATTCTCATCAGCTGCAGCCACACTCCTCCA，含有EcoR I酶切位点。加入其它反应液进行PCR，扩增得到SPH2-Activin A片段(1308bp)。接着利用Hind III和EcoR I酶切SPH2-Activin A片段，回收目的基因SPH2-Activin A片段(1296bp)，与pcDNA3.1(+)经Hind III和EcoR I双酶切后回收载体片段(5387bp)进行连接，筛选得到最终重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A，结果见图1。利用CMV forwardprimer:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG和BGH reverse primer:TAGAAGGCACAGTCGAGG引物进行测序，测序结果显示克隆基因片段与理论一致。
实施例2表达重组人Activin A工程细胞株筛选及鉴定
1.重组人Activin A工程细胞株筛选
利用Pvu I酶切位点对重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A进行线性化，并经过纯化、过滤除菌及无菌检测，获得线性化质粒pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A(浓度为0.4μg/μL)。
将CHO宿主细胞利用无血清培养基(CD OptiCHOTM medium)复苏培养后，当细胞密度约8×105cells/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1×107cells，质粒约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Gene pulser Xcell)。电击后细胞于20mL无血清培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并使用含G418终浓度800μg/mL的20mL无血清培养基重悬培养。当细胞密度约0.6×106cells/mL时，对获得的混合克隆株用无血清培养基进行传代，传代后活细胞密度约0.2×106cells/mL，细胞于35～37℃，140r/min，8.0％CO2培养3天，对细胞进行传代培养及保种。
2.重组人Activin A工程细胞株鉴定
提取经筛选获得的工程细胞株基因组，并以该基因组为模板使用引物CMVforward primer:和BGH reverse primer进行PCR扩增，得到与理论大小(1526bp)相符的DNA片段C，结果见图2，同时通过测序显示扩增片段序列与理论相符，说明pcDNA3.1(+)-SPH2-Activin A整合至宿主CHO DG44细胞基因组上，筛选得到表达重组人Activin A的工程细胞株。
3.工程细胞株培养基驯化
经筛选与鉴定得到的工程细胞株梯度驯化至无血清培养基(Cellvento CHO-200)中，驯化后细胞生长状态良好。
实施例3重组人Activin A无血清培养基高效表达
以驯化后的表达重组人Activin A的工程细胞株进行复苏，培养3～4天后，至细胞密度达到2～4×106cells/mL进行传代，培养至细胞密度达到2～4×106cells/ml，获得种子液。将获得的种子液按接种后细胞密度为0.3～0.8×106cells/ml接种到含有CellventoCHO-200培养基的1L摇瓶中35～37℃、140r/min、8.0％CO2培养，培养过程按每天一定比例(1％～7％)流加营养培养基Cell Boost 7a和氨基酸TCT(300mM Tyr和50mM Trp，150mMCys)，补料培养10天左右收集细胞发酵上清。
实施例4重组人Activin A分离纯化
发酵10天后，结束培养，离心收集上清，采用装载阴离子填料柱(Q Bestchrom FF)的FPLC AKTA纯化设备(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)进行Activin A蛋白捕获，得到Activin A粗品。Activin A粗品使用C8反相柱进行精纯，用5％的乙腈及千分之一的三氟乙酸平衡反相柱，用25％～40％乙腈洗脱Activin A样品。最后使用氮气将乙腈除去，并用3500透析膜透析至0.01M～0.02M PBS pH7.4的缓冲液中，4℃透析过夜，最终得到ActivinA精品。Activin A精纯样品电泳结果见图3，质谱结果见图4，根据电泳及质谱结果纯化获得Activin A纯度大于95％。
对比例1阳离子填料柱纯化Activin A
发酵10天后，结束培养，离心收集上清，采用装载阳离子填料柱(SP550C)的FPLCAKTA纯化设备(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)进行Activin A蛋白捕获，将纯化收集的样品进行电泳，电泳结果见图5，从电泳结果可知Activin A能够高效表达，阳离子并未捕获到目的蛋白。
实施例5重组人Activin A活性检测
本分析方法是基于体外细胞的生物测定法。Activin A能够刺激K562细胞产生血红素，并呈剂量依赖性地在K562细胞内产生血红素，细胞被裂解，使用邻苯二胺检测Activin A刺激细胞后所产生血红素的量，用多功能酶标仪测定波长490nm处的吸光度，使用Prism软件做四参数拟合曲线，结果见图6，EC50值为2.126ng/ml。相比较于R&D SystemsRecombinant Human Activin A活性高约2.9倍。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物药研发有限公司
<120> 一种重组人ActivinA的制备方法
<160> 4
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
5 10 15
Val Gln Cys
<210> 2
<211> 1274
<212> DNA
<213> Activin A precursor sequence
<400> 2
atggagctgg gcctgcggtg ggtgttcctg gtggccatcc tggagggcgt gcagtgctcc
60
cccacccctg gcagcgaggg acactccgct gcccctgattg cccttcctgc gccctggctg
120
ccctgcctaa ggacgtgccc aactcccagc ctgagatggt ggaggctgtg aagaagcaca
180
tcctgaacat gctgcacctg aagaagaggc ctgatgtgac ccagcccgtg cccaaggccg
240
ctctgctgaa cgccatcagg aagctgcacg tgggcaaggt gggcgagaat ggctacgtgg
300
agatcgagga cgacatcggc aggagggccg agatgaacga gctgatggag cagaccagcg
360
agatcatcac cttcgctgag tccggcaccg cccggaagac cctgcacttc gagatctcca
420
aggagggctc cgacctgtcc gtggtggagc gggctgaggt gtggctgttt ctgaaggtgc
480
ctaaggctaa ccggacccgg accaaggtga ccatccggct gtttcagcag cagaagcacc
540
ctcagggctc cctggacacc ggcgaggagg ctgaggaggt gggcctgaag ggcgagcgga
600
gcgagctgct gctgagcgag aaggtggtgg atgctaggaa gtccacctgg cacgtgttcc
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tcgcttgcga gcagtgccag gagagcggcg ccagcctggt gctgctggga aagaagaaga
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acgaggaaaa ggagcagtcc caccggccct ttctgatgct gcaggctagg cagagcgagg
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accaccctca ccggcggagg aggaggggcc tggagtgtga tggcaaggtg aatatctgtt
