CN104854133A - 用于制备重组抗体治疗剂的最佳重链和轻链信号肽 - Google Patents

Abstract

描述了包含重链信号肽和/或轻链信号肽或者其组合的目标抗体以及组合物。描述了确定所述信号肽的方法，包括产生抗体信号肽数据集、成簇、选择和产生重组抗体用于增强的表达和分泌。

Description

用于制备重组抗体治疗剂的最佳重链和轻链信号肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月12日递交的新加坡临时申请第201207629-5号的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文中用于所有目的。

技术领域

本发明涉及生物技术和分子生物学领域。本发明涉及包含最佳选择的信号肽的目标抗体，及其从细胞增加的抗体分泌的应用。具体而言，本发明的实施方案涉及确定用于增加抗体的分泌的信号肽的方法，以及其他相关的抗体、组合物和方法。

发明背景

重组蛋白表达代表了大部分的用于分子生物学、农艺学、兽医学或医学的蛋白的制备。例如，重组治疗性抗体代表了制备的大比例的生技药品(即，利用生物技术制备的医用药物)。

蛋白信号序列，也称为拓扑发生信号或信号肽，在原核和真核生物中几乎所有分泌性蛋白和许多膜内在蛋白的靶向和转移中起着重要作用。来自不同蛋白的信号肽通常由3个结构上且可能功能上不同的区域组成：(1)氨基端(N端)带正电荷的N-区(或N-结构域)，(2)中间的疏水H-区(或H-结构域)，以及(3)中性但极性的羧基端(C-区或C-结构域)。

蛋白信号序列的确定对改善使用产生有效药物(特别是治疗性蛋白)的表达系统如细菌、植物和动物而制备的抗体的排出和分泌非常重要。通过添加特定标签至目标抗体，改善在胞外环境中的抗体排出或分泌是可能的。以这种方式，抗体更易于收获且更不可能被降解或通过在表达系统的胞内环境中累积而诱导表达系统的毒性。因此，抗体可表达为融合蛋白，其包含与抗体的重链或轻链的成熟序列融合的优选的N端序列。

为了有效使用这一技术，必需确定信号肽。然而，公众可获取的数据库中公开的大多数重组治疗性抗体的氨基酸序列不包含信号肽序列。此外，在通过诸如噬菌体展示的方法分离的单克隆抗体的情况下，用于在哺乳动物细胞培养物中进行制备所需的信号肽信息也缺失。

Rituxan是重链和轻链信号肽序列信息在公共数据库中可获取的仅有的抗体。然而，信息的可用性并没有牵涉到优化原始信号肽以用于在选择用于进行制备的所需宿主细胞中分泌抗体。

与包含信号肽的重组抗体的制备相关的另一个问题是切割异质性。切割异质性可能起因于信号肽酶非特异性切割信号肽。因为信号肽的切割发生于重链和轻链的N端的可变区中，非特异性切割可影响抗原识别。

重组IgG制备也可受到重链的C_H2恒定结构域的N-糖基化位点处存在的聚糖异质性影响。一项最近的研究探索了具有用于快速评估聚糖异质性的柱切换系统的LC/MS。

因此，存在提供其他信号肽以产生能在表达系统中有效分泌和产生的重组抗体的需要。

发明概述

下文描述了具有与能够增加制备期间抗体分泌的信号肽融合的轻链和重链的目标抗体，以及确定用于增加目标抗体的分泌的信号肽的方法。

因此，在第一个方面，提供了包含重链信号肽的目标抗体，其中所述重链信号肽包含N-结构域、H-结构域和C-结构域，其中所述重链信号肽通过所述C-结构域的C-末端与抗体结合；其中所述H-结构域包含式(I)所示的氨基酸序列：

X_aa6-X_aa7-X_aa8-X_aa9-X_aa10-X_aa11-X_aa12-X_aa13，

其中X_aa6为Trp、Phe或Ile中的任一个；X_aa7为Val、Ile或Leu中的任一个；X_aa8为Phe或Leu；X_aa9为Leu或Val；X_aa10为Val或Leu；X_aa11为Ala；X_aa12为Leu、Ile或Ala中的任一个；X_aa13为Phe、Leu、Pro或Ala中的任一个；并且其中式(I)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变；前提是排除显示最低分泌的抗体，其中通过如下方法确定最低分泌：a)将编码所述目标抗体的重链的多核苷酸与编码如本文所述的重链信号肽的多核苷酸融合，以获得重链信号肽与目标抗体的不同组合；b)产生至少一种包含a)中限定的多核苷酸的表达载体；以及c)在转染至表达系统后，对b)中提及的载体编码的目标抗体的分泌进行定量，以确定具有最低分泌的抗体。

在第二个方面，提供了包含轻链信号肽的目标抗体，其中所述轻链信号肽包含式(IV)所示的氨基酸序列：

X_bb6-X_bb7-X_bb8-X_bb9-X_bb10-X_bb11-X_bb12-X_bb13-X_bb14，

其中X_bb6为Ala或Thr；X_bb7为Gln或Ala；X_bb8为Leu或Ala；X_bb9为Leu或Ala；X_bb10为Gly；X_bb11-X_bb14为Leu；或者其中式(IV)所示的氨基酸序列具有一个或两个突变；前提是排除显示最低分泌的抗体，其中通过如下方法确定最低分泌：a)将编码目标抗体的轻链的多核苷酸与编码如本文所定义的轻链信号肽的多核苷酸融合，以获得轻链信号肽与目标抗体的不同组合；b)产生至少一种包含a)中限定的多核苷酸的表达载体；以及c)在转染至表达系统后，对b)中提及的载体编码的目标抗体的分泌进行定量，以确定具有最低分泌的抗体。

在第三个方面，提供了编码如本文所述的抗体的多核苷酸。

在第四个方面，提供了包含上文定义的多核苷酸的载体。

在第五个方面，提供了包含如本文之前描述的核苷酸和/或如本文之前描述的载体的宿主细胞。

在第六个方面，提供了能够产生如上文所述的抗体的杂交瘤细胞系。

在第七个方面，提供了氨基酸序列，其包含曲妥单抗(Herceptin，CAS号180288-69-1)的氨基酸序列；与曲妥单抗的重链氨基酸序列融合的SEQID NO：1所示的重链信号肽；以及与曲妥单抗的轻链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：2所示的轻链信号肽。

在第八个方面，提供了氨基酸序列，其包含贝伐单抗(Avastin，CAS号216974-75-3)的氨基酸序列；与贝伐单抗的重链氨基酸序列融合的SEQID NO：3所示的重链信号肽；以及与贝伐单抗的轻链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：5所示的轻链信号肽。

在第九个方面，提供了氨基酸序列，其包含英夫利昔单抗(Remicade，CAS号170277-31-3)的氨基酸序列；与英夫利昔单抗的重链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽；以及与英夫利昔单抗的轻链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：4所示的轻链信号肽。

在第十个方面，提供了氨基酸序列，其包含利妥昔单抗(Rituxan，CAS号174722-31-7)的氨基酸序列；与利妥昔单抗的重链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽；以及与利妥昔单抗的轻链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：4所示的轻链信号肽。

在第十一个方面，提供了氨基酸序列，其包含阿达木单抗(Humira，CAS号331731-18-1)的氨基酸序列；与阿达木单抗的重链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽；以及与阿达木单抗的轻链氨基酸序列融合的SEQ ID NO：5所示的轻链信号肽。

在第十二个方面，提供了编码如上文所述的抗体的核苷酸。

在第十三个方面，提供了编码如本文所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。

在第十四个方面，提供了包含如本文所述的多核苷酸序列的载体。

附图说明

当联合非限制性实例和附图考虑时，参照详细描述将更好地理解本发明，其中：

图1为使用用于搜寻如下序列的序列相似性的聚集嵌套的信号肽的分级成簇树状图：(A)来自173条人Ig重链的数据库的重链信号肽，和(B)来自62条人κ链的数据库的kappa(κ)轻链信号肽。图1C-F为图1A中获得的树状图的放大，其显示产生的代表Ig重链信号肽的簇H1-H8的每个中存在的信号肽的氨基酸序列。对于簇H1-H8中的每个，突出显示了选择的SEQ ID：1、3和5-10的氨基酸序列。图1G为图1B中示出的树状图的放大，其显示用于生成数据库的57条人κ链中的每条的具体氨基酸序列。具有SEQ ID NO：2和4所示的氨基酸序列的两个簇L1和L2的具体氨基酸序列被突出显示。

图2的表提供了选择用于测试抗体的增加的产生和分泌的重链和轻链信号肽的氨基酸序列和DNA序列。氨基酸序列对应于已在图1C-G中突出显示的氨基酸序列。

图3为一系列柱状图，其示出了与选自如上文所述的H1-H8的8种重链信号肽中的一种融合时以及当和与上文描述的L1或L2信号肽融合的Herceptinκ轻链共表达时产生的Herceptin重链的量。图3A和C：绘制的Ig ELISA结果示出具有8种不同的重链信号肽和2种不同的轻链信号肽的单克隆抗体滴度(ng/ml)。图3A示出了重链与轻链信号肽1(L1)配对时的结果，而图3C示出了重链与轻链信号肽2(L2)配对时的结果。图3B和D：示出了每种抗体中的重链信号肽相对于重链信号肽1(H1)(其被设定为1)的效率。图3B示出了重链与轻链信号肽1(L1)配对时的结果，而图3D示出了重链与轻链信号肽2(L2)配对时的结果。GFP的平均荧光强度被用于标准化由于转染效率差异而引起的变化。具有几种不同的信号肽的Herceptin得到有效分泌。按本文所示进行标准化时具有最高分泌的组合为H5/L1，而当与L2配对时H7显示针对Herceptin的最佳滴度。如图3A和C所示，在用于说明不同实验间的转染效率变化的GFP值进行标准化后，得到数值。

图4为如同图3中一样所获得的一系列柱状图。使用Avastin重链和轻链来代替Herceptin。图4A和C：Ig ELISA结果。图4B和D：对H1标准化的相对产率。Avastin的最佳信号肽组合为H7/L1。

图5为一系列柱状图，其示出如以上图3和4中一样使用不同信号肽时产生的Remicade重链的量。图5A和B中使用了具有信号肽1的轻链；并且图5C和D中使用了具有信号肽2的轻链；A和C：Ig ELISA结果。图5B和D：对H1标准化的相对产率。当组合使用时或当L1或L2轻链信号肽与Remicade的轻链融合时，在与Remicade的重链融合时给出最高分泌和表达率的重链信号肽为H7。

图6为一系列柱状图，其示出了如上文所示使用不同的信号肽时产生的Rituxan重链的量。A和C：ELISA结果。底图：对H1标准化的相对产率。图6A和B，使用了具有信号肽1的轻链。图6C和D，使用了具有信号肽2的轻链。Rituxan的最佳信号肽组合为重链信号肽H7与L1或L2。

图7为一系列柱状图，其示出了使用不同的信号肽时产生的Humira重链的量。图7A和C：Ig ELISA结果。底图：对H1标准化的相对产率。A和B，使用了具有信号肽1的轻链。图7C和D，使用了具有信号肽2的轻链。Humira的最佳信号肽组合为H7/L1。

图8为比较根据用于所示的5种治疗性抗体中的每种的轻链L1或L2的分泌效率的一系列柱状图。基于图3-7中得到的结果，选择了具有最高分泌的目标抗体的重链与重链信号肽的组合。选择的构建体在CHO细胞中和与所述目标抗体的轻链融合的轻链信号肽L1或L2共表达。通过IgG ELISA测量产生的抗体的滴度，并比较由此得到的值。比较允许选择给出目标抗体的最佳制备/分泌的重链/信号肽与相应的轻链/信号肽的配对。

对于Herceptin，最好的信号肽对为H5/L1。对于Avastin和Humira，最好的对为H7/L1，而对于Remicade和Rituxan，最好的对为H7/L2。GFP的平均荧光强度被用于将转染效率标准化。

图9为代表最佳信号肽在Rituxan分泌中的效率的条形图。图9为Rituxan的原始信号肽对(其为公共数据库中存在的信号肽)与最佳信号肽对之间的比较，相对于对照对H1/L2(其被设定为1)。Rituxan的最佳信号肽(H7/L2)的相对效率为原始信号肽的2倍多。

图10代表了序列比对，其显示选自本文所述的簇H1-H8的重链信号肽之间的共有序列(图10A)和Avastin重链的H7信号肽的氨基酸取代(图10B)。N-结构域、H-结构域和C-结构域显示在共有序列下面，并且每个结构域中的氨基酸数目在其上显示。对H7信号肽进行了氨基酸取代突变以监测这样的突变对Avastin重链分泌的影响。对于Avastin重链，H7为提供了最高分泌效率的信号肽。(A)：所有重链信号肽与H7的序列比较揭示了几个高度保守的氨基酸残基：M***W**LFLVAA*GVQS。(B)：产生了6个杂合构建体(H7a-H7f)，每个在保守位点中具有氨基酸取代，以研究其对Avastin分泌的影响。(C)：图10C为显示了与Avastin的重链融合的H7信号肽中的氨基酸取代对重组重链分泌的影响的柱状图。仅C-S突变(H7d)未显著影响Avastin的表达水平。所有其他突变均引起减少的Avastin分泌。在实验中包含了H1作为对照，以将结果标准化。

