ES2605677T3 - Glucosiltransferasa de hámster chino y métodos relacionados - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que produce estructuras de Gal-alfa-Gal, en la que la molécula de ácido nucleico aislada está seleccionado del grupo que consiste en: (i) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con (a) una molécula de ADN que tiene una secuencia que codifica la secuencia de restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7 o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a); y (ii) una molécula de ácido nucleico aislada que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, o un complemento de la misma.

Description

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DESCRIPCIÓN

Glucosiltransferasa de hámster chino y métodos relacionados

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El glucano de galactosa-α1,3-galactosa terminal (denominado en el presente documento Gal-α-Gal) puede ser una modificación funcionalmente relevante a las proteínas N-glucosiladas dado su potencial inmunogénico en seres humanos cuando se presenta en terapéuticos biológicos heterólogamente derivados. La presencia de este epítope de hidrato de carbono sobre proteínas endógenas parece ser altamente específico de especie, por ejemplo, detectado en cerdo, ratón y rata, pero ausente en primates. Así, el epítope puede estar presente en biológicos recombinantes producidos en sistemas de expresión celular derivados de ciertos organismos (por ejemplo, células NS0 o SP/2 de ratón, cerdos transgénicos). El anticuerpo monoclonal cetuximab (Erbitux®) es un ejemplo tal de un producto farmacéutico de proteína comercial producido en una línea celular derivada de ratón y que también se ha informado que contiene el epítope de hidrato de carbono Gal-α-Gal (Chung et al. (2008) N Engl J Med 358:11091117). La biosíntesis enzimática del glucano de Gal-α1,3-Gal se ha atribuido a 1,3-glucosiltransferasa-1 (denominado en el presente documento Ggta1) (Taylor et al. (2003) Glycobiology 13:327-337; Smith et al. (1990) J Biol Chem 265:6225-6234).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de secuencias de genes de α-1,3-glucosiltransferasa1 (Ggat1) en tanto el hámster chino (Cricetulus griseus) del que se derivan las células CHO como en una línea celular CHO usada para la producción de proteínas recombinantes. Por consiguiente, la invención se refiere a composiciones de ácido nucleico y de polipéptido relacionadas con los genes descubiertos, y vectores y células relacionados (por ejemplo, células CHO genéticamente manipuladas para reducir, eliminar o aumentar la actividad de Ggta1 y vectores útiles para producir tales células). Además, la invención se refiere al uso de las secuencias identificadas en diversos métodos, por ejemplo, métodos de detección de actividad de Ggta1 en células CHO (incluyendo la actividad transcripcional y/o actividad enzimática de Ggta1), por ejemplo, para cribar células CHO para la capacidad para producir estructuras de Gal-α-Gal, o para identificar y cuantificar la expresión de Ggta1 o actividad en una célula CHO, por ejemplo, una célula usada para la producción de una glucoproteína terapéutica.

Las secuencias de Ggta1 desveladas en el presente documento se enumeran en la Tabla 1:

Tabla 1

FUENTE (NOMBRE)

TIPO DE SECUENCIA SEQ ID NO

Tejido de ovario de hámster chino (Ggta1-a)

ADN; secuencia codificante de longitud completa (Figura 3) SEQ ID NO: 1

Tejido de ovario de hámster chino (Ggta1-a)

polipéptido; secuencia codificante de longitud completa traducida (Figura 3) SEQ ID NO: 2

Tejido del bazo de hámster chino (Ggta1-b)

ADN; secuencia codificante de longitud completa (Figura 4) SEQ ID NO: 3

Tejido del bazo de hámster chino (Ggta1-b)

polipéptido; secuencia codificante de longitud completa traducida (Figura 4) SEQ ID NO: 4

Línea celular de ovario de hámster chino (CHO) (Ggta1-c)

ADN; secuencia de ADN genómico correspondiente a los exones 8 y 9 e intrón intermedio (Figura 5) SEQ ID NO: 5

Línea celular de ovario de hámster chino (CHO) (Ggta1-c)

ADN; secuencia codificante de los exones 8 y 9 (Figura 6) SEQ ID NO: 6

Línea celular de ovario de hámster chino (CHO) (Ggta1-c)

polipéptido; secuencia traducida de los exones 8 y 9 (Figura 6) SEQ ID NO: 7

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada; una construcción de ácido nucleico; una célula huésped aislada; un método de modulación de la estructura de glucano de una glucoproteína terapéutica recombinante producida en una célula CHO; un polipéptido aislado; un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo; un método de detección de la expresión o actividad de Ggta1 en una población de células CHO; una matriz bidimensional; y un método de análisis de una muestra de una célula CHO usando la matriz bidimensional; cada uno como se define en las reivindicaciones adjuntas.

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introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias (por ejemplo, los huecos pueden introducirse en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y pueden ignorarse secuencias no homólogas para fines de comparación). El alineamiento para fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencias puede lograrse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible tal como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. En una realización, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es al menos el 30 %, por ejemplo, al menos el 40 %, por ejemplo, al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

Un "elemento de secuencia característico", como el término se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de aminoácidos cuya identidad y posiciones relativas la una con respecto a la otra confieren a un polipéptido particular una o más actividades o características de interés. En algunas realizaciones, un elemento de secuencia característico es uno que es único para el polipéptido particular porque no se encuentra en polipéptidos conocidos que carecen de la actividad o característica. En algunas realizaciones, un elemento de secuencia característico comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, algunos o todos de los aminoácidos que participan en un elemento de secuencia característico son contiguos entre sí; en algunas realizaciones, ciertos residuos dentro de un elemento de secuencia característico pueden estar separados de uno o varios de otros residuos en orden lineal. En algunas realizaciones, un elemento de secuencia característico comprende residuos que están localizados cerca entre sí en el espacio tridimensional cuando se pliega una cadena de polipéptidos.

Una "preparación de células", como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de células in vitro. En el caso de células de organismos multicelulares (por ejemplo, plantas y animales), una preparación de células purificada es un subconjunto de células obtenido del organismo, no el organismo intacto entero. En el caso de microorganismos unicelulares (por ejemplo, células cultivadas y células microbianas), consiste en una preparación de al menos el 10 % y más preferentemente del 50 % de células del sujeto.

