ES2437224T3

ES2437224T3 - Cadenas peptídicas de variante oct-2 humana, ácidos nucleicos y métodos

Info

Publication number: ES2437224T3
Application number: ES07783878.7T
Authority: ES
Inventors: Haimanti Dorai; Jin Lu
Original assignee: Janssen Biotech Inc; Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2014-01-09
Anticipated expiration: 2027-05-17
Also published as: EP2023962B1; EP2023962A2; JP2009537151A; DK2023962T3; WO2007137121A3; WO2007137121A2; EP2023962A4

Abstract

Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena peptídica que comprende unasecuencia de aminoácido, donde el ácido nucleico codifica una cadena peptídica que tiene: (i) la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4; o (ii) la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cadenas peptídicas de variante OCT-2 de Homo sapiens, polinucleótidos que codifican estas cadenas peptídicas, células que comprenden estos polinucleótidos, y métodos de uso de los anteriores.

Antecedentes de la invención

La producción comercial a gran escala de proteínas, tales como anticuerpos, típicamente depende de la expresión por células eucarióticas cultivadas. En general, en la técnica se reconoce que el incremento de número de copia de mARN da como resultado una mayor expresión de proteínas. Además, ARNs bioactivos tales como ARNs silenciadores (siARN) son útiles para prevenir la expresión de genes que producen efectos indeseados en células. La producción a gran escala de proteínas mediante tecnologías de células eucarióticas cultivadas o ARN bioactivo es dependiente de la transcripción eficiente de genes en proteínas que codifican ARN o ARNs bioactivos, respectivamente. Sin embargo, la baja expresión de proteínas o los niveles bajos de transcripción de ARN son problemas comunes que surgen en el uso de estas tecnologías.

La proteína OCT-2 y sus homólogos conocidos son factores de transcripción capaces de aumentar la producción de transcripción de ARN de genes receptivos a esta proteína. La formas bioactiva predominante de OCT2 Homo sapiens (SEQ ID NO: 2) consiste en 463 residuos de aminoácido y contiene un dominio inhibidor, un dominio de enlace con ADN, y un dominio de activación (Fig. 1). Las variantes de empalme de OCT-2 son conocidas en humanos y ratones. (Véase Genes and Development, 2: 1570 (1988) y Wirth et al. Nucleic acids Research 19:43 (1991). El dominio de enlace de ADN de la proteína OCT-2 se enlaza con el “sitio octámero) que tiene una secuencia en consenso 5’-TNATTTGCAT-3’ (SEQ ID NO: 15; donde N es cualquier residuo de ácido nucleico) en la región promotora o reguladora de genes receptivos de OCT-2. Véase Müller et al., en Nature 336: 544 (1988). Después del enlace de ADN, se cree que el dominio de activación de la proteína OCT-2 interactúa con la proteína co-activadora OBF-1 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 8) para estabilizar la formación de un complejo activo de proteína II polimerasa ARN que puede producir transcripciones de ARN. Véase Boss, Current Opin. In Immunol. 9: 107 (1997). La actividad de OCT-2 aumenta el índice de formación de complejos de proteínas II polimerasa ARN dando como resultado un aumento en la producción de transcripciones de ARN de genes receptivos a OCT-2. En Corcoran et al., Journal of Imunology, 172: 2692 (2004) se presenta que el dominio de activación de C-terminal es esencial para la función de Oct-2 in vivo.

Los genes pueden ser naturalmente receptivos a OCT-2 o construirse para convertirse en receptivos a OCT-2 insertando una secuencia de ADN de “octámero” en la región promotora o reguladora del gen. Como consecuencia, se espera que los niveles bajos de expresión de proteínas o los niveles bajos de ARN bioactivo puedan aumentar por la sobreexpresión de OCT-2 solo o con la proteína co-activadora OBF-1 para aumentar la transcripción de genes receptivos a OCT-2. De este modo, existe una necesidad de composiciones nuevas de OCT2 y métodos efectivos para aumentar la expresión o transcripción de genes receptivos a OCT-2.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Dominios funcionales de una cadena peptídica de OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 2). Dibujo no a escala.

