CN102666844A - 来自中国仓鼠的糖基转移酶以及相关方法 - Google Patents

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Abstract

说明了一种来自中国仓鼠的糖基转移酶以及相关方法。

Description

来自中国仓鼠的糖基转移酶以及相关方法
本申请要求于2009年11月11日提交的美国临时专利申请序列号61/260,232的优先权，其全部披露内容通过引用结合在此。根据37CFR 1.52(e)(5)，将处于文本文件形式的序列表（名称为“序列表.txt”，产生于2010年11月10日，41千字节）以其全部内容通过引用结合在此。
发明背景
末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚糖（在此称为Gal-α-Gal）可能是对N-糖基化蛋白的一种功能结果性修饰，当提供在异源衍生的生物学治疗剂上时，在人体中产生它的潜在免疫原性。在内源性蛋白质上的这种碳水化合物表位的存在显得是高度种类特异性的，例如在猪、小鼠、以及大鼠体内检测出，但是在灵长类体内不存在。因此，该表位可以存在于从某些生物体（例如，小鼠NS0或SP/2细胞，转基因猪）得到的细胞表达系统中产生的重组生物制品上。单克隆抗体西妥昔单抗
Figure BDA00001618012800011
是一个这样的在小鼠衍生的细胞系中产生的商业性蛋白质药物产品的实例，并且还报道含有Gal-α-Gal碳水化合物表位（Chung等人（2008）《新英格兰医学杂志》（N Engl J Med）358:1109-1117)。Gal-α1,3-Gal聚糖的酶促生物合成被归因于1,3糖基转移酶-1（在此称为Ggta1）（Taylor等人（2003）《糖生物学》（Glycobiology）13:327-337；Smith等人（1990）《生物化学期刊》（J Biol Chem）265:6225-6234)。
发明内容
本发明是至少部分地基于在CHO细胞自其衍生的中国仓鼠（Cricetulusgriseus）以及用于重组蛋白质生产的CHO细胞系两者中的α-1,3糖基转移酶-1(Ggat1)基因序列的发现。因此，本发明涉及与发现的基因相关的核酸和多肽组合物、以及相关的载体和细胞（例如，被基因工程化以降低、消除或增加Ggta1活性的CHO细胞以及用于产生这类细胞的载体）。此外，本发明涉及鉴定的序列在各种方法中的用途，例如检测CHO细胞中的Ggta1活性（包括Ggta1转录活性和/或酶活性）的方法，例如用于针对产生Gal-α-Gal结构的能力筛选CHO细胞，或用于鉴定和定量CHO细胞（例如用于产生治疗性糖蛋白的细胞）中的Ggta1的表达或活性。
在此披露的Ggta1序列列于表1中：
Figure BDA00001618012800021
因此，在一个第一方面，本发明的特征是一种分离的核酸分子，该分子包括编码中国仓鼠或CHO细胞Ggta1多肽、或它的具有一种或多种Ggta1活性（例如在此所述的一种Ggta1活性）的一个活性部分的核苷酸序列。
在一个实施方案中，该分离的核酸分子包括与（a）具有编码SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的氨基酸残基序列的序列的DNA分子或（b）（a）的DNA分子的互补物具有至少大约75%序列一致性、或至少大约80%序列一致性、或至少大约85%序列一致性、或至少大约90%序列一致性、或至少大约91%序列一致性、或至少大约92%序列一致性、或至少大约93%序列一致性、或至少大约94%序列一致性、或至少大约95%序列一致性、或至少大约96%序列一致性、或至少大约97%序列一致性、或至少大约98%序列一致性、或至少大约99%序列一致性的核苷酸序列。该分离的核酸分子可以编码具有一种或多种Ggta1活性的一种多肽。在一个实施方案中，该分离的核酸分子包括SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的序列。
在一个实施方案中，该分离的核酸分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6的序列具有至少大约90%序列一致性、或至少大约91%序列一致性、或至少大约92%序列一致性、或至少大约93%序列一致性、或至少大约94%序列一致性、或至少大约95%序列一致性、或至少大约96%序列一致性、或至少大约97%序列一致性、或至少大约98%序列一致性、或至少大约99%序列一致性。该分离的核酸分子可以编码具有一种或多种Ggta1活性的一种多肽。
在一个实施方案中，该分离的核酸分子在高严紧条件下与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列的核酸分子杂交。
在一个实施方案中，该分离的核酸分子包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
本发明的分离的核酸分子可以相应于一种天然发生的核酸分子，例如相应于编码一种表达的Ggta1蛋白的天然发生的CHO核酸序列。在一些实施方案中，该核酸分子可以编码具有一种或多种Ggta1活性的一种多肽，无论该核酸分子是否是天然发生的。例如，该分离的核酸分子是中国仓鼠或CHO细胞Ggta1序列的一种非天然发生的变异体。在一个实施方案中，该分离的核酸序列是一种反义核酸分子、一种RNAi分子（例如dsRNA或siRNA）、一种核酶、或一种肽核酸，其中该反义分子抑制在此所述Ggta1的产生。
在一个实施方案中，该分离的核酸分子编码连接到一种异源氨基酸序列上的在此所述的一种Ggta1多肽，例如它编码一种Ggta1融合蛋白，例如一种表位标记的Ggta1。
在一个第二方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO:1或其互补物、SEQ IDNO:3或其互补物、SEQ ID NO:5或其互补物、或SEQ ID NO:6或其互补物的至少10个连续核苷酸（例如至少12、15、18、20、25、30、35、40、45或50个连续核苷酸）并且少于500个连续核苷酸（例如，少于450、400、350、300、250、200、180、160、140、130、125、120、100、90、80、75、60、或50个连续核苷酸）的寡核苷酸。在一个实施方案中，该寡核苷酸长度在10至200个核苷酸之间，长度在20至200个核苷酸之间，长度在20至100个核苷酸之间，长度在15至100个核苷酸之间，长度在10至100个核苷酸之间，长度在20至75个核苷酸之间，长度在25至50个核苷酸之间，长度在20至50个核苷酸之间，长度在15至50个核苷酸之间，长度在10至50个核苷酸之间，长度在10至40个核苷酸之间，长度在10至30个核苷酸之间，或长度在10至25个核苷酸之间。这样的寡核苷酸可以在多种方法中用作例如引物、标签或探针来检测和/或测量CHO细胞中Ggta1的表达（例如，使用多种方法，如PCR、DNA芯片、或基因表达系列分析（SAGE））。在一个实施方案中，该寡核苷酸具有或包括在表2或表4中所示的序列。
在一个实施方案中，该寡核苷酸具有以下特征的一项或多项：50-65%的GC含量，缺乏实质性二级结构，50°C至60°C之间的熔点（Tm），没有长于3个碱基的GC重复，在末端的GC对，跨越一个内含子-外显子边界。
在一个实施方案中，本发明的特征是一组两个这样的寡核苷酸（例如引物对），它们一起能够扩增从CHO细胞得到的Ggta1 DNA的至少一部分（例如通过PCR）。一个示例性的引物组包括一个退火到Ggta1核酸分子的编码链上的正向引物以及一个退火到Ggta1核酸分子的非编码链上的反向引物。
在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可操作地连接到一个调节元件上（例如可操作地连接到一个载体构建体中的启动子上）。在一些实施方案中，该寡核苷酸处于正义方向。在其他实施方案中，该寡核苷酸处于反义方向。
在一个第三方面，本发明的特征是一种核酸构建体，如一种载体（例如，一种质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体），该载体包括在此所述的核酸分子或寡核苷酸的序列，其可操作地连接到用于表达或克隆的至少一个调节元件上，例如连接到一个启动子上。该载体可以包括另外的元件，如一种增强子、一种信号序列、一个复制起点、一种或多种标记基因、以及一种转录终止序列的一项或多项。
在一个实施方案中，该载体被设计成在宿主细胞（例如，一种原核（例如大肠杆菌）或真核细胞（例如，哺乳动物细胞，如CHO细胞））中表达在此所述的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1多肽。
在一个实施方案中，该载体包括在反义方向上克隆到表达载体中的本发明的一种DNA分子。
在一个实施方案中，该载体包含在此所述的一种核酸分子，例如在此所述的一种中国仓鼠或CHO细胞Ggta1核酸分子，该分子被配置成允许它重组到宿主细胞基因组的特异性位点中，例如配置成修饰、断裂、或敲除宿主细胞中的一种内源性Ggta1基因。
在一个第四方面，本发明特征是用在此所述的核酸分子、寡核苷酸、或核酸构建体转染的分离的宿主细胞。这些宿主细胞可以是原核的（例如大肠杆菌）或真核的（例如植物细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞例如CHO细胞）。在一个实施方案中，这些宿主细胞被进一步基因工程化用来表达一种重组治疗性糖蛋白。
在一个实施方案中，这些宿主细胞是用在此所述的一种核酸分子、寡核苷酸、或核酸构建体（例如包括在此所述的Ggta1-a、Ggta1-b或Ggta1-c编码序列的的一种载体）转染的CHO细胞，其中这些CHO细胞相对于亲本CHO细胞表达增加水平的Ggta1。在这些实施方案中，这些宿主细胞相比于亲本细胞有可能能够产生具有增加水平的末端半乳糖–α1,3-半乳糖聚糖的糖蛋白（例如，重组治疗性糖蛋白）。本发明还提供了通过使用这些宿主细胞来产生这种糖蛋白来生产具有增加水平的末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚的糖蛋白（例如重组治疗性糖蛋白）的方法。