Diversos aspectos y realizaciones de la presente divulgación se describen en más detalle a continuación.

Moléculas de ácidos nucleicos de Ggta1

En un aspecto, la divulgación proporciona moléculas de ácidos nucleicos de Ggta1 aisladas o purificadas como se describe en el presente documento. Una molécula de ácido nucleico proporcionada puede codificar el polipéptido Ggta1 descrito en el presente documento, por ejemplo, una proteína Ggta1 de longitud completa o un fragmento activo de la misma (por ejemplo, un fragmento catalíticamente activo de la misma). También están incluidas moléculas de ácidos nucleicos de Ggta1 o fragmentos de las mismas que pueden no codificar una proteína funcional, pero pueden usarse, por ejemplo, para construir un vector para dirigir un gen Ggta1 endógeno de hámster chino o de células CHO, por ejemplo, para silenciar o modificar la secuencia de un gen Ggta1 endógeno.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos de Ggta1 proporcionadas se derivan de hámster chino o de células CHO. En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos de Ggta1 proporcionadas tienen una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la de una molécula de ácido nucleico de Ggta1 derivada de hámster chino o de células CHO. En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos de Ggta1 proporcionadas codifican un polipéptido Ggta1 que se deriva de hámster chino o de células CHO.

En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 6, o una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico incluye secuencia codificante solo. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico incluye secuencia no codificante, tal como secuencias no traducidas de 5' o secuencia de intrón. Están incluidas tanto secuencias sentido como antisentido.

También están incluidos oligonucleótidos o fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos que son adecuados para su uso como sondas, marcas o cebadores, por ejemplo, para detectar y/o cuantificar la expresión de Ggta1. Tales oligonucleótidos o fragmentos pueden tener al menos aproximadamente el 10, 12 o 15, aproximadamente 20 o 25, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 75 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 6. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos tienen menos de aproximadamente 500, 400, 300, 200, 150, 120 o 100 nucleótidos de longitud. En una realización, una sonda o cebador se une a un soporte sólido, por ejemplo, un soporte sólido descrito en el presente documento. En otra realización se proporciona un conjunto de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para su uso en una reacción de PCR, que pueden usarse para amplificar una región seleccionada de una secuencia de Ggta1, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita en el presente documento. Los cebadores pueden tener al menos 5, 10 o 50 pares de bases de longitud y menos de 100,

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o menos de 200, pares de bases en longitud. Los cebadores deben ser idénticos, o diferenciarse por una base de una secuencia desvelada en el presente documento o de una variante que existe de forma natural. Por ejemplo, cebadores adecuados para amplificar toda o una porción de una secuencia de Ggta1 descrita en el presente documento se desvelan en la Tabla 2 y la Tabla 4. En una realización, un kit de cebadores incluye un cebador directo que se hibrida con una hebra codificante y un cebador inverso que se hibrida con la hebra no codificante de SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 6.

Pueden marcarse los oligonucleótidos del ácido nucleico, por ejemplo, sondas, marcas o cebadores descritos en el presente documento. Normalmente, tales marcas son quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivas o colorimétricas.

Un ácido nucleico de la divulgación puede producirse recombinantemente, o producirse sintéticamente.

Variantes de ácidos nucleicos de Ggta1:

La divulgación engloba moléculas de ácidos nucleicos que se diferencian de las secuencias de nucleótidos desveladas en el presente documento como SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 6. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación puede tener una secuencia relacionada con SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 6, o con una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos, por ejemplo, relacionada por un nivel especificado de identidad de secuencias o capacidad para hibridarse en condiciones de alta rigurosidad. Un ácido nucleico de la divulgación puede tener una secuencia que existe de forma natural (por ejemplo, la secuencia de una variante alélica o mutante que existe de forma natural), o puede tener una secuencia que no existe de forma natural. En una realización, las diferencias pueden ser debidas, por ejemplo, a la degeneración del código genético (y producen un ácido nucleico que codifica las mismas proteínas Ggta1 que aquellas codificadas por la secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento). Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden elegirse para tener codones que son preferidos, o no preferidos, para un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que al menos un codón, por ejemplo, al menos el 10 %, o el 20 % de los codones, ha sido alterado de forma que la secuencia se optimice para la expresión en un sistema particular, por ejemplo, células de E. coli, de levadura, humanas, de insecto, o CHO.

Las variantes de ácido nucleico pueden existir de forma natural, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus), o pueden no existir de forma natural. Las variantes que no existen de forma natural pueden prepararse por técnicas de mutagénesis, que incluyen aquellas aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. Puede producirse variación en cualquiera o ambas de las regiones codificantes y no codificantes. Las variaciones pueden producir tanto sustituciones de aminoácidos conservativas como no conservativas (como se compara en el producto codificado). Se conocen en la técnica técnicas de modificación y mutagénesis de ácidos nucleicos.

Variantes alélicas de Ggta1, por ejemplo, Ggta1 de CHO, incluyen tanto proteínas funcionales como no funcionales. Variantes alélicas funcionales son secuencias de nucleótidos que existen de forma natural que codifican variantes de la proteína Ggta1 que mantienen la capacidad para proporcionar la función enzimática. Las variantes alélicas funcionales normalmente contendrán la sustitución conservativa de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 o 7,

o sustitución, deleción o inserción de restos no críticos en regiones de la proteína no críticas. Variantes alélicas no funcionales son variantes de secuencias de nucleótidos que existen de forma natural que codifican un polipéptido Ggta1 que no preserva la función enzimática. Las variantes alélicas no funcionales normalmente contendrán una sustitución no conservativa, una deleción, o inserción, o truncación prematura de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 o 7, o una sustitución, inserción, o deleción en restos críticos o regiones críticas de la proteína.

