JP2009537151A - ヒトｏｃｔ−２変異体ペプチド鎖、核酸、および方法 - Google Patents

ヒトｏｃｔ−２変異体ペプチド鎖、核酸、および方法 Download PDF

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Abstract

ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＯＣＴ−２変異体ペプチド鎖が開示される。これらのペプチド鎖をコードしているポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む細胞、および前記物質を使用する方法がまた開示される。

Description

本発明は、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＯＣＴ−２変異体ペプチド鎖、これらのペプチド鎖をコードしているポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む細胞、および前記物質を使用する方法に関する。
抗体のようなタンパク質の大規模な商業生産は、典型的には、培養真核細胞によるタンパク質の発現に依っている。一般に、ｍＲＮＡのコピー数を増加することがタンパク質の発現増加をもたらすことは、当該技術分野において認識されている。さらに、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような生物活性ＲＮＡは、細胞において望ましくない効果を生じる遺伝子の発現を防ぐために有用である。培養真核細胞によるタンパク質の大規模生産および生物活性ＲＮＡ技術は、共に、それぞれタンパク質をコードしているＲＮＡまたは生物活性ＲＮＡへの遺伝子の効率的な転写に依存している。しかしながら、低いタンパク質発現または低いＲＮＡ転写レベルは、これらの技術の使用において遭遇される共通の問題である。
ＯＣＴ−２タンパク質およびその既知の相同体は、このタンパク質に対して応答性の遺伝子からＲＮＡ転写物の生産を増加することができる転写因子である。ホモ・サピエンスＯＣＴ−２（配列番号：２）の顕著な生物活性形態物は、４６３個のアミノ酸残基からなり、そして抑制ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを含有する（図１）。ＯＣＴ−２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、ＯＣＴ−２応答性遺伝子のプロモーターまたは調節領域中に共通配列５’−ＴＮＡＴＴＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：１５；ここで、Ｎはいずれかの核酸残基である）を有する「オクタマー（ｏｃｔａｍｅｒ）部位」に結合する。参照、非特許文献１。ＤＮＡに結合の後、ＯＣＴ−２タンパク質の活性化ドメインは、ＲＮＡ転写物を生産できる活性ＲＮＡポリメラーゼＩＩタンパク質複合体の形成を安定化させるために、ホモ・サピエンスのコ・アクチベータータンパク質ＯＢＦ−１（配列番号：８）と相互作用すると考えられる。参照、非特許文献２。ＯＣＴ−２の活性は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子からのＲＮＡ転写物の生産における増加をもたらす活性ＲＮＡポリメラーゼＩＩタンパク質複合体の生成速度を増加させる。
遺伝子は、自然に、ＯＣＴ−２応答性であってもよく、あるいは遺伝子工学的に、遺伝子のプロモーターまたは調節領域中に「オクタマー」ＤＮＡ配列を挿入することによってＯＣＴ−２応答性にされてもよい。結論として、低レベルのタンパク質発現または低い生物活性ＲＮＡレベルが、ＯＣＴ−２単独の過発現によるか、またはＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加するためのＯＢＦ−１コ・アクチベータータンパク質によって増加できることが期待される。かくして、新規なＯＣＴ−２組成物およびＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現または転写を増加させる効率的方法に対するニーズが存在する。
Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５４４（１９８８） Ｂｏｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０７（１９９７）
本発明の１つの態様は、ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：６のアミノ酸残基１
〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードしている配列を有する核酸を含む単離核酸である。
本発明のその他の態様は、ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する単離ペプチド鎖である。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現が、第１の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現を増加する方法である。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を含む第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；配列番号：１０のアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現を増加する方法である。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写が、核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加する方法である。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；配列番号：１０のアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加する方法である。
本明細書において引用される、限定されるものではないが特許および特許出願を含む、すべての公表物は、完全な記述をとおして引用によって本明細書に組み入れられている。