在另一个实施方案中，这些宿主细胞是用在此所述的一种核酸分子、寡核苷酸、或核酸构建体转染的（例如，用一种Ggta1-a、Ggta1-b或Ggta1-c dsRNA、siRNA、或敲除载体转染的）CHO细胞，其中与未转化的CHO细胞相比较（例如这些宿主细胞是Ggta1敲低或敲除细胞），该CHO细胞降低了在此所述的Ggta1的表达。在这样的实施方案中，这些宿主细胞与宿主细胞的亲本细胞相比较有可能能够产生具有降低水平的末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚糖的糖蛋白（例如，重组治疗性糖蛋白）。本发明还提供了通过使用这样的宿主细胞来生产具有降低水平的末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚糖的糖蛋白（例如重组治疗性糖蛋白）的方法。
在一个第五方面，本发明提供了用于调节糖蛋白（例如重组治疗性糖蛋白）的聚糖结构的方法，例如调节存在于重组治疗性糖蛋白中的末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚糖的水平。该方法包括在适合糖蛋白表达的条件下培养在此所述的宿主细胞（例如，Ggta1-转染的或Ggta1敲低或敲除的宿主细胞）。
在一个第六方面，本发明提供了一种分离的多肽，该多肽包括在此所述的Ggta1的氨基酸序列、或其一个活性片段。在一个实施方案中，该多肽包括由在此所述的分离的核酸序列的任一项编码的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，该多肽包括包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7序列的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，该多肽包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:7的氨基酸残基序列具有至少大约90%序列一致性，例如，至少大约91%序列一致性，例如，至少大约92%序列一致性，例如，至少大约93%序列一致性，例如，至少大约94%序列一致性，例如，至少大约95%序列一致性，例如，至少大约96%序列一致性，例如，至少大约97%序列一致性，例如，至少大约98%序列一致性，例如，至少大约99%序列一致性的氨基酸序列。该多肽可以具有一种或多种Ggta1活性。
在另一个实施方案中，该Ggta1多肽或其片段不同于SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:7的对应序列。在一个实施方案中，它以至少一个但是小于20、15、10或5个氨基酸残基而不同。在另一个实施方案中，它与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:7中的对应序列以至少一个残基但是少于这些残基的10%或5%而不同。在一个实施方案中，这些差异包括保守置换。在另一个实施方案中，这些差异包括非保守置换。该多肽可以具有一种或多种Ggta1活性。
在一个实施方案中，在此所述的Ggta1多肽连接到一个异源氨基酸序列上，例如该多肽是一种Ggta1融合蛋白，例如一种表位标记的Ggta1。
在一个第七方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合到在此所述的一种CHO细胞或中国仓鼠Ggta1多肽上。任选地，该抗体是一种单克隆抗体、一种功能性抗体片段（例如一种Fab片段）或一种单链抗体。
在一个实施方案中，与结合到来自小鼠、大鼠、牛或狗的一种或多种的天然发生的Ggta1上相比较，该抗体或其功能性片段以更大的结合亲和力结合到一种CHO细胞或中国仓鼠Ggta1上。例如，与结合到来自小鼠、大鼠、牛或狗的一种或多种的天然发生的Ggta1上相比较，该抗体或其功能性片段以20%、25%、30%、40%、50%、60%或更大的亲和力结合到一种CHO细胞或中国仓鼠Ggta1上。在一个实施方案中，该抗体或其功能性片段结合到在此所述的一种CHO细胞或中国仓鼠Ggta1上，并且不结合到来自小鼠、大鼠、牛或狗的一项或多项的天然发生的Ggta1上。可以通过本领域已知的方法来确定结合亲和力，例如放射免疫测定（RIA）、ELISA、或以柱载体形式结合。通过增加变性条件，或通过与相关配体竞争来进行解离。通过斯卡恰特作图来确定解离常数（Kd）。
在一个第八方面，本发明的特征是用于检测并且任选地定量CHO细胞中的Ggta1表达和/或活性的方法。
在一个实施方案中，该方法包括使来自CHO细胞群的核酸样品与在此所述的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1寡核苷酸或分离的核酸分子相接触，以获得针对CHO群中的Ggta1表达或活性水平的一个值（例如相对值或绝对值）。在一个实施方案中，该方法包括在杂交方法（例如，DNA印迹或RNA印迹）、原位杂交（例如，荧光原位杂交或FISH）、阵列杂交、PCR（例如，RT-PCR、qPCR）分析、基因表达系列分析（SAGE）、RNA酶保护、分支DNA夹心核酸杂交（例如，
Figure BDA00001618012800061
系统）中使用在此所述的一种Ggta1探针或引物或核酸分子。在一个实施方案中，这些CHO细胞表达一种重组治疗性糖蛋白。这类方法可以用于例如针对Ggta1基因的差异表达来筛选CHO细胞克隆。
在另一个实施方案中，该方法包括使来自一个CHO细胞群的蛋白质样品与在此所述的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1多肽或抗体相接触，以获得针对CHO群中的Ggta1存在、表达或活性水平的一个值（例如相对值或绝对值）。在一个实施方案中，该方法包括在一种基于抗体的检测方法（例如酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫沉淀、免疫荧光、酶免疫测定法（EIA）、放射免疫测定（RIA）、蛋白质印迹分析、表面等离子体共振（SPR））中使用在此所述的一种Ggta1抗体或其片段。在一个实施方案中，这些CHO细胞表达一种重组治疗性糖蛋白。这类方法可以用于例如针对Ggta1的差异存在、表达或活性来筛选CHO细胞克隆。
在一个实施方案中，该方法包括进行定量实时PCR反应（qPCR）来评定CHO细胞制剂中的Ggta1表达。在一个实施方案中，该qPCR方法使用在此所述的一组Ggta1寡核苷酸，例如使用在此所述的一个引物对（例如表2或表4中所述的一个引物对）。
在一个实施方案中，将针对CHO群中的Ggta1表达或活性水平获得的值与一个参考值（例如，一个对照值，一个预定值，或针对一个第二CHO细胞群中的Ggta1表达或活性的一个值）进行比较。例如，可以将获得的值与从在不同生物过程条件下（例如不同的培养基配方和/或规模）生长的CHO细胞中获得的值进行比较。
在一个第九方面，本发明的特征是一种评定从CHO细胞得到的样品的方法。该方法包括提供从一种CHO细胞（例如从表达重组治疗性糖蛋白的一种CHO细胞）中得到的一种核酸样品，以及确定该样品的基因表达谱，其中该谱包括代表该CHO细胞中的Ggta1表达水平的一个值、以及代表该CHO细胞中的另一个基因（例如另一种酶）的表达水平的一个值。该方法可以包括使该样品与在此所述的一种或多种Ggta1核酸分子或探针或引物相接触。该方法可以进一步包括将该值或谱（即多个值）与一个参考值或参考谱相比较。可以通过在此所述的任何方法获得样品的基因表达谱（例如，通过提供来自该样品的一种核酸并且使该核酸与包括在此所述Ggta1探针的一个阵列相接触）。该方法可以用来确定在其他基因的表达或活性的水平中的在CHO细胞中的Ggta1表达或活性的水平。
在一个第十方面，本发明的特征是具有多个地址的一个二维阵列，该多个地址中的每个地址在位置上可以与该多个地址中的每个其他地址区别开，并且该多个地址的每个地址具有一个独特的捕获探针，例如一个核酸或肽序列或抗体。该多个地址中的至少一个地址具有识别在此所述Ggta1分子（例如，在此所述的Ggta-1、Ggta1-b或Ggta1-c分子）的捕获探针。在一个实施方案中，该捕获探针是核酸，例如与一个Ggta1核酸序列互补的探针。在另一个实施方案中，该捕获探针是一种抗体，例如对在此所述的Ggta1多肽具有特异性的一种抗体。还表征的是通过使样品（例如来自CHO细胞的样品）与前面提到的阵列相接触并且检测该样品与该阵列的结合来分析样品的一种方法。根据以下详细说明、以及根据权利要求，本发明的其他特征和优点中将是清楚的。
附图简要说明
图1是从由中国仓鼠脑（泳道3）、肾（泳道4）、卵巢（泳道5）、以及脾脏（泳道6）制成的cDNA库扩增的Ggta1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分离的照片。泳道1和2以kB显示了尺寸标准。通过溴化乙锭染色使DNA可视化。
图2是在氨基酸水平上的来自大鼠（NM_145674，其中外显子5和6缺失）、小鼠（NM_010283，全长）、牛（NM_177511，全长）、狗（XM_548478，全长）、中国仓鼠卵巢（共有序列）、中国仓鼠脾脏（共有序列）的Ggta1、以及CHO细胞外显子8和9的多序列比对。NCBI登录号标注在括号中。
图3是从中国仓鼠卵巢得到的cDNA克隆的Ggta1-a序列。这个序列是1110个碱基对（SEQ ID NO:1）并且翻译成370个氨基酸（SEQ ID NO:2）（具有44,002道尔顿预测分子量的一种蛋白质）。
图4是从中国仓鼠得到的cDNA克隆的Ggta1-b序列。这个序列是1110个碱基对（SEQ ID NO:3）并且翻译成370个氨基酸（SEQ ID NO:4）（具有44,016道尔顿预测分子量的一种蛋白质）。
图5是从DHFR-CHO细胞系扩增的Ggta1基因组序列。这个序列由具有插入内含子（以小写字母表示）的外显子8和9（大写字母）组成（SEQ ID NO:5）。
图6是针对CHO细胞系Ggta1外显子8和9翻译的氨基酸序列。这个序列是具有32,597道尔顿预测分子量的276个氨基酸（SEQ ID NO:6）。
图7显示了通过qPCR筛选选择克隆的PCR循环谱，用于评定在CHO细胞系克隆中的Ggta1基因的差异表达（7A）以及作为引物特异性评定的Tm分析（7B）。
图8是扩增的Ggta1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分离的照片。使用引物863和830来扩增来自CHO(DHFR-)细胞系的基因组DNA（泳道2-5）或从相同细胞系得到的cDNA（泳道6和7）。