图11示出了质谱，其代表使用重组信号肽---重链和轻链Herceptin抗体制备的Herceptin的相对丰度相对于质荷比的图。MS²片段离子使用LTQ Orbitrap Velos质谱仪从Herceptin产生。对应于重链和轻链N端片段的峰通过箭头示出。片段的氨基酸序列为粗体。

图12示出了重组Avastin的质谱。MS²片段离子使用LTQ OrbitrapVelos质谱仪从Avastin生成。对应于重链和轻链N端片段的峰通过箭头指示。片段的氨基酸序列为粗体。与(A)重链N端肽，(B)产生于预期的切割位点下游5个残基处的替代切割位点的错误加工的重链N端肽，以及(C)轻链N端肽的b和y离子系列匹配的萃取离子层析(XIC)峰和MS/MS片段化谱。相对于对应重链或轻链多肽所检测的总N端肽的每个N端肽的质/荷比(m/z)、峰面积(PA)及其代表百分比在XIC谱中示出。

图13为概述确定用于促进抗体分泌的最佳信号肽的方法的代表性图。

发明详述

在描述本发明方法、抗体、核苷酸、氨基酸序列以及它们的应用之前，应理解本发明并不限定于描述的特定方法、抗体、核苷酸、氨基酸序列、应用以及实验条件，因为这样的方法、抗体、核苷酸、氨基酸序列、应用以及条件可以不同。还应理解本文中使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，并且不意图为限制性的，因为本发明的范围仅由所附的权利要求限定。

除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。类似或等同于本文中描述的那些的任何方法和物质均可用于实施或测试本发明，因为应理解修改和变型包括在当前公开的精神和范围内。

分泌性蛋白转移至内质网(ER，在真核生物中)内腔或通过质膜(在原核生物中)的机制是普遍保守的。在真核生物中，该过程发生在胞液中，并且涉及新生多肽链中的信号肽从核糖体出现(核糖体新生链或RNC)时，被信号识别粒子(SRP)识别，造成延长停止。该SRP-RNC复合物随后结合ER中的膜锚定的SRP-受体(SR)，其中GTP依赖性机制递送RNC至与膜结合的Sec61易位子，其允许生长的多肽链转移至ER的内腔中。在越过易位子后，信号肽被信号肽酶切割。

几乎所有分泌性蛋白都具有信号肽序列，其通常由20-30个氨基酸残基组成，在N端的10个残基中起始，具有10-15个残基长的疏水性核心。在该序列前有一个亲水性节段，而其后有更多极性的节段直到切割位点。信号序列优先但较弱地以α-螺旋构象结合4-4“坎入槽(ridges-into-grooves)”包装的SRP中的疏水凹槽，利用核糖体来增强该复合物形成。疏水残基形成了对其与SRP、易位子和信号肽酶相互作用至关重要的结合位点。因此，信号肽的准确序列可影响蛋白穿过ER膜的效率。各个信号肽序列显示很少的可辨认的一级序列相似性，并且序列变异可能很大。结果，颇具挑战性的是以任何确信度来预测哪些氨基酸序列能够用作信号肽，从而实现原核或真核生物中重组抗体的增加的表达和分泌。

重组治疗性抗体代表制备的大比例的生技药品。生产这样的抗体的进展已有记录且为本领域所熟知。人IgG的重链通常具有19个氨基酸的信号肽，而人κ轻链包含22个氨基酸的信号肽。

如上文所述的，使用表达系统表达重组抗体需要确定最佳信号肽以促进抗体的重链和轻链的分泌效率。

因此，本发明的一个目标是鉴定和确定在融合至其各自序列时能够促进抗体的重链和轻链的分泌和/或排出的分泌型信号肽。本发明发明人已成功设计了确定蛋白表达系统中这样的最佳信号肽，同时通过在合适的切割位点提供同质切割来维持抗体的活性和特异性的方法。

因此，本发明提供了确定用于促进目标抗体的分泌的信号肽的方法。所述方法可包括如下步骤：使用与抗体的重链和轻链结合的信号肽的公众可获取的氨基酸序列信息生成数据库。

如本文中所定义的，术语“信号肽”(SP；也称为前导肽、靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号)为穿过内质网膜运输的序列基序靶向蛋白。SP发现于初生蛋白的氨基端，并通过促进细胞中的运输机制来发挥作用，以将蛋白带至其在细胞中的特定目的地，或如果蛋白待分泌则至细胞外。如果在胞外环境中分泌，可以明确SP为分泌性信号肽。因此，像许多其他蛋白一样天然分泌的抗体，需要分泌性信号肽来作为分选信号。在一个实例中，如本文所述的信号肽可包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。在其他实例中，如本文中公开的信号肽序列具有约10至约40个氨基酸。在又一个实例中，如本文中公开的信号肽序列具有约15至约35个氨基酸。在另一实例中，如本文中公开的信号肽序列具有约18至约25个氨基酸。

如本文中所述，术语“抗体”以最广义含义使用，并且明确包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们仍然显示所需的生物活性。术语“单克隆抗体”是指具有同源(基本上相同的)抗体群体的抗体组合物。该术语就物种(例如，人、鼠、小鼠或猫)或抗体来源而言不受限制，并且不受其制备方式限制。例如，该术语包括通过除产生单克隆抗体的杂交瘤外的方法制备的单克隆抗体，而不管其如何细分，例如杂合的、改变的、嵌合的或人源化的。此外，该术语包括在制备单克隆抗体期间自然产生的变体。该术语包括完整的免疫球蛋白。如本文所用的术语“人源化抗体”是指经改造的抗体，其通常包含非人(例如，鼠)抗体的可变区(即嵌合抗体)，或至少其互补决定区(CDR)，以及剩下的来源于人抗体的免疫球蛋白部分。制备嵌合抗体和经进一步改造的单克隆抗体的方案包括本领域描述的那些。这样的人源化抗体可通过已知的技术制备并在给予抗体至人时提供降低免疫原性的优势。

本发明的抗体可包含重链恒定区(H_c)、重链可变区(H_v)、轻链可变区(L_v)和轻链恒定区(L_c)中的至少一种，其中多克隆Ab、单克隆Ab、其片段和/或区域包含至少一个重链可变区(H_v)或轻链可变区(L_v)。

例如，抗体的信号肽可为抗体重链和抗体轻链的信号肽。抗体的同种型可包括但不限于IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。因此，重链可包括但不限于γ、μ、δ、α和ε重链，而轻链可为κ或λ轻链。抗体可为哺乳动物抗体。抗体可包括但不限于人、鼠(大鼠和小鼠)、鸟、猪、马、牛和灵长类抗体。

一旦生成数据库，本发明发明人即基于序列的相似性使氨基酸序列成簇。“成簇”意指以这样的方式将一系列序列分组的任务：相同组(称为簇)中的序列彼此相比其他组(簇)中的那些更为相似(在某种意义上或其他)。为了实现成簇，基于待实现的任务可利用多种算法。在一个实施方案中，成簇的实例可包括但不限于分级成簇、基于质心的成簇、基于分布的成簇、基于密度的成簇和基于种子的成簇。在其他实例中，用于本公开的分级成簇可包括聚集成簇或分割成簇。特异性针对一级序列分析的成簇方法为本领域熟知，并且可商购或公开获取。

例如，本发明发明人测试了称为具有未校正(“p”)的邻接法的成簇算法，其中配对序列比对之间的距离被当作序列不同的残基位置的百分比数目。该邻接法是一类聚集性分级成簇方法，其为用于生成音素树(phonetic trees)的自下而上的成簇方法。

通过对存在于数据库中的信号肽序列成簇，发明人能够得到两组簇。一组簇与抗体重链信号肽的氨基酸序列信息有关；另一组与抗体轻链信号肽的氨基酸序列信息有关。

生成的簇的数目将取决于例如存在于数据库中的信号序列数目、实验设备(即因素，如可由技术人员测试的序列数目、预算和分配给测试的时间)、数据库中信号肽的氨基酸序列之间的相似性以及数据库中相同序列的数目。在大多数氨基酸序列相同的情况下，则簇的数目减少。相反，数据库中的序列之间的相似性越低，将生成的簇的数目越高。

当生成的簇的数目为至少3个簇时，簇可包含基于公众可获取的信息生成的数据库中所存在的信号肽序列的总数目的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约22％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％。

例如，基于包含173条Ig重链人信号肽的氨基酸序列信息的数据库，发明人生成了8个簇，编号为H1-H8，包含16-30条信号肽序列，而基于包含来自62条人κ链的信号肽序列的数据库，生成了两个簇。这两个簇例如附图的图1中示出。

在代表来自173条人Ig重链的重链信号肽的系统树的图1A和代表每个簇中的信号肽的氨基酸序列的图1C-1F的非限制性实例中，簇H1和H6例如(图1E和1F)包含16条信号肽序列。换句话说，它们包含数据库中的信号肽总数目的9.25％(或者其中n为给定簇中肽的数目(作为百分比给出)，并且其中x(Hi)为给定簇中信号肽的总数目，并且x(Ht)为数据库中信号肽的总数目)。在上述采用簇H1或H6作为示例的非限制性实例中，x(Hi)为16且x(Ht)为173，因而 使用上述等式，图1C中的簇H2(23条信号肽)和H3(18条信号肽)具有信号肽总数目的约13.29％和10.40％，而图1D中的簇4(25条信号肽)和H5(30条信号肽)、H8(19条信号肽；图1E)和H7(26条信号肽；图1E)分别具有173条重链信号肽的示例性数据库中所存在的信号肽总数目的14.45％、17.34％、10.98％和15.03％。

从62条人κ轻链的可获取的序列信息生成的轻链信号肽数据库仅产生了两个簇。这两个簇的产生部分是由于数据库中的轻链信号肽序列的高度相似性/同一性。使用上文的非限制性实例，L1包含18条轻链信号肽(或数据库中的信号肽总数目的29.03％)，并且L2包含剩下的44条轻链信号肽(或信号肽总数目的70.97％)。然而，应注意簇L2中的40条轻链信号肽具有相同的氨基酸序列(即100％序列同一性)。

产生的簇可包含相同(同样的)或不同的信号肽的氨基酸序列。“同样的”意指氨基酸序列为100％保守的(即，序列中的所有氨基酸是相同的)。不同的意指簇中的信号肽的一级氨基酸序列至少有一个氨基酸不同。不同可涉及氨基酸序列长度(添加或缺失氨基酸)、氨基酸同一性(点突变)或序列结构。

如果氨基酸序列不同，氨基酸差异可为至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个氨基酸。如果序列不同，则可使用任何可获取的多重比对计算机程序，基于簇中存在的序列，来确定共有序列。

因此，在一个实例中，提供了确定用于促进目标抗体的分泌的信号肽的方法，其中所述方法可包括：(a)生成由来自多种抗体的重链和轻链的多种信号肽的氨基酸序列组成的数据库；(b)基于序列相似性将序列成簇，其中基于多种信号肽的总数目确定簇的数目，以便任何一个簇包含存在于数据库中的多种信号肽的至少约5％；(c)选择每个重链信号肽和轻链信号肽簇中的至少一条氨基酸序列，其中如果簇中的信号肽的氨基酸序列为：(1)相同的，则可选择簇中的任何氨基酸序列；以及(2)不同的，则可基于如下原则选择至少一条氨基酸序列：(i)在簇中最常出现的序列；和/或(ii)与簇的共有序列具有最高相似性的序列，其中基于簇中的氨基酸信号肽序列的比较来生成所述共有序列；(d)将编码抗体重链的多核苷酸与编码如本文之前限定的选择的重链信号肽的多核苷酸融合；并将抗体轻链与编码如本文之前限定的选择的轻链信号肽的多核苷酸融合；其中抗体的不同信号肽氨基酸序列的选择产生与本文之前选择的不同信号序列融合的抗体文库；(e)生成包含上文限定的多核苷酸的至少一种载体；以及(f)在转染上述的至少一种载体至表达系统中后，定量和比较抗体的分泌，以确定能够促进目标抗体的最大表达和分泌的重链和轻链信号肽组合。

在一个限制性实例中，通过应用本文中描述的本发明的方法，当步骤(a)应用于可获取的人免疫球蛋白氨基酸序列信息时，生成了173条免疫球蛋白重链信号肽和62条κ轻链信号肽氨基酸序列的数据库。随着更多的信息可获取，可生成更多的数据库。如本文中使用非限制性实例所解释的，当将步骤(b)的成簇应用于173条重链信号肽的数据库时，生成了8个簇，命名为H1-H8，如图1C-1F所示。

所述方法还可包括如下步骤：选择重链信号肽和轻链信号肽的至少一个簇中的至少一种氨基酸序列。例如，所述选择可基于如上文所示的一个簇中的氨基酸序列的同一性。如果至少一个簇中的所有序列均如上文所限定的为相同的，则可选择任何序列。

如果一个簇中的序列是不同的，则选择至少一种信号肽来代表该簇。例如，如果信号肽在簇中出现多于一次，并且如果信号肽比相同簇中的任何其他信号肽更常出现，则选择该信号肽，其为簇中最具代表性的。在簇中的任何一种信号肽具有不同的氨基酸序列的情况下，则最具代表性的信号肽可以是与所述簇的共有序列具有最高程度的一级序列相似性的信号肽。