本明細書および請求項において使用されるように、単数形態物「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別に明白に指示しない限り、複数引用物を含む。かくして、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」に関しては、１個以上の細胞に関する引用であり、そして当業者にとって既知のその等価物を含む。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野における熟達者によって普通に理解されるような同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと類似または等価のすべての組成物および方法が、本発明の実行または教示において使用されてもよいが、代表的な組成物および方法が本明細書では記述される。
用語「ペプチド鎖」は、鎖を形成するようにペプチド結合によって連結された少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個以上のアミノ酸の大ペプチド鎖は、「ポリペプチド」または「タンパク質」として言及されてもよい。５０個未満のアミノ酸の小ペプチド鎖は、「ペプチド」として言及されてもよい。
用語「核酸」は、鎖を形成するように連結された少なくとも２個の核酸残基を含む分子を意味する。そのような核酸残基はＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見出だされるそれらのものであってもよい。
用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、２種の整列ペプチド鎖間の同一性パーセントを意味する。２種のペプチド鎖間の同一性は、ｔｈｅ ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｌｉｇｎＸ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して、対を組ませる（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）アミノ酸配列の整列によって決定することができる。ＡｌｉｇｎＸは、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用して、対を組ませるアミノ酸配列の整列を実施する。
用語「真核細胞」は、遺伝物質が少なくとも１つの膜境界のある核中に組織される細胞を意味する。
用語「ＯＣＴ−２応答性遺伝子」は、ＲＮＡをコードしていて、そして直接的に、オクタマーの（ｏｃｔａｍｅｒｉｃ）共通５’−ＴＮＡＴＴＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：１５）ＯＣＴ−２ＤＮＡ結合性ハーフサイト（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）へのＯＣＴ−２またはＯＣＴ−２相同体の結合を介してＯＣＴ−２活性に応答するか、または間接的にＯＣＴ−２活性に応答する核酸を意味する。ＯＣＴ−２応答性遺伝子によってコードされているＲＮＡは、小さい干渉ＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡまたはリボザイムとしてそれ自体において機能性であってもよい。また、ＯＣＴ−２応答性遺伝子によってコードされているＲＮＡは、ペプチド鎖を生産するために翻訳されてもよい。
用語「発現する」は、核酸によってコードされているペプチド鎖の検出可能な生産を意味する。
用語「骨髄腫細胞」は、多発性骨髄腫を有する生物体から得られるか、または誘導されるがん性形質細胞、ならびにそのようながん性形質細胞とその他の細胞（例えば、抗体産生ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞または抗体をコードしている核酸により安定にトランスフ
ェクトされた真核細胞）の融合から形成されるハイブリドーマ細胞の両方を指す。
本発明の１つの態様は、ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を含むペプチド鎖をコードしている核酸を含む単離核酸である。
当業者は、本発明の核酸によってコードされているペプチド鎖が、そのアミノまたはカルボキシ末端において第２の異種ペプチド鎖に融合されてもよいことを認識できる。そのような異種ペプチド鎖は、タグ、ドメイン、アミノ酸リンカー配列または他のペプチド鎖類であってもよい。ペプチド鎖タグの例は、ヘキサヒスチジン、ｆｌｕ抗原およびＦｃドメインを含む。ペプチド鎖ドメインは、例えば、転写活性化ドメインおよび触媒活性のあるドメイン、例えばペルオキシダーゼまたはクロラムフェニカルアセチルトランスフェラーゼならびに他の別のタンパク質ドメインを含んでもよい。アミノ酸リンカー配列は、立体的に拘束されないペプチド鎖、例えば、多数のグリシン、セリンまたはプロリンアミノ酸残基を含有するそれらのペプチド鎖であってもよい。当業者は、異種タンパク質の融合体をコードしている核酸を生成するための標準技術を認識することができる。
左旋性アミノ酸（Ｌ−アミノ酸）残基は、２０種の天然に存在するＬ−アミノ酸およびこれらのアミノ酸の天然に存在する翻訳後修飾体、例えば、セレノシステインおよびピロリジンを含む。
本発明の単離核酸の１つの実施態様では、ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基は、配列番号：１６または配列番号：１７において示される配列を有する。
その他の実施態様では、本発明の単離核酸は、配列番号：４をコードしている核酸配列を含む。配列番号：４はホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体ペプチド鎖のアミノ酸配列である。配列番号：４のアミノ酸配列をコードしている代表的な核酸配列は配列番号：３において示される。
その他の実施態様では、本発明の単離核酸は、配列番号：６をコードしている核酸配列を含む。配列番号：６はホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９変異体ペプチド鎖のアミノ酸配列である。配列番号：６のアミノ酸配列をコードしている代表的な核酸配列は配列番号：５において示される。
本発明のその他の実施態様は、本発明の単離核酸を含む細胞である。そのような細胞は、原核、真核または古細菌細胞であってもよい。そのような細胞は、本発明の単離核酸からのペプチド鎖の発現のため、または本発明の単離核酸の増殖のために適当であることが好ましい。
本発明のその他の態様は、ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を含む単離ペプチド鎖である。当業者は理解できるように、本発明のペプチド鎖は、第２の異種ペプチド鎖に融合されてもよい。そのようなペプチド鎖融合体は、アミノまたはカルボキシ末端融合体を生成するために標準の分子生物学技術を用いて生成することができる。あるいはまた、そのようなペプチド鎖融合体は、ペプチド鎖を融合するためのインビトロの化学的カップリング技術によって生成でき、そしてアミノ末端融合体、カルボキシ末端融合体、またはア