Fig. 2. Análisis de alineación de secuencias múltiples de la proteínas OCT de Homo sapiens arquetipo de tipo salvaje (NP_002689; SEQ ID NO. 2), Proteína Variante Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens (Clon #19; SEQ ID NO: 6); Proteína Variante Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (Clon #38; SEQ ID NO: 4); y la proteína OCT-2 de Homo sapiens pronosticada para codificarse mediante secuencia 1 codificadora (CDS 1) de Registro M36653 (SEQ ID NO: 14).

Fig. 3. Sobreexpresión de Proteína Variante Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) sola y en combinación con la proteínas OBF-1 de Mus musculus (SEQ ID NO: 10) aumenta los niveles de expresión de gen de anticuerpo receptivo a OCT-2 en células eucarióticas C463A.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena peptídica que comprende una secuencia de aminoácido donde el ácido nucleico codifica una cadena peptídica que tiene:

(i) La secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4; o

(ii): La secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una cadena peptídica aislada que comprende una secuencia de aminoácido, donde la cadena peptídica tiene:

(i): La secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4; o

(ii): La secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; y expresar la primera cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que comprende una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-ProlinaSerina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena peptídica que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 10; y expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 4 o 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; y expresar la primera cadena peptídica en la céluala eucariótica por lo que la transcripción del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a laque no se le proporcionó con el primer ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 4 o 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena peptídica que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 10; y expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la transcripción del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer y segundo ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas singulares “un”, “uno”, “una”, “el”, “la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “una célula” es una referencia a una o más células e incluye equivalentes de la misma conocidos por aquellos expertos en la técnica.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como lo entiende comúnmente un experto ordinario de la técnica al que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o en pruebas de la invención pueden usarse cualquier composición y método similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen composiciones y métodos ejemplares en el presente documento.

El término “cadena peptídica” significa una molécula que comprende al menos dos residuos de aminoácido unidos por un enlace peptídico para formar una cadena. Las cadenas peptídicas grandes de más de 50 aminoácidos

pueden referirse como “polipéptidos” o “proteínas”. Las cadenas peptídicas pequeñas de menos de 50 aminoácidos pueden referirse como “péptidos”.

El término “ácido nucleico” significa una molécula que comprende al menos dos residuos de ácido nucleico unidos para formar una cadena. Tales residuos de ácido nucleico pueden ser aquellos encontrados en ADN o ARN.

El término “identidad” significa la identidad porcentual entre dos cadenas peptídicas alineadas. La identidad entre dos cadenas peptídicas puede determinarse mediante alineación de secuencias de aminoácidos en forma de parejas usando la configuración estándar del módulo AlignX de Vector NTI v. 9.0.0 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). AlignX usa el algoritmo CLUSTALW para realizar alineaciones de secuencias de aminoácidos en forma de parejas.

El término “célula eucariótica” significa una célula en la que se organiza material genético en al menos un núcleo unido a la membrana.

El término “gen receptivo a OCT-2” significa un ácido nucleico que codifica un ARN y responde a la actividad de OCT-2 bien directamente a través del enlace de OCT-2 o un homólogo de OCT-2 con un sitio medio de enlace con ADN de OCT-2 octamérico por consenso 5’-TNATTTGCAT-3’ (SEQ ID NO: 15) o indirectamente con la actividad de OCT-2. El ARN codificado por un gen receptivo a OCT-2 puede ser funcional por sí mismo como un ARN interferente pequeño, ARN silenciador, o ribozima. El ARN codificado por un gen receptivo a OCT-2 puede también trasladarse para producir una cadena peptídica.

El término “expresión” significa la producción detectable de una cadena peptídica codificada por un ácido nucleico.

El término “célula de mieloma” se refiere a células de plasma canceroso obtenidas, o derivadas de un organismo con múltiples mielomas y a células de hibridoma formadas a partir de la fusión de tal célula de plasma canceroso con otra célula (por ejemplo, un anticuerpo que produce célula de bazo de ratón BALB/c o célula eucariótica transfectada establemente con un ácido nucleico que codifica un anticuerpo).