在非限制性实例中，使用来自如上文所述的173条Ig人重链的信号肽序列生成的簇H3(示出在图1C中)，包含18条Ig人重链的信号肽序列。在这18条信号肽序列中，10条是相同的(即具有相同的序列MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H3，SEQ ID NO：7))，并因此选择了SEQID NO：7所示的信号肽序列作为簇H3的代表。在其他实例中，应用上文所述的方法的选择步骤(c)至簇H2的23条信号肽序列(例如参见图1C)，因为没有序列相比其他任何其他序列更常出现，选择的序列为MELGLRWVFLVAILEGVQC(H2，SEQ ID NO：6)，其与从簇H2的23条信号肽序列列表推断的共有序列具有最高的相似性，如本文所述的方法的步骤2(ii)中进一步陈述的。应用相同的方法至其他示例性的簇H1、H4-H8时，采用以下方法。对于簇H4、H5(参见例如图1D)、H8、H1(参见例如图1E)和H6(参见图1F)，根据步骤(c).(2).(i)，即根据这些序列在前述簇中最常出现这一事实，来选择信号肽序列。因此，以下氨基酸序列分别选自簇H4、H5、H8、H1和H6：MDWTWRILFLVAAATGAHS(H4，SEQ ID NO：8)、MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5，SEQ ID NO：1)、MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H8，SEQ ID NO：10)、MELGLSWIFLLAILKGVQC(H1，SEQ ID NO：5)和MEFGLSWLFLVAILKGVQC(H6，SEQ ID NO：9)。对于示例性的簇H7(参见图1F)，基于与从簇中的所有26条序列的比对推断的共有序列的最高相似性来选择具有氨基酸序列MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7，SEQ IDNO：3)的信号肽。

还可通过比较簇中的信号肽序列进一步优化信号肽。例如，发现本文所述的N-结构域、H-结构域和C-结构域分别包含Ig人重链信号肽序列的第1-6个氨基酸、第7-14个氨基酸和第15-19个氨基酸。

确定用于促进分泌的信号肽的方法还可包括如下步骤：将编码信号肽序列的至少一个多核苷酸(也称为寡核苷酸或核苷酸)与编码目标抗体的轻链和/或目标抗体的重链的至少一个多核苷酸融合，其中所述信号肽按上文所示进行选择，并且其中至少一种信号肽选自产生自从轻链信号肽生成的数据库的簇，并且至少一种信号肽选自重链信号肽生成的簇。选择的信号肽的数目可取决于产生的簇的数目和选自每个簇的肽的数目。例如，选择的重链信号肽的数目可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30种不同的信号肽。选择的轻链信号肽的数目可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或35种不同的信号肽。

选择的信号肽的实例在下文的实验部分中提供，且示例性的公众可获取的抗体信号肽列表在图1中提供。例如，可通过重链信号肽修饰目标抗体。在一个实例中，提供了如本文中公开的抗体，其中N-结构域包含式(II)：M-X_aa1-X_aa2-X_aa3-X_aa4-X_aa5(SEQ ID NO：278)所示的氨基酸序列，其中X_aa1为Asp、Asn或Lys中的任一个；X_aa2为Phe、Leu、His或Trp中的任一个；X_aa3为Gly、Leu或Thr中的任一个；X_aa4为Leu或Trp；X_aa5为Ser、Arg或Phe中的任一个；其中式(II)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

在另一个实例中，提供了如本文所述的抗体，其中所述C-结构域包含式(III)，X_aa14-X_aa15-X_aa16-X_aa17-X_aa18(SEQ ID NO：279)所示的氨基酸序列，其中X_aa14为Arg、Lys、Asp或Thr中的任一个；X_aa15为Gly或Trp；X_aa16为Val或Ala；X_aa17为Glu、Leu或His中的任一个；X_aa18为Cys或Ser；其中式(III)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

在另外的实例中，提供了如本文中公开的抗体，还排除这样的抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过1.5倍。在又一个实例中，提供了如本文所述的抗体，还排除这样的抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过2倍。

在一个实例中，提供了如本文公开的抗体，其中重链信号肽的N-结构域的氨基酸序列选自MELGLS(SEQ ID NO：293)、MELGLR(SEQ IDNO：294)、MKHLWF(SEQ ID NO：295)、MDWTWR(SEQ ID NO：296)和MEFGLS(SEQ ID NO：297)。在另一个实例中，提供了如本文所述的抗体，其中重链信号肽的C-结构域的氨基酸序列选自KGVQC(SEQ IDNO：298)、EGVQC(SEQ ID NO：299)、RWVLS(SEQ ID NO：300)、TGAHS(SEQ ID NO：301)、TGVQS(SEQ ID NO：302)和RGVQC(SEQ ID NO：303)。在又一个实例中，提供了如本文所述的抗体，其中重链信号肽的H-结构域的氨基酸序列选自WIFLLAIL(SEQ ID NO：304)、WVFLVAIL(SEQ ID NO：305)、FLLLVAAP(SEQ ID NO：306)、ILFLVAAA(SEQ IDNO：307)、FLFVVAAA(SEQ ID NO：308)、WLFLVAIL(SEQ ID NO：309)和WVFLVALF(SEQ ID NO：310)。

因此，在一个实例中，提供了包含重链信号肽的如本文公开的目标抗体，其中重链信号肽的氨基酸序列包含但不限于MELGLSWIFLLAILKGVQC(H1，SEQ ID NO：5)、MELGLRWVFLVAILEGVQC(H2，SEQ ID NO：6)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H3，SEQ ID NO：7)、MDWTWRILFLVAAATGAHS(H4，SEQ ID NO：8)、MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5，SEQ ID NO：1)、MEFGLSWLFLVAILKGVQC(H6，SEQ ID NO：9)、MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7，SEQ ID NO：3)、MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H8，SEQ ID NO：10)。

在其他实例中，提供了如本文公开的抗体，其中目标抗体的重链与包含但不限于MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5，SEQ ID NO：1)和MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7，SEQ ID NO：3)的信号肽融合。

在一个实例中，提供了包含轻链信号肽的目标抗体，其中轻链信号肽包含式(IV)：X_bb6-X_bb7-X_bb8-X_bb9-X_bb10-X_bb11-X_bb12-X_bb13-X_bb14(SEQ ID NO：280)所示的氨基酸序列，其中X_bb6为Ala或Thr；X_bb7为Gln或Ala；X_bb8为Leu或Ala；X_bb9为Leu或Ala；X_bb10为Gly；X_bb11-X_bb14为Leu；或者其中式(IV)所示的氨基酸序列具有一个或两个突变；前提是排除显示最低分泌的抗体，其中通过如下方法确定最低分泌：a)将编码目标抗体轻链的多核苷酸与编码如本文中限定的轻链信号肽的多核苷酸融合，从而获得轻链信号肽和目标抗体的不同组合；b)生成至少一种包含a)中限定的多核苷酸的表达载体；以及c)在转染至表达系统中后，对b)中提及的载体编码的目标抗体的分泌进行定量，以确定具有最低分泌的抗体。

在一个实施方案中，提供如本文所公开的抗体，其中轻链信号肽选自哺乳动物κ轻链的信号肽。在其他实例中，提供了如本文所限定的抗体，其中抗体包含式(V)：M-X_bb1-X_bb2-X_bb3-X_bb4-X_bb5(SEQ ID NO：281)所示的氨基酸序列，其中X_bb1为Asp或Lys；X_bb2为Met或Tyr；X_bb3为Arg或Leu；X_bb4为Val或Leu；X_bb5为Pro；并且其中式(V)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

在又一个实例中，提供了如本文中限定的抗体，其中所述抗体还包含式(VI)：X_bb15-X_bb16-X_bb17-X_bb18-X_bb19-X_bb20-X_bb21(SEQ ID NO：282)所示的氨基酸序列，其中X_bb15为Ala或Trp；X_bb16为Ala或Leu；X_bb17为Ser或Glu；X_bb18为Gly或Pro；X_bb19为Ala；X_bb20为Arg或Met；X_bb21为Ala或Cys；并且其中式(VI)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

在一个实例中，提供了如本文中限定的抗体，其中轻链信号肽的氨基酸序列可包含MDMRVP(SEQ ID NO：311)或MKYLLP(SEQ ID NO：312)。在另一个实例中，提供了如本文中限定的抗体，其中轻链信号肽的氨基酸序列还可包含SGARC(SEQ ID NO：313)或QPAMA(SEQ ID NO：314)。在其他实例中，提供了如本文中限定的抗体，其中轻链信号肽的氨基酸序列还可包含AQLLGLLLLWL(SEQ ID NO：315)或TAAAGLLLLAA(SEQ ID NO：316)。

因此，在另一个实例中，提供了包含轻链信号肽的目标抗体，其中目标抗体的轻链与包含但不限于MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(L1，SEQ ID NO：2)和MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(L2，SEQ ID NO：4)的信号肽融合。

因为目标抗体可包含重链和轻链，本发明还提供了与目标抗体融合以改善所述抗体的表达和分泌的重链和轻链信号肽组合。因此，在一个实例中，提供了如本文中公开的抗体，其中目标抗体包含如上文针对重链和轻链所限定的一条重链和一条轻链信号肽的组合。

在一个实例中，本文提供了包含重链信号肽与轻链信号肽组合的目标抗体，其中重链信号肽包含N-结构域、H-结构域和C-结构域，其中所述重链信号肽通过所述C-结构域的C-末端与抗体重链结合，且所述轻链信号肽通过所述C-结构域的C-末端与抗体轻链结合；其中所述重链信号肽的H-结构域包含式(I)：X_aa6-X_aa7-X_aa8-X_aa9-X_aa10-X_aa11-X_aa12-X_aa13所示的氨基酸序列，其中X_aa6为Trp、Phe或Ile中的任一个；X_aa7为Val、Ile或Leu中的任一个；X_aa8为Phe或Leu；X_aa9为Leu或Val；X_aa10为Val或Leu；X_aa11为Ala；X_aa12为Leu、Ile或Ala中的任一个；X_aa13为Phe、Leu、Pro或Ala中的任一个；并且其中所述轻链包含式(IV)：X_bb6-X_bb7-X_bb8-X_bb9-X_bb10-X_bb11-X_bb12-X_bb13-X_bb14所示的氨基酸序列，其中X_bb6为Ala或Thr；X_bb7为Gln或Ala；X_bb8为Leu或Ala；X_bb9为Leu或Ala；X_bb10为Gly；X_bb11-X_bb14为Leu；并且其中式(I)或式(IV)所示的氨基酸序列独立地具有一个或两个突变；前提是排除显示最低分泌的抗体，其中通过如下方式确定最低分泌：a)将编码目标抗体重链的多核苷酸与编码如本文所限定的重链信号肽的多核苷酸融合，并将编码目标抗体轻链的多核苷酸与编码如本文所限定的轻链信号肽的多核苷酸融合，从而获得重链信号肽与目标抗体的不同组合以及轻链信号肽与目标抗体的不同组合；b)生成至少一种包含a)中限定的多核苷酸的表达载体；以及c)在转染至表达系统后，对b)中提及的载体编码的目标抗体的分泌进行定量，以确定具有最低分泌的抗体。

具有最低分泌的抗体的排除确保了选择的待与目标抗体融合的信号肽序列是最佳的。换句话说，当与所选的信号肽融合时，目标抗体的分泌和表达相比与具有最低分泌的信号肽融合的抗体得到改善。产生多核苷酸和测量分泌的方法将在下文和实施例中进行更详细的解释。

可设定阈值以测量可由于其低分泌而被排除的抗体，并且可经实验和凭经验确定该阈值。测量分泌的方法在下文的实验部分中提供。例如，图3A为柱状图，其代表了测量通过本文所述的方法制备的mAb的滴度的酶联免疫吸附测定(ELISA)所提供的结果。更具体而言，在图3A中，通过将Herceptin(一种目标抗体)重链与通过使用如本文所述的方法选择的Ig重链人信号肽融合而生成抗体。重链信号肽选自如本文所述的8个簇H1-H8中的各一个。因此，在本实例中，生成了对应于具有SEQ ID NO：11的Herceptin抗体重链与具有SEQ ID NO：1、3、5、6、7、8、9或10所示序列的重链信号肽的融合的8种不同的抗体。通过在编码绿色荧光蛋白(GFP)或本领域已知的允许测量单个细胞或细胞群中的转染效率的任何蛋白或分子的载体存在下，将SEQ ID NO：21的Herceptin重链的多核苷酸序列与如本文所述的SEQ ID NO：283-290中的任一个的重链信号肽的多核苷酸序列框内融合，插入载体中并连同相同的或不同的载体转染至CHO细胞中来生成抗体，所述相同的或不同的载体包含与SEQ IDNO：291的轻链信号肽的多核苷酸序列(编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链信号肽)框内融合的具有SEQ ID NO：26的Herceptin轻链的多核苷酸序列(编码具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的Herceptin轻链)。然后通过本领域技术人员熟知的ELISA方法滴定包含重链和轻链的分泌性抗体。通过测量例如GFP的平均荧光强度测量宿主细胞中的转染效率。因此，获得了包含如上文所述的与重链信号肽融合的Herceptin重链的抗体和如上文所述的与轻链信号肽融合的Herceptin轻链的所有组合的原始滴度。