Moléculas antisentido de Ggta1:

También se desvelan moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido para una Ggta1 de hámster chino o de células CHO descrita en el presente documento. Las clases principales de agentes antisentido son oligonucleótidos antisentido (ODNs), ribozimas, ADNzimas e interferencia por ARN (iARN). Tales moléculas pueden usarse en métodos para inhibir la actividad de Ggta1, por ejemplo, en células CHO. Un ácido nucleico "antisentido" tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico diana. Un ácido nucleico antisentido puede diseñarse de forma que sea complementario a la región codificante entera de un ARNm de Ggta1, pero más preferentemente es un oligonucleótido que es antisentido a solo una porción de la región codificante o no codificante de un ARNm de Ggta1. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de Ggta1, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana de interés. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más nucleótidos de longitud. Una molécula antisentido inhibirá la producción de Ggta1 descrita en el presente documento

Un ácido nucleico antisentido de la divulgación puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que existen de forma natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o

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para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. El ácido nucleico antisentido también puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que un ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido. Las moléculas de ácidos nucleicos antisentido pueden administrarse a células usando vectores descritos en el presente documento. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, las construcciones de vector en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca pueden estar bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte.

Se conocen en la técnica métodos de preparación y uso de las moléculas antisentido para modular actividades biológicas, véanse, por ejemplo: Pan and Clawson, Antisense applications for biological control (2006) J. Cell Biochem. 98(1):14-35; Sioud and Iversen, Ribozymes, DNAzymes and small interfering RNAs as therapeutics (2005) Curr Drug Targets 6(6):647-53; Bhindi et al., Brothers in arms: DNA enzymes, short interfering RNA, and the emerging wave of small-molecule nucleic acid-based gene-silencing strategies (2007) Am J Pathol. 171(4):1079-88.

Polipéptidos Ggta1

En otro aspecto, la divulgación presenta polipéptidos Ggta1 aislados o proteínas (o fragmentos biológicamente activos de los mismos) como se describen en el presente documento. Normalmente, un fragmento biológicamente activo de una proteína Ggta1 tiene una o más de las siguientes características: tiene la capacidad de catalizar la síntesis de un glucano Gal-α1,3-Gal; utiliza UDP-Gal para transferir un resto de galactosa sobre un glucano enlazado en N existente que contiene Gal para generar una estructura de Gal-α-Gal y UDP; utiliza UDP-Gal para transferir un resto de galactosa sobre un glucano enlazado en O existente que contiene Gal para generar una estructura de Gal-α-Gal y UDP; utiliza UDP-Gal para transferir un resto de galactosa sobre un glucolípido existente que contiene Gal para generar una estructura de Gal-α-Gal y UDP; se une a UDP-Gal y un glucano que termina en galactosa; se une a estructuras que contienen Gal-α-Gal; hidroliza UDP-Gal a Gal; está confinado en el compartimento de Golgi si se transfecta y se expresa en una célula eucariota; se une a un anticuerpo anti-Ggta1 específico de hámster chino o de células CHO; puede utilizar análogos de UDP-Gal químicamente modificados (por ejemplo, tioazúcar, trinitrofenilo, 2-desoxi, 2-azido, radioquímicamente marcados tales como 3H, C14,33P, 32P) para transferir un resto de galactosa sobre un glucano enlazado en N u O existente.

Los polipéptidos o proteínas Ggta1 (o fragmentos de los mismos) pueden aislarse de células o fuentes de tejido usando técnicas de purificación de proteínas estándar. En algunas realizaciones, los polipéptidos o proteínas Ggta1 se aíslan de hámster chino o de células CHO. Los polipéptidos o proteínas Ggta1 (o fragmentos de los mismos) pueden producirse por técnicas de ADN recombinante o sintetizarse químicamente.

Los polipéptidos de la divulgación incluyen aquellos que surgen como resultado de la existencia de múltiples genes, eventos de transcripción alternativos, eventos de corte y empalme de ARN alternativos, y eventos traduccionales y post-traduccionales alternativos. El polipéptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, células cultivadas, que producen sustancialmente las mismas modificaciones post-traduccionales presentes cuando el polipéptido se expresa en una célula nativa, o en sistemas que producen la alteración u omisión de modificaciones posttraduccionales, por ejemplo, glucosilación o escisión, presentes cuando se expresa en una célula nativa.

En algunas realizaciones, un polipéptido Ggta1 de la divulgación tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, 4 o 7 o un fragmento funcional de la misma. Otras realizaciones incluyen una proteína que contiene al menos un resto de aminoácido diferente de SEQ ID NO: 2, 4 o 7, pero no más del 10 %. Las diferencias pueden ser en restos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. En algunas realizaciones, las diferencias son sustituciones conservativas o diferencias o cambios en un resto no esencial. También están incluidas secuencias de polipéptidos que están altamente relacionadas con SEQ ID NO: 2, 4 o 7 por un porcentaje de identidad de secuencias especificado.

La divulgación incluye proteínas quiméricas o de fusión de Ggta1. Como se usa en el presente documento, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de Ggta1 incluye un polipéptido Ggta1 asociado a un polipéptido no Ggta1. El polipéptido no Ggta1 puede fusionarse con el extremo N o extremo C del polipéptido Ggta1, o puede fusionarse internamente. En un ejemplo, la proteína de fusión puede incluir un resto que tiene una alta afinidad por un ligando. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-Ggta1 en la que las secuencias de Ggta1 están fusionadas con el extremo C de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de Ggta1 recombinante. Están comercialmente disponibles vectores de expresión que codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica Ggta1 puede clonarse en un vector de expresión tal de forma que el resto de fusión se enlace en marco a la proteína Ggta1.

Alternativamente, la proteína de fusión puede ser una proteína Ggta1 que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de Ggta1 pueden aumentarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

Las proteínas de fusión pueden incluir toda o una parte de una proteína del suero, por ejemplo, una región constante de IgG, o albúmina de suero humano.

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Vectores de expresión recombinantes

En otro aspecto, la divulgación incluye vectores (por ejemplo, vectores de expresión, vectores inactivados, o vectores que conducen secuencias antisentido) que contienen un ácido nucleico descrito en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el que se ha enlazado y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede ser capaz de replicación autónoma o puede integrarse en un ADN de huésped.