图9是扩增的Ggta1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分离的照片。使用跨越两个外显子（外显子8和9）并且设计成在表达的基因与基因组拷贝之间有区别的Ggta1-特异性引物875（正向）和855（反向）来图谱说明表达CTLA4-Ig的DHFR-CHO细胞系的三种不同的扩增克隆。在通过甲氨喋呤扩增之后通过稀释将这些克隆分离。Ggta1PCR产物的预期尺寸（从cDNA特异性扩增的）是324bp。
详细说明
由于表位的潜在免疫原性以及（因此）在生物制品开发和制造中的调节重要性，在重组糖蛋白上的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基（Gal-α-Gal）的存在通常在很大程度上代表重要的翻译后修饰。然而，Ggta1基因或基因产物的表达以及酶活性两者都未被报道发生在任何CHO细胞系中（历史上用于商业化生产治疗性生物制品的优选的哺乳动物表达平台）。事实上，科学文献表明相反的情况，即由于在中国仓鼠基因组中缺乏Ggta1基因的功能性拷贝或它的在足够水平上的表达，CHO细胞显然不能产生具有末端Gal-α-Gal结构的N-聚糖（Smith等人（1990）《生物化学期刊》（J Biol Chem）265:6225-62343,4)；Takeuchi等人（1989）《美国国家科学院院刊》（Proc Natl Acad Sci USA）86:7819-7822）。
在国际申请序列号PCT/US2009/031678（公开参考号WO 2010/085251）（被授予本申请的受让人）中具体描述了在CHO细胞中产生的糖蛋白中末端Gal-α-Gal残基的出人意料的存在。1,3糖基转移酶-1（Ggta1）从中国仓鼠以及从CHO细胞的鉴定和克隆（如在此说明的）提供了一种有价值的用于在此所述的方法中的工具，以检测、测量和控制在生物产品中的含有Gal-α-Gal的聚糖。
定义
如在此使用的，术语“核酸分子”包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如，mRNA）以及DNA或RNA的类似物。DNA或RNA类似物可以从核苷酸类似物合成。该核酸分子可以是单链的或双链的。
术语“分离的核酸分子”或“纯化的核酸分子”包括从在核酸天然来源中存在的其他核酸分子中分离的核酸分子。例如，就基因组DNA而言，术语“分离的”包括从该基因组DNA天然地与其结合的染色体中分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不含有在从中得到该核酸的生物的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列（即，定位在该核酸5’和/或3’端处的序列）。例如，在多个实施方案中，分离的核酸分子可以包含在从中得到该核酸的细胞基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的小于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的5’和/或3’核苷酸序列。此外，当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子（例如cDNA分子）可以基本上不含有其他细胞物质、或培养基，或当化学合成时，基本上不含有化学前体或其他化学试剂。
如在此使用的，术语“在高严紧度下杂交”说明了在进行杂交反应中用于杂交和洗涤的条件。这类条件可以在《当代分子生物学实验手册》，John Wiley & Sons，纽约（N.Y.）（2007），章节6.3中找到，通过引用将其结合在此。在这个参考文件中说明了水性和非水性方法，并且可以使用任何一项。在此提及的特异性杂交条件如下：1）低严紧度杂交条件是在大约45°C下在6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中，之后至少在50°C下（对于低严紧度条件洗涤温度可以增加到55°C）在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤两次；2）中等严紧度杂交条件是在45°C下在6X SSC中，之后在60°C下在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤一次或次；3）高严紧度杂交条件是在约45°C下在6X SSC中，之后在65°C下在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次；以及4）非常高严紧度杂交条件是在65°C下0.5M磷酸钠、7%SDS，之后在65°C下在0.2X SSC、1%SDS下洗涤一次或多次。
如在此使用的，“天然发生的”核酸分子是指具有自然界中出现的核苷酸序列的一种RNA或DNA分子。例如，一种天然发生的核酸分子可以编码由野生型细胞表达的一种天然蛋白。
如在此使用的，术语“基因”以及“重组基因”是指包括编码Ggta1蛋白的至少一个开放阅读框的核酸分子。该基因任选地可以进一步包括非编码序列，例如调节序列和内含子。
“分离的”或“纯化的”多肽或蛋白质是基本上不含有来自从中得到该蛋白质的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白，或当化学合成时基本上不含有化学前体或其他化学试剂。“基本上不含有”表示Ggta1蛋白制剂具有按重量计至少50%Ggta1蛋白。在一个优选的实施方案中，Ggta1蛋白制剂具有至少大约30%、20%、10%以及更优选5%（按干重计）的非Ggta1蛋白（在此也称为“污染蛋白”）或化学前体或非Ggta1化学试剂。当重组生产Ggta1蛋白或其生物活性部分时，优选地它也基本上不含有培养基，即培养基表示小于大约20%、更优选小于大约10%，并且最优选小于大约5%的蛋白制剂的体积。
如在此使用的术语，“Ggta1多肽”是指以下各项的一种多肽：（1）显示与SEQID NO:2、4、或7的一项或多项具有至少大约90%的总序列一致性；（2）包括发现于SEQ ID NO:2、4、或7中的至少一种特征性序列元件；和/或（3）共享发现于SEQ ID NO:2、4、或7的多肽中的至少一种生物活性。在一些实施方案中，Ggta1多肽显示与SEQ ID NO:2、4、或7的一项或多项具有至少大约90%、至少大约91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少约97%、至少大约98%、至少大约99%或更高的总序列一致性。在一些实施方案中，Ggta1多肽包括发现于SEQ ID NO:2、4、或7的至少一种序列元件特征性序列元件并且还显示与SEQ ID NO:2、4、或7具有至少大约90%、至少大约91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或更高的总序列一致性。在一些实施方案中，Ggta1多肽具有SEQ ID NO:2、4、或7的长度的至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或更多的长度。在一些实施方案中，Ggta1多肽是SEQ IDNO:2、4、或7的一个片段。在一些实施方案中，Ggta1多肽显示了与SEQ ID NO:2、4、或7的片段至少大约90%、至少91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或更高的一致性；在一些这样的实施方案中，该片段具有至少大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、或更多个氨基酸的长度。
“保守氨基酸置换”是其中用具有类似侧链的氨基酸残基替换该氨基酸残基的一种置换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经被定义。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）以及芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，在Ggta1蛋白中预测非必需氨基酸残基优选地用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换。可替代地，在另一个实施方案中，可以将突变随机地连同Ggta1编码序列的全部或部分一起引入（如通过饱和诱变），并且可以针对Ggta1活性筛选出生成的突变体用来鉴定保持活性的突变体。在诱变之后，可以重组地表达编码的蛋白质并且可以确定该蛋白质的活性。
对于在此鉴定的序列的“序列一致性百分比（%）”被定义为在比对这些序列和引入空位之后（如果必要），在候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与参考序列中的氨基酸残基或核苷酸完全相同的百分比，以实现最大序列一致性百分比。（例如，为了最佳比对，可以将多个空位引入一个第一和一个第二氨基酸或核酸序列之一或两者中，并且为了比较的目的可以不考虑非同源性序列）。为了确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了实现在被比较的序列的全长上进行最大比对所需要的任何算法。在一个实施方案中，为了比较的目的所比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30%，例如至少40%，例如至少50%、60%、70%、80%、90%、或100%。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当在第一序列中的一个位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么这些分子在那个位置是相同的。
如在此使用的术语，“特征性序列元件”是指其个性特征和相对于彼此的相对位置对于一种特定多肽赋予了感兴趣的一种或多种活性或特征的一组氨基酸。在一些实施方案中，特征性序列元件是该特定多肽所独有的一种元件，因为它未被发现于缺乏该活性或特征的已知多肽中。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸。在一些实施方案中，参与一种特征性序列元件的一些或全部氨基酸是彼此连续的；在一些实施方案中，特征性序列元件中的某些残基可以与处于线性顺序中的一个或多个其他残基分开。在一些实施方案中，特征性序列元件包括当多肽链折叠时彼此邻近地定位在一个三维空间内的残基。