在接下来的步骤中，首先使用GFP给出的平均荧光强度将以上获得的值标准化，以计算上文所述的不同载体之间的转染效率变化。然后将SEQ ID NO：11的Herceptin重链-重链信号肽组合及SEQ ID NO：16的Herceptin轻链-SEQ ID NO：2的轻链信号肽L1的分泌效率，与例如Herceptin重链和SEQ ID NO：5的H1信号肽以及SEQ ID NO：16的Herceptin轻链-SEQ ID NO：2的轻链信号肽L1形成的组合比较。因此，如例如图3B中所示的，如上文所述的与Herceptin的重链融合的重链信号肽H1和与Herceptin的轻链融合的轻链信号肽的Herceptin抗体组合被给予了1.0的任意倍数变化。

因此，抗体用作不同抗体组合的分泌的标准化和比较参照。例如，在本发明中，生成了对应于与5种不同的抗体融合的8种不同的信号肽的40种重链-重链信号肽组合，并生成了对应于与5种不同的抗体融合的2种不同的信号肽的10种轻链-轻链信号肽组合。结果，当表达编码前述重链和轻链组合的载体时，生成了总共80种抗体组合。

使用H1作为参照，具有高于1.0的倍数变化的任何组合具有比如上文所述的H1更高的分泌，具有小于1.0的倍数变化的任何组合具有比上文所述的H1更低的分泌。使用图3B作为实例，当在Herceptin轻链-轻链信号肽L1存在下共转染Herceptin重链-重链信号肽的组合时，H2/L1、H3/L1、H4/L1、H5/L1、H6/L1和H8/L1具有比H1/L1组合更高的分泌。相反，H7/L1组合具有比H1/L1更低的分泌。H5/L1具有为H1/L1的约2.2倍高的分泌。

基于上述分析，可以排除具有最低分泌的抗体。例如，当测量和比较按照上文所述生成的抗体文库之间的分泌时，排除了这样的抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过至少约1.2倍，或至少约1.3倍，或至少约1.4倍，或至少约1.5倍，或至少约1.6倍，或至少约1.7倍，或至少约1.8倍，或至少约1.9倍，或至少约2.0倍，或至少约2.5倍，或至少约3.0倍，或至少约3.5倍，或至少约4.0倍，或至少约5.0倍。

例如，在图4A和B以及下文的实验部分中，具有最低标准化分泌的抗体为H7/L1组合。H1/L1组合分泌高于H7/L1组合的约1.7倍(即，H1/L1的倍数变化÷H7/L1的倍数变化或者1÷0.6)。因此，当Herceptin为目标抗体时，通过设定排除阈值为具有最低分泌的抗体(在本实例中为H7/L1)的2.0倍高，H1/L1组合将被排除。如果选择2.5倍，则进一步排除H6/L组合。在CHO细胞中表达时，具有最高倍数变化的组合(即H5/L1和H8/L1)相比H7/L1组合产生约3.75倍的抗体。

排除意指目标抗体和信号肽的特定组合不再被考虑用于测试在编码目标抗体的载体所转染的表达系统中的改善的分泌和表达。然而，其不排除使用所述抗体作为阴性对照或进一步在其他表达系统中测试所述目标抗体，或修饰所述抗体，例如通过突变所使用的信号肽序列。

在其他实例中，提供了包含如本文所述的重链和轻链的如本文所述的抗体，其中重链的N-结构域包含式(II)：M-X_aa1-X_aa2-X_aa3-X_aa4-X_aa5所示的氨基酸序列，其中X_aa1为Asp、Asn或Lys中的任一个；X_aa2为Phe、Leu、His或Trp中的任一个；X_aa3为Gly、Leu或Thr中的任一个；X_aa4为Leu或Trp；X_aa5为Ser、Arg或Phe中的任一个；并且其中轻链包含式(V)：M-X_bb1-X_bb2-X_bb3-X_bb4-X_bb5所示的氨基酸序列，其中X_bb1为Asp或Lys；X_bb2为Met或Tyr；X_bb3为Arg或Leu；X_bb4为Val或Leu；X_bb5为Pro；其中式(II)和/或式(V)所示的氨基酸序列独立地任选具有一个或两个突变。在又一个实例中，本文中提供了包含如本文所述的重链和轻链的抗体，其中重链信号肽的C-结构域包含式(III)，X_aa14-X_aa15-X_aa16-X_aa17-X_aa18所示的氨基酸序列，其中X_aa14为Arg、Lys、Asp或Thr中的任一个；X_aa15为Gly或Trp；X_aa16为Val或Ala；X_aa17为Glu、Leu或His中的任一个；X_aa18为Cys或Ser；并且其中轻链信号肽包含式(VI)：X_bb15-X_bb16-X_bb17-X_bb18-X_bb19-X_bb20-X_bb21所示的氨基酸序列，其中X_bb15为Ala或Trp；X_bb16为Ala或Leu；X_bb17为Ser或Glu；X_bb18为Gly或Pro；X_bb19为Ala；X_bb20为Arg或Met；X_bb21为Ala或Cys；并且其中式(III)和/或式(VI)所示的氨基酸序列独立地任选具有一个或两个突变。

因此，在一个实例中，提供了如本文所述的抗体，其中重链信号肽的N-结构域的氨基酸序列可包含但不限于MELGLS(SEQ ID NO：293)、MELGLR(SEQ ID NO：294)、MKHLWF(SEQ ID NO：295)、MDWTWR(SEQ ID NO：296)和MEFGLS(SEQ ID NO：297)，并且其中轻链信号肽的氨基酸序列可包含MDMRVP(SEQ ID NO：311)或MKYLLP(SEQ ID NO：312)。在其他实例中，提供了如本文所述的抗体，其中重链信号肽的C-结构域的氨基酸序列可包含但不限于KGVQC(SEQ ID NO：298)、EGVQC(SEQ ID NO：299)、RWVLS(SEQ ID NO：300)、TGAHS(SEQ IDNO：301)、TGVQS(SEQ ID NO：302)和RGVQC(SEQ ID NO：303)，并且其中轻链信号肽的氨基酸序列还可包含SGARC(SEQ ID NO：313)或QPAMA(SEQ ID NO：314)。在另一实例中，提供了如本文所述的抗体，其中重链信号肽的H-结构域的氨基酸序列可包含但不限于WIFLLAIL(SEQ ID NO：304)、WVFLVAIL(SEQ ID NO：305)、FLLLVAAP(SEQ IDNO：306)、ILFLVAAA(SEQ ID NO：307)、FLFVVAAA(SEQ ID NO：308)、WLFLVAIL(SEQ ID NO：309)和WVFLVALF(SEQ ID NO：310)，并且其中轻链信号肽的氨基酸序列为AQLLGLLLLWL(SEQ ID NO：315)或TAAAGLLLLAA(SEQ ID NO：316)。

因此，在一个实例中，提供了包含重链信号肽和轻链信号肽的如本文所公开的目标抗体，其中重链信号肽的氨基酸序列包含但不限于MELGLSWIFLLAILKGVQC(H1，SEQ ID NO：5)、MELGLRWVFLVAILEGVQC(H2，SEQ ID NO：6)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H3，SEQ ID NO：7)、MDWTWRILFLVAAATGAHS(H4，SEQ ID NO：8)、MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5，SEQ ID NO：1)、MEFGLSWLFLVAILKGVQC(H6，SEQ ID NO：9)、MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7，SEQ ID NO：3)、MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H8，SEQ ID NO：10)，其中目标抗体的轻链与包含MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(L1，SEQ ID NO：2)或MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(L2，SEQ ID NO：4)的信号肽融合。

因此，在一个实例中，如本文所公开的方法包括如下步骤：将编码抗体重链的多核苷酸与编码如本文和上文所述的选择的重链信号肽的多核苷酸融合，从而生成以信号肽修饰的目标抗体的重组重链。在另一实例中，如本文中公开的方法包括如下步骤：将编码抗体的轻链的多核苷酸与编码如本文和上文所述的选择的轻链信号肽的多核苷酸融合，从而生成以信号肽修饰的目标抗体的重组重链。可使用本领域技术人员已知的技术如酶连或聚合酶链式反应进行多核苷酸的融合。可使用公众可获取的信息或通过氨基酸序列的逆翻译获得多核苷酸序列。本领域技术人员了解如何可操作地连接信号肽的编码序列和抗体的编码序列，使得产生的蛋白产物为具有所需的氨基酸序列的功能蛋白产物。因此，信号肽和抗体的多核苷酸序列必需在框内。

可以这样的方式进行融合：使得所编码的信号肽位于轻链的N端或重链的N端。在其他实例中，信号肽可与目标抗体的轻链的可变区的N端或目标抗体的重链的可变区的N端连接。在一个实例中，与轻链融合的信号肽可包含这样的信号肽：其选自基于抗体κ轻链的信号肽的可获取的氨基酸序列生成的数据集产生的簇。在另一个实例中，与轻链融合的信号肽可包含这样的信号肽：其选自基于抗体重链的信号肽的可获取的氨基酸序列生成的数据集产生的簇。

融合的多核苷酸可包含接头以将可变区与信号肽隔开。信号肽序列可包含特定可切割的序列，其可被信号肽酶识别和特异性切割。编码目标抗体的轻链或重链的多核苷酸序列可包含轻链或重链的完整序列包括轻链或重链的可变区和恒定区，或者轻链或重链的可编码治疗性目标抗体的轻链或重链区域的部分序列。

本发明还提供了鼠或嵌合抗体的“衍生物”、其片段、区域或衍生物，该术语包括截短的或修饰的基因编码的那些蛋白，从而产生功能上类似于免疫球蛋白片段的分子种类。所述修饰包括但不限于添加编码细胞毒性蛋白如植物和细菌毒素的基因序列。可从本发明的任何宿主制备所述片段和衍生物。

片段包括，例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv。相比完整的抗体，这些片段缺少完整抗体的Fc片段，从循环更快速地清除，且可以具有更少的非特异性组织结合。可使用本领域熟知的方法，例如通过使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)的酶进行蛋白水解切割，从完整的抗体制备这些片段。

在一个实例中，与编码轻链和/或重链的多核苷酸融合的编码至少一种信号肽的至少一条多核苷酸被整合在载体中。根据本公开，可使用本领域已知的任何分子生物学方法获得核酸分子。本领域技术人员了解如何将信号肽编码序列与目标抗体的重链或轻链的编码序列可操作地连接，从而获得根据本发明的实施方案的核酸分子。

将重组多核苷酸克隆至载体中为本领域技术人员熟知。技术人员可使用多种载体来获得重组轻链和/或重链在目标表达系统中的表达。在一个实例中，生成了至少一种载体，其包含与目标抗体的重链和/或轻链的编码序列可操作地连接的信号肽序列的编码多核苷酸。在一个实例中，提供了编码至少一种重组轻链和至少一种重组重链的载体，所述重组轻链包含信号肽和轻链(其还可包含可变区和恒定区)，所述重组重链包含信号肽和重链(其还可包含可变区和恒定区)。在其他实例中，提供了编码至少一种重组轻链的至少一种载体，所述重组轻链包含信号肽以及轻链(其还可包含可变区和恒定区)。在又一个实例中，提供了编码至少一种重组重链的至少一种载体，所述重组重链包含信号肽以及轻链(其还可包含可变区和恒定区)。在本文中“载体编码”是指包含重组目标抗体的多核苷酸序列的核酸分子，其被引入宿主细胞时能够表达重组目标抗体(或其轻链和/或重链)，从而产生与功能信号肽融合的目标抗体的氨基酸序列。核酸分子可为表达载体。

如果连接产生连续可翻译的序列而不改变或中断三联阅读框，则两个编码DNA序列被说成是“可操作地连接的”。如果连接导致基因表达元件的合适功能，从而引起DNA编码序列的表达，则该编码序列与该基因表达元件可操作地连接。

表达媒介物包括质粒或其他载体。这些中优选的为携带具有合适的限制位点的功能上完整的人C_H或C_L链序列的媒介物，所述限制位点经改造以便任何具有合适的粘性末端的V_H或V_L链序列可被容易地插入其中。因此，包含人C_H或C_L链序列的媒介物可用作用于在任何合适的宿主中表达任何所需的完整H或L链的中间物。

代表了可变区序列的一部分的寡核苷酸可用于筛选存在的同源基因和编码目标抗体的可变区或恒定区的此类基因的克隆。这样的探针优选结合编码轻链或重链可变区(其结合目标抗原的表位)的序列部分。用于合成这样的寡核苷酸的此类技术为本领域熟知且已有公开。

因为遗传密码是简并性的，可使用多于一个密码子来编码特定氨基酸。使用遗传密码，可以确定一种或多种不同的寡核苷酸，其中的每一个都能编码氨基酸。可通过考虑异常碱基配对关系及特定密码子在表达目标抗体或片段的真核或原核细胞中真实使用(以编码特定氨基酸)的频率，估计特定寡核苷酸事实上构成了真正的XXX编码序列的可能性。这样的“密码子使用规则”在本领域中已有公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，确定了包含能够编码目标抗体可变区或恒定序列的理论上“最可能的”核苷酸序列的单个寡核苷酸或寡核苷酸集合。