Un vector puede incluir un ácido nucleico de Ggta1 de hámster chino o de células CHO en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Preferentemente, el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras operativamente enlazadas a la secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, además de secuencias reguladoras y/o inducibles específicas de tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada, y similares. Los vectores de expresión desvelados en el presente documento pueden introducirse en células huésped para así producir proteínas

o polipéptidos, que incluyen proteínas o polipéptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento (por ejemplo, proteínas Ggta1, formas mutantes de proteínas Ggta1, proteínas de fusión, y similares).

Los vectores de expresión recombinantes de la divulgación pueden diseñarse para la expresión de polipéptidos Ggta1 en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los polipéptidos de la divulgación pueden expresarse en E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero, preferentemente células CHO. Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión pueden proporcionarse por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 simio.

La expresión de proteínas en procariotas es casi siempre llevada a cabo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de tanto proteínas de fusión como no de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en ellos, normalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión normalmente cumplen tres fines: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando de ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, un sitio de escisión proteolítica se introduce en la intersección del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Masa.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante diana. Pueden usarse proteínas de fusión purificadas en ensayos de actividad de Ggta1 (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos), o para generar anticuerpos específicos para proteínas Ggta1.

En otra realización, un promotor es un promotor inducible, por ejemplo, un promotor regulado por una hormona esteroidea, por una hormona polipeptídica (por ejemplo, por medio de una vía de transducción de señales), o por un polipéptido heterólogo (por ejemplo, los sistemas inducibles por tetraciclina, "Tet-On" y "Tet-Off" de Clontech Inc., CA.

La divulgación proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la divulgación clonado en el vector de expresión en una orientación antisentido. Pueden elegirse secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores y/o potenciadores virales) operativamente enlazadas a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo de célula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un vector que contiene una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de Ggta1 de hámster chino o de células CHO descrita en el presente documento, configurada para permitir que se recombine homólogamente en un sitio específico de un genoma de la célula huésped, por ejemplo, configurada para modificar, alterar o inactivar un gen Ggta1 endógeno en la célula huésped.

Puede introducirse ADN de vector en células huésped mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, que incluye co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación.

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pluralidad tiene una sonda de captura única, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos o de polipéptidos o anticuerpo descrita en el presente documento. Al menos una dirección de la pluralidad tiene una sonda de captura que reconoce una molécula de Ggta1 de hámster chino o de células CHO descrita en el presente documento (por ejemplo, una molécula de Ggta-1, Ggta1-b o Ggta1-c descrita en el presente documento). En una realización, la sonda de captura es un ácido nucleico, por ejemplo, una sonda complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos de Ggta1. En otra realización, la sonda de captura es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico para un polipéptido Ggta1 descrito en el presente documento. También se presenta un método de análisis de una muestra (por ejemplo, una muestra de una célula CHO) poniendo en contacto la muestra con la matriz anteriormente mencionada y detectando la unión de la muestra a la matriz.

La matriz puede tener una densidad de al menos 10, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000 o 10.000 o más direcciones/cm2, e intervalos intermedios. En una realización preferida, la pluralidad de direcciones incluye al menos 10, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000 direcciones. En una realización preferida, la pluralidad de direcciones incluye igual a o menos de 10, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o 50.000 direcciones. El sustrato puede ser un sustrato bidimensional tal como un portaobjetos de vidrio, una oblea (por ejemplo, sílice o plástico), una placa de espectroscopía de masas, o un sustrato tridimensional tal como una almohadilla de gel. Pueden disponerse direcciones, además de la dirección de la pluralidad, sobre la matriz.

Una matriz puede generarse por diversos métodos, por ejemplo, por métodos fotolitográficos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.º 5.143.854; 5.510.270; y 5.527.681), métodos mecánicos (por ejemplo, métodos de flujo dirigido como se describen en la patente de EE.UU. N.º 5.384.261), métodos basados en aguja (por ejemplo, como se describen en la patente de EE.UU. N.º 5.288.514) y técnicas basadas en perlas (por ejemplo, como se describen en PCT US/93/04145).

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de análisis de la expresión de Ggta1. El método incluye proporcionar una matriz como se ha descrito anteriormente; poner en contacto la matriz con una muestra y detectar la unión de una molécula de Ggta1 (por ejemplo, ácido nucleico o polipéptido) a la matriz. En una realización preferida, la matriz es una matriz de ácido nucleico. Opcionalmente, el método incluye además amplificar ácido nucleico de la muestra antes o durante el contacto con la matriz.

En otra realización, la matriz puede usarse para ensayar la expresión génica en una población de células (por ejemplo, una población de células CHO), particularmente la expresión de Ggta1. Si se analiza un número suficiente de diversas muestras, puede usarse agrupamiento (por ejemplo, agrupamiento jerárquico, agrupamiento K-means, agrupamiento bayesiano y similares) para identificar otros genes que están co-regulados con Ggta1. Por ejemplo, la matriz puede usarse para la cuantificación de la expresión de múltiples genes. Así, no solo puede determinarse la especificidad por el tipo de célula, sino también el nivel de expresión de una batería de genes en el tejido. Pueden usarse datos cuantitativos para reunir (por ejemplo, agrupar) genes basándose en su expresión en tejido por ella misma y el nivel de expresión en ese tejido.

En un ejemplo, puede usarse el análisis de matrices de la expresión génica para evaluar el efecto de diferentes condiciones de cultivo celular sobre la expresión de Ggta1. Puede cultivarse una primera población de células bajo un primer conjunto de condiciones, y puede cultivarse una segunda población de células bajo un segundo conjunto de condiciones y el ácido nucleico de la pluralidad de poblaciones puede analizarse en una matriz tal. En este contexto, puede determinarse el efecto de las condiciones de cultivo sobre la respuesta biológica. Similarmente, pueden compararse células CHO que tienen diferentes contextos genéticos.

Métodos de modulación de la estructura de glucano de glucoproteínas

La divulgación presenta métodos de producción de una glucoproteína en células CHO, donde la glucoproteína tiene niveles alterados de estructuras de glucano de Gal-alfa-Gal, por ejemplo, con respecto a una glucoproteína en el estado de la técnica, por ejemplo, con respecto a una glucoproteína comercializada como una glucoproteína terapéutica. El método incluye cultivar las células huésped descritas en el presente documento (por ejemplo, las células huésped transfectadas con Ggta1 o silenciadas o inactivadas para Ggta1) en condiciones adecuadas para la expresión de la glucoproteína. La glucoproteína puede seleccionarse de aquellas descritas en la Tabla 5.