如在此使用的，“细胞制剂”是指细胞的一种体外制剂。在来自多细胞生物（例如植物和动物）细胞的情况下，纯化的细胞制剂是从该生物中获得的一个细胞亚群，而不是整个的完整生物。在单细胞微生物（例如，培养的细胞和微生物细胞）的情况下，它包括至少10%以及更优选地50%的受试者细胞的制剂。
下面进一步详细说明本发明的多个方面。
Ggta1核酸分子
一方面，本发明提供了如在此说明的分离的或纯化的Ggta1核酸分子。所提供的核酸分子可以编码在此所述的Ggta1多肽，例如全长Ggta1蛋白或其一种活性片段（例如，它的一种催化活性片段）。还包括了不能编码功能性蛋白但可以用于例如构建一种载体来靶向内源性中国仓鼠或CHO细胞Ggta1基因（用于例如敲除或修饰内源性Ggta1基因序列）的Ggta1核酸分子或其片段。
在一些实施方案中，所提供的Ggta1核酸分子是从中国仓鼠或从CHO细胞得到的。在一些实施方案中，所提供的Ggta1核酸分子具有与从中国仓鼠或从CHO细胞得到的Ggta1核酸分子完全相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所提供的Ggta1核酸分子编码从中国仓鼠或CHO细胞得到的一种Ggta1多肽。
在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有SEQ ID NO:1、3、5或6的核苷酸序列、或任何这些核苷酸序列的一部分。在一些实施方案中，该核酸分子仅包括编码序列。在其他实施方案中，该核酸分子包括非编码序列，如5’未翻译序列或内含子序列。包括正义和反义序列两者。
还包括了适合作为探针、标签、或引物用于例如检测和/或定量Ggta1表达的寡核苷酸或核酸分子的片段。这类寡核苷酸或片段可以是SEQ ID NO:1、3、5或6的至少大约10、12或15个、约20或25个，或大约30、35、40、45、50、55、60、65、或75个连续核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是小于约500、400、300、200、150、120、或100个核苷酸长度。在一个实施方案中，将一种探针或引物附着到一种固体载体上，例如在此所述的一种固体载体。在另一个实施方案中，提供了一组引物，例如适合用于PCR反应中的引物，它们可以用来扩增Ggta1序列的选择区域，例如在此所述的结构域、区域、位点或其他序列。这些引物可以是至少5、10、或50个碱基对长度并且小于100、或小于200个碱基对长度。这些引物应当是完全相同的，或与在此所述的一个序列或与一种天然发生的变异体有一个碱基不同。例如，适合用于扩增在此所述的Ggta1序列的全部或一部分的引物披露于表2和表4中。在一个实施方案中，一个引物试剂盒包括退火到SEQID NO:1、3、5或6的编码链上的一个正向引物以及退火到SEQ ID NO:1、3、5或6的非编码链上的一个反向引物。
可以标记核酸寡核苷酸，例如在此所述的探针、标签或引物。典型地，这类标记是化学发光的、荧光的、放射性的、或比色的。
可以重组地生产或合成地生产本发明的核酸。
Ggta1 核酸变异体：
本发明包括与在此披露的核苷酸序列（如SEQ ID NO:1、3、5或6）不同的核酸分子。例如，本发明的分离的核酸分子可以具有与SEQ ID NO:1、3、5或6相关的、或与任何这些核苷酸序列的一部分相关（例如以特定水平的序列一致性或在高严紧条件下的杂交能力相关）的序列。本发明的核酸可以具有一种天然发生的序列（例如，天然发生的等位基因变异体或突变体的序列）或它可以具有一种非天然发生的序列。在一个实施方案中，差异可能是由于例如遗传密码（以及导致编码与由在此披露的核苷酸序列编码的那些相同的Ggta1蛋白的核酸）的简并性所致。可以针对具有优选的或非优选的密码子、或针对特定表达系统选择本发明人的核酸。例如，该核酸可以是其中至少一个密码子（例如至少10%、或20%的密码子）已经被改变使得该序列针对在特定系统（例如，大肠杆菌、酵母、人类、昆虫、或CHO细胞）中表达而被优化的一种核酸。
核酸变异体可以是天然发生的，如等位基因变异体（相同的基因座）、同系物（不同的基因座），或可以是非天然发生的。可以通过诱变技术（包括应用于多核苷酸、细胞、或生物的那些）制造非天然发生的变异体。这些变异体可以包含核苷酸置换、缺失、倒位以及插入。变异可以发生在编码区和非编码区之一或两者中。这些变异可以产生保守和非保守氨基酸置换两者（如在编码的产物中比较的）。核酸修饰和诱变技术是本领域已知的。
Ggta1（例如CHO Ggta1）的等位基因变异体包括功能性和非功能性蛋白质两者。功能性等位基因变异体是编码保持提供酶功能能力的Ggta1蛋白的变异体的天然发生的核苷酸序列。功能性等位基因变异体将典型地包含SEQ ID NO:2、4或7的一个或多个氨基酸的保守置换、或在该蛋白质的非关键区域中的非关键残基的置换、缺失或插入。非功能性等位基因变异体是天然发生的核苷酸序列变异体，它们编码未保留酶功能的一种Ggta1多肽。非功能性等位基因变异体可以典型地包括SEQ ID NO:2、4或7的氨基酸序列的一种非保守置换、缺失、或插入、或成熟前截短，或该蛋白质的关键区的关键残基的置换、插入、或缺失。
Ggta1 反义分子：
本发明中还包括对于在此所述的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1是反义的分离的核酸分子。反义试剂的主要类别是反义寡核苷酸类（ODN）、核酶类、DNA酶类以及RNA干扰（RNAi）。这类分子可以用于多种方法中用来抑制Ggta1活性（例如在CHO细胞中）。“反义”核酸具有与目标核酸互补的核苷酸序列。可以设计出一种反义核酸使得它与Ggta1 mRNA的整个编码区互补，并且更优选地是仅对于Ggta1 mRNA的编码或非编码区的一部分是反义的一种寡核苷酸。例如，该反义寡核苷酸可以与Ggta1 mRNA翻译起始位点周围的区域互补（例如，在感兴趣的靶基因核苷酸序列的-10至+10区域之间）。反义寡核苷酸可以具有例如大约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、或更多个核苷酸的长度。反义分子将抑制在此所述Ggta1的生产。
可以使用本领域已知的步骤使用化学合成以及酶促连接反应来构建本发明的反义核酸。例如，使用设计成增加分子的生物学稳定性或设计成增加在反义与正义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的天然发生的核苷酸或不同修饰的核苷酸，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸，可以化学合成反义核酸（例如反义寡核苷酸）。还可以使用已经将一种核酸在反义方向上亚克隆到其中的表达载体在生物学上产生反义核酸。可以使用在此所述的载体将反义核酸分子递送到细胞中。为了实现反义分子的足够的细胞内浓度，该反义核酸分子置于其中的载体构建体可以处于强pol II或pol III启动子的控制之下。
制造和使用反义分子来调节生物活性的方法是本领域已知的，参见例如Pan和Clawson，《生物控制的反义应用》（Antisense applications for biological control）（2006）《细胞生物化学期刊》（J.Cell Biochem.）98(1):14-35；Sioud和Iversen，《作为治疗剂的核酶、DNA酶以及小干扰RNA》（Ribozymes,DNAzymes and small interfering RNAs as therapeutics）（2005）《当代药物靶标》（Curr Drug Targets）6(6)：647-53；Bhindi等人，《Brothers in arms：DNA酶、短干扰RNA、以及基于小分子核酸的基因沉默策略的出现潮流》（Brothers in arms:DNA enzymes,short interfering RNA,and the emerging wave of small-molecule nucleic acid-based gene-silencing strategies）（2007）《美国病理学期刊》（Am J Pathol.）171(4)：1079-88）。
Ggta1多肽
另一方面，本发明的特征是如在此所述的一种分离的Ggta1多肽或蛋白质（或其生物活性片段）。典型地，Ggta1蛋白的生物活性片段具有以下特征的一项或多项：它有催化Gal-α1,3-Gal聚糖的合成的能力；它利用UDP-Gal将半乳糖部分转移到现有的含有Gal的N-连接的聚糖上从而产生一种Gal-α-Gal结构以及UDP；它利用UDP-Gal将半乳糖部分转移到现有的含有Gal的O-连接的聚糖上从而产生Gal-α-Gal结构以及UDP；它利用UDP-Gal将半乳糖部分转移到现有的含有Gal的糖脂上从而产生Gal-α-Gal结构以及UDP；结合到UDP-Gal以及以半乳糖封端的聚糖上；结合到含有Gal-α-Gal的结构上；将UDP-Gal水解成Gal；如果转染和表达于真核细胞中则定位到高尔基区室中；结合到中国仓鼠或CHO细胞特异性抗-Ggta1抗体上；可以利用化学修饰的UDP-Gal同系物（例如，硫糖、三硝基苯基；2脱氧、2叠氮基，放射化学标记的，例如3H、C14、33P、32P）将半乳糖部分转移到现有的N-或O-连接的聚糖上。
可以使用标准蛋白质纯化技术从细胞或组织来源分离出Ggta1多肽或蛋白质（或其片段）。在一些实施方案中，从中国仓鼠或从CHO细胞分离出Ggta1多肽或蛋白。Ggta1多肽或蛋白质（或其片段）可以通过重组DNA技术生产或化学地合成。
本发明的多肽包括作为多基因、可变转录事件、可变RNA剪接事件、以及可变翻译和翻译后事件的存在的结果而产生的那些。该多肽可以表达于当在天然细胞中表达所表达的多肽时导致存在基本上相同的翻译后修饰的系统中（例如培养的细胞）或导致翻译后修饰改变或遗漏的系统中（例如当在天然细胞中表达时存在糖基化或切割）。