Como aquellos expertos en la técnica reconocerán, la cadena peptídica codificada por el ácido nucleico de la invención puede fusionarse en su terminal amino o carboxi con una segunda cadena peptídica heteróloga. Tales cadenas peptídicas heterólogas pueden ser etiquetas, dominios, secuencias enlazadoras de aminoácido y otro tipos de cadena peptídica. Ejemplos de etiquetas de cadena peptídica pueden incluir, por ejemplo, dominios de activación de transcripción y dominios catalíticamente activos tales como peroxidasas o cloranfenicol acetiltransferasa así como otros dominios distintos de proteínas. Las secuencias enlazadoras de aminoácido pueden ser cadenas peptídicas estéricamente contenidas tales como aquellas cadenas peptídicas que contienen múltiples residuos de aminoácidos de glicina, serina o prolina. Aquellos expertos en la técnica reconocerán técnicas estándares para generar ácidos nucleicos que codifiquen fusiones de proteínas heterólogas.

Los residuos de aminoácido levorrotatorio (L-aminoácido) incluyen los veinte L-aminoácidos que ocurren de manera natural y las modificaciones post-traslaciones que ocurren de manera natural de estos L-aminoácidos tales como, por ejemplo, selenocisteína y pirrolisina.

En el ácido nucleico aislado desvelado en el presente documento, los cinco residuos de aminoácido en la terminal carboxi de la cadena peptídica pueden tener la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.

En una realización el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ácido nucleico de la cadena peptídica variante Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens. Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 4 se muestra en la SEQ ID NO: 3.

En otra realización el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ácido nucleico de la cadena peptídica variante Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens. Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 6 se muestra en la SEQ ID NO: 5.

Otra realización de la invención es una célula que comprende un vector de expresión de la invención. Tal célula puede ser una célula procariótica, eucariótica o arqueal. Es preferente que tales células sean adecuadas para la expresión de cadenas peptídicas de ácidos nucleicos aislados desvelados en el presente documento o para la propagación de los ácidos nucleicos aislados desvelados en el presente documento.

Otro aspecto de la invención es una cadena peptídica aislada que comprende una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la cadena peptídica tienen la secuencia de aminoácido Asparagina-ProlinaSerina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido. Como aquellos expertos en la técnica reconocerán, la cadena peptídica de la invención puede fusionarse con una segunda cadena peptídica heteróloga.

Tales fusiones de cadenas peptídicas pueden generarse usando técnicas estándares de biología molecular para generar fusiones de amino y carboxi-terminal. Alternativamente, tales fusiones de cadenas peptídicas pueden generarse mediante técnicas de unión química in vitro para fusionar cadenas peptídicas y generar fusiones de amino-terminal, fusiones de carboxi-terminal, o fusiones de cadena lateral de aminoácido.

En la cadena peptídica aislada los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la cadena peptídica pueden tener la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.

En una realización la cadena peptídica aislada de la invención tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4.

En otra realización la cadena peptídica aislada de la invención tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; y expresar la primera cadena peptídica codificada por el primer ácido nucleico en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no s ele proporcionó con el primer ácido nucleico.

Las células eucarióticas útiles en el método de la invención incluyen células derivadas de mamíferos tales como céulas de Ovario de Hámster Chino (CHO), y células de mieloma tales como células SP2/0 (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manasas, VA, CRL-1581) y células C463A. Las células C463A y la generación de células C463A se describen en US20030166146A1, que en el presente documento se incorpora por referencia en su totalidad. Tales células eucarióticas pueden adaptarse para crecimiento en medios definidos químicamente carentes de suero animal.

El término “gen receptivo a OCT-2” se ha definido anteriormente. El ARN codificado por un gen receptivo a OCT-2 puede ser funcional por sí mismo como un ARN interferente pequeño, ARN silenciador, o ribozima. El ARN codificado por un gen receptivo a OCT-2 puede también trasladarse para producir una cadena peptídica. Tales cadenas peptídicas pueden ser cadenas de anticuerpo, fragmentos de cadenas de anticuerpo, cadenas peptídicas catalíticamente activas, cadenas peptídicas agonistas receptoras, cadenas peptídicas antagonistas receptoras, y otras cadenas peptídicas con cualquier función que sea deseable expresar en una célula.