ミノ酸側鎖融合体を生成することができる。
本発明の単離ペプチド鎖のその他の実施態様では、ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基は、配列番号：１６または配列番号：１７において示されるアミノ酸配列を有する。
その他の実施態様では、本発明の単離ペプチド鎖は配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有する。
その他の実施態様では、本発明の単離ペプチド鎖は配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有する。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている第１の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１の核酸によってコードされている第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現が、第１の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現を増加する方法である。
本発明の方法において有用な真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物由来の細胞，およびＳＰ２／０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）およびＣ４６３Ａ細胞のような骨髄腫細胞を含む。Ｃ４６３Ａ細胞およびＣ４６３Ａ細胞の作成はＵＳ２００３０１６６１４６Ａ１に記述されており、これは引用によって完全に本明細書に組み入れられている。そのような真核細胞は動物血清を欠如する化学的規定培地における増殖のために適応されてもよい。
用語「ＯＣＴ−２応答性遺伝子」は先に定義されている。ＯＣＴ−２応答性遺伝子によってコードされているＲＮＡは、小さい干渉ＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡまたはリボザイムとしてそれ自体において機能性であってもよい。また、ＯＣＴ−２応答性遺伝子によってコードされているＲＮＡは、ペプチド鎖を生産するために翻訳されてもよい。そのようなペプチド鎖は、抗体鎖、抗体鎖のフラグメント、触媒的に活性なペプチド鎖、受容体アゴニストペプチド鎖、受容体アンタゴニストペプチド鎖、および細胞における発現に望ましいいずれかの機能をもつ他のペプチド鎖であってもよい。
真核細胞は、そのような遺伝子が細胞中に存在する場合の、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む。ＯＣＴ−２応答性遺伝子は、自然にＯＣＴ−２応答性であるＯＣＴ−２応答性遺伝子になるように、部位特異的または任意の組み換えによって改変されたネイティブ遺伝子であってもよい。ネイティブ遺伝子は、ネイティブ遺伝子のプロモーターまたは調節領域中に、ＯＣＴ−２結合部位を含有する核酸を導入することによってＯＣＴ−２応答性にさせることができる。あるいはまた、遺伝子は、ＯＣＴ−２活性の結果として生産される転写アクチベーターに応答性のプロモーターまたは調節領域を含有する核酸を導入することによって、間接的にＯＣＴ−２応答性にさせることができる。また、外因性ＯＣＴ−２応答性遺伝子が、真核細胞中に導入されてもよい。そのような外因性ＯＣＴ−２応答性遺伝子は、例えば、免疫グロブリンプロモーターのようなＯＣＴ−２応答性プロモーターの制御下の抗体軽鎖または重鎖遺伝子構築物であってもよい。部位特異的、標的化組み換えは、また、内因性のＯＣＴ−２応答性調節領域またはプロモーターの制御下に外因性遺伝子
を置くように使用されてもよい。当該技術分野において周知の標準的分子生物学、組み換え遺伝子工学技術および細胞培養技術が、インビトロまたはインビボのいずれかのＯＣＴ−２応答性遺伝子の構築のために、ならびにＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞の同定のために使用することができる。
核酸は、周知の技術、例えば細胞融合、エレクトロポレーション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ウイルス感染、およびリン酸カルシウム沈降に基づく技術によって、本発明の方法において真核細胞に提供されてもよい。当業者は真核細胞に核酸を提供するための他の技術を認識できる。
ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子によってコードされているペプチド鎖のレベルまたは活性が対照真核細胞に比較して増加される場合に、対照真核細胞に比較して増加される。ペプチド鎖レベルは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような当該技術分野において既知のいかなる手段によって測定されてもよい。ペプチド鎖の活性レベルは、ペプチド鎖の活性に特異的な活性アッセイを使用して測定することができる。例えば、抗体ペプチド鎖の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されてもよく、そして抗体の抗原結合活性は、当該技術分野において周知の標準ＥＬＩＳＡ技術を使用して測定されてもよい。ペプチド鎖レベルまたは活性は、いずれか適当な単位を用いて数値として表現され、そして必要ならば正規化されてもよい。正規化は、第２のペプチド鎖のレベル、サンプル中の細胞数を使用することによって、または例えば、経過時間に基づいて、達成することができる。
本発明の方法の１つの実施態様では、第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における第１の５個のアミノ酸残基は配列番号：１６または配列番号：１７において示される配列を有する。
本発明の方法のその他の実施態様では、第１のペプチド鎖は配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有する。
本発明の方法のその他の実施態様では、第１のペプチド鎖は配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有する。
本発明の方法のその他の実施態様では、真核細胞は骨髄腫細胞である。本発明の方法において有用な骨髄腫細胞系の例は、ＳＰ２／０、ＮＳＯ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）細胞系を含み、これらはマウスから得られた。ヒトから得られ、そして本発明の方法において有用な骨髄腫細胞系の例はＵ２６６細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。Ｃ４６３Ａ骨髄腫細胞系もまた、本発明の方法において有用であり、そして化学的規定培地において成長可能なＳＰ２／０由来の細胞系の例である。当業者は他の骨髄腫細胞系を認識できる。