在一些实施方案中，本发明的Ggta1多肽具有SEQ ID NO:2、4或7的序列或其功能性片段。其他实施方案包括含有与SEQ ID NO:2、4或7至少一个不同的氨基酸残基（但是不大于10%）的蛋白质。这些差异可以是在对于活性不重要的氨基酸残基中。在一些实施方案中，这些差异是在一个非必需残基处的保守置换或差异或改变。还包括了以一个特定的序列一致性百分比与SEQ ID NO:2、4或7高度相关的多肽序列。
本发明包括Ggta1嵌合蛋白或融合蛋白。如在此使用的，Ggta1“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括连接到一种非Ggta1多肽上的一种Ggta1多肽。非Ggta1多肽可以融合到Ggta1多肽的N端或C端上，或可以内部融合。在一个实例中，该融合蛋白可以包括对于配体具有高亲和力的一个部分。例如，该融合蛋白可以是一种GST-Ggta1融合蛋白，其中这些Ggta1序列融合到GST序列的C端上。这类融合蛋白可以促进重组Ggta1的纯化。编码融合部分（例如，GST多肽）的表达载体是可商购的。可以将编码Ggta1的核酸克隆到这类表达载体中，使得该融合部分在框内连接到该Ggta1蛋白上。
可替代地，该融合蛋白可以是在其N端上含有一个异源信号序列的Ggta1蛋白。在某些宿主细胞中（例如，哺乳动物宿主细胞），可以通过使用一种异源信号序列来增加Ggta1的表达和/或分泌。
融合蛋白可以包括血清蛋白的全部或一部分，例如一个IgG恒定区，或人血清白蛋白。
Ggta1 多肽的变异体：
在另一个方面，本发明还表征了Ggta1多肽的变异体，例如它作为激动剂（模拟物）或作为拮抗剂起作用。Ggta1蛋白的变异体可以通过诱变产生，例如不连续点突变、序列的插入或缺失或Ggta1蛋白的截短。Ggta1蛋白的激动剂可以保留Ggta1蛋白的天然发生形式的基本上相同的、或一个亚类的生物活性。通过例如竞争性调节Ggta1蛋白的Ggta1介导的活性，Ggta1蛋白的拮抗剂能够抑制Ggta1蛋白天然发生形式的一种或多种活性。
在一些实施方案中，Ggta1多肽的变异体共享“母体”Ggta1多肽（或变异体Ggta1多肽）的氨基酸序列，但是与母体多肽相比较，包括一种或多种共价修饰。例如，在一些实施方案中，这些变异体被聚乙二醇化、糖基化、磷酸化等。
可以通过针对激动或拮抗活性筛选Ggta1蛋白突变体（例如，截短突变体）的组合文库来鉴定Ggta1蛋白的变异体。
可以将Ggta1多肽的变异体（像Ggta1多肽）产生为融合蛋白。
Ggta1抗体和抗体产生
在另一个方面，本发明提供了特异性地结合到如在此所述的Ggta1多肽上（和/或Ggta1多肽变异体上）的一种抗体；本发明还提供了用于生产这类抗体的方法。术语“抗体”是指包括能够结合中国仓鼠或CHO Ggta1抗原的至少一个免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白可变域序列的一种蛋白质。例如，抗体可以包括一个重（H）链可变区（在此缩写为VH），以及一个轻链（L）可变区（在此缩写为VL）。在另一个实例中，抗体包括两个重（H）链可变区以及两个轻（L）链可变区。这样，术语“抗体”包括多克隆的、单一特异性的、单克隆的、单价的、嵌合的、人源化的、人的、双特异性的、以及异源偶联抗体以及这些的抗原结合片段。
如此使用的，术语全长抗体的“抗原结合片段”是指保持特异性结合到感兴趣的靶标上的能力的全长抗体的一个或多个片段。这类片段的实例包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab')2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，（v）由VH结构域组成的dAb片段；以及（vi）保留功能性的分离的互补决定区（CDR）。
分离的Ggta1蛋白（包括变异体）或其抗原片段可以用作抗原来生产、筛选或选择这类抗体。可以使用任何适当的技术（包括常规杂交瘤技术、重组技术、组合方法、噬菌体展示技术、以及本领域普通技术人员已知的其他技术）获得抗体及其抗原结合片段。例如，参见《抗体工程：方法和实验方案》（Antibody Engineering:Methods and Protocols），Benny K.C.Lo，Ed.(Humana Press，2003)；《制造和使用抗体：实用手册》（Making and Using Antibodies:A Practical Handbook），Gary Howard and Matthew Kaser,Eds.(CRC,2006)；《抗体噬菌体展示：方法和实验方案》（Antibody Phage Display:Methods and Protocols），Philippa Obrien and RobertAitken,Eds.(Humana Press,2001)；《单克隆抗体：方法和实验方案》（Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols），Maher Albitar,Ed.(Humana Press,2007)。
本发明的抗体可以结合到一个第二功能部分上，例如该抗体可以结合到一个标记上（例如，一个荧光标记、放射性标记、显像剂）。
在一些实施方案中，可以使用一种抗-Ggta1抗体来检测Ggta1多肽（例如在细胞溶解产物或细胞上清液中）以便检测以及任选地测量该蛋白质的存在、水平、丰度或表达模式。通过使抗体结合（例如物理连接）到可检测物质（例如抗体标记）上可以促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、以及放射性材料。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基基团复合物的实例包括链霉亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、玫瑰精、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、以及水母发光蛋白。
重组表达载体
在另一个方面，本发明包括包含在此所述的核酸的载体（例如，表达载体、敲除载体、或驱动反义序列的载体）。如在此使用的，术语“载体”是指一种核酸分子，该核酸分子能够转运它已经连接到其上的另一种核酸，并且可以包括一种质粒、粘粒或病毒载体。该载体可以能够自主复制或它能够整合到一个宿主DNA中。
载体可以包括一种中国仓鼠或CHO细胞Ggta1核酸，其处于适合在宿主细胞中表达该核酸的一种形式。优选地，该重组表达载体包括可操作地连接到有待表达的核酸序列上的一个或多个调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子以及其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。调节序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的那些、以及组织特异性调节和/或诱导型序列。表达载体的设计可以取决于这类因素，如有待转化宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中，由此产生由在此所述的核酸编码的蛋白或多肽（包括融合蛋白或多肽）（例如，Ggta1蛋白、Ggta1蛋白的突变体形式、融合蛋白等）。
可以针对在原核或真核细胞中的Ggta1多肽的表达来设计本发明的重组表达载体。例如，本发明的多肽可以表达于大肠杆菌、昆虫细胞（例如，使用杆状病毒表达载体）、酵母细胞或哺乳动物细胞中，优选CHO细胞。当用于哺乳动物细胞中时，可以通过病毒调节元件来提供该表达载体的控制功能。例如，常用的启动子是来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒以及猿猴病毒40。
原核生物中的蛋白质表达最通常是在具有载体的大肠杆菌中进行的，这些载体包含指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体将多个氨基酸添加到在其中编码的蛋白质上，通常是该重组蛋白质的氨基端上。这类融合蛋白典型地用于三个目的：1）用于增加重组蛋白的表达；2）用于增加重组蛋白的溶解度；以及3）通过在亲和纯化中作为配体起作用以有助于重组蛋白的纯化。通常地，将蛋白裂解位点引入该融合部分与该重组蛋白的结合处从而能够在该融合蛋白纯化之后从该融合部分中分离出该重组蛋白。这类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以及肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc)、pMAL（New England Biolabs，贝弗利市，马萨诸塞州。）.以及pRIT5（Pharmacia，皮斯卡特维，新泽西州），它们对应地将谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A融合到目标重组蛋白上。纯化的融合蛋白可以用于Ggta1活性测定（例如，直接测定或竞争性测定），或用来产生对于Ggta1蛋白具有特异性的抗体。
在另一个实施方案中，该启动子是一种诱导型启动子，例如由类固醇激素、由多肽激素（例如通过信号转导途径）、或由异源多肽（例如四环素诱导系统，“Tet-On”和“Tet-Off”来自Clontech Inc.，加利福尼亚州）调节的启动子。
本发明进一步提供了包括本发明的DNA分子的一种重组表达载体，该DNA分子以反义反向克隆到该表达载体中。可以选择可操作地连接到以反义方向克隆的核酸上的调节序列（例如，病毒启动子和/或增强子），它们在多种细胞类型中指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。该反义表达载体可以是处于重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式。
本发明的另一个方面提供了一种载体，该载体包含在此所述的一种核酸分子，例如在此所述的一种中国仓鼠或CHO细胞Ggta1核酸分子，该分子被配置成允许它同源地重组到宿主细胞基因组的特异性位点中，例如配置成修饰、断裂、或敲除宿主细胞中的一种内源性Ggta1基因。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入到宿主细胞中。如在此使用的，术语“转化”和“转染”旨在是指许多种用于将外来核酸（例如DNA）引入到宿主细胞中的领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染法、或电穿孔。
