CN101657725A - 使用外切糖苷酶对n-聚糖进行表征 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了用于分析N－聚糖类的结构和/或组成的方法。此类方法经常涉及用多种外切糖苷酶来消化N－聚糖。在一些实施方案中，N－聚糖是用多种外切糖苷酶同时进行消化。在一些实施方案中，N－聚糖是用多种外切糖苷酶顺序地进行消化。在一些实施方案中，根据本披露的方法涉及将已经使用多种外切糖苷酶同时进行消化的N－聚糖类的切割产物与已经使用多种外切糖苷酶顺序地进行消化的N－聚糖类的切割产物进行比较。

Description

使用外切糖苷酶对N-聚糖进行表征
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2007年4月16日提交的美国临时申请序列号60/923,688的优先权，其全部内容通过引用结合在此。
背景
[0002]糖蛋白的糖基化作用模式经常在该糖蛋白的功能中发挥重要的作用。仅给出一些实例：糖蛋白的糖基化作用模式会影响其正确地折叠的能力，其稳定性(例如，对蛋白质水解和/或其他的降解的耐受性)，催化活性、药效学和/或药物代谢动力学特性，和/或糖蛋白与其他的分子适当地进行相互作用的能力。可替代地或额外地，糖蛋白的糖基化作用模式可以影响这种糖蛋白的传送和靶向。例如，糖蛋白的糖基化作用模式会影响该糖蛋白是否仍然是细胞内(包括，例如该糖蛋白正确地靶向适当的亚细胞区室或多个区室)，该糖蛋白是否会是膜结合的和/或该糖蛋白是否会从细胞中分泌出来。
[0003]目前的方法经常不能检测到在多种聚糖的一个群体中以低水平存在的几种聚糖。主要的几种聚糖会阻止以低水平存在的几种聚糖的检测和识别。此外，目前的方法通常不能对多种聚糖的一个群体中的几种单个的聚糖的相对水平进行精确地定量。目前的方法可能不能检测多种聚糖的一个群体中的非标准化的连接。因此，需要对在多种聚糖的一个群体中以低水平存在的几种聚糖进行检测的方法。需要对多种聚糖的一个群体中的几种单个的聚糖的相对水平进行定量的方法。
概述
[0004]本披露提供了对N-聚糖的组成和/或结构进行分析的方法。在此所说明的方法可以用来分析N-聚糖制品(例如，多种N-聚糖的一个混合物)，并且用来测定在制品中特定的结构基团和/或不常见的修饰作用(例如，核心或触角海藻糖、乳糖胺扩展物、高甘露糖以及杂合的聚糖，硫酸化作用以及磷酸化作用)的相对水平。在此所说明的方法总体上可以涉及以下步骤：获得一种N-聚糖制品；用外切糖苷酶的酶类对N-连接的聚糖进行消化以便特异性地从非还原性末端对单糖进行切割；并且分析这些切割产物。将使用外切糖苷酶的酶类的多种处理(例如同时的以及不同的顺序处理)的结果进行比较可以提供有关聚糖结构的出人意料的信息，例如可以鉴别出在一种N-聚糖制品中以非常低的水平而存在的几种聚糖。
[0005]聚糖制品可以通过本领域内任何一种可供使用的方法而获得。总体而言，获得一种N-聚糖制品包括以下步骤：(1)获得一种糖蛋白或其他的结合糖(glycoconjugate)制品；并且(2)从该结合糖制品中获得一种N-聚糖制品。结合糖(例如糖蛋白)制品可以从任何一种来源中获得，包括但不限于，治疗性配制品、商业性生物产品、以及生物样品。
[0006]在一些实施方案中，通过提供一种糖蛋白群体并且从该糖蛋白群体的这些糖蛋白中移出N-聚糖而获得一种N-聚糖制品。在一些实施方案中，N-聚糖可以与一种可检测的标记物(例如，荧光的和/或放射性的部分(moiety))相缔合。
[0007]在一些实施方案中，使用一种或多种外切糖苷酶对多种N-聚糖群体进行消化，并且对消化产物的结构和/或组成进行分析。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割了一种具体类型的糖苷连接(glycosidic linkage)。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割了多于一种具体类型的糖苷连接。根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。
[0008]根据本披露，N-聚糖群体可以使用任何外切糖苷酶进行消化。在一些实施方案中，通过将多种N-聚糖的一个群体经受多种外切糖苷酶的处理而对N-聚糖进行消化。例如，多种N-聚糖的一个群体中可以经受2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种外切糖苷酶的处理。在一些实施方案中，同时给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，顺序地给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，改变所给予的外切糖苷酶的身份揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息。在一些实施方案中，改变所给予的多种外切糖苷酶的顺序揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息。
[0009]在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关N-聚糖结构和/或组成的信息，该信息不同于用同一组外切糖苷酶同时进行消化所揭示的信息。在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关N-聚糖结构和/或组成的信息，该信息与用同一组外切糖苷酶同时进行消化所揭示的信息相同。
[0010]在一些实施方案中，一旦一种外切糖苷酶的处理已经执行完成，就对所切割的聚糖的结构和/或身份进行分析。在一些实施方案中，至少一种样品可以在外切糖苷酶的处理过程中(例如，在完成该外切糖苷酶处理之前的任何时间点)从该聚糖制品中被移出。在一些实施方案中，在至少所移出的样品之一中对所切割的聚糖的结构和/或类别进行分析。在一些实施方案中，该分析步骤包括将在所移出的样品中的一种或多种中所切割的聚糖的结构和/或功能与在至少一种其他的所移出的样品中所切割的聚糖的结构和/或功能进行比较。在一些实施方案中，该分析步骤包括将在所移出的样品中的一种或多种中所切割的聚糖的结构和/或功能与在一种参比样品中所切割的聚糖的结构和/或功能进行比较。
[0011]已消化的N-聚糖的结构和组成可以通过任何一种可供使用的方法进行分析(例如色谱方法、质谱法、核磁共振、毛细管电泳法、等等)。在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的几种N-聚糖。例如，根据本披露，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中按照以下水平存在的几种N-聚糖：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、或小于0.1％。
[0012]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的具体的连接(linkage)。例如，根据本披露，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中按照以下水平存在的具体的连接：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。
[0013]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测多种N-聚糖的一个群体中的几种单个的N-聚糖的相对水平。例如，可对液相色谱法中每个峰之下的面积进行测量并且将其表达为总数的一个百分数。这种分析提供了在多种N-聚糖的一个群体中每个N-聚糖种类的相对百分比的量。
[0014]在一些实施方案中，在此所说明的方法可以用来分析作为治疗剂(例如，干扰素、集落刺激因子、血液凝固因子、等等)而使用的糖蛋白的糖基化作用模式。如本领域的普通技术人员应当理解，这些治疗性糖蛋白试剂的糖基化作用模式可以潜在地影响其治疗特性。这样，对所感兴趣的一种已表达的糖蛋白的糖基化作用模式进行精确表征是重要的。在一些实施方案中，根据本披露的方法在此类治疗性糖蛋白的糖基化作用模式的精确表征方面是有用的。
[0015]在一些实施方案中，所感兴趣的治疗性糖蛋白产生于细胞中并且在产生之后从该细胞中分泌出来。根据本披露的方法可以用于预测此类经分泌的治疗性糖蛋白的糖基化作用模式。
[0016]在一些实施方案中，根据本披露的方法可以用于监测糖蛋白在其通过细胞进行生产的过程中的糖基化作用模式。例如，糖蛋白的生产(例如，商业性生产)可以涉及以下步骤：(1)培养产生这种糖蛋白的细胞，(2)在整个培养细胞的过程中以规则或不规则的间隔获得样品，并且(3)分析在每个所获得的样品中产生的糖蛋白的糖基化作用模式。在一些实施方案中，此类方法可以进一步包括将在每个所获得的样品中产生的糖蛋白的糖基化作用模式彼此进行比较的一个步骤。在一些实施方案中，此类方法可以进一步包括将在每个所获得的样品中产生的糖蛋白的糖基化作用模式与一个参比样品的糖基化作用模式进行比较的一个步骤。
[0017]在一些实施方案中，所感兴趣的治疗性糖蛋白是一种可商购的糖蛋白(例如，抗体、多肽、白细胞介素、受体类似物、受体拮抗剂类，等等，和/或其用于治疗一种疾病、病况、或紊乱的特征性部分)。根据本披露的方法可以用于确定此类可商购的糖蛋白的糖基化作用模式。
附图简要说明
[0018]图1：示例性的N-聚糖结构。
[0019]图2：将经2AB-标记的N-聚糖的混合物经受用唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶的酶类的处理。将样品施用至酰胺柱上并且用正相色谱法进行洗脱。(A)在酰胺柱上分离开的N-聚糖混合物。(B)用酶逐步处理之后的N-聚糖类。如色谱图中所示，通过这种处理乳糖胺-扩展的聚糖没有被完全地切割成M3N2。这些峰的身份通过基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)得到确认。
[0020]图3：N-聚糖混合物在该混合物用唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶的酶类同时进行处理而彻底消化之后的色谱图。将这些样品施用至酰胺柱上并且用正相色谱法进行洗脱。插图：从大约30至大约70分钟的柱色谱图的特写，放大至可看见较小的峰。
[0021]图4：使用广泛特异性的唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶(Rx05-C处理)顺序地进行消化的示例性的N-聚糖群体中。示出了不同的消化产物的全体。
[0022]图5：消化产物的比较，这些消化产物在使用α-2/3，6，8，9-唾液酸酶、β-1/3，4，6-半乳糖苷酶、以及β-1，4-己糖胺酶对一种聚糖群体(由顶部所示的两种聚糖表示)顺序地(左)以及同时地(右)进行消化之后而获得。针对该聚糖群体的两种聚糖，同时的消化产生了同样的反应产物(甘露糖核心)。顺序的消化产生了两种不同的消化产物。该实例示出了顺序消化如何能够揭示不能从一种同时的消化中获得的信息。