本発明の方法のその他の実施態様では、真核細胞は、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる。これらの細胞類の各々は、インビトロ培養のために適当であり、そして高レベルでペプチド鎖を発現する能力を有するという共通の性質を有する。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン
−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている第１の核酸を真核細胞に提供し；配列番号：８または配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現を増加する方法である。配列番号：８はホモ・サピエンスＯＢＦ−１ペプチド鎖のアミノ酸配列である。配列番号：８のアミノ酸配列をコードしている代表的な核酸配列は、配列番号：７において示される。配列番号：１０はムス・ムスクルスＯＢＦ−１ペプチド鎖のアミノ酸配列である。配列番号：１０のアミノ酸配列をコードしている代表的な核酸配列は、配列番号：９において示される。
本発明の方法の１つの実施態様では、第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における第１の５個のアミノ酸残基は配列番号：１６または配列番号：１７において示される配列を有する。
本発明の方法のその他の実施態様では、ＯＣＴ−２応答性遺伝子は抗体遺伝子、例えば重鎖または軽鎖遺伝子であってもよい。
本発明の方法のその他の実施態様では、第１のペプチド鎖は配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有する。
本発明の方法のその他の実施態様では、第１のペプチド鎖は配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有する。
本発明の方法のその他の実施態様では、真核細胞は骨髄腫細胞である。
本発明の方法のその他の実施態様では、真核細胞は、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子を含む真核細胞を提供し；配列番号：４または配列番号：６において示される配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている第１の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１の核酸によってコードされている第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子の発現が、第１の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子の発現を増加する方法である。
本発明の方法の１つの実施態様では、真核細胞は、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；配列番号：４または配列番号：６において示される配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている第１の核酸を真核細胞に提供し；配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子の発現が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子の発現を増加する方法である。
本発明の方法の１つの実施態様では、真核細胞は、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写が、核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加する方法である。
ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子によってコードされているＲＮＡ転写物のレベルまたは活性が対照真核細胞に比較して増加される場合に、対照真核細胞に比較して増加される。ＲＮＡ転写物レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロットのような当該技術分野において既知のいかなる手段によって測定されてもよい。ＲＮＡ転写物の活性レベルは、例えば、ＲＮＡ転写物の活性に特異的なリボザイム活性アッセイ、サイレンシングＲＮＡアッセイまたはアンチセンスＲＮＡアッセイを使用して測定することができる。ＲＮＡ転写物レベルまたは活性は、いずれか適当な単位を用いて数値として表現され、そして必要ならば正規化されてもよい。正規化は、第２のＲＮＡ転写物のレベル、サンプル中の細胞数を使用することによって、または例えば、経過時間に基づいて、達成することができる。
本発明のその他の態様は、ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；配列番号：１０のアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加する方法である。
本発明は次に示す実施例に関してさらに記述される。これらの実施例は、本発明の態様を単に具体的に説明することであり、そして本発明の限定を意図するものではない。
ホモ・サピエンスＯＣＴ−２変異体タンパク質をコードしているｃＤＮＡの単離
ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８（配列番号：４）およびホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９（配列番号：６）変異体タンパク質をコードしている２種のｃＤＮＡが単離され、そして配列決定された。ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質（配列番号：４）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：３）およびホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９変異体タンパク質（配列番号：６）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：５）は、ホモ・サピエンスｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ，．Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して単離された。
これらのホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質変異体をコードしている配列番号：４および配列番号：６のＰＣＲ増幅において使用された正プライマーおよび逆プライマーの核酸配列は、配列番号：１１（正プライマー）および配列番号：１２（逆プライマー）において示される。これらのプライマーは、寄託Ｍ３６６５３に記述された核酸配列を使用して設計された。寄託Ｍ３６６５３は、ＣＤＳ １およびＣＤＳ ２と呼ばれる２個のオープンリーディングフレームを含有し、そしてホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質をコードしている。このホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質はＣＤＳ １によってコードされていると予測される。正（配列番号：１１）および逆（配列番号：１２）プライマーは、寄託Ｍ３６６５３におけるＣＤＳ １に隣接している５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および寄託Ｍ３６６５３によって記述された核酸配列のＣＤＳ １に対して３’に位置される配列に特異的である。これらのプライマーを用いるＰＣＲは、これらの２種のプライマーの結合部位の間に位置されるいかなるライブラリー核酸配列も増幅する。これらのプライマーを用いるＰＣＲから得られる増幅されたＤＮＡフラグメントが単離され、ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローン化され、そして標準分子生物学技術を使用して配列決定された。
配列決定、概念的翻訳および多配列整列分析（図２）が、ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８タンパク質およびホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９タンパク質をコードしている２種のユニーク核酸配列が単離されたことを示した。この分析は、これらの２種のクローンが、寄託ＮＰ＿００２６８９によって記述された野生型、原型ホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質（配列番号：１）および寄託Ｍ３６６５３のＣＤＳ １（配列番号：１３）によってコードされていると推定されるホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質（配列番号：１４）とは異なるホモ・サピエンスＯＣＴ−２変異体タンパク質をコードしていることを示した。図２の多タンパク質配列の整列において見られるように、ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８タンパク質配列（配列番号：４）およびホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９タンパク質配列（配列番号：６）の両者は、寄託ＮＰ＿００２６８９によって記述された野生型、原型ホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質配列（配列番号：２）において見出だされる１２のカルボキシ末端アミノ酸残基（配列番号：１９）を欠いている。さらに、図２の多タンパク質配列の整列において見られるように、ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８タンパク質配列（配列番号：４）およびホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９タンパク質配列（配列番号：６）の両者は、寄託Ｍ３６６５３のＣＤＳ １によってコードされていると推定されるホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質（配列番号：１４）の位置１６６〜１８１において見出だされる１１のアミノ酸残基配列を欠いている。最後に、また多タンパク質配列の整列（図２）は、ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９タンパク質配列（配列番号：６）が、野生型、原型ホモ・サピエンスＯＣＴ−２（配列番号：２）、クローン＃３８タンパク質配列（配列番号：４）、および寄託Ｍ３６６５３のＣＤＳ １によってコードされていると推定されるホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質（配列番号：１４）における位置１１６において見出だされるプロリン（Ｐ）残基の代わりに、位置１１６においてセリン（Ｓ）アミノ酸残基を有することを示した。多配列整列分析は、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムおよびＣＬＵＳＴＡＬＷデフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）を使用して実施された。これらの結果は、２種の新ホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質変異体が単離され、そして同定されたことを例証している。
ＯＣＴ−２変異体タンパク質およびＯＢＦ−１の過発現が抗体遺伝子転写物および発現レベルを増加する
ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質（配列番号：４）単独での、およびムス・ムスクルスＯＢＦ−１（配列番号：１０）の過発現と組み合わせての、その安定な過発現は、Ｃ４６３Ａ細胞における組み換え抗体重鎖および軽鎖遺伝子転写物
（図３）および発現レベル（図４）を増加した。
この実験のための対照Ｃ４６３Ａ細胞は、標準方法を使用して、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターにより安定にコ・トランスフェクトされた。ＯＣＴ−２をトランスフェクトされた細胞は、重鎖発現ベクター、軽鎖発現ベクター、およびホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８（配列番号：４）をコードしているｐｃＤＮＡ３．１／ｈＯＣＴ−２ベクターにより安定にコ・トランスフェクトされた。ＯＣＴ−２およびＯＢＦ−１をトランスフェクトされた細胞は、重鎖発現ベクター、軽鎖発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＯＣＴ−２、およびムス・ムスクルスＯＢＦ−１（配列番号：１０）をコードしているｐｃＤＮＡ３．１／ｍＯＢＦ−１ベクターにより安定にコ・トランスフェクトされた。