可替代地，可以使将重组表达载体体外转录和翻译（例如使用T7启动子调节序列以及T7聚合酶）。
用于制造和使用包括在此所述核酸的载体的方法是本领域已知的。例如，这些方法提供于《当代分子生物学实验手册》（Current Protocols in Molecular Biology）(2007,John Wiley and Sons,Inc.,Print ISSN:1934-3639)中。
宿主细胞/基因工程化细胞
宿主细胞（例如包含在此所述的任何载体的宿主细胞）可以是任何原核或真核细胞。例如，一种Ggta1蛋白可以表达于细菌细胞（例如大肠杆菌）、植物细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞（例如CHO细胞）中。其他适合的宿主细胞对于本领域的普通技术人员而言是已知的。
本发明分离的细胞可以是被基因工程化的用于相对于亲本细胞表达增加水平的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1的一种细胞。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞用于生产Ggta1蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适当的培养基中培养本发明的宿主细胞（编码Ggta1蛋白的一种重组表达载体已经被引入其中），从而产生一种Ggta1蛋白。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从该培养基或该宿主细胞中分离一种Ggta1蛋白。
在另一个方面，本发明的特征是一种细胞或包括一种中国仓鼠或CHO细胞Ggta1转基因的、或另外地错误表达Ggta1的细胞的纯化制剂。例如，本发明的分离的细胞是被基因工程化用来表达比亲本细胞（例如该细胞是一种Ggta1敲除或敲低CHO细胞）更低水平Ggta1的一种细胞（例如CHO细胞）。用于降低或抑制内源性蛋白质的表达的敲除或敲低细胞的产生是一种已知技术。例如，一种CHO敲除细胞最近在Yamane-Ohnuki等人（2004）《生物技术与生物工程》（Biotechnol.Bioeng）87:614-622中进行了说明。
细胞制剂可以由分离的人类或非人类细胞（例如，啮齿动物细胞（例如仓鼠衍生的）、小鼠或大鼠细胞、兔细胞、或猪细胞或细胞系（例如CHO细胞系））组成的。用作本发明的宿主细胞的CHO细胞包括任何CHO株的细胞，包括CHO K1(ATCC CCL-61)、CHO pro3-、CHO DG44、CHO-S、CHO P12或dhfr-CHO细胞系DUK-BII（Chassin等人，PNAS 77,1980,4216-4220）。
用于在这类宿主细胞中制造和使用本发明的宿主细胞、以及用于制造治疗性糖蛋白的方法是本领域已知的。例如，这些方法提供于《当代细胞生物学实验手册》（Current Protocols in Cell Biology）(2007，John Wiley and Sons，Inc.，Print ISSN:1934-2500)；《当代蛋白质科学实验手册》（Current Protocols in Protein Science）(2007,John Wiley and Sons,Inc.,Print ISSN:1934-3655)；Wurm,《在培养的哺乳动物细胞中产生重组蛋白治疗剂》（Production of recombinant protein therapeutics incultivated mammalian cells）(2004)《自然生物技术》（Nature Biotech.）22:1393-1398；《治疗性蛋白：方法和实验方案》（Therapeutic Proteins:Methods and Protocols）,Smales and James,eds.(2005,Humana Press,ISBN-10:1588293904)中。
用于检测Ggta1表达或活性的方法
监测负责N-聚糖上Gal-α-Gal表位的酶添加的α-1,3糖基转移酶-1(Ggta1)的表达和/或活性的能力是一种有价值的工具，用于预测特定细胞系或克隆群中该表位存在的可能性。因此，本发明的特征还在于评估在CHO细胞中的Ggta1表达的方法。该方法包括提供来自CHO细胞群的一种样品，以及使该样品与在此所述的一种Ggta1核酸或抗体相接触。
这些方法可以用来谱图说明在潜在不同背景或克隆表型的细胞中的相对Ggta1表达。同样地当这类细胞生长在不同生物过程条件下时（如培养基配方和/或规模），它可以用来评定基因表达的变化。例如，这类方法可以用来评估在表达或产生治疗性糖蛋白的CHO细胞群中的Ggta1活性或Gal-α-Gal存在或水平。在一些实施方案中，该CHO细胞群是在生物反应器中（例如商用生物反应器）的一个群体。这类方法可以用于例如监测在制造过程期间的Ggta1表达。在其他实施方案中，CHO细胞群是针对Ggta1活性进行筛选的多种CHO细胞群之一。被筛选的多种CHO细胞可以在任何数量的方面上不同，例如它们可以在遗传背景、生长条件等方面不同。在这类筛选方法中，可以基于Gta1活性的水平选择CHO细胞，例如选择作为用于生产特定治疗性糖蛋白的适当宿主。可以将被评估的CHO细胞中的Ggta1活性与Ggta1活性的参考水平（例如，对照水平、预定水平，或相应于在一个第二CHO细胞群中的水平的水平）进行比较。
基于核酸的检测方法包括多种杂交或扩增测定法，它们包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链式反应分析（例如，定量PCR）、SAGE分析、探针阵列或寡核苷酸阵列。
用于检测Ggta1表达的一种方法涉及使从CHO细胞群分离的mRNA的样品与在此所述的一种核酸分子（例如探针）相接触，该核酸分子可以与由Ggta1基因编码的mRNA杂交。用于检测Ggta1表达的另一种方法涉及使来自CHO细胞群的mRNA或cDNA的一种样品与在此所述的引物对相接触，从而扩增Ggta1序列。可以例如通过rtPCR、qPCR、连接酶链式反应、自主序列复制、滚环复制、或任何其他核酸扩增方法，之后使用本领域已知的技术来检测这些扩增的分子来评估样品中的Ggta1mRNA的水平。实时定量PCR（或qPCR）代表用于对有限数量细胞中的Ggta1的基因表达水平进行定量的特异性的且高敏感的分子谱法（molecular profling method）的一个实例。
如在此使用的，适当的引物对被定义为能够退火到限定在中间的一个区域的基因（对应地正链和负链，或反之亦然）的5’和3’区域上的一对寡核苷酸。通常，扩增引物在长度上是从大约10个至30个核苷酸并且位于长度从大约50至200个核苷酸的一个区域的侧翼。在适当条件下并且使用适当试剂，这类引物允许扩增包括侧翼为这些引物的核苷酸序列的核酸分子。
可以通过原位或通过体外形式两者来确定在细胞（例如CHO细胞）中的Ggta1基因表达的水平。在一种形式下，将mRNA（或cDNA）固定在一个表面上并且与探针接触（例如，通过使分离的mRN在琼脂糖凝胶上移动并且将mRNA从该凝胶转移到膜如硝酸纤维素上）。在一种替代形式中，将探针固定在一个表面上并且使mRNA（或cDNA）与这些探针接触（例如在以下说明的二维基因芯片阵列中）。熟练的技术人员可以采用已知的mRNA检测方法用于检测由Ggta1基因编码的mRNA的水平。对于原位方法而言，可以将细胞或组织样品制备/处理以及固定在一种载体（典型地一种载玻片）上，进而使之与可以杂交到被分析的Ggta1基因上的一种探针接触。
在另一个实施方案中，这些方法进一步包括使一种对照样品与能够检测Ggta1mRNA、或基因组DNA的一种化合物或试剂相接触，并且将对照样品中的Ggta1mRNA或基因组DNA的存在度（presence）与测试样品中的Ggta1 mRNA或基因组DNA的存在度相比较。仍然在另一个实施方案中，使用基因表达系列分析（例如如美国专利号5,695,937中说明的）来检测Ggta1转录本水平。
用于检测Ggta1蛋白的基于抗体的技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫沉淀、免疫荧光、酶免疫测定（EIA）、放射免疫测定（RIA）、蛋白质印迹分析、表面等离子共振。其他方法可以包括使用基于质谱的方法来检测Ggta1肽或其片段，包括但不限于LC-MS、MS/MS、MS/MS/MS、MALDI-MS、多反应监测（MRM）。
在一个实施方案中，在此所述的检测方法是确定样品的基因表达谱的一部分，其中该谱包括代表Ggta1表达水平的一个值（在针对至少一个其他基因的表达的至少一个其他值之中）。该方法可以进一步包括将该值或谱（即多个值）与一个参考值或参考谱进行比较。可以通过在此所述的任何方法获得样品的基因表达谱（例如通过提供来自该样品的核酸以及使该核酸与一个阵列接触）。可以使用这种方法来评估或筛选CHO细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于具有多个数字编码的数据记录的一种计算机介质。每个数据记录包括代表在样品中的中国仓鼠或Ggta1表达水平的一个值、以及该样品的一个描述符。样品的描述符可以是该样品的一个标识符，例如从中得到该样品的细胞类型（例如CHO细胞株）、或在其下培养作为该样品来源的细胞的细胞培养条件。在一个实施方案中，该数据记录进一步包括代表除了Ggta1之外的基因的表达水平的值（例如，与聚糖合成相关的其他基因，或阵列上的其他基因）。该数据记录可以被结构化为一个表格，例如作为数据库例如关系数据库（例如Oracle或Sybase数据库环境的SQL数据库）的一部分的表格。
它们的阵列和用途
本发明的特征还在于具有多个地址的一种二维阵列，该多个地址的每个地址在位置上与该多个地址的每个其他地址可区别开。该多个地址的每个地址具有独特的捕获探针，例如在此所述的一种核酸或多肽序列或抗体。该多个地址的至少一个地址具有识别在此所述的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1分子（例如，在此所述的Ggta-1、Ggta1-b或Ggta1-c分子）的捕获探针。在一个实施方案中，该捕获探针是核酸，例如与Ggta1核酸序列互补的探针。在另一个实施方案中，该捕获探针是一种抗体，例如对在此所述的Ggta1多肽具有特异性的一种抗体。特征还在于通过使样品（例如来自CHO细胞的样品）与前面提到的阵列相接触并且检测该样品与该阵列的结合来分析样品的一种方法。