[0023]图6：glcNAc(正方形)的岩藻糖基化作用(由三角形表示)阻止己糖胺酶能够切割一个末端的glcNAc。这里示出的是两种聚糖，一种具有触角岩藻糖化的glcNAc(右)，而另一种没有(左)。用唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶消化之后，左边的这类被切去成为其甘露糖的核心。相比之下，岩藻糖化的glcNAc不能通过一个相同的外切糖苷酶的处理而被切割掉。
[0024]图7：同时的以及顺序的外切糖苷酶的处理以揭示杂合的以及聚乳糖胺的结构。使用外切糖苷酶对聚糖混合物进行处理并且对其进行标记。通过HPLC(A)展示了保留在同时对比顺序的切割中的聚糖结构的对比。使用唾液酸酶、半乳糖苷酶(顶部格子)、唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶(中部格子)或唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶(底部格子)对聚糖制品同时地或顺序地进行处理。通过质谱(MS)(B)展示了保留在针对唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶的反应的同时对比顺序的切割中的聚糖结构的比较。用HPLC以及相应的MS对保留在顺序的切割之后的聚乳糖胺结构进行标定。
[0025]图8：通过对同样的聚糖样品的顺序的以及同时的酶处理所产生的色谱图进行头对头的比较(head-to-head comparison)来快速鉴别包含聚乳糖胺的聚糖。将唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶用于酶促反应。用箭头指示顺序的以及同时的处理。
[0026]图9：通过对同样的聚糖样品的顺序的(顶部格子)以及同时的(底部格子)酶处理所产生的MALDI-MS谱图进行头对头的比较来快速鉴别包含聚乳糖胺的聚糖。将唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶用于酶促反应。
定义
[0027]大约、约、约略：如在此所使用，术语“大约”、“约”或“约略”当施用至一个或多个所感兴趣的值时，是指与一个所指出的参考值相类似的一个值。在一些实施方案中，术语“大约”、“约”或“约略”是指落在所指出的参考值的以下比例之内的数值的范围：25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小。
[0028]生物样本：如在此所使用，术语“生物样品”是指由任何活细胞或生物体排泄或分泌而获得的任何固体或液体的样品，包括但不限于组织培养物、生物反应器样品、人或动物的组织、植物、水果、蔬菜、单细胞的微生物(如，细菌以及酵母)以及多细胞的生物体。例如，生物样本可以是一种生物液体，该生物液体获自例如，血液、血浆、血清、尿液、胆汁、精液、脑脊液、房水或玻璃体液、或任何一种身体的分泌物、一种渗出液、一种溢泌物(例如，获自脓肿或任何其他的感染或炎症点的液体)、或者获自关节的液体(例如，正常的关节或受疾病(如类风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风或脓毒性关节炎)影响的关节)。生物样板还可以是例如，获自任何器官或组织(包括活组织检查或尸体解剖样本)的一种样品，可以包括细胞(不论是原代细胞或是培养的细胞)，受任何细胞、组织或器官、组织培养物限制的培养介质。
[0029]细胞表面糖蛋白：如在此所使用，术语“细胞表面糖蛋白”是指一种糖蛋白，它的至少一部分存在于细胞的外表面上。在一些实施方案中，细胞表面糖蛋白是一种蛋白质，该蛋白质位于细胞表面上，这样聚糖结构中至少一个结构存在于细胞的外表面上。
[0030]细胞表面聚糖：“细胞表面聚糖”是存在于细胞的外表面上的一种聚糖。在本披露的多个实施方案中，细胞表面聚糖被共价地连接到作为一种细胞表面糖蛋白的部分的一个多肽上。细胞表面聚糖还可以被连接到细胞膜的类脂上。
[0031]聚糖：如本领域内已知并且在此所使用，“聚糖”是多种糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但典型地包含至少三个糖，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰基神经氨糖酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等等)和/或经修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2，-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺基N-乙酰葡糖胺、等等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物以及杂聚物。术语“聚糖”还涵盖了结合糖的一个聚糖组分(例如，一种糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等的一个聚糖组分)。该术语还涵盖游离的聚糖，包括从一种结合糖中已经被切割的或由其他方式所释放的聚糖。
[0032]聚糖制品：如在此所使用的术语“聚糖制品”是指根据一个具体的生产方法而获得的一组聚糖。在一些实施方案中，聚糖制品是指从一种糖蛋白制品(见以下糖蛋白制品的定义)中获得的一组聚糖。
[0033]结合糖：如在此所使用的术语“结合糖”涵盖了以下所有分子，其中至少一个糖部分被共价地连接到至少一个其他部分上。0该术语确切地涵盖了所有具有共价附连的糖部分的生物分子，包括例如N-连接的糖蛋白、O-连接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等。
[0034]糖形：在此所使用的术语“糖形”是指结合糖的一种具体形式。即，当相同的主链部分(它作为一种结合糖的部分)(例如多肽、类脂、等等)具有被连接到不同的聚糖或聚糖的不同组上的潜在性时，于是结合糖(即，其中该主链被连接到具体的一组聚糖上)的每一种不同形式即被称为一种“糖形”。
[0035]糖脂：如在此所使用的术语“糖脂”是指包含一个或多个共价连接的糖部分(即，聚糖)的一种类脂。一个或多个糖部分可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这种或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分支的链或者可以由一个或多个分支的链所组成。在一些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。在一些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在一些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。
[0036]糖蛋白：如在此所使用，术语“糖蛋白”是指一种蛋白质，该蛋白质包含了共价连接至一个或多个糖部分(即，聚糖)上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解，这种肽主链典型地包括具有多种氨基酸残基的一个直链的链。在一些实施方案中，这种肽主链跨越了细胞膜，这样它包括一个跨膜部分以及一个细胞外部分。在一些实施方案中，跨过了细胞膜的糖蛋白的肽主链包括了细胞内部分，跨膜部分、以及细胞外部分。在一些实施方案中，本披露的方法包括使用一种蛋白酶来切割一种细胞表面糖蛋白以释放该糖蛋白的细胞外部分，或它的一部分，其中这种暴露基本上不会使细胞膜破裂。这个或这些糖部分可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这个或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分支的链或者可以包括一个或多个分支的链。在一些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。可替代地或额外地，这些糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基的修饰。在一些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在一些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。在一些实施方案中，在此所披露的方法包括分析以下项中任何一项或全部的一个步骤：细胞表面糖蛋白、已释放的细胞表面糖蛋白的碎片(例如，糖肽)、附连到细胞表面糖肽上的细胞表面聚糖、细胞表面糖肽的肽主链、此类糖肽的碎片、聚糖和/或肽主链，以及它们的组合。
[0037]糖苷酶：如在此所使用的术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割了在聚糖中的多种顺序的糖之间的或在糖与主链部分之间(例如，在糖蛋白的糖与肽主链之间)的一个共价键。在一些实施方案中，糖苷酶是一种酶。在一些实施方案中，糖苷酶是含有一个或多个多肽链的一种蛋白(例如，一种蛋白质酶(protein enzyme))。在一些实施方案中，糖苷酶是一种化学切割试剂。
[0038]糖基化作用模式：如在此所使用，术语“糖基化作用模式”是指在一个具体的样品中存在的一组聚糖结构。例如，一个具体的结合糖(例如，糖蛋白)或一组结合糖(例如，糖蛋白的组合)将具有一种糖基化作用模式。在一些实施方案中，提及的是细胞表面聚糖的糖基化作用模式。糖基化作用模式的特征可以是，例如聚糖的身份、单个的聚糖或具体类型的聚糖的量(绝对的或相对的)、糖基化位点的占用度、等等，或这些参数的组合。
[0039]糖蛋白制品：如在此所使用，术语“糖蛋白制品”是指一组单个的糖蛋白分子，该组中的每一个包括具有一个特定的氨基酸序列(该氨基酸序列包括至少一个糖基化位点)的一个多肽以及被共价地附连到该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制品中的一种具体糖蛋白的单个的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可能在至少一个糖基化位点的占用方面有所不同和/或在被连接到至少一个糖基化位点上的聚糖的身份方面所有不同。即，一种糖蛋白制品可以仅包括一种具体的糖蛋白的一种单一的糖形，但是更典型地包括多种糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在所存在的糖形的身份方面(例如，在一种制品中存在的糖形可能是另一种制品所缺少的)和/或在不同糖形的相对量方面有所不同。
[0001]N-聚糖：如在此所使用，术语“N-聚糖”是指多种糖的一个聚合物，该聚合物已经从一种结合糖中释放出来，但是之前通过一个氮连接(参见以下N-连接的聚糖的定义)被连接到该结合糖上。
[0002]N-连接的聚糖：N-连接的聚糖是以下聚糖，它们通过一个氮连接而被连接到一种结合糖上。存在着不同分类的N-连接的聚糖，但是它典型地基于共同的核心戊糖(Man)3(GlcNAc)(GlcNAc)。
[0003]O-聚糖：如在此所使用，术语“O-聚糖”是指多种糖的一个聚合物，该聚合物已经从一种结合糖中释放出来，但是之前通过一个氧连接(参见以下O-连接的聚糖的定义)被连接到该结合糖上。