Ｃ４６３Ａ細胞はムス・ムスクルスＳＰ２／０骨髄腫細胞から得られ、そして化学的規定培養培地における成長のために適応された。重鎖および軽鎖発現ベクターは、完全ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）特異的モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている。重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターによる重鎖および軽鎖の発現を進める免疫グロブリンプロモーターは、オクタマーの共通（５’−ＴＮＡＴＴＴＧＣＡＴ−３’；配列番号：１５）ＯＣＴ−２ＤＮＡ結合性ハーフサイトを含有する。このＯＣＴ−２ＤＮＡ部位は、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターからの重鎖および軽鎖遺伝子転写物をＯＣＴ−２活性に対して応答性にさせる。重鎖発現ベクター、軽鎖発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＯＣＴ−２およびｐｃＤＮＡ３．１／ｍＯＢＦ−１ベクターは各々、それらがコードしている種々のタンパク質を構成的に発現する。
トランスフェクションは、標準方法を用いて約１ｘ１０７Ｃ４６３Ａ細胞のエレクトロポレーションによって実施された。対照Ｃ４６３Ａ細胞は、重鎖発現ベクター４μｇ、軽鎖発現ベクター４μｇおよびｐｃＤＮＡ３．１の２μｇを用いるエレクトロポレーションによって安定にトランスフェクトされた。ＯＣＴ−２ Ｃ４６３Ａ細胞は、重鎖発現ベクター４μｇ、軽鎖発現ベクター４μｇおよびｐｃＤＮＡ３．１／ｈＯＣＴ−２の２μｇを用いて安定にトランスフェクトされた。ＯＣＴ−２ ４６３Ａ細胞は、重鎖発現ベクター４μｇ、軽鎖発現ベクター４μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＯＣＴ−２の２μｇおよびｐｃＤＮＡ３．１／ｍＯＢＦ−１の２μｇを用いて安定にトランスフェクトされた。ＭＨＸ（ミコフェノール酸、ヒポキサンチンおよびキサンチン）および標準方法が使用されて、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた細胞が選別された。Ｇ４１８および標準方法が使用されて、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＯＣＴ−２およびｐｃＤＮＡ３．１／ｍＯＢＦ−１を用いて安定にトランスフェクトされた細胞が選別された。次いで、標準方法を用いてＥＬＩＳＡアッセイが実施されて、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターによってコードされている完全ヒト組み換え腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）特異的モノクローナル抗体の最高発現を有するクローンが同定された（図４）。
ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質単独の安定な発現は、対照細胞に比較して組み換え抗体遺伝子転写物および発現レベルを増加した（図３および図４）。ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８（配列番号：４）変異体タンパク質およびムス・ムスクルスＯＢＦ−１タンパク質（配列番号：１０）の安定な同時発現は、対照細胞およびＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質（配列番号：４）のみを発現する細胞に比較して組み換え抗体の発現をさらに増加した（図３および図４）。一緒に考えるとこれらの結果は、ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質が、遺伝子の活性化を促進するようにＯＣＴ−２ＤＮＡ結合部位に結合可能な生物活性を有し、そしてムス・ムスクルスＯＢＦ−１タンパク質と相互作用して、ＯＣＴ−２応答性遺伝子発現を活性化することが可能である。
本発明は、ここに、完全に記述されており、多くの変更物および修飾物が、添付された請求項の精神および範囲を逸脱することなく、それに対して作成できることは当業者には明らかである。
ホモ・サピエンスＯＣＴ−２ペプチド鎖（配列番号：２）の機能性ドメイン。図面は一定の比率ではない。 野生型、原型ホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質（ＮＰ＿００２６８９；配列番号：２）；ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃１９変異体タンパク質（クローン＃１９；配列番号：６）；ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質（クローン＃３８；配列番号：４）；および寄託Ｍ３６６５３のコーディング配列１（ＣＤＳ １）によってコードされていると推定されるホモ・サピエンスＯＣＴ−２タンパク質（配列番号：１４）；の多配列整列分析。 単独およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＯＢＦ−１タンパク質（配列番号：１０）と組み合わせて、ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質（配列番号：４）の過発現が、真核生物Ｃ４６３Ａ細胞におけるＯＣＴ−２応答性抗体重鎖および軽鎖遺伝子の転写物レベルを増加する。 ホモ・サピエンスＯＣＴ−２クローン＃３８変異体タンパク質（配列番号：４）単独での、およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＯＢＦ−１タンパク質（配列番号：１０）と組み合わせての、その過発現が、真核生物Ｃ４６３Ａ細胞におけるＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子の発現レベルを増加する。

Claims (28)

  1. ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を含むペプチド鎖をコードしている核酸を含む単離核酸。
  2. ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基が配列番号：１６または配列番号：１７において示される配列を有する、請求項１の単離核酸。
  3. 配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードしている請求項２の単離核酸。
  4. 配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードしている請求項２の単離核酸。