该阵列可以具有至少大于10、50、100、200、500、1,000、2,000、或10,000或更多个地址/cm2（以及在其间的范围）的密度。在一个优选的实施方案中，该多个地址包括至少10、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000个地址。在一个优选的实施方案中，该多个地址包括等于或少于10、100、500、1,000、5,000、10,000、或50,000个地址。该基质可以是一种二维基质，如载玻片、晶片（例如，二氧化硅或塑料）、质谱板、或一种三维基质（如凝胶垫）。除了这多个地址之外的地址可以布置在该阵列上。
可以通过多种方法产生一个阵列，例如通过光刻法（参见例如美国专利号5,143,854、5,510,270、以及5,527,681）、机械法（例如，如美国专利号5,384,261中说明的定向流动法）、基于插针的方法（例如，如美国专利号5,288,514中说明的）、以及基于珠粒的技术（例如，如PCT US/93/04145中说明的）。
在另一方面，本发明的特征在于分析Ggta1表达的方法。该方法包括提供如上所述的一个阵列；使该阵列与一个样品接触并且检测Ggta1分子（例如，核酸或多肽）与该阵列的结合。在一个优选实施方案中，该阵列是一个核酸阵列。任选地该方法进一步包括在与该阵列接触之前或期间从该样品中扩增核酸。
在另一个实施方案中，该阵列可以用来测定细胞群（例如，CHO细胞群）中的基因表达，特别地是Ggta1的表达。如果对足够数量的多种样品进行分析，可以使用聚类（例如，层次聚类、k-均值聚类、贝叶斯聚类等）来鉴定与Ggta1共调节的其他基因。例如，该阵列可以用于定量多基因的表达。因此，不但可以确定细胞类型特异性，而且可以确定组织中的一组基因的表达水平。可以使用定量数据基于它们本身的组织表达以及在该组织中的表达水平将基因分组（例如聚类）。
在一个实例中，可以使用基因表达的阵列分析来评定不同细胞培养条件对Ggta1表达的影响。在一个第一组条件下可以培养一个第一细胞群，并且在一个第二组条件下可以培养一个第二细胞群，并且可以在这样一个阵列上分析来自该多个群的核酸。在本发明的背景下，可以确定培养条件对生物反应的影响。类似地，可以比较具有不同遗传背景的CHO细胞。
调节糖蛋白聚糖结构的方法
本发明的特征在于在CHO细胞中产生糖蛋白的方法，其中该糖蛋白例如相对于现有技术中的糖蛋白（例如相对于作为治疗性糖蛋白销售的糖蛋白）具有改变水平的Gal-α-Gal聚糖结构。该方法包括在适合于糖蛋白表达的条件下培养在此所述的宿主细胞（例如，Ggta1-转染的或Ggta1敲低或敲除的宿主细胞）。该糖蛋白可以选自在表5中说明的那些。
在一个实施方案中，产生了一种相对于具有相同的或高度相似的多肽序列（例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%完全相同的多肽序列）的现有技术中的糖蛋白具有增加水平的Gal-α-Gal聚糖结构的糖蛋白。该方法包括培养在此所述的一种CHO宿主细胞，该细胞已经被基因工程化用于产生相对于亲本细胞（例如过表达Ggta1的CHO细胞）具有增加水平的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1，其中该宿主细胞还包含编码治疗性糖蛋白的转基因；以及从生成的培养细胞纯化该治疗性糖蛋白。
在另一个实施方案中，产生了一种相对于具有相同或高度相似多肽序列（例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%完全相同的多肽序列）的现有技术中的糖蛋白具有降低水平的Gal-α-Gal聚糖结构的糖蛋白。这种方法包括培养在此所述的一种CHO宿主细胞，该细胞已经被基因工程化用于产生相对于亲本细胞（例如在此所述的Ggta1敲除或敲低CHO细胞）具有降低水平的中国仓鼠或CHO细胞Ggta1，其中该宿主细胞包含编码治疗性糖蛋白的转基因；以及从生成的培养细胞中纯化该治疗性糖蛋白。如此产生的这类糖蛋白可以提供改进形式的市售治疗性糖蛋白。
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根据以下详细说明、并且根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将是清楚的。
通过下面实例对本发明进行进一步说明，这些实例不应当被认为是限制性的。贯穿本申请引证的所有参考文献、专利、公开的专利申请的内容通过引用结合在此。
实例
实例1：来自中国仓鼠组织和来自CHO细胞的Ggta1的cDNA克隆
基于与大鼠或小鼠Ggta1编码序列的同源性设计了初始寡核苷酸引物集合（参见例如表2）。使用这些引物通过PCR扩增来自CHO细胞衍生的cDNA或基因组DNA（gDNA）的至少一部分Ggta1序列的初期反复尝试是不成功的。因此本发明包括这样的认识，即标准杂交方法可能不足以允许克隆CHO Ggta1。
特别地，使用这些相同引物集合的一个子集合来筛选从中国仓鼠（而不是从CHO细胞系）得到的四种组织特异性cDNA库：脑、脾脏、肾、以及卵巢。这些cDNA库是从两种分开的、性别分化的动物中得到的（cDNA脑和脾脏库来自雄性中国仓鼠，并且cDNA肾和卵巢库来自雌性中国仓鼠）。使用与一组已知的、对照CHO特异性的基因序列互补的一组寡核苷酸引物通过PCR来确认这些cDNA库是中国仓鼠特异性的。所有四个cDNA库导致一个特异性1.1kb产物的扩增（参见图1）。基于与小鼠和大鼠Ggta1翻译序列的序列同源性，通过DNA测序来证实相应于Ggta1的假定的中国仓鼠直系同源性的这些PCR产物（图2）。
在图3中来自卵巢的中国仓鼠Ggta1的编码序列（在此称为Ggta1-a）显示为SEQ ID NO:1并且它的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:2。在图4中来自脾脏的中国仓鼠Ggta1的编码序列（在此称为Ggta1-b）显示为SEQ ID NO:3并且它的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:4。如上所述，这两个序列是从分开的中国仓鼠“供体”（即雌性和雄性）得到的。基于与小鼠Ggta1基因的外显子结构的比较，这两个克隆显得是全长的并且包括所有预测的外显子（4至9）。
Ggta1-a和Ggta1-b编码序列彼此具有大于99%的一致性，该1110bp编码序列中仅6个核苷酸不同。这些核苷酸差异中的五个是沉默的，仅一个导致保守氨基酸改变（Ile69Val）。因此，Ggta1-a和Ggta1-b氨基酸序列具有大于99.5%的一致性。
Ggta1-a和Ggta1-b核苷酸序列与大鼠序列对应地具有79.4%和79.6%一致性；与小鼠序列对应地具有87.2%和87.5%一致性；与牛序列对应地具有77.5%和77.7%一致性，并且与狗序列对应地具有82.2%和82.3%一致性。在氨基酸水平上，Ggta1-a和Ggta1-b序列与大鼠序列具有81%一致性；与小鼠序列具有86%一致性，与牛序列具有73%一致性，以及与狗序列具有77%一致性。
最高度保守的区域是推定地需要用于配体结合以及催化活性的那些，相应于SEQ ID NO:2或4的氨基酸残基Iso-82至Val-370（参见《生物化学与生物物理学报》（Biochimica et Biophysica Acta）（2000）1480:222-234）。参见图2。在氨基酸水平上，在催化区域上Ggta1-a和Ggta1-b序列与大鼠序列具有91%一致性；与小鼠序列具有90.3%一致性，与牛序列具有83%一致性，以及与狗序列具有79%一致性。Ggta1-a和Ggta1-b催化区域与Ggta1-c催化区域具有大于95%的一致性。
类似于小鼠和大鼠基因序列，还注意到中国仓鼠Ggta1基因的可变剪接（数据未显示）。具体地，显示了在至少一个克隆中，外显子6被切除（相应于SEQ IDNO:2的Iso-40至Gly-60）。这种缺失可以通过PCR辨别，当通过琼脂糖凝胶电泳显影时该PCR导致较小扩增的DNA片段（注意图1中泳道3-6的双联体）。
基于上述从组织特异性DNA库中得到的中国仓鼠Ggta1序列，为了使用它们通过PCR从CHO细胞系产生的cDNA中扩增Ggta1，设计了另外的qPCR寡核苷酸引物集合。然而，这样做的努力最初是不成功的。更出人意料的是，这些引物也未能扩增该基因的任何基因组拷贝（当使用从用于cDNA筛选的相同CHO细胞源分离的基因组DNA时）。不希望受任何特定理论的束缚，本发明的诸位发明人提出，与从中独立地得到cDNA库（用于克隆Ggta1-a和Ggta1-b序列）的亲本中国仓鼠的基因组相比较，该问题可能是由于在CHO细胞系Ggta1基因的基因组拷贝中存在的DNA序列异质性所致。此外，编码催化区的大部分的外显子9显示了最初使我们认为它对于大肠杆菌（用于克隆的细菌细胞）具有毒性的特征，从而进一步挑战从CHO细胞成功克隆的努力。
最终使用合理设计的PCR引物集合（表2）实现了从CHO细胞基因组DNA（gDNA）成功扩增具有5,877个碱基对并且包括外显子8、9（以及插入内含子）的一部分基因序列。这种部分Ggta1基因组序列示于图5中（SEQ ID NO:5），并且相应的氨基酸序列示于图6中（SEQ ID NO:6）。几个克隆的序列分析证实了DNA多态性的存在（相对于初始的Ggta1-a和Ggta1-b序列）。具体地，相对于从卵巢得到的cDNA中国仓鼠cDNA库最初克隆的序列，在Ggta1基因的外显子8-9区域中注意到13个氨基酸改变（在275个残基中）。当比较这两种基因序列时，这种多态性等于蛋白质序列中的大致5%的差异（在核苷酸水平上的6.5%差异）。相比之下，当直接与CHO细胞得到的cDNA序列比较时，通过PCR从四个组织特异性中国仓鼠cDNA库同样扩增的不相关的对照CHO序列都展示出100%的碱基对一致性。这个观察表明遗传多态性中的基因特异性偏倚。