[0040]O-连接的聚糖：O-连接的聚糖是以下聚糖，它们通过一个氧连接而被连接到一种结合糖上。O-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)而被连接到糖蛋白上或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)而被连接到L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的羟基基团上。一些O-连接的聚糖还具有诸如乙酰化作用以及硫酸化作用的修饰作用。在一些例子中，O-连接的聚糖附连到糖蛋白，通过岩藻糖或甘露糖到L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的羟基基团上。
[0041]磷酸化作用：如在此所使用，术语“磷酸化作用”是指将一个或多个磷酸根基团共价地加至一个分子(例如，一种聚糖)中的过程。
[0042]蛋白酶：如在此所使用的术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割了在一个多肽链中的多个顺序的氨基酸之间的一个肽键。在一些实施方案中，蛋白酶是一种酶(即，一种蛋白水解酶)。在一些实施方案中，蛋白酶是一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶)，该蛋白质包括一个或多个多肽链。在一些实施方案中，蛋白酶是一种化学切割试剂。
[0043]蛋白质：总体而言，“蛋白质”是一种多肽(即，通过肽键彼此相连的一串至少两个的氨基酸)。蛋白质可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或还可以另行处理或修饰。本领域的普通技术人员应当理解，“蛋白质”可以是由细胞(具有或没有一种信号序列)所产生的一种完整的多肽链，或者可以是它的一个功能性部分。本领域的普通技术人员应当进一步地理解，有时蛋白质可包括多于一种的多肽链，例如通过一个或多个二硫键相连接或通过其他方式相缔合。
[0044]唾液酸：在此所使用，术语“唾液酸”是针对神经氨糖酸的N-或O-取代的衍生物的一个统称，是一种九碳单糖。神经氨糖酸的氨基基团典型地带有唾液酸中的乙酰基或羟乙酰基的基团。唾液酸中存在的羟基取代基可以通过乙酰化作用、甲基化作用、硫酸化作用、以及磷酸化作用进行修饰。主导性唾液酸是N-乙酰神经氨糖酸(Neu5Ac)。唾液酸向聚糖传递一个负电荷，这是因为羰基基团在生理pH下易于解离出一个质子。示例性的去质子的唾液酸显示如下：
Figure A20088001180600311
[0045]基本上：如在此所使用，术语“基本上”是指展示出一个所感兴趣的特征或特性的总体的或接近总体的范围或程度的定性的状态。生物领域内的普通技术人员应当理解，生物以及化学现象很少(如果存有的话)会达到完全和/或进行到完全或实现或避免一个绝对的结果。因此，术语“基本上”在此进行使用以涵盖在许多生物以及化学现象中固有的潜在的完全性的缺失。仅给出一个具体的实例，当一种处理被说成“基本上”不会使细胞膜破裂时，它意指在处理的过程中以及在处理之后所有的或大部分细胞膜仍然是完整的，例如这样细胞内的糖蛋白或糖肽因此不会从细胞中释放出来。在一些实施方案中，术语“基本上”当被施用至未破裂的细胞膜中时是指一种状态，其中经受了一种具体的处理的细胞的15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少展示出了可测量的已破裂的细胞膜。在一些实施方案中，术语“基本上”当被施用于未破裂的细胞膜中是指一种状态，其中经受了一种具体的处理的多个细胞都没有展示出可测量的已破裂的细胞膜。
某些实施方案的详细说明
[0046]本披露提供了分析N-连接的聚糖的组成的方法。根据本披露，在此所说明的方法可以用于分析一种N-聚糖的混合物，并且用于测量在这种混合物中特定的基团以及不常见的修饰(例如，核心或触角岩藻糖、乳糖胺扩展物、高甘露糖以及杂合聚糖、硫酸化作用、磷酸化作用，等等)的相对水平。例如，图6证实了触角的岩藻糖基化作用如何通过己糖胺酶阻止了glcNAc的消化。在多个实施方案中，本披露提供了多种方法，涉及以下步骤：获得一种N-聚糖制品；使用一种外切糖苷酶的酶来消化N-连接的聚糖以特异性地从非还原性末端对单糖进行切割；并且分析这些切割产物。
N-连接的聚糖类
[0047]总体而言，聚糖是指一个碳水化合物部分，在一些实施方案中该碳水化合物部分被共价地附连到一种糖蛋白上。碳水化合物部分(例如，寡糖链)通过N-连接或O-连接被连接到内质网以及高尔基体中的糖蛋白上。典型地，N-连接的寡糖链被加到内质网的内腔中的糖蛋白上(参见Alberts et al.，Molecular Biology ofthe Cell，1994，通过引用结合在此)。碳水化合物部分被加到包含于Asn-X-Ser/Thr的目标共有序列内的天冬酰胺残基的侧链的氨基基团上，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。最初的寡糖链通常通过内质网中的特异性的糖苷酶的酶类进行修剪，产生由两个N-乙酰葡糖胺以及三个甘露糖残基组成的一个短的、分支的核心寡糖。
[0048]N-聚糖可以再分成三个独特的组，称为“高甘露糖类型”、“杂合类型”、以及“复合类型”，其中在所有三个组中均发生一个常见的戊糖核心(Manp(α1，6)-(Manp(α1，3))-Manp(β1，4)-GlcpNAc(β1，4)-GlcpNAc(β1，N)-Asn)。对核心的修饰作用包括例如，额外的糖基化作用，提供一个二等分的GlcNAc，将一个岩藻糖基残基附接至最里面的GlcNAc上，以及使用唾液酸(Neu)残基进行加帽。示例性的N-聚糖描绘于图1中。正如所见，N-聚糖的结构变化多数发生于(相对于(高达)4个触角)在图1中所述的N-聚糖的左手侧。N-连接的聚糖通常被发现作为肽(即，糖肽)以及蛋白(即，糖蛋白)的成分。
[0049]在内质网中进行最初的处理之后，糖蛋白接着被传送至高尔基体，在高尔基体中可发生另外的处理。经修剪的N-连接的寡糖链可以通过加入几种甘露糖残基进行修饰，产生一个“高甘露糖的寡糖”。可替代地或额外地，一个或多个N-乙酰葡糖胺的单糖单元可以被加到核心甘露糖的亚单元中以便形成“复合的寡糖”。半乳糖可以被加到N-乙酰葡糖胺的亚单元中，并且唾液酸的亚单元可以被加到半乳糖的亚单元中，产生用唾液酸、半乳糖、或N-乙酰葡糖胺的残基中的任何一个进行终止的链。岩藻糖残基可以被加到核心寡糖的一个N-乙酰葡糖胺残基中。这些加入物各自通过特异性的糖基转移酶进行催化。
[0050]N-连接的聚糖涉及多种细胞的处理。例如，N-聚糖有助于真核细胞中适当的蛋白质折叠。内质网中的分子伴侣蛋白(例如，钙联接蛋白以及钙网蛋白)结合到在N-聚糖核心上存在的三个葡萄糖残基上。分子伴侣蛋白典型地辅助聚糖所附连的蛋白质的折叠。在适当的折叠之后，这三个葡萄糖残基被移出，并且该聚糖可以继续进行另外的处理反应。如果该蛋白未能进行适当地折叠，则这三个葡萄糖残基被再附连，允许该蛋白与分子伴侣蛋白进行再缔合。这种循环可以重复若干次，直至蛋白质达到其合适的构象。如果蛋白质未能重复地进行适当地折叠，则通常它从内质网中分泌出来并且被细胞质蛋白酶降解。
[0051]可替代地或额外地，N-聚糖有助于通过空间效应进行蛋白质折叠。例如，由于附近聚糖的大小，可以暂时地阻止肽中的半胱氨酸残基与其他半胱氨酸残基形成二硫键。因此，N-连接的聚糖的存在可以允许细胞来控制哪个半胱氨酸残基会形成二硫键。
[0052]N-聚糖可参与细胞与细胞的相互作用。例如，肿瘤细胞时常产生异常的N-聚糖结构，这些结构可以被自然杀伤细胞上的CD337受体识别成表示相关的细胞为癌性的一种信号。
[0053]N-聚糖可以参与将降解的溶酶体的酶类靶向至溶酶体。具体而言，使用甘露糖-6-磷酸残基来修饰N-聚糖可以作为表示这种聚糖所附连的蛋白应当被靶向至该溶酶体的一个信号。
[0054]因此，本披露涵盖了以下识别，该识别对确定N-聚糖(例如，结合到糖蛋白上的N-聚糖)的糖基化作用模式而言是重要的。在此所说明的方法可以用来分析任何N-聚糖的特征(例如，组成和/或结构)。
N-聚糖制品
[0055]本披露提供了分析聚糖制品中的单个的N-聚糖的结构和/或组成的方法。聚糖制品可以通过本领域内的任何一种可供使用的方法而获得。总体而言，获得一种N-聚糖制品包括以下步骤：(1)获得一种糖蛋白制品；并且(2)从该糖蛋白制品中获得一种N-聚糖制品。在一些实施方案中，获得一种N-聚糖制品可任选地包括用一种可检测的标记物对该N-聚糖制品进行标记的一个步骤。
糖蛋白制品
[0056]糖蛋白制品可以从任何一种来源中获得，包括但不限于，治疗性配制品(例如，促红细胞生成素、胰岛素、人生长激素、等等)、商业性生物产品(例如，在表3中所呈现的那些生物产品)、以及生物样品。如在此所使用，术语“生物样品”是指通过任何活细胞或生物体排泄或分泌而获得的任何一种固体或液体的样品，包括但不限于组织培养物、人或动物的组织、植物、水果、蔬菜、单细胞的微生物(如，细菌以及酵母)以及多细胞的生物体。例如，生物样本可以是一种生物液体，该生物液体获自例如，血液、血浆、血清、尿液、胆汁、精液、脑脊液、房水或玻璃体液、或任何一种身体分泌物、一种渗出液、一种溢泌物(例如，获自脓肿或任何其他感染或炎症点的液体)，或者获自关节的液体(例如，正常的关节或受疾病(如，类风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风或脓毒性关节炎)影响的关节)。生物样品还可以是例如一种样品，该样品获自任何一种器官或组织(包括活组织检查或尸体解剖样本)，可以包括细胞(不论是原代细胞或是培养的细胞)，受任何细胞、组织或器官、组织培养物限制的培养介质。
[0057]糖蛋白制品可以被任何机器、人、或实体所接受。在一些实施方案中，糖蛋白制品可以被机器所接受，然后它可进行一个或多个糖蛋白制品的测定、处理、或精制。在一些实施方案中，糖蛋白制品可以被人接受。在一些实施方案中，糖蛋白制品可以被一个外界的实体所接受。在一些实施方案中，糖蛋白制品可以被一个人或业务单位(为第二个人或业务单位进行表征服务)所接受。例如，一个业务单位可以得到运行，其中该业务单位接受了将从其他业务单位或实验室中得到表征的糖蛋白制品。糖蛋白制品能以任何方式进行处理。例如，可以对糖蛋白制品进行处理以便分离出一种或多种糖形。
N-聚糖制品
[0058]在一些实施方案中，N-聚糖制品通过提供一种糖蛋白群体并且从该糖蛋白群体的这些糖蛋白中移出N-聚糖而获得。
[0059]在一些实施方案中，N-聚糖通过消化从糖蛋白中被移出。总体而言，根据本披露有待使用的聚糖酶在核心的GlcNAc-Asn、GlcNAc-GlcNAc或Man-GlcNAc残基之间进行切割。可用来从糖蛋白中移出N-聚糖的示例性的酶类包括但不限于，N-聚糖酶F和/或N-聚糖酶-A、O-聚糖酶和/或Endo H。
[0060]在一些实施方案中，N-聚糖通过化学切割从糖蛋白中被移出。仅给出一些实例，肼、硼氢化钠、和/或三氟甲磺酸(TFMS)可以用来从糖蛋白中移出聚糖。
标记N-聚糖