Una célula eucariótica comprende un gen receptivo a OCT-2 si tal gen está presente en la célula. Los genes receptivos a OCT-2 pueden ser genes nativos que se han modificado mediante recombinación con especificidad de sitio o aleatoria para ser genes receptivos a OCT-2 que son receptivos a OCT-2 de manera natural. Un gen nativo puede hacerse receptivo a OCT-2 introduciendo un ácido nucleico que contiene un sitio de enlace de OCT-2 en la región promotora o reguladora del gen nativo. Alternativamente, un gen puede hacerse indirectamente receptivo a OCT-2 introduciendo un ácido nucleico que contiene una región promotora o reguladora receptiva a un activador transcripcional producido como un resultado de actividad de OCT-2. Un gen receptivo a OCT-2 exógeno puede también introducirse en una célula eucariótica. Tal gen receptivo a OCT-2 exógeno puede ser, por ejemplo, una construcción genética de cadena ligera o pesada de anticuerpo bajo el control de un promotor receptivo a OCT-2 tal como un promotor de inmunoglobulina. También puede usarse recombinación dirigida con especificidad de sitio para colocar un gen exógeno bajo el control de una región o promotor regulador endógeno receptivo a OCT-2. La biología molecular estándar, técnicas de tecnología genética recombinante y técnicas de cultivo celular bien conocidas por aquellos expertos en la técnica pueden usase para la construcción de genes receptivos a OCT-2 bien in vitro o in vivo y para la identificación de células eucarióticas que comprenden un gen receptivo a OCT-2.

En el método de la invención puede proporcionarse un ácido nucleico a las células eucarióticas mediante técnicas bien conocidas tales como fusión celular, electroporación, lipofección, infección viral, y técnicas basadas en precipitación de fosfato cálcico. Aquellos expertos en la técnica reconocerán otras técnicas para proporcionar un ácido nucleico a una célula eucariótica.

La expresión de un gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control cuando el nivel o actividad de la cadena peptídica codificada por el gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con la célula eucariótica de control. Los niveles de cadena peptídica pueden medirse mediante cualquier medio conocido en la técnica tal como, por ejemplo, SDS-PAGE. Los niveles de actividad de la cadena peptídica pueden medirse usando ensayos de actividad específicos para la actividad de la cadena peptídica. Por ejemplo, le expresión de cadena peptídica de anticuerpo puede medirse mediante SDS-PAGE, y la actividad de enlace de antígeno de un anticuerpo puede medirse usando técnicas estándares ELISA bien conocidas en la técnica. Los niveles o actividad de cadena peptídica pueden expresarse numéricamente usando cualquier unidad apropiada y normalizada si es

necesario. La normalización puede llevarse a cabo usando el nivel de una segunda cadena peptídica, el número de células en la muestra, o en base de tiempo transcurrido, por ejemplo.

En una realización del método de la invención los primeros cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.

En otra realización del método de la invención la primera cadena peptídica tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4.

En otra realización del método de la invención la primera cadena peptídica tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.

En otra realización del método de la invención la célula eucariótica es una célula de mieloma. Ejemplos de líneas celulares útiles en los métodos de la invención incluyen líneas celulares SP2/0, NSO (Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unidos, ECACC Nº 85110503), FO (ATCC CRL-1646), y Ag653 (ATCC CRL-1580) que se obtuvieron de ratones. Un ejemplo de línea celular de mieloma obtenida de humanos y útiles en los métodos de la invención es la línea celular U266 (ATCC CRL-TIB-196). La línea celular de mieloma C463A es también útil en los métodos de la invención y es un ejemplos de una línea celular derivada de SP2/0 capaz de crecer en medios químicamente definidos. Aquellos expertos en la técnica reconocerán otras líneas celulares de mieloma.