尽管氨基酸序列偶尔可由仅单一寡核苷酸编码，通常氨基酸序列可由相似的寡核苷酸集合中的任何一种编码。重要的是，虽然该集合的所有成员均包含能够编码肽片段的寡核苷酸，并因而潜在地包含与编码所述肽片段的基因相同的寡核苷酸序列，但该集合中仅一个成员包含与所述基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。因为这一成员存在于所述集合中，并能够甚至在所述集合的其他成员存在下与DNA杂交，可能以相同的方式采用未分级的寡核苷酸集合，其中将采用单一寡核苷酸来克隆编码所述蛋白的基因。

包含能够编码抗体或片段(其包含可变区或恒定区)的理论上“最可能的”序列的寡核苷酸或寡核苷酸集合，被用于确定能够与“最可能的”序列或序列集合杂交的互补寡核苷酸或寡核苷酸集合的序列。包含这样的互补序列的寡核苷酸可用作用于确定和分离可变区或恒定区基因的探针。

合适的寡核苷酸或寡核苷酸集合，其能够编码可变或恒定抗体区片段(或与这样的寡核苷酸或寡核苷酸集合互补)，被确定(使用上文描述的方案)、合成、并通过本领域熟知的方式针对来源于能够表达抗体或者其可变区或恒定区的细胞的DNA或更优选地，cDNA制备物杂交。可使用本领域技术人员熟知的方案合成与“最可能的”可变区或恒定区肽编码序列互补的单链寡核苷酸分子。另外，可通过使用自动化合成仪来实现DNA合成。公开了核酸杂交技术。诸如或类似于上文描述的那些的技术已成功使得能够克隆人醛脱氢酶、纤连蛋白、人雌激素受体基因、组织类型纤溶酶原激活物和人类胎盘碱性磷酸酶互补DNA的基因。

在克隆编码可变区或恒定区的多核苷酸的替代方式中，通过克隆DNA或更优选地，cDNA(来自能够表达抗体或者可变区或恒定区的细胞)至表达载体中来制备表达载体的文库。然后筛选文库的能够表达竞争性抑制抗体结合的蛋白，且具有能够编码与目标抗体或其片段具有相同氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的成员。在该实施方案中，DNA或更优选地cDNA，提取和纯化自能够表达目标抗体或片段的细胞。纯化的cDNA被片段化(通过剪切、内切酶消化等)，以产生DNA或cDNA片段的库。然后可将来自该库的DNA或cDNA片段克隆至表达载体中，以生成表达载体的基因组文库，其成员每个包含独特的克隆的DNA或cDNA片段，如表达于原核细胞(例如，细菌)或真核细胞(例如，哺乳动物、酵母、昆虫或真菌)中的λ噬菌体文库。一旦分离编码这样的可变区或恒定区的核酸序列，核酸序列即可连同其他恒定或可变重链或轻链编码核酸，适当地在宿主细胞中表达，以提供重组MAb。这样的抗体优选包含鼠或人可变区，其包含具有负责抗原结合的互补决定残基的骨架残基。

编码本发明的鼠和嵌合抗体、片段和区域的恒定(C)区的人基因可来源于通过已知的方法构建的人胎肝文库。人C区基因可来源于任何人细胞，包括表达和产生人免疫球蛋白的那些。人C_H区可来源于人H链的任何已知类型或同种型，包括γ、μ、α、δ或ε，及其亚型如G1、G2、G3和G4。因为H链同种型负责抗体的各种效应子功能，通过所需的效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的补体固定或活性来引导CH区的选择。优选地，CH区来源于γ1(IgG1)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)或μ(IgM)。

人C_L区可来源于人L链同种型、κ或λ。编码人免疫球蛋白C区的基因通过标准克隆技术获自人细胞。可从包含显示2类L链、5类H链及其亚类的基因的已知克隆容易地获取人C区基因。可通过设计适当截短的嵌合H链基因制备嵌合抗体片段如F(ab′)2和Fab。例如，编码F(ab′)2片段的H链部分的嵌合基因包含编码CH1结构域和H链的铰链区的DNA序列，其后为翻译终止密码子以产生截短的分子。

通常，通过克隆编码目标抗体的H和L链抗原结合区的DNA片段，以及将这些DNA片段与分别编码C_H和C_L区的DNA片段连接从而制备鼠、人或嵌合免疫球蛋白编码基因，来制备本发明的鼠、人和嵌合抗体、片段和区域。

因此，在优选的实施方案中，生成了融合的嵌合基因，其包含与编码人C区的至少一部分的第二DNA片段连接的、编码非人来源的至少抗原结合区的第一DNA片段，如具有连接(J)片段的功能重排的V区。

在其他实例中，方法可包括在转染至少一种载体至表达系统中后定量和比较抗体分泌，以就哪种组合能够最多地促进抗体表达和分泌确定重链和轻链信号肽的组合。可通过转染、电穿孔或本领域已知的任何技术实现引入载体至表达系统中。如本文中所用的，术语“表达系统”涉及允许蛋白表达的系统，其为活的生物体中蛋白被合成、修饰和调控的方式。该术语可涉及制备蛋白所需要的系统。活的生物体中的重组蛋白产生依赖于使用细胞机制。

表达系统可为宿主细胞或无细胞的表达系统。为了本发明的目的，在要评估重组抗体的分泌时，表达系统可为宿主细胞。可将载体引入宿主细胞中以获得重组细胞。可在适合用于目标抗体的表达和分泌的条件下培养重组细胞。

转染可为单一转染(如果载体编码重组重链和重组轻链)，或者可为共转染，以引入独立编码包含目标抗体的重链和待测试的信号肽的重组重链以及包含目标抗体的轻链和待测试的信号肽的重组轻链的至少两种载体。根据一个实例，表达系统中至少一种载体的转染可为瞬时的或稳定的。在转染为稳定转染的情况下，至少一种载体可编码可选择的标记，从而允许确定具有目标载体的表达系统。

分泌性重组抗体的定量可包括但不限于IgG ELISA测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫荧光、质谱或荧光激活的细胞分选(FACS)。分泌的重组抗体的定量可提供数值，从而允许包含不同信号肽的不同重组抗体之间的比较。因此，所述方法允许确定哪些信号肽能够促进目标抗体的最大表达和分泌。

在一个实施方案中，如上文所述的方法还可包括突变待与目标抗体融合的信号肽的至少一个氨基酸。例如，信号肽氨基酸序列可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个突变。在一个实例中，本文公开了如本文所公开的目标抗体，其中所述目标抗体包含重链信号肽，其可在所述重链信号肽中包含一个或两个或者三个或四个突变。在另一实例中，提供了如本文所公开的抗体，其中目标抗体包含轻链信号肽，其在所述轻链信号肽中包含一个或两个或者三个或四个突变。

突变可包括改变信号肽的核苷酸序列从而改变编码的氨基酸(错义突变)、从信号肽序列缺失氨基酸或插入新的氨基酸至信号肽序列中。

在其他实例中，在确定如上文所示的共有序列后将至少一个氨基酸突变。基于按上文所示生成的组簇之一当中的氨基酸信号肽序列的比较，生成共有序列。在另一实例中，信号肽序列中的待突变的氨基酸不为共有序列的氨基酸。

通常从通过构建体中使用的小鼠H和L链V区天然的染色体基因启动子驱动的基因合成嵌合抗体如小鼠-人抗体；剪接通常发生在小鼠J区中的剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，并且也发生于存在于人C区中的剪接位点处；聚腺苷酸化和转录终止发生于人编码区下游的天然染色体位点处。

在一些实施方案中，宿主细胞可包括真核细胞或原核细胞。真核细胞可包括但不限于哺乳动物细胞、鸟细胞、昆虫细胞、真菌细胞、酵母细胞和植物细胞。原核细胞可以是细菌细胞。在其他实例中，如本文所公开的表达系统可包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、杆状病毒表达载体系统、蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)表达系统、鸡精蛋白(鸡)细胞、酵母表达系统和植物表达系统。本领域技术人员知道如何选择合适的表达系统以用于制备重组目标抗体的目的。

在一个实例中，监测了表达和分泌以确定能够促进最多表达的信号肽的目标抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以上的衍生物、区域或片段。在一个实例中，所述方法提供了单克隆抗体。

如本文所限定的抗体(也称为免疫球蛋白)可具有同种型，包括但不限于IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。通过其重链的性质来确定抗体的同种型。例如，在哺乳动物中存在5种类型的Ig重链，表示为希腊字母gamma(γ)、mu(μ)、delta(δ)、alpha(α)和epsilon(ε)。如本文中指出的，在哺乳动物中存在2种类型的免疫球蛋白轻链，其被称为lambda(λ)和kappa(κ)。

可通过如本文所公开的方法表达和分泌任何目标抗体。如在本文中可以见到的，目标抗体的实例可包括重组治疗性抗体，如曲妥单抗(Herceptin，CAS号180288-69-1；重链(H)SEQ ID NO：11；轻链(L)SEQID NO：16)、贝伐单抗(Avastin，CAS号216974-75-3；(H)SEQ ID NO：12；(L)SEQ ID NO：17)、英夫利昔单抗(Remicade，CAS号170277-31-3；(H)SEQID NO：13；(L)SEQ ID NO：18)、利妥昔单抗(Rituxan，CAS号174722-31-7；(H)SEQ ID NO：14；(L)SEQ ID NO：19)和阿达木单抗(Humira，CAS号331731-18-1；(H)SEQ ID NO：15；(L)SEQ ID NO：20)。

如上文所示的，所述至少一种编码重组目标抗体的载体可包含，例如包含目标抗体的重链和信号肽的重组重链，以及包含目标抗体的轻链和信号肽的重组轻链。例如，可将编码重组目标轻链的第一载体和编码重组目标重链的第二载体共转染至宿主细胞中。

因此，在一个实例中，提供了目标抗体，其可包含如本文和上文针对重链和轻链所限定的一条重链信号肽和一条轻链信号肽的组合。在其他实例中，提供了目标抗体，其可包含一条重链信号肽和一条轻链信号肽的组合，其中对于重链，信号肽包括但不限于MELGLSWIFLLAILKGVQC(H1，SEQ ID NO：5)、MELGLRWVFLVAILEGVQC(H2，SEQ ID NO：6)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H3，SEQ ID NO：7)、MDWTWRILFLVAAATGAHS(H4，SEQ ID NO：8)、MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5，SEQ ID NO：1)、MEFGLSWLFLVAILKGVQC(H6，SEQ ID NO：9)、MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7，SEQ ID NO：3)、MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H8，SEQ ID NO：10)，并且对于轻链，信号肽包括但不限于MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(L1，SEQID NO：2)和MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(L2，SEQ ID NO：4)。

如上文所示的，目标抗体可包括重组治疗性抗体。因此在一个实例中，提供了如本文所限定的抗体，其中目标抗体包括但不限于用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胶质瘤、肾癌和卵巢癌；自身免疫性疾病、风湿性关节炎(RA)、淋巴瘤、白血病和移植排斥的抗体。

在一个实施方案中，提供了如本文所述的目标抗体，其中用于治疗乳腺癌的目标抗体为曲妥单抗((H)SEQ ID NO：11；(L)SEQ ID NO：16)或贝伐单抗((H)SEQ ID NO：12；(L)SEQ ID NO：17)。在其他实施方案中，提供了如本文所述的抗体，其中用于治疗结肠直肠癌、肺癌、胶质瘤、肾癌和卵巢癌的目标抗体为贝伐单抗((H)SEQ ID NO：12；(L)SEQ ID NO：17)。

在又一个实施方案中，提供了如本文和上文所述的抗体，其中用于治疗自身免疫性疾病和风湿性关节炎的目标抗体为英夫利昔单抗((H)SEQ ID No.13；(L)SEQ ID NO：18)或利妥昔单抗((H)SEQ ID No.14；(L)SEQ ID NO：19)或阿达木单抗((H)SEQ ID No.15；(L)SEQ ID NO：20)。在一个实施方案中，提供了如本文所述的抗体，其中自身免疫性疾病可包括但不限于牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。因此，在一个实例中，提供了如上文所述的抗体，其中用于治疗淋巴瘤、白血病和移植排斥的目标抗体为利妥昔单抗((H)SEQ ID No.14；(L)SEQ ID NO：19)。

本公开还提供了编码如本文所述的目标抗体的核苷酸序列。例如，所述核苷酸序列包括但不限于这样的核苷酸序列：其编码曲妥单抗(Herceptin；(H)SEQ ID NO：21；(L)SEQ ID NO：26)、贝伐单抗(Avastin；(H)SEQ ID NO：22；(L)SEQ ID NO：27)、英夫利昔单抗(Remicade；(H)SEQID NO：23；(L)SEQ ID NO：28)、利妥昔单抗(Rituxan；(H)SEQ ID NO：24；(L)SEQ ID NO：29)和阿达木单抗(Humira；(H)SEQ ID NO：25；(L)SEQID NO：30)。

本公开还提供了包含如本文所述的核苷酸序列的载体。如上文所示，提供了包含如本文所公开的核苷酸序列和/或载体的宿主细胞。可将载体或核苷酸序列引入至宿主细胞，如上文所公开的。