[0061]在一些实施方案中，N-聚糖(例如，已经从一种糖蛋白群体中移出的N-聚糖)可以与其他一种或多种可检测的标记物相缔合。可检测的标记物典型地与N-聚糖的还原性末端相缔合。在一些实施方案中，可检测的标记物是荧光的部分。根据本披露可以使用的示例性的荧光团包括但不限于2-氨基苯甲酸(2AA)、2-氨基苯甲酰胺(2AB)、和/或2-氨基嘌呤(2AP)。总体而言，根据本披露而使用的荧光团的特征在于在不损害和/或破坏聚糖的条件下具有与一种寡糖和/或单糖的还原性末端的反应性。在一些实施方案中，荧光的部分被直接地附连到还原性末端。例如，直接附连可以通过还原性氨基化作用的直接结合而实现。在一些实施方案中，荧光的部分被间接地附连到还原性末端。例如，间接连接可以通过一个反应性的连接臂而实现。
[0062]在一些实施方案中，可检测的标记物包括放射性的部分或经同位素标记的分子。根据本披露可以使用的示例性的放射的部分包括但不限于氚(3H)、氘(2H)、和/或35S。典型地，这些部分被直接附连到该荧光团上或者以其他方式与该荧光团相缔合。仅给出一个放射性的荧光团的实例，可以对2AP进行修饰这样将所有的氢都被氘化。N-连接的聚糖的消化
[0063]本披露提供了确定糖蛋白的糖基化作用模式的方法。此类方法总体上涉及将一种N-聚糖群体经受一种或多种外切糖苷酶处理并且分析这些消化产物的结构和/或组成。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割了一种具体类型的糖苷连接。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割了多于一种具体类型的糖苷连接。
外切糖苷酶
[0064]外切糖苷酶是从聚糖的非还原性末端切割末端的糖苷键的酶。它们对于具体的单糖连接以及异头性(anomericity)(α/β)是典型地高度特异的。在一些实施方案中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶的处理通常导致标准的触角连接的聚糖被切割成戊糖核心(M3N2)(包含3个甘露糖以及2个glcNAc残基)。然而，不常见的修饰的种类(例如，岩藻糖化的触角或核心岩藻糖化的种类、高甘露糖以及杂合聚糖、乳糖胺扩展的聚糖、硫酸化的聚糖、磷酸化的聚糖，等等)对外切糖苷酶处理具有耐受性，并且可以用色谱方式分辨出并且相对于M3N2戊糖进行定量。
[0065]根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。外切糖苷酶可以获自任何一种来源，包括商业来源(例如，来自QA-Bio、ProZyme、Roche、Sigma、NEB、EMD、Glyko、等等)。可替代地或额外地，外切糖苷酶可以从一种细胞的来源(例如细菌、酵母、植物、等等)中被分离和/或纯化。
[0066]在一些实施方案中，外切糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶)可以被分成多个分类或“亚组”。在一些实施方案中，不同的亚组对切割不同类型的连接显示出不同的能力。表1呈现出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中得出每一种的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这仅是一个示例性的，而非综合性的外切糖苷酶列表，并且具有任何连接特异性的外切糖苷酶都可以根据本披露进行使用。
表1.外切糖苷酶
Figure A20088001180600371
Figure A20088001180600381
*“EC#”是指酶学委员会登记号
[0067]根据本披露，N-聚糖群体可以使用任何一种外切糖苷酶或任何一组外切糖苷酶进行消化。总体而言，外切糖苷酶反应在与酶活性相容的条件下发生。例如，pH、温度、反应溶液成分以及浓度(例如，盐、洗涤剂、等等)，以及反应时间的长度可以得到最佳化以便获得所希望的外切糖苷酶活性水平。
[0068]总体而言，外切糖苷酶反应在中性或酸性条件下发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应在基本上中性的条件下发生。在一些实施方案中，中性条件是指pH在大约6与大约8之间的范围。在一些实施方案中，中性条件是指pH为大约7。在一些实施方案中，中性条件是指pH为大约6.5。在一些实施方案中，中性条件是指pH为大约7.5。在一些实施方案中，中性条件是指pH为大约6。在一些实施方案中，中性条件是指pH为大约8。
[0069]在一些实施方案中，外切糖苷酶反应在酸性的条件下发生。在一些实施方案中，酸性条件是指pH小于约7。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约1与大约7之间的范围。在一些些实施方案中，酸性条件是指pH在大约2与大约7之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约3与大约7之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约4与大约7之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约5与大约7之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH是在大约6与大约7之间的范围。
[0070]在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约2与大约6之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约3与大约6之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约4与大约6之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约5与大约6之间的范围。
[0071]在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约1与大约2之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约2与大约3之间的范围。在一些实施方案中，酸性条件是指pH在大约4与大约5之间的范围。
[0072]在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约6.5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约6。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约5.5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约4.5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约4。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约3.5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约3。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约2.5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约2。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约1.5。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约1。在一些实施方案中，酸性条件是指pH为大约0.5。
[0073]在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当pH在从大约5至大约6的范围时发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当pH在大约5.5时发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当pH在从大约6至大约8的范围时发生。
[0074]总体而言，外切糖苷酶反应当温度在大约20℃与大约45℃之间的范围时(例如从大约30℃至大约40℃)发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当温度在大约25℃与大约40℃之间的范围时发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应在大约20℃、大约25℃、大约30℃、大约35℃、大约36℃、大约37℃、大约38℃、大约39℃、大约40℃、大约42℃、或大约45℃发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当温度在大约35℃与大约40℃之间的范围时发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当温度在大约36℃与大约38℃之间的范围时发生。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应当温度在大约37℃时发生。
[0075]总体而言，外切糖苷酶反应进行的时间长度在大约10分钟与大约20小时之间的范围内。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应进行大约10分钟、大约30分钟、大约1小时、大约2小时、大约5小时、大约10小时、大约12小时、大约15小时、大约18小时、大约20小时、大约24小时、大约36小时、或大约48小时。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应过夜进行。
[0076]在一些实施方案中，外切糖苷酶反应在一种洗涤剂的存在下(例如高达25％的洗涤剂)进行。根据本披露可在外切糖苷酶反应中利用的示例性的洗涤剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)，月桂基硫酸钠(SLS)，山梨聚糖脂肪酸酯类(例如，吐温、斯盘、卖泽、等等)、聚乙二醇脂肪酸酯类(例如，克列莫佛)、布里杰、Triton、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应是在大约0.1％、大约0.5％、大约1％、大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、或大约25％的洗涤剂存在下进行。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应是在不存在任何一种洗涤剂时进行。
[0077]在一些实施方案中，外切糖苷酶反应是在盐的存在下进行。根据本披露可在外切糖苷酶反应中利用的示例性的洗涤剂包括但不限于氯化钠、氯化钙、磷酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠、氯化镁、氯化锰、和/或它们的组合。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应在大约1mM至大约500mM的盐的存在下进行。例如，在一些实施方案中，外切糖苷酶反应是在大约1mM、大约2mM、大约5mM、大约10mM、大约25mM、大约50mM、大约100mM、大约150mM、大约200mM、大约250mM、大约300mM、大约400mM、大约□mM、大约500mM的盐的存在下进行。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应是在大约100mM的盐的存在下进行。在一些实施方案中，外切糖苷酶反应是在不存在任何一种盐时进行。