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ctagcggcta tcacgctaat tactgcgagg gcgagtgtcc ttcccacatc gctggcacct
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ccggcagcag cctgtccttt cactccaccg tgatcaacca ctaccggatg cggggccact
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ccccttttgc taacctgaag agctgctgtg tgcccaccaa gctgcggccc atgtccatgc
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agtgtggctg cagc
1274
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<211> 425
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
5 10 15
Val Gln Cys Ser Pro Thr Pro Gly Ser Glu Gly His Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Asp Cys Pro Ser Cys Ala Leu Ala Ala Leu Pro Lys Asp Val Pro Asn
35 40 45
Ser Gln Pro Glu Met Val Glu Ala Val Lys Lys His Ile Leu Asn Met
50 55 60
Leu His Leu Lys Lys Arg Pro Asp Val Thr Gln Pro Val Pro Lys Ala
65 70 75 80
Ala Leu Leu Asn Ala Ile Arg Lys Leu His Val Gly Lys Val Gly Glu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu Met
100 105 110
Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly Ser
130 135 140
Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys Val
145 150 155 160
Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Phe Gln
165 170 175
Gln Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Thr Gly Glu Glu Ala Glu
180 185 190
Glu Val Gly Leu Lys Gly Glu Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ser Glu Lys
195 200 205
Val Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Val Phe Pro Val Ser Ser
210 215 220
Ser Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Lys Ser Ser Leu Asp Val Arg
225 230 235 240
Ile Ala Cys Glu Gln Cys Gln Glu Ser Gly Ala Ser Leu Val Leu Leu
245 250 255
Gly Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys Gly
260 265 270
Gly Gly Glu Gly Gly Ala Gly Ala Asp Glu Glu Lys Glu Gln Ser His
275 280 285
Arg Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro His
　　290 295 300
Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys
305 310 315 320
Cys Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp
325 330 335
Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu
340 345 350
Cys Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His
355 360 365
Ser Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala
370 375 380
Asn Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met
385 390 395 400
Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn
405 410 415
Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser
420 425
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 4
Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe
5 10 15
Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile
35 40 45
Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn
50 55 60
His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys
65 70 75 80
Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp
85 90 95
Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu
100 105 110
Cys Gly Cys Ser
115

Claims (7)

1.一种重组人ActivinA的制备方法，其特征在于，在进行重组人ActivinA表达时，采用CHO细胞和无血清培养基进行培养及表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行重组人ActivinA的纯化阶段，采用阴离子填料捕获重组人ActivinA。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，在进行重组人ActivinA的纯化阶段，采用C8反相柱对重组人ActivinA进一步精纯。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，在构建重组人ActivinA表达质粒时，所优选的信号肽是SPH2，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于，构建的重组人ActivinA表达质粒包含优化后的重组人Activin A前体核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于，所述的重组人ActivinA的前体氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于，无血清培养基表达重组人ActivinA的过程如下：以驯化后的表达重组人ActivinA的工程细胞株进行复苏，培养至细胞密度达到2～4×106cells/mL进行传代，然后培养至细胞密度达到2～4×106cells/ml时，获得种子液；将获得的种子液按接种后细胞密度为0.3～0.8×106cells/ml接种到含有无血清培养基的摇瓶中，35～37℃、140r/min、8.0％CO2培养，培养过程每天按1％～7％的比例补料营养培养基Cell Boost 7a和氨基酸TCT混合液，补料培养一定时间后收集细胞发酵上清液。
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