En una realización, se produce una glucoproteína que tiene niveles elevados de estructuras de glucano de Gal-alfa-Gal con respecto a una glucoproteína en el estado de la técnica que tiene la misma secuencia de polipéptidos o altamente similar (por ejemplo, al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de secuencia de polipéptidos idéntica). El método incluye cultivar una célula CHO huésped descrita en el presente documento que ha sido genéticamente manipulada para producir niveles elevados de Ggta1 de hámster chino o de células CHO con respecto a la célula parental (por ejemplo, una Ggta1 que expresa en exceso célula CHO), donde la célula huésped también contiene un transgén que codifica una glucoproteína terapéutica, y purificar la glucoproteína terapéutica a partir de las células cultivadas resultantes.

En otra realización, se produce una glucoproteína que tiene niveles reducidos de estructuras de glucano de Gal-alfa-Gal con respecto a una glucoproteína en el estado de la técnica que tiene la misma secuencia de polipéptidos o altamente similar (por ejemplo, al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de

secuencia de polipéptidos idéntica). El método incluye cultivar una célula huésped CHO descrita en el presente documento que ha sido genéticamente manipulada para producir niveles reducidos de Ggta1 de hámster chino o de células CHO con respecto a la célula parental (por ejemplo, una célula CHO inactivada o silenciada para Ggta1 descrita en el presente documento), donde la célula huésped contiene un transgén que codifica una glucoproteína terapéutica, y purificar la glucoproteína terapéutica a partir de las células cultivadas resultantes. Tales glucoproteínas así producidas pueden proporcionar versiones mejoradas de glucoproteínas terapéuticas comercializadas.

TABLA 5

Producto de proteína

Fármaco de referencia

interferón gamma-1b

Actimmune®

alteplasa; activador tisular del plasminógeno

Activase®/Cathflo®

factor antihemofílico recombinante

Advate

albúmina humana

Albutein®

laronidasa

Aldurazyme®

interferón alfa-N3, derivado de leucocitos humanos

Alferon N®

factor antihemofílico humano

Alphanate®

factor de coagulación IX humano filtrado de virus

AlphaNine® SD

Alefacept; recombinante, proteína de fusión LFA3-Ig dimérica

Amevive®

bivalirudina

Angiomax®

darbepoetina alfa

Aranesp™

bevacizumab

Avastin™

interferón beta-1a; recombinante

Avonex®

factor de coagulación IX

BeneFix™

Interferón beta-1b

Betaseron®

Tositumomab

Bexxar®

factor antihemofílico

Bioclate™

hormona de crecimiento humana

BioTropin™

toxina botulínica tipo A

Botox®

alemtuzumab

Campath®

acritumomab; marcada con tecnecio-99

CEA-Scan®

alglucerasa; forma modificada de beta-glucocerebrosidasa

Ceredase®

imiglucerasa

Cerezyme®

Fab inmune polivalente para crótalos, ovino

CroFab™

Fab inmune de digoxina, ovina

DigiFab™

rasburicasa

Elitek®

etanercept

Enbrel®

epoyetina alfa

Epogen®

cetuximab

Erbitux™

TABLA 5

Producto de proteína

Fármaco de referencia

algasidasa beta

Fabrazyme®

urofolitropina

Fertinex™

folitropina beta

Follistim™

teriparatida

Forteo®

somatropina humana

GenoTropin®

glucagón

GlucaGen®

folitropina alfa

Gonal-F®

factor antihemofílico

Helixate®

factor antihemofílico; factor XIII

Hemofil®

insulina

Humalog®

complejo de factor antihemofílico / factor de von Willebrand

Humate-P®

somatotropina

Humatrope®

adalimumab

HUMIRA™

insulina humana

Humulin®

hialuronidasa humana recombinante

Hylenex™

interferón alfacon-1

Infergen®

Eptifibatida

Integrilin™

alfa-interferón

Intron A®

palifermina

Kepivance

anakinra

Kineret™

factor antihemofílico

Kogenate®FS

insulina glargina

Lantus®

factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos

Leukine®/Leukine® Liquid

lutropina alfa, para inyección

Luveris

lipoproteína OspA

LYMErix™

ranibizumab

Lucentis®

gemtuzumab ozogamicina

Mylotarg™

galsulfasa

Naglazyme™

nesiritida

Natrecor®

pegfilgrastim

Neulasta™

oprelvekin

Neumega®

filgrastim

Neupogen®

fanolesomab

NeutroSpec™ (antiguamente LeuTech®)

TABLA 5

Producto de proteína

Fármaco de referencia

somatropina [ARNr]

Norditropin®/Norditropin Nordiflex®

insulina; suspensión de cinc;

Novolin L®

insulina; suspensión de isófana

Novolin N®

insulina, regular;

Novolin R®

insulina

Novolin®

factor de coagulación VIIa

NovoSeven®

somatropina

Nutropin®

inmunoglobulina intravenosa

Octagam®

PEG-L-asparaginasa

Oncaspar®

abatacept, proteína de fusión soluble completamente humana

Orencia™

muromomab-CD3

Orthoclone OKT3®

gonadotropina coriónica humana

Ovidrel®

peginterferón alfa-2a

Pegasys®

versión pegilada de interferón alfa-2b

PEG-Intron™

Abarelix; antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina

Plenaxis™

epoyetina alfa

Procrit®

aldesleucina

Proleukin, IL-2®

somatrem

Protropin®

dornasa alfa

Pulmozyme®

Efalizumab; bloqueante de linfocitos T reversible selectivo

Raptiva™

combinación de ribavirina e interferón alfa

Rebetron™

Interferón beta 1 a

Rebif®

factor antihemofílico

Recombinate®

rAHF/factor antihemofílico

ReFacto®

lepirudina

Refludan®

infliximab

Remicade®

abciximab

ReoPro™

reteplasa

Retavase™

rituximab

Rituxan™

interferón alfa-2a

Roferon-A®

somatropina

Saizen®

secretina porcina sintética

SecreFlo™

basiliximab

Simulect®

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TABLA 5

Producto de proteína

Fármaco de referencia

eculizumab

Soliris®

pegvisomant

Somavert®

Palivizumab; mAb humanizado recombinantemente producido

Synagis™

tirotropina alfa

Thyrogen®

tenecteplasa

TNKase™

natalizumab

Tysabri®

globulina intravenosa inmune humana

Venoglobulin-S®

interferón alfa-nl, linfoblastoide

Wellferon®

drotrecogina alfa

Xigris™

Omalizumab

Xolair®

daclizumab

Zenapax®

ibritumomab tiuxetan

Zevalin™

Somatotropina

Zorbtive™ (Serostim®)