En otra realización del método de la invención la célula eucariótica se selecciona del grupo consistente en células SP2/0, C463A, y CHO. Cada uno de estos tipos celulares tiene las propiedades comunes de ser adecuados para cultivo in vitro y tienen la habilidad de expresar cadenas peptídicas a altos niveles.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar la célula eucariótica con un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena peptídica que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10; y expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer y segundo ácido nucleico. La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácido de la cadena peptídica OBF-1 de Homo sapiens. Una secuencia de acido nucleico ejemplar que codifica la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 8 se muestra en SEQ ID No. 7. La SEQ ID NO 10 es la secuencia de aminoácido de la cadena peptídica OBF-1 de Mus musculus. Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 10 se muestra en SEQ ID NO: 9.

En una realización del método de la invención los primeros cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.

En otra realización del método de la invención, el gen receptivo a OCT-2 puede ser un gen de anticuerpo, tal como un gen de cadena pesada o ligera.

En otra realización del método de la invención la célula eucariótica es una célula de mieloma.

En otra realización del método de la invención la célula eucariótica se selecciona del grupo consistente en célula SP2/0, C463A y CHO.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de de incremento de expresión de un gen de anticuerpo receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen de anticuerpo receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6; y expresar la primera cadena peptídica codificada por el primer ácido nucleico en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen de anticuerpo receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer ácido nucleico.

En una realización del método de la invención la célula eucariótica se selecciona del grupo consistente en célula SP2/0, C463A y CHO.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de de incremento de expresión de un gen de anticuerpo receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar la célula eucariótica con un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6; y expresar la primera cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen de anticuerpo receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de transcripción de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6; proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena peptídica que tiene la secuencia amino mostrada en SEQ ID NO: 10; y expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen de anticuerpo receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer y segundo ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de transcripción de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 4 ó 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; y expresar el primer péptido en la célula eucariótica por lo que la transcripción del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a laque no se se proporcionó con el primer ácido nucleico.

La transcripción de un gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control cuando el nivel o actividad de la transcripción de ARN codificada por el gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con la célula eucariótica de control. Los niveles de transcripción de ARN pueden medirse mediante cualquier medio conocido en la técnica tal como, por ejemplo RT-PCR y la técnica Northern Blot. Los niveles de actividad de la transcripción de ARN pueden medirse usando ensayos de actividad de ribozoma, ensayos de ARN silenciador, o ensayos de ARN antisentido específicos para la actividad de la transcripción de ARN, por ejemplo. Los niveles o actividad de la transcripción de ARN pueden expresarse numéricamente usando cualquier unidad apropiada y normalizada si es necesario. La normalización puede llevarse a cabo usando el nivel de una segunda cadena peptídica, el número de células en la muestra, o en base de tiempo transcurrido, por ejemplo.

Otro aspecto de la invención es un método in vitro de incremento de transcripción de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; proporcionar a la célula eucariótica on un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 4 ó 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-SerinaXaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica la segunda cadena peptídica que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 10; y expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la transcripción del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó con el primer ácido nucleico.

La presente invención se describe más con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son meramente para ilustrar aspectos de la presente invención y no pretenden ser limitaciones de esta invención.

Ejemplo 1

Aislamiento de cADN que Codifica Proteínas Variantes de OCT-2 de Homo sapiens

Dos cADNs que codifican proteínas de variante Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) y de

variante Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 6) se aislaron y secuenciaron. El cADN (SEQ ID NO: 3) que codifica la proteína variante Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) y el cADN que codifica la proteína variante Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 6) se aislaron usando técnicas estándares de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una biblioteca de cADN de Homo sapiens (Stratagene Inc., La Jolla, CA).