[0078]在一些实施方案中，N-聚糖可以通过将一种N-聚糖群体经受多种外切糖苷酶的处理而被消化。例如，多种N-聚糖的一个群体可以经受2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或更多种外切糖苷酶的处理。在一些实施方案中，多种N-聚糖的一个群体使用全部以基本上相等的量而存在的两种或多种外切糖苷酶进行消化。在一些实施方案中，多种N-聚糖的一个群体使用并非全部以基本上相等的量而存在的两种或多种外切糖苷酶进行消化。仅给出一个实例，多种N-聚糖的一个群体可以使用外切糖苷酶A、B以及C(比例为1∶2∶1)进行消化。在一些实施方案中，同时给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，顺序地给予多种外切糖苷酶。
使用多种外切糖苷酶同时进行消化
[0079]在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶同时进行的消化可以用来分析聚糖的结构和/或功能。在一些实例中，可以进行同时消化以便确定具体类型的连接和/或聚糖修饰作用的存在。仅给出一个实例，用于以下所示的假设的聚糖结构：
Figure A20088001180600411
[0080]对使用半乳糖苷酶以及己糖胺酶的同时处理进行预测，仅留下最初包含于末端的唾液酸残基中的触角。然后这些唾液酸残基可以可任选地被移出，并且通过HPLC对得到的聚糖混合物进行分析，以便揭示在起始的混合物中存在的单、二、三以及四唾液酸化的触角种类的特性。同时消化的方法的实例以及此类方法的分析说明于实例2中。
使用多种外切糖苷酶进行顺序的消化
[0081]作为另一个非限制性的实例，N-聚糖可以通过以下步骤而被消化：将多种N-聚糖的一个群体经受一个第一外切糖苷酶的处理，持续一个第一段时间，在这之后这种多种N-聚糖的一个群体经受了一个第二外切糖苷酶的处理，持续一个第二段时间。使用第二外切糖苷酶处理之前，该第一外切糖苷酶可以可任选地被移出和/或被灭活。作为举例，该第一外切糖苷酶，在一个温度下孵育该外切糖苷酶足以将其灭活的时间，可以被灭活。额外地或可替代地，该第一外切糖苷酶可以通过用对该外切糖苷酶特异的一种抑制剂(例如，一种抗体或其他分子，它特异性地连接至该第一外切糖苷酶上并抑制其催化活性)进行孵育而被灭活。其他将该第一外切糖苷酶灭活的方法对于本领域的普通技术人员而言应当是已知的。当该第一外切糖苷酶通过用一种特异的抑制剂对其进行孵育而被灭活的情况下，应当理解的是抑制剂的存在不应该基本上抑制该第二外切糖苷酶的活性。在一些实施方案中，在加入一种第二外切糖苷酶之前用于灭活或移出一种第一外切糖苷酶的方法包括将反应混合物加热、将反应混合物冷却、加入有机溶剂、加入蛋白酶，和/或它们的组合。在一些实施方案中，该第一外切糖苷酶在加入一种第二外切糖苷酶之前从该反应中被移出，例如通过色谱法、固相萃取柱柱体、分子量过滤器、离心作用、沉淀作用、和/或它们的组合。本领域的普通技术人员应当认识到这些相同的原则适用于第三、四、五、六、等等外切糖苷酶。
[0082]在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息，该信息不同于用同一组外切糖苷酶同时消化所揭示的信息。
[0083]在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息，该信息与用同一组外切糖苷酶同时消化所揭示的信息相同。
[0084]在一些实施方案中，改变给予多种外切糖苷酶的顺序揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息。仅给出一个实例，将一种具体的N-聚糖按照以下具体顺序经受(1)唾液酸酶、(2)半乳糖苷酶、(3)己糖胺酶、(4)岩藻糖苷酶，以及(5)甘露糖苷酶的处理，会产生一组消化产物，该组消化产物不同于将同样的N-聚糖按照以下顺序经受(1)己糖胺酶、(2)甘露糖苷酶、(3)唾液酸酶、(4)岩藻糖苷酶以及(5)唾液酸酶的处理所获得的消化产物。进行这两种系列的顺序消化，分析通过两种顺序消化所获得的不同组的消化产物，并且比较不同组的消化产物(例如，相对于彼此和/或相对于一个参比样品)可以提供有关N-聚糖的结构和/或组成的信息，该信息将不会通过仅进行这些系列的顺序消化之一并且分析仅从这些系列的顺序消化之一所获得的消化产物而获得。顺序消化方法的实例以及此类方法的分析说明于实例3中。
[0085]在一些实施方案中，对构成有待用于顺序和/或同时消化的一组酶的单个的酶进行挑选以便将可通过进行消化而获得的信息最大化。表2中所示的处理例证了酶处理的选择以鉴定唾液酸化的聚糖上特异的聚糖修饰作用。
表2.用于鉴定唾液酸化的聚糖上的修饰作用的示例性的酶处理
  有待鉴定的聚糖修饰作用的实例   可应用至所选择的聚糖的修饰作用的鉴定上的酶处理的实例*
  聚乳糖胺   将使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶而没有唾液酸酶、以及N-乙酰己糖胺酶的顺序反应与同时反应进行比较。
  触角的岩藻糖基化物   将使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶的顺序处理与同时处理进行比较。将使用α-1，3岩藻糖苷酶以及α-1，6，3岩藻糖苷酶的多种处理(例如，顺序和/或同时的)进行比较。将使用岩藻糖苷酶，跟随半乳糖苷酶或半乳糖苷酶，跟随岩藻糖苷酶的多种处理(例如，顺序和/或同时的)进行比较。将使用以及没有使用岩藻糖苷酶的多种处理(例如，顺序和/或同时的)进行比较。
  杂合聚糖   将使用唾液酸酶、半乳糖苷酶以及N-乙酰己糖胺酶、己糖胺酶、以及甘露糖苷酶的顺序反应与同时反应进行比较。
  硫酸化的聚糖   将使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶而没有唾液酸酶、以及N-乙酰己糖胺酶的顺序反应与同时反应进行比较。
  磷酸化的聚糖   将使用以及没有使用甘露糖苷酶的多种处理(例如，顺序和/或同时的)进行比较。
  连接GlcNAc的唾液酸   将使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶而没有唾液酸酶、以及N-乙酰己糖胺酶的顺序反应与同时反应进行比较。
[0086]在一些实施方案中，用于鉴定非唾液酸化的聚糖上的修饰作用的酶处理可以如表2中所说明而进行，除了将唾液酸酶从表2中所例证的反应中省略之外。
聚糖结构的分析
[0087]总体而言，根据本披露的方法包括将一种聚糖制品经受一个外切糖苷酶处理。在一些实施方案中，一旦一种外切糖苷酶的处理已经执行完成，就对已切割的聚糖的结构和/或身份进行分析。在一些实施方案中，样品可以在外切糖苷酶处理的过程中从聚糖制品中移出。在一些实施方案中，在时间上分离开(例如，以规则的或是不规则的间隔)的多个样品可以在外切糖苷酶处理的过程中(例如，在完成外切糖苷酶处理之前的任何一个时间点)从聚糖制品中被移出。在一些实施方案中，外切糖苷酶处理包括给予至少一种外切糖苷酶，以及包括在给予至少一种外切糖苷酶的过程中将至少一种样品移出的移出步骤(例如，在将外切糖苷酶加到该聚糖制品之后，但在该外切糖苷酶已经被灭活和/或从该聚糖制品中被移出之前)。在一些实施方案中，外切糖苷酶处理包括顺序地给予至少一种第一以及第二外切糖苷酶(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、和/或更多外切糖苷酶)，以及移出步骤，该移出步骤包括(i)在给予该第一外切糖苷酶之后但在给予该第二外切糖苷酶之前移出至少一个第一样品；以及(ii)在给予该第二外切糖苷酶之后移出至少一个该第二样品。在一些实施方案中，在所移出的样品的至少一种中对切割的聚糖的结构和/或身份进行分析。在一些实施方案中，该分析步骤包括将在一种或多种所移出的样品中的切割聚糖的结构和/或功能与在至少一种其他的所移出的样品中的切割聚糖的结构和/或功能进行比较。在一些实施方案中，该分析步骤包括将在一种或多种所移出的样品中的切割聚糖的结构和/或功能与在一种参比样品中的切割聚糖的结构和/或功能进行比较。
[0088]N-聚糖的结构和组成可以通过任何一种可供使用的方法进行分析。在一些实施方案中，N-聚糖的结构和组成可以通过以下方法进行分析：色谱方法、质谱法(MS)、色谱方法跟随有MS、电泳法、电泳法跟随有MS、核磁共振(NMR)法，以及它们的组合。
[0089]在一些实施方案中，N-聚糖的结构和组成可以通过色谱方法进行分析，包括但不限于，液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)，超高效液相色谱法(UPLC)，薄层色谱法(TLC)，酰胺柱色谱法，以及它们的组合。
[0090]在一些实施方案中，N-聚糖的结构和组成可以通过质谱法(MS)以及相关的方法进行分析，包括但不限于，串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)、以及它们的组合。
[0091]在一些实施方案中，N-聚糖结构和组成可以通过电泳法进行分析，包括但不限于毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有使用识别特定的多糖结构的的抗体蛋白质印迹法，以及它们的组合。
[0092]在一些实施方案中，N-聚糖结构和组成可以通过核磁共振(NMR)以及相关方法进行分析，包括但不限于，一维NMR(1D-NMR)，二维NMR(2D-NMR)，相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)，全相关光谱NMR(TOCSY-NMR)，异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)，异核多级量子相干(HMQC-NMR)，旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)，核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合。
[0093]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的几种N-聚糖。例如，本方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中按照以下水平存在的几种N-聚糖：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。
[0094]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的具体的连接。例如，本方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中按照以下水平存在的具体的连接：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。