将本发明的抗体提升至小肽序列的技术为本领域熟知，所述小肽序列能够识别和结合游离或缀合形式的或者在大蛋白背景下作为天然序列存在时的那些序列。这样的抗体包括通过本领域已知的杂交瘤或重组技术制备的鼠、鼠-人和人-人抗体。

也可根据已知的方法步骤，通过单个多肽链的适当结合制备具相同或不同可变区结合特异性的嵌合H链和L链的抗体、片段或衍生物。

使用这种方法，表达嵌合H链(或其衍生物)的宿主与表达嵌合L链(或其衍生物)的宿主分开培养，并单独回收免疫球蛋白链然后结合。可选地，可将宿主共培养，并允许链在培养基中自发结合，然后回收组装的免疫球蛋白、片段或衍生物。

通过融合产非人的目标抗体的细胞，通常为针对包含抗原的天然或重组人配体，或人表位蛋白序列的肽片段免疫的动物的脾细胞，形成杂交细胞。可选地，产非人的目标抗体的细胞可以是获自以包含抗原的配体免疫的动物的血液、脾、淋巴结或其他组织的B淋巴细胞。

提供永生化功能的第二种融合伴侣可以是淋巴样干细胞或浆细胞瘤或骨髓瘤细胞，它们本身并非产抗体的细胞，但为恶性的。优选的融合伴侣细胞包括杂交瘤SP2/0-Ag14(简写为SP2/0(ATCC CRL1581))以及骨髓瘤P3X63Ag8(ATCC TIB9)或其衍生物。

通过小鼠融合伴侣细胞如SP2/0和脾细胞的融合，形成能够产生配体特异性的mAb的鼠杂交瘤，所述脾细胞来自针对包含纯化的抗原的蛋白、包含重组抗原的蛋白、包含天然或合成抗原的肽(包括包含5个或更多个氨基酸的肽)，或者包含含抗原的蛋白的其他生物制剂免疫的小鼠。为了免疫小鼠，可遵循多种不同的常规方案。例如，小鼠可接受包含抗原的蛋白的初次和增强性免疫接种。

也可通过转化非人的如灵长类的细胞或人细胞来制备提供编码本发明的嵌合抗体的抗原结合区的核苷酸序列的产抗体的细胞。例如，可通过提供转化基因或转化基因产物来转化B淋巴细胞，如本领域所熟知的。

通过免疫学领域技术人员熟知的标准程序完成细胞融合。用于融合和选择杂交瘤以及筛选mAb的融合伴侣细胞系和方法为本领域熟知。

可以通过以下来大量制备本发明的目标抗体特异性的鼠或嵌合mAb：将能够分泌抗体的杂交瘤或转染瘤细胞注射至小鼠的腹腔中，在合适的时间后，收获包含高滴度的mAb的腹水，并从中分离mAb。对于这样的使用非鼠杂交瘤(例如，大鼠或人)体内制备mAb，优选在辐照的或无胸腺裸鼠中培养杂交瘤细胞。可选地，可以通过体外培养杂交瘤或转染瘤细胞并从细胞培养基中分离分泌性mAb，或者在真核或原核细胞中重组制备抗体。

因此在一个实例中，提供了能够产生目标抗体的杂交瘤细胞系。在一些实例中，提供了这样的氨基酸序列：其包含重组治疗性目标抗体的氨基酸序列、与目标抗体的重链氨基酸序列融合的重链信号肽氨基酸序列，以及轻链氨基酸序列。在抗体重链氨基酸序列已包含氨基酸信号肽序列的情况下，则所述氨基酸信号肽序列被本发明的最佳氨基酸信号肽序列取代。因此，在下文的具体非限制性实例中，应理解示例性目标抗体的重链或轻链的氨基酸序列不应当包含信号肽的氨基酸序列。在这样的氨基酸信号肽序列在分子的C端包含重链或轻链氨基酸序列的情况下，则所述氨基酸信号肽序列应当被最佳的氨基酸信号肽序列取代。

在其他实例中，本文公开了这样的氨基酸序列：其包含曲妥单抗的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)；与曲妥单抗的重链氨基酸序列融合的SEQID NO：1所示的重链信号肽；以及SEQ ID NO：2所示的轻链信号肽。在另一实例中，提供了这样的氨基酸序列：其包含贝伐单抗的氨基酸序列、与贝伐单抗的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：12)融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽，以及与贝伐单抗的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：16)融合的SEQ ID NO：5所示的轻链信号肽。

在其他的实例中，提供了这样的氨基酸序列：其包含英夫利昔单抗的氨基酸序列、与英夫利昔单抗的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：13)融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽，以及与英夫利昔单抗的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：18)融合的SEQ ID NO：4所示的轻链信号肽。

本文中公开了这样的氨基酸序列：其包含利妥昔单抗的氨基酸序列、与利妥昔单抗的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：14)融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽，以及与利妥昔单抗的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：19)融合的SEQ ID NO：4所示的轻链信号肽。

本文中还提供了这样的氨基酸序列：其包含阿达木单抗的氨基酸序列、与阿达木单抗的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：15)融合的SEQ ID NO：3所示的重链信号肽，以及与阿达木单抗的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：20)融合的SEQ ID NO：5所示的轻链信号肽。

因此，提供了编码如本文和上文公开的抗体的核苷酸序列。还提供了包含如上文所述的核苷酸序列的载体。

虽然重组目标抗体的重链和轻链的分泌效率问题是关于信号肽的首要考虑，发明人还确定了分泌性重组抗体是否保存了其活性。切割异质性可能产生自信号肽酶对信号肽的非特异性切割。因为这发生在重链和轻链的N端中的可变区中，其可能影响分泌性抗体关于抗原识别的特异性。可能影响重组抗体产生的另一异质性问题为重链的C_H2恒定结构域的N-糖基化位点处存在的聚糖异质性。

因此，提供了这样的方法：其中通过质谱分析了分泌性重组抗体，以检测切割的信号肽是否对应于与目标抗体的重链和/或轻链融合的信号肽。原始融合的信号肽的存在指示同源切割，其还指示信号肽酶的切割是特异性的。因此，分泌性抗体保持其完整性和特异性。

可在没有本文中未明确公开的任何一种或多种元素、限制下合适地实施本文中示例性描述的发明。因此，例如，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应理解为开放性的且没有限制。另外，本文中采用的术语和表达被用作描述性术语且不具限制意义，并且不试图使用这样的术语和表达排除显示和描述的特征或其部分的任何等同物，但应理解在要求保护的发明的范围中的不同的修改是可能的。因此，应理解尽管已通过优选实施方案和最佳特征具体公开了本发明，公开的本文中具体体现的修改和变型可由本领域技术人员实施，并且这样的修改和变型被认为位于本发明的范围中。必须注意如本文所用的和在所附的权利要求中，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数参照，除非上下文明确另有所指。

本文中从广义和整体上描述了本发明。落入总体公开中的每个较窄的种类和亚属组群也形成了本发明的一部分。这包括本发明的具有从属中去除任何主题的附带条件或阴性限制的总体描述，而不管所去除的物质在本文中是否被具体描述。其他实施方案位于以下权利要求和非限制性实例中。

实验部分

抗体重链和轻链构建体的产生

通过序列比对分析了来自173条人抗体重链(SEQ ID NO：1、3、5-10和43-214)的信号肽。这些抗体包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。还通过序列比对分析了来自57条人κ链(SEQ ID NO：2、4和215-276)的信号肽。序列比对结果示出在图1中。基于这些结果，选择了8种重链信号肽和2种κ轻链信号肽(图2)，并比较其对抗体分泌的影响。将5种最畅销的治疗性重组抗体，即Avastin、Herceptin、Humira、Remicade和Rituxan用作模式分子。通过重叠PCR将每条抗体重链和轻链分别融合至8种信号肽和2种信号肽，并连接至载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。将8种重链中的每种单独与2种不同的轻链构建体共转染(图3)。因此，对于每种抗体，将16种重链和轻链组合转染至CHO-K1细胞中，如下文所述的。Rituxan与其原始重链和轻链信号肽的组合也被构建至pcDNA3.1中。

抗体构建体的瞬时转染

使用8种不同的重链信号肽和2种轻链信号肽进行瞬时抗体表达。使用Fugene 6(Roche，Indianapolis，IN)在6孔组织培养板中进行转染。转染前24h，以3×10⁵细胞/mL的密度将2mL的对数期贴壁CHO K1细胞接种至6孔板中。使用6μL∶2μg的Fugene 6与质粒的比，对每组mAb载体进行一式双份的瞬时转染。每种转染使用具有1μg的每种轻链和重链的质粒。为了标准化转染效率，平行进行了第三类转染，其中添加了具有编码绿色荧光蛋白(GFP)、pMax-GFP(Amaxa，Gaithersburg，MD)的基因的0.2μg的质粒。在转染后48h，收集来自以仅mAb载体转染的培养物的上清液，用于使用ELISA分析mAb浓度，且收集了来自与GFP共转染的培养物的细胞，以使用FACS Calibur(Becton Dickinson，Bedford，MA)测量荧光强度。结果标准化为GFP表达和S1(第一条重链信号肽)的表达水平。

通过IgG ELISA对分泌性抗体的定量

在96孔平底MaxiSorp免疫板(NUNC)中进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。首先在37℃下，以于PBS中的50μL的山羊抗人IgG+IgA+IgM(重链和轻链)抗体(KPL)(10μg/mL)包被平板1h，然后以洗涤缓冲液(0.1％Tween-20，于PBS中)洗涤3次。之后，于4℃将平板在封闭溶液(3％BSA，于PBS中)中孵育过夜。第二天，按如上所述洗涤平板，并以一式双份添加50μL的标准室内纯化的人抗恒河猴(D)抗体和来自瞬时转染的1∶10稀释的上清液(均稀释于稀释缓冲液(1％BSA，于PBS)中)，并在37℃下孵育1h。在第二轮洗涤后，添加50μL缀合有碱性磷酸酶的抗人IgG(Fc特异性的)抗体(Sigma)至每个孔中，并在37℃下孵育1h。在另外3次洗涤后，将50μLSIGMAFAST^TM磷酸对硝基苯酯底物添加至平板的每个孔中，并在室温下孵育15min，然后使用VersaMax ELISA微板读数仪(Molecular Devices)在405nm的波长下读取吸光度。使用了620nm的参照波长。

具有杂合信号肽的Avastin重链构建体的产生

基于8条IgG重链信号肽S1-S8的序列比对，观察到几个保守的氨基酸残基。发明人制备了具有杂合引导肽的6种Avastin重链构建体，所述引导肽具有来自亲本H7(称为H7a-H7f)的突变的一个或多个氨基酸残基。使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Agilent)，根据厂商的方案对这些构建体进行了改造。

用于从亲本H7(除非另有所示)生成每种构建体的引物对如下：

H7a，5′-ccaccatggagtttgggtggagctgggttttcctcg-3′(SEQ ID NO：31)和5′-cgaggaaaacccagctccacccaaactccatggtgg-3′(SEQ ID NO：32)；

H7b，5′-gagtttgggctgagctggctcttcctcgttgctcttttt-3′(SEQ ID NO：33)和5′-aaaaagagcaacgaggaagagccagctcagcccaaactc-3′(SEQ ID NO：34)；

H7c 5′-ctgggttttcctcgttgctgcttttagaggtgtccagtgt-3′(SEQ ID NO：35)和5′-acactggacacctctaaaagcagcaacgaggaaaacccag-3′(SEQ ID NO：36)；

H7d，5′-tttttagaggtgtccagtccgaggttcagctggtggag-3′(SEQ ID NO：37)和5′-ctccaccagctgaacctcggactggacacctctaaaaa-3′(SEQ ID NO：38)；

H7e，5′-gccaccatggagtttgggtggagctggctcttcctcgttgctgctttt-3′(SEQ ID NO：39)和5′-aaaagcagcaacgaggaagagccagctccacccaaactccatggtggc-3′(SEQ ID NO：40)，使用构建体H7c作为模板；

H7f，5′-cttttagaggtgtccagtccgaggttcagctggtggag-3′(SEQ ID NO：41)和5′-ctccaccagctgaacctcggactggacacctctaaaag-3′(SEQ ID NO：42)，使用构建体H7e作为模板，其中有下划线的碱基为突变靶标。随后，使用QIAGENPlasmid Maxi Kit(Qiagen，Basel，Switzerland)制备了2批杂合构建体和1批Avastin轻链构建体。

杂合构建体的瞬时转染

对于每对Avastin轻链和重链构建体，以每mL 3x 10⁵个细胞的浓度将2mL的CHO-K1细胞接种至6孔板的每个孔上。在第二天，以6∶1∶1的试剂∶轻链∶重链比，根据厂商的方案，使用FuGENE 6转染试剂(RocheApplied Science，Rotkreuz，Switzerland)进行转染。每种转染以一式双份进行，并用0.2μg除Avastin构建体外的GFP构建体转染第三个孔。这用作转染效率对照。孵育48h后，收集培养基并在6,000x g下离心10min以去除细胞碎屑，然后对上清液进行ELISA。对于以GFP转染的孔，将细胞以胰蛋白酶处理并进行绿色荧光的流式细胞术分析。