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Clonación de ADNc de Ggta1 de tejidos de Cricetulus griseus y de células CHO

Se diseñaron conjuntos de cebadores de oligonucleótidos originales (véase, por ejemplo, la Tabla 2) basados en la homología con tanto la secuencia codificante de Ggta1 de rata como de ratón. Intentos repetidos iniciales por usar estos cebadores para amplificar por PCR al menos una secuencia de Ggta1 parcial de ADNc derivado de células CHO o ADN genómico (ADNg) fueron no satisfactorios. La presente divulgación, por tanto, engloba el reconocimiento de que enfoques de hibridación estándar pueden ser insuficientes para permitir la clonación de Ggta1 de CHO.

Específicamente, se usó un subconjunto de estos mismos conjuntos de cebadores para cribar cuatro conjuntos de ADNc específico de tejido derivados de hámster chino (en vez de una línea de células CHO): cerebro, bazo, riñón y ovario. Estos conjuntos de ADNc se derivaron de dos animales de sexo diferenciado separados (conjuntos de cerebro y bazo de ADNc de un hámster chino macho y conjunto de riñón y ovario de ADNc de un hámster chino hembra). Los conjuntos de ADNc se validaron por PCR como que eran específicos para hámster chino usando un conjunto de cebadores de oligonucleótidos complementarios a una secuencia de genes específica de CHO de control conocida. Los cuatro conjuntos de ADNc produjeron la amplificación de un producto específico de 1,1 kb (véase la Figura 1). Se confirmó por secuenciación de ADN que los productos de PCR se correspondían con el supuesto ortólogo de hámster chino de Ggta1 basado en homología de secuencias con las secuencias traducidas de Ggta1 de ratón y de rata (Figura 2).

La secuencia codificante de Ggta1 de ovario de hámster chino (denominada en el presente documento Ggta1-a) se muestra como SEQ ID NO: 1 y su secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 2 en la Figura 3. La secuencia codificante de la Ggta1 de bazo de hámster chino (denominada en el presente documento Ggta1-b) se muestra como SEQ ID NO: 3 y su secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 4 en la Figura 4. Como se ha descrito anteriormente, estas dos secuencias se derivaron de "donantes" de hámster chino separados (concretamente hembra y macho). Los dos clones parecen tener longitud completa e incluyen todos los exones predichos (4 a 9) basándose en una comparación con la estructura del exón del gen Ggta1 de ratón.

Las secuencias codificantes de Ggta1-a y Ggta1-b son más del 99 % idénticas entre sí, discrepando solo en 6 nucleótidos de la secuencia codificante de 1110 pb. Cinco de estas diferencias de nucleótidos son silenciosas; solo

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una produce un cambio de aminoácido conservativo (Ile69Val). Por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de Ggta1-a y Ggta1-b son más del 99,5 % idénticas.

Las secuencias de nucleótidos de Ggta1-a y Ggta1-b son el 79,4 y el 79,6 % idénticas, respectivamente, a la secuencia de rata; 87,2 % y 87,5 % idénticas, respectivamente, a la secuencia de ratón; 77,5 % y 77,7 % idénticas, respectivamente, a la secuencia de vaca, y 82,2 % y 82,3 % idénticas, respectivamente, a la secuencia de perro. A nivel de aminoácidos, las secuencias de Ggta1-a y Ggta1-b son el 81 % idénticas a la secuencia de rata; 86 % idénticas a la secuencia de ratón, 73 % idénticas a la secuencia de vaca, y 77 % idénticas a la secuencia de perro.

Las regiones más altamente conservadas son aquellas aparentemente requeridas para unión al ligando y la actividad catalítica, correspondientes a los restos de aminoácidos Iso-82 a Val-370 de SEQ ID NO: 2 o 4 (véase Biochimica et Biophysics Acta (2000) 1480:222-234). Véase la Figura 2. Al nivel de aminoácidos, las secuencias de Ggta1-a y Ggta1-b son el 91 % idénticas a la secuencia de rata; 90,3 % idénticas a la secuencia de ratón, el 83 % idénticas a la secuencia de vaca, y 79 % idénticas a la secuencia de perro con respecto a la región catalítica. Las regiones catalíticas de Ggta1-a y Ggta1-b son más del 95 % idénticas a la región catalítica de Ggta1-c.

Similar a los genes de las secuencias de ratón y de rata, también se observó corte y empalme alternativo del gen Ggta1 de hámster chino (datos no mostrados). En particular, parece que en al menos un clon, el exón 6 se escindió (correspondiente a Iso-40 a Gly-60 de SEQ ID NO: 2). Esta deleción fue perceptible por PCR, produciendo un fragmento de ADN más pequeño amplificado cuando se visualizó por electroforesis en gel de agarosa (obsérvese el doblete en la Figura 1, carriles 3-6).