[0095]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的几种单个的N-聚糖的相对水平。例如，可以对液相色谱法中每个峰之下的面积进行测量并且将其表达为总数的一个百分数。这种分析提供了多种N-聚糖的一个群体中的每个N-聚糖种类的相对百分比的量。
应用
[0096]本披露提供了用于分析任何一种聚糖的结构和/或组成的方法。仅给出一个实例，本披露提供了用于分析一种糖蛋白的糖基化作用模式的方法。本披露涵盖了以下认识，即确定一种糖蛋白的糖基化作用模式具有多种潜在的商业性、工业性、和/或治疗性应用。
[0097]根据本发明的方法可以被施用至获自各种各样来源的聚糖中，包括但不限于，治疗性配制品(例如，促红细胞生成素、胰岛素、人生长激素、等等)、商业性生物产品(例如，在表3中所呈现的那些生物产品)、以及生物样品。生物样本在根据本披露得到分析之前或之后可以经历一个或多个分析和/或纯化步骤。仅给出一些实例，在一些实施方案中，使用一种或多种蛋白酶和/或外切糖苷酶对生物样本进行处理(例如，这样聚糖被释放出来)；在一些实施方案中，用一个或多个可检测测的标记物或其他试剂对生物样本中的聚糖进行标记(这可促进通过例如质谱或NMR进行分析)。多种分离和/或离析步骤中的任何一个可以被施用至根据本披露的一种生物样本中。
[0098]可以利用本披露的方法来分析处于多种状态中的任何一种的聚糖，例如游离的聚糖、结合糖(例如，糖肽、糖脂、蛋白聚糖、等等)、与细胞缔合的聚糖(例如，与细胞核、细胞质、细胞膜缔合的聚糖、等等)；与细胞的、细胞外、细胞内、和/或亚细胞的组分(例如蛋白质)缔合的聚糖；在细胞外空间的聚糖(例如，细胞培养基)、等等。
[0099]本披露的方法可以用于针对生产所感兴趣的一种治疗性或其他商业上相关的糖蛋白的工艺开发的一个或多个阶段中。可以采用本披露的方法的此类过程进展阶段的非限制性的实例包括细胞选择、克隆选择、培养基最佳化、培养条件、处理条件、和/或纯化操作。本领域的普通技术人员应当意识到其他的过程进展阶段。
[00100]还可以利用本披露来监测在一个具体的细胞培养物中所发生的糖基化作用的程度和/或类型，由此允许调节或可能地终止培养，以便(例如)实现一种特别希望的糖基化作用模式或避免发展一种特别不希望的糖基化作用模式。
[00101]还可以利于本披露来评估细胞或细胞系的糖基化作用特征，这些细胞或细胞系被认为用于生产一种特别希望的糖蛋白(例如，甚至是在对这些细胞或细胞系进行工程处理以生产该糖蛋白、或生产一种处于商业上相关水平的糖蛋白之前)。
[00102]例如，其中靶糖蛋白是一种治疗性糖蛋白，例如在一个或多个国家中已经历了规章审查，经常会希望的是监测这些培养物以便评估它们会产生具有一种糖基化作用模式(尽可能接近于已确立的药物产品的糖基化作用模式)的产物的可能性，无论它是否正在通过确实相同的路径进行生产。如在此所使用，“接近”是指一种糖基化作用模式，该模式与所确立的药物产品的糖基化作用模式具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的相关性。在此类实施方案中，典型地在多个时间点获取生产培养物的样品并且将它们与一个已确立的标准或与一个对照培养物进行比较以便评估相对的糖基化作用。
[00103]例如，在一些实施方案中，用于监测一种糖蛋白的生产的方法可以包括以下步骤：(i)在一种糖蛋白的生产过程中，从该生产体系中移出至少第一以及第二含聚糖的样品；(ii)将该第一以及第二含聚糖的样品各自经受一个外切糖苷酶操作，以便特异性地从在该含聚糖的样品中的N-连接的聚糖的非还原性末端对单糖进行切割；并且(iii)将从该第一含聚糖的样品中获得的这些切割产物与从该第二含聚糖的样品中的那些切割产物进行比较，从而确定了差别并且因此使糖蛋白生产的进程得到监测。
[00104]在一些实施方案中，用于监测一种糖蛋白的生产的方法涉及在外切糖苷酶反应的过程中(例如，外切糖苷酶操作)在某个点移出至少一种含聚糖的样品。在一些实施方案中，用于监测一种糖蛋白的生产的方法涉及在外切糖苷酶反应已完成之前移出至少一种含聚糖的样品。在一些实施方案中，用于监测一种糖蛋白的生产的方法涉及一旦外切糖苷酶反应完成就移出至少一种含聚糖的样品。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品在以下条件时被移出：外切糖苷酶操作完成了约10％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％，约60％、约70％、约75％、约80％、约90％、约95％、约99％、几乎100％、基本上100％、或100％。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品当外切糖苷酶反应完成了几乎100％时被移出。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品当外切糖苷酶反应完成了100％时被移出。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品在外切糖苷酶反应完成了100％之前被移出。
[00105]在一些实施方案中，含聚糖的样品包括多种结合糖(例如，多种糖蛋白)。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品在100％的这些结合糖已经被切割之前被移出。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品在100％的这些结合糖已经被切割时才被移出。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品在以下条件时被移出：约10％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％，约60％、约70％、约75％、约80％、约90％、约95％、约99％、几乎100％、基本上100％、或100％的这些结合糖已经被切割。在一些实施方案中，至少一种含聚糖的样品在100％的结合糖已经被切割时被移出。在一些实施方案中，至少一种含聚糖样品是在100％的结合糖已经被切割之前被移出。
[00106]在一些实施方案中，含聚糖的样品以规则的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品按照以下间隔被移出：约30秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约12小时、或约18小时的间隔、或以甚至更长的间隔移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以不规则的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以5小时的间隔被移出。
[0004]在本披露的一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会更加广泛。例如，在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式显示高度的糖基化位点占用(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)；在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式显示出一个高分支度(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高具有三或四触角结构)。
[0005]在本披露的一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会不太广泛。例如，在一些实施方案中，一种所希望的细胞表面糖基化作用模式显示出低的糖基化位点占有(例如，小于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约15％、约5％、约1％、或更小)；和/或一种低分支度(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％或更少具有三或四触角结构)。
[0006]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式在一些方面将会更加广泛，而在其他方面将会不太广泛。例如，采用易于产生具有长的，未分枝的寡糖链的糖蛋白的一种细胞系，这可能是所希望的。可替代地，采用易于产生具有短的，高度分支的寡糖链的糖蛋白的一种细胞系，这可能是所希望的。
[0007]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会针对一种具体类型的聚糖结构进行富集。例如，在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将会具有低水平的(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)高甘露糖或杂合结构，高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)高甘露糖结构，高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高；例如，每个糖蛋白至少一个)磷酸化的高甘露糖，或低水平的(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)磷酸化的高甘露糖。
[0008]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括至少约一种唾液酸。在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括一个高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)唾液酸化的末端。在一些实施方案中，一种所希望的的糖基化作用模式(包括唾液酸化作用)将显示出至少约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高的N-乙酰神经氨酸和/或小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少的N-乙酰神经氨酸。
[0009]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式显示出分支延长的特异性(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多的延长是在α1，6甘露糖分枝上；或大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多的延长是在α1，3甘露糖分枝上)。
[0010]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的核心岩藻糖基化作用。
[0011]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的一种硫酸化的聚糖。