用于抗体制备和纯化的抗体构建体的大规模转染

对于每种抗体，将CHO-K1细胞接种至10个T-175烧瓶中，并在第二天用编码通过IgG ELISA测定确定的最佳信号肽的构建体转染。转染后6小时，以DPBS洗涤细胞，并用化学限定的无血清培养基替代培养基。在7天的过程中，每2-3天收集包含分泌性抗体的条件培养基。然后用快速蛋白液相色谱(FPLC-AKTA纯化仪)系统，在以20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液平衡的HiTrap Protein A HP柱(GE Healthcare)上纯化抗体。

NanoLC-MS/MS分析

使用透析过滤盒(30kDa；Millipore，Billerica，MA)浓缩20μg的每种抗体至PBS中。然后对抗体补充20mM三乙铵碳酸氢盐，pH 8.5，60℃下以30mM tris(2-羧乙基)膦(TCEP)还原1h，并在室温、黑暗下用60mM碘乙酰胺半胱氨酸烷基化40min。37℃下使用测序级别的改良胰蛋白酶(1∶25)(Promega，Madison，WI)进行消化过夜。在Savant SpeedVac(ThermoScientific，Asheville，NC)中将肽样品干燥，并以25μl缓冲液A(0.1％甲酸)重悬。

在nanoACQUITY UPLC系统(Waters，Milford，MA)上进行纳米级液相色谱(NanoLC)。将肽样品(2μl)加载至Symmetry C18捕获柱，5μm，180μm x 20mm(Waters)上，并用2％缓冲液B(0.1％甲酸，于乙腈中)以8μl/min脱盐8min。随后在线将捕获柱切换为nanoACQUITY UPLCBEH130C18柱，1.7μm，75μm x 150mm(Waters)，并以300nl/min的流速使用由60min 2-28％缓冲液B，8min 28-40％缓冲液B和5min 97％缓冲液B组成的梯度分离肽。

在LTQ Orbitrap Velos MS(Thermo Scientific)上进行质谱仪(MS)检测，在CID top 10模式下操作，纳升电喷雾电势为1.7kV。通过分辨率设定为60,000的数据依赖性获取得到了全扫描MS谱(m/z 300-1,800)。以35V的标准化的碰撞能量将电荷态≥2的10种最强肽离子顺序片段化。MS/MS的最小信号阈值设定为500个计数，激活q值设定为0.25，且激活时间设定为10ms。离子阱和轨道阱最大注射时间分别设定为100ms和10ms。

通过Proteome Discoverer(Thermo Scientific)的版本1.3.0.339，使用SEQUEST算法处理原始数据文件，并针对各自的由从N端序列缩短的抗体序列组成的编译数据库进行搜索。

用于CHO细胞中的抗体分泌的人免疫球蛋白信号肽的评估

从PubMed数据库收集了具有完整编码区的人Ig重链和κ链的序列。总共收集了173条人Ig重链和62条人κ链。大多数的重链信号肽包含19个氨基酸，且所有的κ轻链信号肽包含22个氨基酸。使用这些重链和轻链构建信号肽序列的数据库。然后根据序列相似性将信号肽成簇，且系统树示出在图1中。基于系统树，选择了8种重链信号肽(H1-H8)和两种κ轻链信号肽(L1和L2)。这些选择的信号肽的氨基酸序列和DNA序列示出在图2中的表格中。然后评估了这些信号肽对CHO-K1细胞中的抗体分泌的影响。

基于公众可获取的信息生成了Herceptin、Avastin、Remicade、Rituxan和Humira的重链和轻链的可变区和恒定区。然后将每条抗体重链与8种信号肽(H1-H8)中的任一种融合，以产生8种不同的重链构建体。将每条抗体轻链与2种信号肽(L1&L2)融合从而生成两种不同的轻链构建体(图2中的表格)。

为了分析信号肽对每种抗体分泌的影响，将16种重链和轻链组合转染至CHO-K1细胞中。对每个重链和轻链对进行了一式双份的转染。为了标准化转染效率，还进行了第三类转染。在该转染中，除了相同的重链和轻链构建体对外，在转染中还包含表达GFP的构建体作为转染效率对照，如本领域所已知的。在转染后2天通过ELISA确定抗体浓度。图3-8(A和C)显示了ELISA的原始数据和GFP的表达水平。标为A和C的图分别评估了L1和L2轻链的分泌效率。在每个框中，比较了H1-H8的分泌效率。还评估了每个样品中的GFP荧光作为转染效率对照。

如上文所解释的，使用重链信号肽1(H1)作为参考，将每种抗体的相对产率绘图和示出在图3-8(B和D)中。如所清晰显示的，培养基中的抗体量高度依赖于使用的信号肽。有趣的是，重链信号肽7(H7)引起Avastin、Remicade、Rituxan和Humira分泌的显著增加。使用轻链信号肽L1和L2观察到了这一观察结果。对于Herceptin，轻链信号肽更显著地增加抗体滴度包括在内。发明人发现重链/轻链信号肽的几种组合引起增加的Herceptin抗体分泌，即H4/L1、H5/L1、H8/L1、H1/L2和H7/L2。

然而，轻链信号肽(L1&L2)的影响不能在图6A-D中最终确定。如图6A和C中所示，H7/L1产生的Rituxan抗体的量显著不同于H7/L2产生的量。这两组转染之间的GFP水平差异也非常大，表明转染效率存在差异。为了进一步确认这些结果，在单个实验中测试了信号肽H7与L1或L2的组合对Avastin、Remicade和Rituxan产生的影响。评估了与L1或L2组合的信号肽H1、H5和H7增加Herceptin产生的能力。

图8中的结果与图6的结果相关性良好，这允许发明人确定理想的信号肽组合用于增加的特定抗体产生。Herceptin、Avastin、Remicade、Rituxan和Humira的信号肽组合分别为H5/L1、H7/L1、H7/L2、H7/L2和H7/L1。基于CHO细胞表达系统中这些抗体的瞬时转染结果，确定了Herceptin的产生最为有效，然后是Rituxan、Avastin、Humira，且最后是Remicade。

针对原始肽评价最佳的Rituxan信号肽的影响

在5种抗体中，Rituxan是重链和轻链信号肽序列信息在公共数据库中可获取的仅有抗体。然而，信息的可用性并没有使得原始信号肽对于CHO细胞中抗体的分泌为最佳的。Rituxan的原始轻链信号肽为MDFQVQIISFLLISASVIMSRG，而原始重链信号肽为MGWSLILLFLVAVATRVLS。如上文所示的，H7/L2为Rituxan的最佳信号肽组合(图8D)。为了比较原始信号肽与最佳肽的效应，将原始重链和轻链信号肽融合至Rituxan并转染至CHO-K1细胞中。作为对照，RituxanH1/L2构建体也被转染至CHO-K1细胞中。转染后2天，收获条件培养子并利用ELISA测定Rituxan重链滴度。图4中的结果表明最佳的信号肽(H7/L2)相比原始信号肽引起抗体滴度多于2倍的增加。

8种Ig重链信号肽的序列比较

确定了信号肽中的3个结构域，即带正电荷的N端结构域(N-结构域)、疏水结构域(H-结构域)和极性C端结构域(C-结构域)。本研究中确定的8种重链信号肽显示某些共有特性，然而它们中的每种与其他都非常不同。如图10A中示出的序列比对，除H8外(其包含26个)的所有信号肽包含19个氨基酸。在除H3外的所有信号肽中，翻译起始蛋氨酸(M)之后的氨基酸为带负电荷的谷氨酸或天冬氨酸(E或D)，然而，在H3中的相同位置处为赖氨酸(K)。事实上，在我们的数据库的几乎所有Ig重链中，第二个氨基酸为E或D。在H3所表示的簇3的几乎所有信号肽中的第二个氨基酸为K(图1C，底图)。氨基酸7-14形成了疏水性H-结构域，且氨基酸15-19形成了C-结构域。4种信号肽(H1、H2、H6、H7)以半胱氨酸(C)终止，而其他以丝氨酸(S)终止。信号肽簇1、6和7(由H1、H6和H7表示)的N-结构域中仅存在一个带负电荷的氨基酸(E)，且没有带正电荷的氨基酸。因此，并非信号肽的所有N-结构域均带正电荷。

Avastin的最佳信号肽(H7)的表征

如上文所论述的，H7显示为研究的5种抗体中的4种的重链的最佳信号肽。Avastin被用作进一步优化H7的氨基酸序列的模式分子。本发明中使用的所有信号肽(H1-H8)的序列比较显示出几个高度保守的氨基酸：M***W/L**LFLVAA**GVQS/C(图10A)。该高度保守序列与H7的比对(MEFGLSWVFLVALFRGVQC)揭示H7中的3个氨基酸残基(有下划线的)不同于高度保守的序列。为了研究这些氨基酸的功能意义，通过单独突变所述氨基酸中的每个生成了3种H7突变体。如图10B中所示，H7a携带L5W突变，H7b携带V8L突变，且H7c携带L13A突变。为了比较切割位点处C与S之间的差异，我们生成了携带C19S突变的H7d。在H7e中，H7中的所有3个氨基酸均被突变以研究这3个氨基酸的组合效用。在H7f中，4个氨基酸被突变，包括C-S突变(图10B)。

将这些与Avastin重链融合的突变信号肽与L1Avastin轻链一起共转染至CHO-K1细胞。转染后2天，通过ELISA测定每种条件培养基中的抗体的量。有趣的是，结果表明3个氨基酸(H7a、H7b和H7c)中的任何一个的取代均极大地减少了分泌至培养基中的Avastin重链的量(图10C)，表明H7上的这三个氨基酸中的每个对其作为Avastin的信号肽H7而发挥功能都很重要。尽管存在这3个氨基酸在许多重链信号肽中高度保守这一事实。一起取代所有3个氨基酸(H7e和H7f)进一步降低了Avastin的分泌。相反，在切割位点将半胱氨酸取代为丝氨酸(H7d)并未影响抗体分泌，表明两种氨基酸在切割位点处同样有效。

由于N端加工和信号肽切割而产生的抗体异质性的分析

除了改善分泌效率，发明人还提供了一些关于由于SPP非特异性切割信号肽而发生的切割异质性问题的令人吃惊的结果。这一现象引起可能对抗体的抗原识别位点具有直接影响的重链和轻链的N端的延长或截短。这样的具有可变异质性的抗体可能不适合生物药物治疗。为了确定当前鉴定的最佳信号肽是否可在其预期位点被有效切割，进行了每种重组抗体的大规模转染。从条件培养基收获抗体并通过蛋白A亲和层析进行纯化。随后通过胰蛋白酶消化纯化的抗体，并通过质谱分析产生的肽。

通过胰蛋白酶肽作图，使用LC-MS/MS进行每个抗体的重链和轻链的N端肽的替代切割位点的检测。通过高分辨率串联质谱(MS/MS)确定了N端肽，并将来自萃取离子层析(XIC)的相应的肽前体峰面积用于相对定量。

获得的Avastin的结果表明正确的重链N端肽EVQLVESGGGLVQPGGSLR(m/z 941.51)占检测的总重链N端肽的99.4％，而错误加工的肽ESGGGLVQPGGSLR(m/z 657.35)，切割预期切割位点下游5个残基，占0.6％(图11A&B)。对于轻链，仅检测到正确加工的N端肽DIQMTQSPSSLSASVGDR(939.95的m/z)(图11C)，因此表明在信号肽加工中缺少替代切割位点。来自所有抗体的N端肽在一式三份的质谱分析中类似地确定和定量。结果概括在下面的表2中，且详细分解在表3中示出。如同所示的，用于抗体表达的最佳信号序列未产生显著的信号肽切割异质性。预期的切割位点处的N端加工效率范围为～99.2％至100％，而产生自错误切割的N端肽在存在和总计时占总N端肽群体的小于1％。

表2.通过使用质谱进行的一式三份分析定量的N端肽的比例。

轻链(LC)；重链(HC)；信号肽加工位点：真实的N端错误的N端胰蛋白酶位点(↓)。信号肽序列以较小的字体大小示出。

单独示出了＞0.5％的错误加工的N端肽，而＜0.5％的那些在适用时分组在一起。

*Remicade-HC N端肽的比例的估计可能并不精确，因为其依赖于具有一个漏掉的胰蛋白酶切割的肽的定量。

将分泌性蛋白转移至ER内腔代表了经典分泌途径中的限速步骤。几项研究已显示可通过使用替代信号肽促进蛋白制备。本工作是用于确定重组抗体制备的最佳信号肽的第一个系统分析。有利地，选择最佳信号肽的策略通过以下开始：从公共数据库中的完整cDNA序列生成人Ig重链和κ轻链的已知抗体信号肽的数据库。本文描述的数据库中收集的当前示例性的信号肽是仅为人来源的信号肽，这部分是由于现今大多数的抗体药物为人源化的或完全人抗体这一事实。

表3.通过使用质谱进行的一式三份分析定量的N端肽的比例(详细分解)。

轻链(LC)；重链(HC)；信号加工位点：真实的N端错误的N端胰蛋白酶位点(↓)。信号肽序列以较小的字体大小示出。

*靠近Remicade-HC的N端的胰蛋白酶位点的存在，需要依赖于用于鉴定和定量的具有一个漏掉的切割的N端肽。因此，N端肽的比例的估计可能是不可靠的，因为大多数的N端肽在胰蛋白酶位点处已被处理，造成难以鉴定任何错误的N端肽，其在存在时将以低浓度开始。注意Remicade样品-1按照所述的在正常条件下消化，而样品-2和3在有利于部分消化的条件(在pH 7.4，室温下4hr)下消化。