Las secuencia de ácido nucleico del cebador delantero y cebador trasero usados en la amplificación PCR de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 que codifica estas variantes de proteínas OCT-2 de Homo sapiens se muestran en la SEQ ID NO: 11 (cebador delantero) y SEQ ID NO: 12 (cebador trasero). Estos cebadores se diseñaron usando la secuencia de ácido nucleico descrita en el Registro M36653. El Registro M36653 contiene dos marcos de lectura abiertos, designados CDS 1 y CDS 2, y codifica una proteína OCT-2 de Homo sapiens. Se pronostica que CDS 1 codificará esta proteína OCT-2 de Homo sapiens. El cebador delantero (SEQ ID NO: 11) y trasero (SEQ ID NO: 12) son específicos para la región 5’ no trasladada (UTRs) que flanquea CDS 1 en el Registro M36653 y una secuencia localizada 3’ a CDS 1 de la secuencia de ácido nucleico descrita en el Registro M36653. PCR que usa estos cebadores amplifica cualquier secuencia de ácido nucleico de la biblioteca localizada entre los sitios de enlace de estos dos cebadores. Los fragmentos amplificados de ADN que resultan de PCR usando estos cebadores se aislaron, clonaron en el vector de expresión pCDNA3.1 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), y secuenciaron usando técnicas estándares de biología molecular.

La secuenciación, translaciones conceptuales, y múltiples análisis de alineación secuencial (Fig. 2) revelaron que se aislaron dos únicas secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens y la proteína de Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens. Este análisis mostró que estos dos clones codificados codificaron proteínas variantes OCT-2 de Homo sapiens que son diferentes a la proteína OCT-2 de Homo sapiens arquetipal de tipo salvaje (SEQ ID NO: 11) descrita por Accesión NP_002689 y se pronosticó que CDS 1 (SEQ ID NO: 13) de Accesión M36653 codificará la proteína OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 14). Como se ve en las múltiples alineaciones de secuencias de proteína de la Fig. 2, la secuencia de proteína de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) y secuencia de proteína de Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 6) carecen de doce residuos de aminoácidos de carboxi-terminal (SEQ ID NO: 19) encontrados en la secuencia de proteína OCT-2 de Homo sapiens arquetipal de tipo salvaje descrita por el Registro NP_002689 (SEQ ID NO: 2). Además, como se ve en las múltiples alineaciones de secuencia de proteína de la Fig. 2 la secuencia de proteína de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) y la secuencia de proteína de Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 6) carecen de 11 residuos de aminoácidos encontrados en la posición 166 a 181 de la proteína OCT-2 de Homo sapiens que se pronostica que CDS 1 de Accesión M36653 (SEQ ID NO: 14) codificará. Por último, las múltiples alineaciones de secuencia de proteína (Fig. 2) también revelaron que la secuencia de proteína de Clon #19 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 6) tiene un residuo de aminoácido de serina (S) en la posición 116, en lugar del residuo de prolina (P) encontrado en la posición 116 en OCT-2 de Homo sapiens arquetipo de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2), secuencias de proteína de Clon #38 (SEQ ID NO: 4), y se pronosticó que CDS 1 de Accesión M36653 (SEQ ID NO: 14) codificará la proteína OCT-2 de Homo sapiens. Se realizaron múltiples análisis de alineación secuencial usando el algoritmo CLUSTALW y la configuración estándar de CLUSTALW. Estos resultados demuestran que dos nuevas variantes de proteína OCT-2 de Homo sapiens se han aislado e identificado.

Ejemplo 2

Sobreexpresión de Proteína Variante OCT-2 y OBF-1 Aumenta los Niveles de Transcripción y Expresión Genética de Anticuerpos

La sobreexpresión estable de proteína variante sola de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4), y en combinación con sobreexpresión de OBF-1 de Mus musculus (SEQ ID NO. 10) aumentó los niveles de transcripción y expresión genética de cadena pesada y ligera de anticuerpos recombinantes (Fig. 4) en células C463A.

Las células de control C463A para este experimento se co-transfectaron establemente usando métodos estándares, con un vector de expresión de cadena pesada y un vector de expresión de cadena ligera. Las células transfectadas OCT-2 se co-transfectaron establemente con el vector de expresión de cadena pesada, el vector de expresión de cadena ligera, y un vector pcDNA3.1 / hOCT-2 que codifica el Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4). Las células transfectadas OCT-2 y OBF-1 se co-transfectaron establemente con el vector de expresión de cadena pesada, el vector de expresión de cadena ligera, pcDNA3.1 / hOCT-2 y el vector pcDNA3.1 / hOBF-1 que codifica OBF-1 de Mus musculus (SEQ ID NO: 10).