[0012]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的一种磷酸化的聚糖。
[0013]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的连接到N-乙酰葡糖胺上的一种唾液酸。
[00107]在一些实施方案中，一种所希望的糖基化作用模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更小)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更大)的一种乙酰化的聚糖。
[00108]无论是否出于质量控制的目的而监测一种具体的靶蛋白的生产，可以利用本披露来例如监测处于发展的具体阶段的，或在具体的生长条件下的糖基化作用。
[00109]在一些实施方案中，在此所说明的方法可以用来表征和/或控制或比较多种治疗性产品的质量。仅给出一个实例，本发明的方法学可以用于评估在产生一种治疗性蛋白产品的细胞中的糖基化作用。具体而言，假定糖基化作用可经常影响一种治疗性蛋白产品的活性、生物利用度、或其他特征，则用于评估在这种治疗性蛋白产品的生产过程中的细胞的糖基化作用的方法是特别希望的。除其他事项之外，本披露可以促进在用于治疗性蛋白的生产体系中的糖基化作用的实时分析。
[00110]代表性的治疗性糖蛋白(其生产和/或质量可以根据本披露进行监测)包括，例如，多种血液学试剂中的任何一种(包括例如，促红细胞生成素、血液凝固因子，等等)、干扰素、集落刺激因子、抗体、酶、以及激素。
[00111]代表性的可商购的糖蛋白产品包括，例如表3中所呈现的那些糖蛋白产品：
表3：示例性的可商购的糖蛋白产品
Figure A20088001180600521
Figure A20088001180600541
Figure A20088001180600551
[00112]在一些实施方案中，本披露提供了多种方法，在这些方法中将来自不同来源或样品的聚糖彼此进行比较。在一些此类的实例中，随着时间获得了来自相同来源的多个样品，这样糖基化作用模式中的变化(并且特别是细胞表面的糖基化作用模式)就得到监测。在一些实施方案中，样品之一是一种历史样品或历史样品的一个记录。在一些实施方案中，样品之一是一个参比样品。
[00113]在一些实施方案中，对来自不同的细胞培养物样品的聚糖进行比较，这些聚糖在以下条件下进行制备，这些条件在一个或多个所选择的参数方面有所不同(例如，细胞类型，培养类型[例如，连续进料对比分批进料，等等]、培养条件[例如，培养基的类型、一种或多种具体的培养基中具体成分的存在，或浓度、渗透性、pH、温度、一种或多种因素(如渗透性、pH、温度，等等)变换的时间或程度]、培养时间，分离步骤，等等)，但在其他方面相同，从而确定所选择的参数对N-糖基化作用模式的影响。在一些实施方案中，对来自不同的细胞培养物样品(该样品在一定的条件下得到制备，这些条件在一个单一选择的参数方面有所不同)的聚糖进行比较，从而确定该单一选择的参数对糖基化作用模式的影响。因此，在其他应用中，使用在此所说明的技术可促进了确定具体的参数对细胞中的糖基化作用模式的影响。
[00114]在一些实施方案中，对来自不同批次的一种所感兴趣的糖蛋白的聚糖(例如，一种治疗性糖蛋白)(无论是通过相同的方法还是通过不同的方法进行制备，以及无论是同时制备还是分开制备)进行了比较。在此类实施方案中，本披露促进了糖蛋白制品的质量控制。可替代地或额外地，一些此类的实施方案促进了监测一种具体的培养物(生产一种所感兴趣的糖蛋白)的进程(例如，当样品在不同的时间点从培养物中移出，并且进行分析并且彼此进行比较时)。在一些实例中，随着时间获得了来自相同来源的多个样品，这样糖基化作用模式中的变化就得到了监测。在一些实施方案中，含聚糖的样品按照以下间隔被移出：约30秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约12小时、或约18小时的间隔、或以甚至更长的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以不规则的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以5小时的间隔被移出。
[00115]在一些实施方案中，根据本披露的方法可以用于监测糖蛋白在其通过细胞进行生产的过程中的糖基化作用模式。例如，糖蛋白的生产(例如，商业性生产)可以涉及以下步骤：(1)培养产生糖蛋白的细胞，(2)在培养过程中以规格或不规则的间隔获得样品，并且(3)分析在所获得的一种或多种样品中所产生的一种或多种糖蛋白的糖基化作用模式。在一些实施方案中，此类方法可以包括将在所获得的样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化作用模式彼此进行比较的一个步骤。在一些实施方案中，此类方法可以包括将在所获得的一个或多个样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化作用模式与一个参比样品的糖基化作用模式进行比较的一个步骤。
[00116]在这些实施方案的任何一个中，聚糖分析的特征可以(例如在一个质量控制记录中)得到记录。如以上所指明，在一些实施方案中，与糖蛋白的一个先前的历史记录，或标准批次和/或与一个参比样品进行了比较。
[00117]在一些实施方案中，将来自不同批次的一种所感兴趣的糖蛋白的聚糖(例如，一种治疗性糖蛋白)(无论是通过相同的方法还是不同的方法进行制备，以及无论是通过同时制备还是分别制备)彼此之间和/或与一个参比样品进行了比较。在一些实施方案中，批次对批次的比较可包括以下步骤：(i)提供来自一个第一批次的糖蛋白的一个第一聚糖制品；(ii)提供来自一个第二批次的糖蛋白的一个第二聚糖制品；(iii)将该第一以及第二聚糖制品各自经受一个外切糖苷酶操作(例如，顺序和/或同时地用1、2、3、4、5、6、7、或更多种外切糖苷酶进行处理)，以便特异性地从在该聚糖制品中的N-连接的聚糖的非还原性末端对单糖进行切割；并且(iv)将获自该第一聚糖制品的切割产物与获自该第二制品的切割产物进行比较，这样这两个批次的一致性就得到评定。在一些实施方案中，可以通过从来自一个批次的至少一种糖蛋白中移出至少一种N-聚糖而提供聚糖制品，并且可任选地，分离所移出的N-聚糖。在一些实施方案中，聚糖制品可以如在此所说明进行标记(例如，荧光地和/或放射性地；例如，在分离之前和/或之后)。
[00118]在一些实施方案中，本披露促进了糖蛋白制品的质量控制。聚糖分析的特征可以(例如在一个质量控制记录中)得到记录。如以上所指明，在一些实施方案中，与糖蛋白的一个先前的历史记录或标准批次进行了比较。在一些实施方案中，与一种参比糖蛋白样品进行了比较。
[00119]在一些实施方案中，可在多项研究中利用本披露来修饰一种细胞的糖基化作用特征，(例如)以便确立具有一个或多个所希望的糖基化作用特征的一种细胞系和/或培养条件。然后，可以利用这种细胞系和/或培养条件(如果希望的话)用于生产一种具体的靶结合糖(例如，糖蛋白)，预期这种或此类糖基化作用特征对其是有益的。
[00120]在一些实施方案中，根据本披露的技术可被施用至在细胞的表面存在的聚糖。在一些实施方案中，所分析的聚糖基本上没有非细胞表面聚糖。在一些实施方案中，所分析的聚糖，当存在于细胞表面上时，存在于一种或多种细胞表面的结合糖(例如，糖蛋白或糖脂类)的环境中。在一些实施方案中，一种膜结合的或跨膜的细胞表面糖蛋白的糖基化作用模式可以通过以下方法得到确定：(1)通过使用一种或多种蛋白酶进行处理来释放该糖蛋白；(2)通过用聚糖酶消化所释放的糖蛋白来分离一个聚糖群体；(3)根据在此说明的方法中的任何一种通过外切糖苷酶消化来消化该聚糖群体；并且(4)使用对本领域普通技术人员而言可供使用的任何一种方法来分析消化产物。
[00121]在一些具体的实施方案中，对细胞表面聚糖进行了分析以便评定一种或多种所感兴趣的靶糖蛋白的糖基化作用，特别是其中此类靶糖蛋白不是细胞表面糖蛋白。在一些实施方案中，可以监测一种靶糖蛋白的糖基化作用而不将该糖蛋白自身分离。在一些实施方案中，本披露提供了使用细胞表面聚糖作为在一个所感兴趣的已表达的糖蛋白上的一种读出信息(readout)或代表物(proxy)的方法。在一些实施方案中，此类方法包括但不限于，后处理、批次、筛选或产品质量的“在线”测量。此类方法可以使用生产反应(例如，细胞)的一个副产物，提供一种所感兴趣的已生产的糖蛋白的一种独立的糖基化作用模式的测量，而不需要任何已生产的糖蛋白的破坏的使用。此外，根据本披露的方法可以避免产物的分离以及可能在分离过程中发生的潜在的产物的糖形的选择所需要的努力。
[00122]在一些实施方案中，根据本披露的技术可被施用至从细胞中分泌的聚糖中。在一些此类的实施方案中，所分析的聚糖是由细胞在一种结合糖(例如，一种糖蛋白或糖脂)的环境下产生的。
[00123]根据本披露，在此所说明的技术可以用于检测所希望的或不希望的聚糖，例如用于检测在一个产品中一种或多种污染物的存在或对其进行定量，或用于检测一种或多种活性或所希望的种类的存在或对其进行定量。
[00124]在不同的实施方案中，这些方法可以用于检测生物标记物，这些生物标记物在症状出现之前和/或疾病状态发展到一种不可处理或处理可能性较小的状态之前通过检测一种或多种特异性的聚糖来指明例如一种疾病状态，这种或这些特异性的聚糖的存在或水平(不论是绝对或相对的)可以与一种具体的疾病状态(包括对于一种疾病的易感性)和/或随着时间在此类聚糖的浓度方面的变化相关。
[00125]在一些实施方案中，在此所说明的方法促进了聚糖的检测，这些聚糖在一个来源(例如，一种生物样品，聚糖制品，等等)中以非常低的水平存在。在此类实施方案中，有可能检测聚糖的水平和/或可任选地对其进行定量，这些聚糖在多种聚糖的一个群体中按照以下水平存在：小于约10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、或0.01％。在一些实施方案中，有可能检测聚糖的水平和/或可任选地对其进行定量，这些聚糖包括在0.1％与5％之间，例如，在0.1％与2％之间，例如，在0.1％与1％之间的一种聚糖制品。在一些实施方案中，有可能检测细胞表面聚糖的水平和/或可任选地对其进行定量，这种细胞表面聚糖在约0.1fmol与约1mmol之间。
[00126]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种聚糖的一个群体中以低水平存在的具体的连接。例如，本方法允许检测在多种聚糖的一个群体中按照以下水平存在的具体的连接：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。
[00127]在一些实施方案中，在此所说明的方法允许检测在多种聚糖的一个群体中几种单个的聚糖的相对水平。例如，可以对液相色谱法中每个峰之下的面积进行测量并且将其表达为总数的一个百分数。这种分析提供了在多种聚糖的一个群体中每个聚糖种类的一个相对百分比的量。