基于序列相似性，将8条重链和2条轻链信号肽与5种抗体中的每种融合用于分泌效率分析。我们的结果表明一些抗体能够耐受不同的信号肽，而其他抗体更受限。对于Herceptin、Avastin、Remicade、Rituxan和Humira确定的最佳信号肽组合分别为H5/L1、H7/L1、H7/L2、H7/L2和H7/L1。在Avastin、Remicade和Rituxan的情况下，重链信号肽对这些抗体产生的影响显示相似的模式，其中H7是最佳的信号肽(图2)。对于一些抗体如Herceptin、Avastin和Humira，在产生了L1轻链时抗体产率更高，而对于其他抗体(Rituxan和Remicade)，L2轻链引起更高的抗体产率(图3-10)，表明在组合使用时，轻链信号肽也影响抗体的总体产率。

因为Rituxan是重链和轻链信号肽信息在公共数据库中可获取的仅有抗体，故将其天然小鼠信号肽的分泌效率与人信号肽的效率进行了比较，且结果表明后者将嵌合Rituxan的制备提高了2个系数。有利地，如本文公开的用于信号肽优化的方法可改善重组抗体的制备。

总之，发明人从230条人IgG信号肽的集合库确定了针对5种治疗性抗体药物中的每种的最佳信号肽对。另外，本发明的方法可用于确定能够用于制备新的抗体药物的最佳信号肽。

Claims (45)

1.包含重链信号肽的目标抗体，其中所述重链信号肽包含N-结构域、H-结构域和C-结构域，其中所述重链信号肽通过所述C-结构域的C-末端与所述抗体结合；其中所述H-结构域包含式(I)所示的氨基酸序列：

X_aa6-X_aa7-X_aa8-X_aa9-X_aa10-X_aa11-X_aa12-X_aa13(SEQ ID NO:277)，

其中

X_aa6为Trp、Phe或Ile中的任一个；

X_aa7为Val、Ile或Leu中的任一个；

X_aa8为Phe或Leu；

X_aa9为Leu或Val；

X_aa10为Val或Leu；

X_aa11为Ala；

X_aa12为Leu、Ile或Ala中的任一个；

X_aa13为Phe、Leu、Pro或Ala中的任一个；并且

其中式(I)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变；

前提是排除显示最低分泌的抗体，其中所述最低分泌通过如下方法确定：a)将编码所述目标抗体的重链的多核苷酸与编码本文所限定的重链信号肽的多核苷酸融合，以获得重链信号肽与目标抗体的不同组合；b)产生至少一种包含a)中限定的多核苷酸的表达载体；以及c)在转染至表达系统中后，对b)中提及的载体编码的目标抗体的分泌进行定量，以确定具有最低分泌的抗体。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述N-结构域包含式(II)所示的氨基酸序列：

M-X_aa1-X_aa2-X_aa3-X_aa4-X_aa5(SEQ ID NO:278)，

其中

X_aa1为Asp、Asn或Lys中的任一个；

X_aa2为Phe、Leu、His或Trp中的任一个；

X_aa3为Gly、Leu或Thr中的任一个；

X_aa4为Leu或Trp；

X_aa5为Ser、Arg或Phe中的任一个；

其中式(II)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述C-结构域包含式(III)所示的氨基酸序列，

X_aa14-X_aa15-X_aa16-X_aa17-X_aa18(SEQ ID NO:279)，

其中

X_aa14为Arg、Lys、Asp或Thr中的任一个；

X_aa15为Gly或Trp；

X_aa16为Val或Ala；

X_aa17为Glu、Leu或His中的任一个；

X_aa18为Cys或Ser；

其中式(III)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

4.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，还排除以下抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过1.5倍。

5.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，还排除以下抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过2倍。

6.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述重链信号肽的N-结构域的氨基酸序列选自MELGLS(SEQ ID NO:293)、MELGLR(SEQID NO:294)、MKHLWF(SEQ ID NO:295)、MDWTWR(SEQ ID NO:296)和MEFGLS(SEQ ID NO:297)。

7.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述重链信号肽的C-结构域的氨基酸序列选自KGVQC(SEQ ID NO:298)、EGVQC(SEQ IDNO:299)、RWVLS(SEQ ID NO:300)、TGAHS(SEQ ID NO:301)、TGVQS(SEQ ID NO:302)和RGVQC(SEQ ID NO:303)。

8.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述重链信号肽的H-结构域的氨基酸序列选自WIFLLAIL(SEQ ID NO:304)、WVFLVAIL(SEQ ID NO:305)、FLLLVAAP(SEQ ID NO:306)、ILFLVAAA(SEQ IDNO:307)、FLFVVAAA(SEQ ID NO:308)、WLFLVAIL(SEQ ID NO:309)和WVFLVALF(SEQ ID NO:310)。

9.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述重链信号肽的氨基酸序列选自MELGLSWIFLLAILKGVQC(H1,SEQ ID NO:5)、MELGLRWVFLVAILEGVQC(H2,SEQ ID NO:6)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H3,SEQ ID NO:7)、MDWTWRILFLVAAATGAHS(H4,SEQ ID NO:8)、MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5,SEQ ID NO:1)、MEFGLSWLFLVAILKGVQC(H6,SEQ ID NO:9)、MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7,SEQ ID NO:3)和MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(H8,SEQ ID NO:11)。

10.如权利要求9所述的抗体，其中所述目标抗体的重链与选自如下的信号肽融合：MDWTWRFLFVVAAATGVQS(H5,SEQ ID NO:1)和MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7,SEQ ID NO:3)。

11.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述目标抗体包含以下重链信号肽：其在所述重链信号肽中包含一个或两个或者三个或四个突变。

12.包含轻链信号肽的目标抗体，其中所述轻链信号肽包含式(IV)所示的氨基酸序列：

X_bb6-X_bb7-X_bb8-X_bb9-X_bb10-X_bb11-X_bb12-X_bb13-X_bb14(SEQ ID NO:280)，

其中

X_bb6为Ala或Thr；

X_bb7为Gln或Ala；

X_bb8为Leu或Ala；

X_bb9为Leu或Ala；

X_bb10为Gly；

X_bb11-X_bb14为Leu；或

其中式(IV)所示的氨基酸序列具有一个或两个突变；

前提是排除显示最低分泌的抗体，其中通过如下方式确定所述最低分泌：a)将编码所述目标抗体的轻链的多核苷酸与编码本文所限定的轻链信号肽的多核苷酸融合，以获得轻链信号肽与目标抗体的不同组合；b)产生至少一种包含a)中限定的多核苷酸的表达载体；以及c)在转染至表达系统中后，对b)中提及的载体编码的目标抗体的分泌进行定量，以确定具有最低分泌的抗体。

13.如权利要求12所述的抗体，其中所述轻链信号肽选自哺乳动物κ轻链的信号肽。

14.如权利要求12或权利要求13所述的抗体，其中所述抗体还包含式(V)所示的氨基酸序列：

M-X_bb1-X_bb2-X_bb3-X_bb4-X_bb5(SEQ ID NO:281)，

其中

X_bb1为Asp或Lys；

X_bb2为Met或Tyr；

X_bb3为Arg或Leu；

X_bb4为Val或Leu；

X_bb5为Pro；并且

其中式(V)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

15.如权利要求12-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体还包含式(VI)所示的氨基酸序列：

X_bb15-X_bb16-X_bb17-X_bb18-X_bb19-X_bb20-X_bb21(SEQ ID NO:282)，

其中

X_bb15为Ala或Trp；

X_bb16为Ala或Leu；

X_bb17为Ser或Glu；

X_bb18为Gly或Pro；

X_bb19为Ala；

X_bb20为Arg或Met；

X_bb21为Ala或Cys；并且

其中式(VI)所示的氨基酸序列任选具有一个或两个突变。

16.如权利要求12-15中的任一项所述的抗体，还排除以下抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过1.5倍。

17.如权利要求12-16中的任一项所述的抗体，还排除以下抗体：当与具有最低分泌的抗体的分泌相比时，其分泌为不超过2倍。

18.如权利要求12-17中的任一项所述的抗体，其中所述轻链信号肽的氨基酸序列包含MDMRVP(SEQ ID NO:311)或MKYLLP(SEQ ID NO:312)。

19.如权利要求12-18中的任一项所述的抗体，其中所述轻链信号肽的氨基酸序列还包含SGARC(SEQ ID NO:313)或QPAMA(SEQ ID NO:314)。

20.如权利要求12-19中的任一项所述的抗体，其中所述轻链信号肽的氨基酸序列还包含AQLLGLLLLWL(SEQ ID NO:315)或TAAAGLLLLAA(SEQ ID NO:316)。

21.如权利要求12-20中的任一项所述的抗体，其中所述轻链信号肽的氨基酸序列为MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(L1,SEQ ID NO:2)或MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(L2,SEQ ID NO:4)。

22.如权利要求12-21中的任一项所述的抗体，其中所述目标抗体包含以下轻链信号肽：其在所述轻链信号肽中包含一个或两个或者三个或四个突变。

23.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述目标抗体包含权利要求1-11中针对重链限定的一条重链信号肽与权利要求12-22中针对轻链限定的一条轻链信号肽的组合。

24.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述目标抗体为单克隆抗体。

25.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述目标抗体选自IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。

26.如前述权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述目标抗体选自用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胶质瘤、肾癌和卵巢癌；自身免疫性疾病、淋巴瘤、白血病和移植排斥的抗体。

27.如权利要求26所述的抗体，其中用于治疗乳腺癌的目标抗体为曲妥单抗(Herceptin，CAS号180288-69-1)或者贝伐单抗(Avastin，CAS号216974-75-3)。

28.如权利要求26所述的抗体，其中用于治疗结肠直肠癌、肺癌、胶质瘤、肾癌和卵巢癌的目标抗体为贝伐单抗(Avastin，CAS号216974-75-3)。

29.如权利要求26所述的抗体，其中用于治疗自身免疫性疾病的目标抗体为英夫利昔单抗(Remicade，CAS号170277-31-3)或利妥昔单抗(Rituxan，CAS号174722-31-7)或阿达木单抗(Humira，CAS号331731-18-1)。

30.如权利要求29所述的抗体，其中所述自身免疫性疾病选自牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。

31.如权利要求26所述的抗体，其中用于治疗淋巴瘤、白血病和移植排斥的目标抗体为利妥昔单抗(Rituxan，CAS号174722-31-7)。

32.多核苷酸，其编码权利要求1-31中的任一项所述的抗体。

33.载体，其包含权利要求32所述的多核苷酸。

34.宿主细胞，其包含权利要求32所述的多核苷酸和/或权利要求33所述的载体。

35.杂交瘤细胞系，其能够产生权利要求1-31中的任一项所述的抗体。

36.氨基酸序列，其包含

a)曲妥单抗(Herceptin，CAS号180288-69-1)的氨基酸序列；

b)SEQ ID NO:1所示的重链信号肽，其与曲妥单抗的重链氨基酸序列融合；以及

c)SEQ ID NO:2所示的轻链信号肽。

37.氨基酸序列，其包含

a)贝伐单抗(Avastin，CAS号216974-75-3)的氨基酸序列；

b)SEQ ID NO:3所示的重链信号肽，其与贝伐单抗的重链氨基酸序列融合；以及

c)SEQ ID NO:5所示的轻链信号肽，其与贝伐单抗的轻链氨基酸序列融合。

38.氨基酸序列，其包含

a)英夫利昔单抗(Remicade，CAS号170277-31-3)的氨基酸序列；

b)SEQ ID NO:3所示的重链信号肽，其与英夫利昔单抗的重链氨基酸序列融合；以及

c)SEQ ID NO:4所示的轻链信号肽，其与英夫利昔单抗的轻链氨基酸序列融合。

39.氨基酸序列，其包含

a)利妥昔单抗(Rituxan，CAS号174722-31-7)的氨基酸序列；

b)SEQ ID NO:3所示的重链信号肽，其与利妥昔单抗的重链氨基酸序列融合；以及

c)SEQ ID NO:4所示的轻链信号肽，其与利妥昔单抗的轻链氨基酸序列融合。

40.氨基酸序列，其包含

a)阿达木单抗(Humira，CAS号331731-18-1)的氨基酸序列；

b)SEQ ID NO:3所示的重链信号肽，其与阿达木单抗的重链氨基酸序列融合；以及

c)SEQ ID NO:5所示的轻链信号肽，其与阿达木单抗的轻链氨基酸序列融合。

41.多核苷酸序列，其编码权利要求36-40中的任一项所述的氨基酸序列。

42.载体，其包含权利要求41所述的多核苷酸序列。

43.如权利要求1-31中的任一项所述的抗体，其中所述表达系统为宿主细胞。

44.如权利要求1-31中的任一项所述的抗体，其中所述宿主细胞为哺乳动物或细菌细胞。

45.如权利要求43所述的抗体，其中所述表达系统选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、杆状病毒表达载体系统、蜥蜴利什曼原虫(Leishmaniatarentolae)表达系统、鸡精蛋白细胞、酵母表达系统和植物表达系统。