  5. 請求項１、２、３または４の単離核酸を含む細胞。
  6. ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を含む単離ペプチド鎖。
  7. ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基が配列番号：１６または配列番号：１７において示される配列を有する、請求項６の単離ペプチド鎖。
  8. 配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有する、請求項７の単離ペプチド鎖。
  9. 配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有する、請求項７の単離ペプチド鎖。
  10. ａ）ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；
    ｂ）第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；そして
    ｃ）真核細胞において第１の核酸によってコードされている第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現が、第１の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：
    という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現を増加する方法。
  11. 第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における第１の５個のアミノ酸残基が配列番号：１６および配列番号：１７において示される配列を有する、請求項１０の方法。
  12. 第１のペプチド鎖が配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１１の方法。
  13. 第１のペプチド鎖が配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１１の方法。
  14. 真核細胞が骨髄腫細胞である、請求項１０の方法。
  15. 真核細胞が、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる、請求項１０の方法。
  16. ａ）ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；
    ｂ）ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；
    ｃ）配列番号：８または配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして
    ｄ）真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：
    という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の発現を増加する方法。
  17. 第１のペプチド鎖のカルボキシ末端における第１の５個のアミノ酸残基が、配列番号：１６または配列番号：１７において示される配列を有する、請求項１６の方法。
  18. 第１のペプチド鎖が配列番号：４において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１７の方法。
  19. 第１のペプチド鎖が配列番号：６において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１７の方法。
  20. 真核細胞が骨髄腫細胞である、請求項１６の方法。
  21. 真核細胞が、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる、請求項１６の方法。
  22. ＯＣＴ−２応答性抗体遺伝子が抗体遺伝子である、請求項１０または１６の方法。
  23. ａ）ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；
    ｂ）ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を有する、配列番号：４または６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；そして
    ｃ）真核細胞において第１のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写が、核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：
    という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加する方法。
  24. 真核細胞が、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる、請求項２３の方法。
  25. 真核細胞がＣ４６３Ａである、請求項２４の方法。
  26. ａ）ＯＣＴ−２応答性遺伝子を含む真核細胞を提供し；
    ｂ）ペプチド鎖のカルボキシ末端における５個のアミノ酸残基がアミノ酸配列アスパラギン−プロリン−セリン−Ｘａａ−グリシン（配列番号：１８）［ここで、ＸａａはいずれかのＬ−アミノ酸である］を含む、配列番号：４または６のアミノ酸残基１〜４４７に対して少なくとも９０％同一性をもつアミノ酸配列を有する第１のペプチド鎖をコードしている核酸を含む第１の核酸を真核細胞に提供し；
    ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有する第２のペプチド鎖をコードしている第２の核酸を真核細胞に提供し；そして
    ｄ）真核細胞において第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖を発現し、これによって、ＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写が、第１および第２の核酸を提供されなかった対照真核細胞に比較して増加される：
    という段階を含む、真核細胞によるＯＣＴ−２応答性遺伝子の転写を増加する方法。
  27. 真核細胞が、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる、請求項２６の方法。
  28. 真核細胞がＣ４６３Ａである、請求項２７の方法。
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