总之，从CHO细胞中克隆Ggta1在技术上具有挑战性。虽然数个种类（包括小鼠、大鼠、牛、猪、狗、猫、以及若干其他生物）的Ggta1基因序列是公众可得的，使用这些相关序列通过常规同源性克隆从CHO细胞获得Ggta1基因还是不成功的。与缺乏对于CHO细胞中Ggta1活性的存在的文献支持相结合，其他人则可能已经得出CHO Ggta1不存在的结论。相反地，诸位发明人认识到他们遇到的这些问题的来源，并且追求从中国仓鼠组织和基因组DNA克隆Ggta1基因，以便提供最终允许从CHO细胞克隆Ggta1 cDNA的工具。除了其他事项之外，向正在研究从CHO细胞克隆Ggta1 cDNA的研究人员们提出的挑战包括（1）文献中总体一致的意见是CHO细胞不包括Ggta1活性；（2）在啮齿动物序列之间的DNA序列同源性的不寻常的发散性（例如，小鼠对大鼠，其中这两个对应的Ggta1基因序列大致相差9%）；以及（3）CHO细胞Ggta1基因序列的遗传多态性。本发明的诸位发明人识别出这些挑战，开发出用于对付它们的策略，并且成功克隆了CHOGgta1序列。
实例2：使用转录谱通过qPCR来筛选CHO细胞系克隆中的Ggta1基因的差 异表达
PCR的成功使用需要严紧的考虑，即，将仔细设计的寡核苷酸引物与互补的核苷酸序列一起用到正在被检测的靶基因序列上。在没有首先确定CHO Ggta1基因的确切序列（如上述）下，用于特异性地描绘CHO细胞中的Ggta1基因表达的这些序列匹配引物的设计最初是不可能的。基于如上所述的克隆的CHO细胞Ggta1序列的知识，然后仔细设计了另外的引物用来通过qPCR对表达CTLA4-Ig的CHO细胞的克隆群中的Ggta1基因的相对表达水平进行定量。这些引物被设计为特异性地杂交在Ggta1外显子9序列的一个区域中，通过多重序列比对显示在它们对应的核苷酸序列中（表2）是绝对保守的。使用一种对照DNA模板，基于效率、特异性以及敏感性对这些引物进行定量。这些引物的动态范围超过8个数量级，表明它们基本上能够检测低至单数字拷贝/细胞的Ggta1 mRNA水平。
这些qPCR结果总结在图7中。在表达CTLA4-Ig的CHO细胞系的基于DHFR的扩增之后通过稀释将克隆分离。使用外显子9特异性引物845（正向）和846（反向）（序列示于表2中）通过qPCR对Ggta1表达进行定量。图7A显示了选择克隆的PCR循环曲线。图7B显示了通过Tm分析对引物特异性的评定。表3说明了针对三个例证性克隆的循环阈值（Ct）。这些结果表明特异性产物的扩增（基于扩增产物的解链温度分析，图7B）。而且，这些结果还证明了这些引物用于区分从一个单一的亲本CHO细胞系得到的独特克隆的用途（基于Ggta1基因的相对表达水平）（表3）。
此外，通过作图到相邻外显子（即，正向引物，外显子8；反向引物，外显子9）上，我们设计了在Ggta1基因的基因组对转录（cDNA）拷贝之间进行区分的引物。相应于cDNA模板对基因组DNA（gDNA）模板的Ggta1序列的差异扩增示于图8中。由于存在一个较大的（>5kb）插入型内含子序列（该序列将基因组拷贝中的两个外显子物理地分开但是随后剪接掉从而形成成熟的Ggta1 mRNA转录本），在所使用的qPCR条件下这些引物集合将不能扩增Ggta1的基因组拷贝。同样，针对Ggta1基因的差异表达使用在此披露的其他引物筛选CHO细胞克隆。图9显示Ggta1PCR产物（从cDNA特异性地扩增）是324bp。在某些应用中（例如需要以特殊方式明确检测和/或定量低的Ggta1基因表达水平，该特异性方式排除了由于基因组DNA携带污染（genomic DNA carryover）所致的假阳性结果的任何可能性）这类引物具有特殊价值。
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延伸和替代方案
在本申请中引证的所有文献以及类似材料（包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文、以及网页），无论这样的文献和类似材料的形式如何，都通过引用以其全部内容清楚地结合在此。在结合的文献和类似材料的一项或多项与本申请不同或矛盾的情况下（包括但不限于定义的术语、术语用法、说明的技术等），以本申请为准。在此使用的部分标题仅用于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制所说明的主题。虽然已经结合不同的实施方案和实例说明了这些方法，并不旨在使这些方法受到这些实施方案或实例的限制。相反，如本领域的技术人员应当理解的，这些方法包括各种替代方案、变更、以及等效物。
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Figure IDA00001618013300211

Claims (26)

1.一种分离的核酸分子，包括与（a）具有编码SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的氨基酸残基序列或其生物活性片段的序列的DNA分子或（b）（a）的DNA分子的互补物具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。
2.一种分离的核酸分子，该分子编码SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:4或SEQID NO:7的序列。
3.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列具有至少90%序列一致性。
4.一种分离的核酸分子，在高严紧条件下该分离的核酸分子与具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列的一种核酸分子或其互补物杂交。
5.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子包括SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列、或其互补物。
6.如权利要求1-5的任一项所述的分离的核酸分子，其中该核酸分子编码连接到一种异源氨基酸序列上的一种Ggta1多肽。
7.一种选自下组的寡核苷酸，该组由以下各项组成：
(a)一种由SEQ ID NO:1或它的互补物的至少10个连续核苷酸并且小于500个连续核苷酸组成的寡核苷酸，
(b)一种由SEQ ID NO:3或它的互补物的至少10个连续核苷酸并且小于500个连续核苷酸组成的寡核苷酸，
(c)一种由SEQ ID NO:5或它的互补物的至少10个连续核苷酸并且小于500个连续核苷酸组成的寡核苷酸，
(d)一种由SEQ ID NO:6或它的互补物的至少10个连续核苷酸并且小于500个连续核苷酸组成的寡核苷酸，
(d)一种具有10至500个核苷酸的寡核苷酸，包括在表2中所示的一个序列，以及
(e)一种具有10至500个核苷酸的寡核苷酸，包括在表4中所示的一个序列。
8.一种核酸构建体，包括如权利要求1-7的任一项所述的核酸分子或寡核苷酸的序列。
9.一种分离的宿主细胞，该分离的宿主细胞是用如上述权利要求的任一项所述的一种核酸分子、寡核苷酸、或核酸构建体来转染的。
10.如权利要求9所述的分离的宿主细胞，其中与由该宿主细胞的亲本细胞产生的重组治疗性糖蛋白相比较该宿主细胞产生具有增加水平的末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚糖的重组治疗性糖蛋白。
11.如权利要求9所述的分离的宿主细胞，其中与由该宿主细胞的亲本细胞产生的重组治疗性糖蛋白相比较该宿主细胞产生具有降低水平的末端半乳糖-α1,3-半乳糖聚糖的重组治疗性糖蛋白。
12.一种调节在CHO细胞中产生的重组治疗性糖蛋白的聚糖结构的方法，该方法包括在足以表达该糖蛋白的条件下培养如权利要求10或权利要求11所述的宿主细胞。
13.一种分离的多肽，包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7具有至少90%序列一致性的一种氨基酸序列、或其生物活性片段。
14.一种分离的多肽，包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或其生物活性片段以至少一个但是小于20个氨基酸残基而不同的氨基酸序列。
15.一种分离的多肽，包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
16.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其与如权利要求13、14或15所述的多肽特异性地结合。
17.一种检测在CHO细胞群中的Ggta1表达或活性的方法，该方法包括：使来自该CHO细胞群的核酸样品与如权利要求1-5的任一项所述的核酸分子或如权利要求7所述的寡核苷酸相接触，由此检测在CHO细胞群中的Ggta1表达或活性。
18.如权利要求17所述的方法，其中该方法包括使用PCR来扩增在该核酸样品中的核酸序列。
19.如权利要求17所述的方法，进一步包括对在CHO细胞群中的Ggta1表达的水平进行定量。
20.如权利要求19所述的方法，进一步包括将该CHO细胞群中的Ggta1表达的水平与参考水平、对照水平、预定水平或由一个第二CHO细胞群展示的水平进行比较。
21.一种检测CHO细胞群中的Ggta1表达或活性的方法，该方法包括：使来自该CHO细胞群的一种样品与如权利要求13、14或15所述的多肽或如权利要求16所述的抗体或其片段相接触，由此检测在该CHO细胞群中的Ggta1表达或活性。
22.如权利要求21所述的方法，进一步包括对该CHO细胞群中的Ggta1表达的水平进行定量。
23.如权利要求22所述的方法，进一步包括将该CHO细胞群中的Ggta1表达的水平与参考水平、对照水平、预定水平或由一个第二CHO细胞群展示的水平进行比较。
24.一种具有多个地址的二维阵列，该多个地址的每个地址在位置上可与该多个地址的每个其他地址区别开，并且该多个地址的每个地址具有一个独特的捕获探针，其中该多个地址的至少一个地址具有包括如权利要求1-5的任一项所述的核酸分子或如权利要求7所述的寡核苷酸的捕获探针。
25.一种具有多个地址的二维阵列，该多个地址的每个地址在位置上可与该多个地址的每个其他地址区别开，并且该多个地址的每个地址具有一个独特的捕获探针，其中该多个地址的至少一个地址具有包括如权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段的捕获探针。
26.一种分析来自CHO细胞的样品的方法，该方法包括使该样品与如权利区域24或25所述的阵列相接触。
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