Las células C463A se derivaron de células de mieloma SP2/0 de Mus musculus y se adaptaron para crecimiento en medio de cultivo químicamente definido. Los vectores de expresión de cadena pesada y ligera codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo específico monoclonal totalmente humano, de necrosis tumoral factor-alfa (TNF-alfa). Un promotor de inmunoglobulina que lleva la expresión de la cadena pesada y ligera por el vector de expresión de cadena pesada y el vector de expresión de cadena ligera contiene un sitio medio de enlace con ADN de OCT-2 octamérico por consenso (5’-TNATTTGCAT-3’; SEQ ID NO: 15). Este sitio ADN de OCT2 hace que la transcripción genética de cadena pesada y ligera del vector de expresión de cadena pesada y el vector de expresión de cadena ligera sean receptiva a la actividad de OCT-2. El vector de expresión de cadena pesada, el vector de expresión de cadena ligera, los vectores pcDNA3.1 / hOCT-2 y pcDNA3.1 / hOBF-1 expresan constitutivamente las varias proteínas que codifican.

5 Las transfecciones se realizaron mediante electroporación de aproximadamente 1x107 C463A células usando métodos estándares. Las células C4653A de control se transfectaron establemente con 4 μg de vector de expresión de cadena ligera, y 2 μg de pcDNA3.1. Las células C463 OCT-2 se transfectaron establemente con 4 μg de vector de expresión de cadena pesada, 4 μg de vector de expresión de cadena ligera, y 2 μg de pcDNA3.1/hOCT-2. Las células C463 OCT-2 se transfectaron establemente con 4 μg de vector de expresión de

10 cadena pesada, 4 μg de vector de expresión de cadena ligera, 2 μg de pcDNA3.1./hOCT-2 y 2 μg de pcDNA3.1./mOBF-1. Se usaron MHX (ácido micofenólico, hipoxantina y xantina) y métodos estándares para seleccionar células establemente transfectadas con el vector de expresión de cadena pesada y el vector de expresión de cadena ligera. Se usaron G418 y métodos estándares para seleccionar células establemente transfectadas con células pcDNA3.1./hOCT-2 y pcDNA3.1./mOBF-1. Después se realizaron ensayos ELISA usando

15 métodos estándares para identificar clones con la expresión más alta del anticuerpo específico monoclonal totalmente humano, de necrosis tumoral factor-alfa (TNF-alfa) codificadr por el vector de expresión de cadena pesada y el vector de expresión de cadena ligera (Fig. 4).

La expresión estable de la proteína variante sola de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens aumentó los niveles

20 de transcripción y expresión genética de anticuerpo recombinante en relación con células de control (Fig. 3 y Fig. 4). La co-expresión adecuada de la proteína variante de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) y la proteína OBF-1 de Mus musculus (SEQ ID NO: 10) aumentó además la expresión de anticuerpo recombinante en relación con células de control y células que expresaban la proteína variante sola de Clon #38 OCT-2 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 4) ((Fig. 3 y Fig. 4). Estos resultados en conjunto indican que la proteína variante de Clon #38

25 OCT-2 de Homo sapiens es biológicamente activa, capaz de enlazarse con sitios de enlace de ADN de OCT-2 para mejorar la activación genética y es capaz de interactuar con la proteína OBF-1 de Mus musculus para activar la expresión genética receptiva a OCT-2.

LISTADO SECUENCIAL

<110> CENTOCOR, INC

<120> CADENAS PEPTÍDICAS VARIANTES HUMANAS DE OCT-2, ÁCIDOS NUCLEICOS Y MÉTODOS

35 <130> CEN5136 PCT

<140> A ASIGNAR

<141>

<150> 60/801.127 40 <151>

<160> 19

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

45 <210> 1

<211> 1389

<212> ADN

<213> Homo sapiens

50 <400> 1

<210> 3

<211> 1353

<212> ADN 55 <213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 5

<211> 1353

<212> ADN

<213> Homo sapiens 35

<400> 5

<210> 7

<211> 768

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 9 60 <211> 768

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9 65

<211> 17

<212> ADN 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador delantero para clonar ácidos nucleicos que codifican cadenas peptídicas de variante humana de

OCT-2 25

<400> 11

ggcagcatgg ttcactc 17

30 <210> 12

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Cebador trasero para clonar ácidos nucleicos que codifican cadenas peptídicas de variante humana de OCT2

<400> 12

40 gtgcacccac ttaccc

<210> 13 45 <211> 1401

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13 50

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> inseguro

<222> (2)

<223> Secuencia de ADN “octómero” de consenso enlazada por cadenas peptídicas de OCT-2. N es cualquier ácido nucleico.