Basándose en las secuencias de Ggta1 de hámster chino anteriormente descritas derivadas de conjuntos de ADN específico de tejido, se diseñaron conjuntos de cebadores de oligonucleótidos de qPCR adicionales con intención de usarlos para amplificar por PCR una Ggta1 de ADNc generado a partir de una línea de células CHO. Sin embargo, los esfuerzos para hacer esto no fueron inicialmente satisfactorios. Más sorprendentemente, estos cebadores también dejaron de amplificar cualquier copia genómica del gen (si se usa ADN genómico aislado de la misma fuente de células CHO que se usó para el cribado de ADNc). Sin desear ceñirse a teoría particular alguna, los presentes inventores propusieron que el problema podría resultar de la homogeneidad de secuencias de ADN presente en la copia genómica del gen Ggta1 de la línea de células CHO en comparación con el genoma del hámster chino parental del que los conjuntos de ADNc (usados para clonar secuencias de Ggta1-a y Ggta1-b) se derivaron independientemente. Además, el exón 9, que codifica la mayoría de la región catalítica, presentó características que inicialmente condujeron a los presentes inventores a creer que era tóxico para E. coli (las células bacterianas usadas para clonar), suponiendo además un reto a los esfuerzos de clonación satisfactorios de células CHO.

La amplificación satisfactoria del ADN genómico (ADNg) de células CHO de una secuencia de genes parcial de

5.877 pares de bases y que comprende los exones 8, 9 (y el intrón intermedio) se logró por último lugar usando un conjunto racionalmente diseñado de cebadores de PCR (Tabla 2). Esta secuencia genómica de Ggta1 parcial se muestra en la Figura 5 (SEQ ID NO: 5), y la secuencia de aminoácidos correspondiente en la Figura 6 (SEQ ID NO: 6). Un análisis de secuencias de varios clones confirmó la presencia de polimorfismos de ADN (con respecto a las secuencias de Ggta1-a y Ggta1-b originales). En particular, se observaron 13 cambios de aminoácidos (de los 275 restos) en la región del exón 8-9 del gen Ggta1 con respecto a la secuencia originalmente clonada a partir del conjunto de ADNc de hámster chino de ADNc derivado de ovario. Este polimorfismo es equivalente a aproximadamente una diferencia del 5 % en la secuencia de proteínas (6,5 % de diferencia al nivel de nucleótidos) cuando se comparan las dos secuencias de genes. A diferencia, una secuencia de CHO de control sin relacionar asimismo amplificada por PCR a partir de los cuatro conjuntos de ADNc de hámster chino específico de tejido presentaron todos el 100 % identidad de pares de bases cuando se comparó directamente con la secuencia de ADNc derivada de células CHO. Esta observación sugiere un sesgo específico del gen en polimorfismos genéticos.

En resumen, la clonación de Ggta1 de células CHO fue técnicamente desafiante. Mientras que las secuencias de genes Ggta1 para varias especies, que incluyen ratón, rata, vaca, cerdo, perro, gato, y varias otras, estuvieron públicamente accesibles, el uso de estas secuencias relacionadas para obtener el gen Ggta1 de células CHO por clonación por homología rutinaria no fue satisfactorio. Acoplado a la falta de apoyo en la bibliografía para la presencia de una actividad de Ggta1 en células CHO, otros podrían entonces haber llegado a la conclusión de que una Ggta1 de CHO no existió. En su lugar, los inventores reconocieron las fuentes de problemas que encontraron, y continuaron clonando los genes Ggta1 de tejidos y ADN genómico de hámster chino con el fin de proporcionar las herramientas que por último lugar permitieran la clonación de ADNc de Ggta1 de células CHO. Entre otras cosas, los retos presentados a los investigadores que investigan la clonación de ADNc de Ggta1 de células CHO incluyeron (1) consenso general en la bibliografía de que las células CHO no incluyeron la actividad de Ggta1; (2) divergencia poco usual de la homología de la secuencia de ADN entre secuencias de roedor (por ejemplo, ratón frente a rata en la que las dos secuencias de genes Ggta1 respectivas divergen aproximadamente el 9 %); y (3) polimorfismos genéticos de la secuencia de genes Ggta1 de células CHO. Los presentes inventores identificaron estos retos, desarrollaron estrategias para cumplirlos, y clonaron satisfactoriamente secuencias de Ggta1 de CHO.

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Ejemplo 2: Uso de perfil transcripcional por qPCR para cribar la expresión diferencial del gen Ggta1 en clones de la línea de células CHO

El uso satisfactorio de PCR requiere consideraciones rigurosas, concretamente el uso de cebadores de oligonucleótidos cuidadosamente diseñados con secuencias de nucleótidos complementarias a la secuencia de genes diana que se detecta. El diseño de estos cebadores que coinciden en secuencia para tratar un perfil específicamente de la expresión génica de Ggta1 en células CHO no fue inicialmente posible sin primero determinar la secuencia exacta del gen Ggta1 de CHO, como se ha descrito anteriormente. Basándose en el conocimiento de la secuencia de Ggta1 de células CHO clonada como se ha descrito anteriormente, cebadores adicionales se diseñaron entonces cuidadosamente para cuantificar por qPCR los niveles de expresión relativa de genes Ggta1 en la población clonal de células CHO que expresa CTLA4-Ig. Estos cebadores se diseñaron para hibridarse específicamente en una región de la secuencia del exón 9 de Ggta1 que se mostró mediante un alineamiento de múltiples secuencias que estaba absolutamente conservada en sus secuencias de nucleótidos respectivas (Tabla 2). Los cebadores se clasificaron basándose en la eficiencia, especificidad y sensibilidad usando un molde de ADN de control. El intervalo dinámico de estos cebadores superó 8 órdenes de magnitud, que indica su capacidad en principio para detectar niveles de ARNm de Ggta1 hasta la copia de un único dígito por célula.

Los resultados de qPCR se resumen en la Figura 7. Se aislaron clones por dilución tras la amplificación basada en DHFR de una línea de células CHO que expresa CTLA4-Ig. La expresión de Ggta1 se cuantificó por qPCR usando cebadores específicos del exón 9 845 (directo) y 846 (inverso) (secuencias mostradas en la Tabla 2). La Figura 7A muestra los perfiles de ciclos de PCR de clones seleccionados. La Figura 7B muestra una evaluación de la especificidad por cebador por análisis de Tm. La Tabla 3 ilustra los valores de ciclo umbral (Ct) para tres clones ilustrativos. Estos resultados indican la amplificación de un producto específico (basado en el análisis de la temperatura de fusión del producto amplificado, Figura 7B). Además, estos resultados también demuestran el uso de estos cebadores para diferenciar clones únicos derivados de una única línea de células CHO parental basándose en los niveles de expresión relativa del gen Ggta1 (Tabla 3).