25 <400> 15

tnatttgcat

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 35 <223> Cinco residuos de carboxi-terminal de cadena peptídica variante de OCT-2

<400> 16

<210> 17

<211> 5

<212> PRT 45 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cinco residuos de carboxi-terminal de cadena peptídica variante de OCT-2

<400> 17

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> inseguro

<222> (4)

<223> Cinco residuos de carboxi-terminal de cadena peptídica variante de OCT-2 donde Xaa puede ser cualuqaiera 65 de los veinte aminoácidos que ocurren de manera natural

<400> 18

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> Veinte residuos de carboxi-terminal de cadena peptídica de Homo sapiens tipo salvaje/OCT-arquetipo

<400> 19 15

60 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena peptídica que comprende una secuencia de aminoácido, donde el ácido nucleico codifica una cadena peptídica que tiene:

(i)

la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4; o

(ii)

la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.
2. Una cadena peptídica aislada que comprende una secuencia de aminoácido, donde la cadena peptídica tiene:

(i)

la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4; o

(ii)

la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.
3.

Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 1.
4.

Un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de:

a) proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; b) proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-SerinaXaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; y c) expresar la primera cadena peptídica codificada por el primer ácido nucleico en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer ácido nucleico.
5.

Un método in vitro de incremento de expresión de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de:

a) proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; b) proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-SerinaXaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; c) proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena peptídica que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10; y d) expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la expresión del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer y segundo ácido nucleico.
6.

El método in vitro de la reivindicación 4 ó 5 donde los primeros cinco residuos de aminoácido en la carboxiterminal de la primera cadena peptídica tienen la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.
7.

El método in vitro de la reivindicación 4, 5 ó 6 donde la primera cadena peptídica tiene:

(i)

la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 4; o

(ii)

la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 6.
8.

El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7 donde la célula eucariótica es:

(i)

una célula de mieloma.

(ii)

seleccionada del grupo consistente en células SP2/0, C463A y CHO.
9.

El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8 donde el gen receptivo a OCT-2 es un gen de anticuerpo.
10.

Un método in vitro de incremento de transcripción de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2;

(b)

proporcionar a la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 4 ó 6, donde los cinco residuos de

5

aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; y (c) expresar la primera cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la transcripción del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer ácido nucleico.

10 15 20 25

11. Un método in vitro de incremento de transcripción de un gen receptivo a OCT-2 por una célula eucariótica que comprende las etapas de: (a) proporcionar una célula eucariótica que comprende un gen receptivo a OCT-2; (b) proporcionara la célula eucariótica un primer ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una primera cadena peptídica que tiene una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácido 1 a 447 de SEQ ID NO: 4 ó 6, donde los cinco residuos de aminoácido en la carboxi-terminal de la primera cadena peptídica comprenden la secuencia de aminoácido Asparagina-Prolina-Serina-Xaa-Glicina (SEQ ID NO: 18) donde Xaa es cualquier L-aminoácido; (c) proporcionar a la célula eucariótica un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena peptídica que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO. 10; y (d) expresar la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica en la célula eucariótica por lo que la transcripción del gen receptivo a OCT-2 aumenta en relación con una célula eucariótica de control a la que no se le proporcionó el primer y segundo ácido nucleico. 12. El método en vitro de la reivindicación 10 u 11 donde la célula eucariótica se selecciona del grupo consistente en SP2/0, C463A y CHO. 13. El método in vitro de la reivindicación 12 donde la célula eucariótica es C463A.

30

35

40

45

50

55