Además, los presentes inventores diseñaron cebadores que se diferencian entre copias genómicas frente a transcripcionales (ADNc) del gen Ggta1 por mapeo en exones contiguos (es decir, cebador directo, el exón 8; cebador inverso, el exón 9). La amplificación diferencial de la secuencia de Ggta1 correspondiente al molde de ADNc frente a un molde de ADN genómico (ADNg) se ilustra en la Figura 8. Estos conjuntos de cebadores no amplificarán copias genómicas de Ggta1 bajo las condiciones de qPCR usadas debido a la presencia de una gran secuencia de intrón intermedio (>5 kb), que físicamente separa los dos exones en la copia genómica, pero posteriormente se corta y empalma para formar el transcrito de ARNm de Ggta1 maduro. Otros cebadores desvelados en el presente documento se usaron asimismo para cribar clones de células CHO para la expresión diferencial del gen Ggta1. La Figura 9 muestra que el producto de PCR de Ggta1 (amplificado específicamente a partir de ADNc) tiene 324 pb. Tales cebadores tienen valor particular en ciertas aplicaciones, tales como la necesidad de detectar y/o cuantificar inequívocamente bajos niveles de expresión génica de Ggta1 en un modo específico que excluye cualquier posibilidad de un resultado positivo falso debido a ADN genómico sobrante.

Tabla 2 Cebadores de oligonucleótidos de Ggta1 usados para la clonación y el perfil transcripcional

Fin

Conjunto de cebadores Secuencia

Clonación de ADNc de la secuencia codificante de Ggta1 de longitud completa de tejidos de hámster chino

807 (directo) TGGATCACAGGAGAAAATAATGAA (SEQ ID NO: 8)

806 (inverso)

AAGTTTCCATCACAATTTGAAGTCAGA (SEQ ID NO: 9)

Clonación de la secuencia de genes Ggta1 (exón 8, 9 e intrón) de ADN genómico de células CHO

863 (directo) GAACCGCCCAGAAGTTTTGACAGTGACC (SEQ ID NO: 10)

830 (inverso)

GTCAGACATTACTCCTAACCAAATTATAC (SEQ ID NO: 11)

Perfil transcripcional de la expresión de Ggta1 en línea de células CHO

845 (directo) ATGCCTCCAGAATGCCTTT(SEQID NO: 12)

846 (inverso)

ATCCACGTCCATACAGAAGA (SEQ ID NO: 13)

875 (directo)

GCCAGACAGAAAATCACCG (SEQ ID NO: 14)

855 (inverso)

AAAGACCTGATCCACGTCCAT (SEQID NO: 15)

897 (directo)

TGGGAAGGCACTTATGACAG (SEQ ID NO: 16)

Tabla 2 Cebadores de oligonucleótidos de Ggta1 usados para la clonación y el perfil transcripcional

Fin

Conjunto de cebadores Secuencia

892 (inverso)

TTGTAAGGAATGCAGAGGAC (SEQ ID NO: 17)

Tabla 3 Valores de Ct de clones ilustrativos cribados por qPCR usando los cebadores 845 y 846

Pares de cebadores

Clon 33 Clon 33 (sin RT) Clon 34 Clon 34 (sin RT) Clon 57 Clon 57 (sin RT)

pr845+pr846

32,74 ND 34,26 ND ND ND

Los clones se obtuvieron por dilución de la línea de células CHO DHFR-amplificada por MTX que expresa CTLA4-Ig; Sin RT= control de transcriptasa inversa menos para excluir la amplificación de copias genómicas del gen Ggta1; ND=no detectado

Tabla 4 Oligonucleótidos/cebadores/sondas a modo de ejemplo

nombre

secuencia hebra nt fuente

pr854

GATGCCTCCAGAATGCCTT (SEQ ID NO: 18) directa 19 CHO1

pr874

CTCATTCTTGAAGCTATGCC (SEQ ID NO: 19) directa 20 CHO1

pr875

GCCAGACAGAAAATCACCG (SEQ ID NO: 20) directa 19 CHO1

pr876

CTTACGGGGACACATGCTA (SEQ ID NO: 21) inversa 19 CHO1

pr877

GGCACAGAAGGGAAAGAC (SEQ ID NO: 22) directa 18 CHO1

pr878

GTCAACCATCTAAGCTACAGT (SEQ ID NO: 23) inversa 21 CHO1

pr886

AAATCTGACCCTAATCCTGTG (SEQ ID NO: 24) directa 21 CHO1

pr887

CTCCTTGCTTTCTATGGCTT (SEQ ID NO: 25) inversa 20 CHO1

pr888

GCCAGACAGAAAATCACC (SEQ ID NO: 26) directa 18 CHO1

pr895

GTCTCCTTCCTAGTAACTCAAA (SEQ ID NO: 27) inversa 22 CHO1

pr896

CTAGCATGTGTCCCCGTAA (SEQ ID NO: 28) directa 19 CHO1

pr898

GCTGGTGGTTCCCGAG (SEQ ID NO: 29) directa 16 CHO1

pr855

AAAGACCTGATCCACGTCCAT (SEQ ID NO: 30) inversa 21 Exón 8-9

pr889

GAAGTTTTGACAGTGACCCC (SEQ ID NO: 31) directa 20 Exón 8-9

pr891

GTTTTTGCTGTGGGAAAGTACAT (SEQ ID NO: 32) directa 23 Exón 8-9

pr892

TTGTAAGGAATGCAGAGGAC (SEQ ID NO: 33) inversa 20 Exón 8-9

pr893

AAAGACCTGATCCACGTCCA (SEQ ID NO: 34) inversa 20 Exón 8-9

pr894

GATCTCAAACACTTGTAAGGAATG (SEQ ID NO: 35) inversa 24 Exón 8-9

pr897

TGGGAAGGCACTTATGACAG (SEQ ID NO: 36) directa 20 Exón 8-9

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2