[00128]在一些实施方案中，在此所说明的技术可以与一种或多种技术相结合，用于聚糖或结合糖的检测、分析、以及分离。例如，在一些实施方案中，根据本披露使用一种或多种可供使用的方法对聚糖进行分析(仅给出一些实例，参见Anumula，Anal.Biochem.350(1)：1，2006；Klein et al.，Anal.Biochem.，179：162，1989；和/或Townsend，R.R.Carbohydrate Analysis”High Permofrmance Liquid Chromatography andCapillary Electrophoresis.，Ed.Z.El Rassi，pp 181-209，1995，这些文献中的每一个其全文均通过引用结合在此)。例如，在一些实施方案中，使用一种或多种色谱方法、电泳法、核磁共振法，以及它们的组合对聚糖进行表征。示例性的此类方法包括例如，NMR、质谱法、液相色谱法、2-维色谱法、SDS-PAGE、抗体染色、凝集素染色、单糖定量、毛细管电泳法、荧光团辅助糖电泳(FACE)、胶束动电色谱法(MEKC)、外切糖苷酶或内切糖苷酶处理，以及它们的组合。本领域的普通技术人员应当意识到其他方法，这些方法可以与在此所说明的IMAC方法一起使用来对聚糖进行表征。
[00129]在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过色谱方法进行分析，包括但不限于，液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)，超高效液相色谱法(UPLC)，薄层色谱法(TLC)，酰胺柱色谱法，以及它们的组合。
[00130]在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过质谱法(MS)以及相关的方法进行分析，包括但不限于，串联MS、LC-MS、LC-MS/MS，基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)，傅里叶变换质谱法(FTMS)，离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)，电子转移解离(ETD-MS)，以及它们的组合。
[00131]在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过电泳法进行分析，包括但不限于毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有蛋白质印迹法(使用识别特定的多糖结构的抗体)，以及它们的组合。
[00132]在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过核磁共振(NMR)以及相关方法进行分析，包括但不限于，一维NMR(1D-NMR)，二维NMR(2D-NMR)，相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)，全相关光谱NMR(TOCSY-NMR)，异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)，异核多级量子相干(HMQC-NMR)，旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)，核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合。
[00133]本披露参照以下的实例应当得到更确切地阐述。然而，应当理解的是本披露不以任何方式通过这些实例而受到限制。
实例
实例1：使用外切糖苷酶逐步消化N-聚糖
材料和方法
样品制备
[00134]通过N-聚糖酶F将N-聚糖从一种纯化的示例性糖蛋白中释放出来，跟随有一个清除步骤以便移出盐类、洗涤剂、蛋白质、以及非聚糖材料。首先将蛋白热变性，并接着使用过量的N-聚糖酶F在SDS的存在下于37℃进行过夜处理。用一种石墨化的碳柱(例如，EnviCarb)将所释放的聚糖从这些盐和酶中分离出来。对N-聚糖在还原性末端(N-聚糖-2AB)进行荧光标记，并且过量的标记物通过加入一个额外的清除步骤而被移出。首先将2-AB溶解在处于DMSO溶液中的30％乙酸中，并且将氰基氢硼酸钠加至最终浓度为1.2M。将约5至10μl的这种进行标记的溶液加到经干燥的聚糖中并且加热至65℃持续3小时，以便使标记完成。然后通过将该样品施用到一个Glycoclean S药筒中，用96％乙腈洗涤，并用水洗脱而将经标记的聚糖从游离的标记物和盐类中分离出来。
外切糖苷酶反应
[00135]将聚糖混合物(0.25nmol/μl至0.5nmol/μl)经受分步处理，该处理采用至少两种选自下组的外切糖苷酶(每20μl至40μl反应体积有1μl至2μl序列等级的糖苷酶)，该组的构成为：唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶。典型地，这些反应在pH约为5.5时进行。在分步分析的每个步骤之后，在加入下一种酶之前将酶灭活。
消化产物的分析
[00136]通过使用液相色谱法(LC)(该液相色谱法与质谱法(MS)相结合)在一个酰胺柱中确定了消化产物。聚糖的峰的结构鉴定通过基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)来完成。将聚糖保留时间与已知的标准物的以及与一种葡萄糖梯(glucose ladder)的保留时间进行比较。
结果
[00137]在用外切糖苷酶进行彻底的分步处理之后，大多数的N-聚糖被消化成一个保守的M3N2核心，其中一些小峰稍后在色谱图上洗脱(图2B)。质谱法(MS)确认了对应着乳糖胺的小峰(图2B)。
图2A示出了消化之前N-聚糖的色谱图。
实例2：使用多种外切糖苷酶同时消化N-聚糖
材料和方法
样品制备以及消化产物的分析
[00138]制备N-聚糖并且如在实例1中所说明对消化产物进行分析。
外切糖苷酶反应
[00139]将聚糖混合物(0.25nmol/μl至0.5nmol/μl)经受同时的处理，这种处理采用至少两种选自下组的外切糖苷酶(每20μl至40μl反应体积有1μ至2μl序列等级的糖苷酶)，该组的构成为：唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶。典型地，这些反应在pH为约5.5时进行。
结果
[00140]当用两种或多种外切糖苷酶对N-聚糖进行同时处理时，大多数的N-聚糖的结构塌陷成一种保守的核心(M3N2)。由于同时存在半乳糖苷酶以及己糖胺酶的活性，乳糖胺扩展被消除。如图3中所示，存在一些种类，这些种类具有30至70分钟的LC保留时间，它们对所使用的外切糖苷酶中的所有都具有抵抗力。这些种类对常规的外切糖苷酶处理而言是难治的这一事实表明它们包括不常见的修饰作用，这种作用可以通过MS分析得到鉴定并且可以通过测量峰面积(作为总数的一个百分数)而进行定量。
实例3：使用同时以及顺序的外切糖苷酶消化确定乳糖胺在一种N-聚糖中的存在
[00141]顺序对比同时的外切糖苷酶消化的实验计划可以用来获得有关在一种聚糖制品中的N-聚糖的结构和/或组成的信息。例如，乳糖胺基团的存在可以通过将由顺序与同时的消化所产生的消化产物进行比较而得到确定，如在表4中对于假设的N-聚糖结构所画的轮廓：
Figure A20088001180600621
[00142]在表4中所示的所有外切糖苷酶均具有广泛的底物特异性，即，它们将会从一个非还原性末端切割掉末端的糖，而不管连接的类型。顺序(Q)与同时(S)处理Rx04或Rx05的比较允许在一种待确认的聚糖制品中聚乳糖胺基团的存在。
表4.使用外切糖苷酶的顺序对比同时的消化
Figure A20088001180600631
[00143]如表4中所示，Rx04(S)以及Rx04(Q)各自均代表了用相同组的酶(广泛特异性的唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶)对同一种N-聚糖进行的消化。然而，同时(S)以及顺序(Q)消化产生了独特的消化产物。同样地，Rx05(S)以及Rx05(Q)各自均代表了用相同组的酶(广泛特异性的唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及岩藻糖苷酶)对同一种N-聚糖进行的消化。然而，同时(S)以及顺序(Q)的消化产生了独特的消化产物。这个实例证实了一种方式，其中将通过同时以及顺序的消化所产生的消化产物进行对比可以提供有关聚糖的结构和/或组成的信息。
[00144]以上实例在图7中得到进一步阐述，该图示出了如何通过顺序对比同时的消化将聚乳糖胺结构阐明。在图7中，该样品包括一个聚糖群体。在该聚糖群体用唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶进行同时消化之后，多数的聚糖被切割成Man3Gn2核心结构，如通过液相色谱法(LC；图7A)以及质谱法(MS；图7B)所指明。具有较长保留时间的一些选择性的峰对应着高甘露糖类型结构。然而，当使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶进行顺序消化时，除了与高甘露糖类型结构相关联的峰之外，额外的峰仍然存在。这些额外的峰对应于一些聚糖(具有附连至Man3Gn2核心上的一个乳糖)，如MS数据所指明得到保存。这些峰的存在(以顺序以及并非同时)对应着起始的样品中的聚乳糖胺类型结构。
实例4：使用同时以及顺序的外切糖苷酶消化鉴定在一种N-聚糖中的唾液酸连接
[00145]顺序对比同时的外切糖苷酶消化的实验计划可以用来获得有关一种聚糖制品中的N-聚糖的结构和/或组成的信息。例如，唾液酸连接的存在和/或类型可以通过将由顺序以及同时的消化所产生的消化产物进行比较而得到确定，如在表5中对于假设的N-聚糖结构所画的轮廓：
Figure A20088001180600641
[00146]表5呈现了一组唾液酸酶，每个具有一种不同的底物连接特异性。所呈现的实例证实了末端α-2，3唾液酸连接是如何可以与α-2，6-连接相区别的。
表5.在N-聚糖中唾液酸连接的确定
Figure A20088001180600651
[00147]如表5中所示，Rx12(S)以及Rx12(Q)各自均代表了用相同组的酶(α-2/3，6，8，9-唾液酸酶、β-1/3，4，6-半乳糖苷酶、以及β-1，4-己糖胺酶)对相同的N-聚糖进行的消化。然而，同时(S)以及顺序(Q)的消化产生了独特的消化产物。如所阐述，顺序与同时的消化之间的比较阐明了聚乳糖胺结构，并且2，6-连接的唾液酸存在于聚乳糖胺扩展上，而2，3-连接的唾液酸在具有仅一个乳糖胺的臂上。这个实例证实了一种方式，其中将通过由同时以及顺序的消化所产生的消化产物进行对比可以提供有关聚糖的结构和/或组成的信息。
[00148]此外，如表5中所展示，处理Rx15(Q)将在一个聚糖群体中的所有非唾液酸化的触角切割成了三甘露糖基聚糖的核心。这些切割产物包括单、二、三以及四触角种类，它可以是具有色谱特性的。这种特性提供了起始的聚糖混合物的触角组合物的一个可读物。具体而言，这种特性提供了唾液酸化分支的触角组合物的一个可读物。对于多个样品而言，在进行这种糖苷酶处理之后，每个单个的聚糖将具有尽可能多的被唾液酸化的分支，并且这些可以通过色谱法进行分离。这在图4中进行进一步展示，它代表了一个示例性N-聚糖群体，该N-聚糖群体经受了Rx05(Q)的消化条件的处理，如在表5中所示。对于在图4中所示的N-聚糖群体而言，这个实例示出了顺序的处理怎样可以产生多种消化产物的一个群体。可对消化产物进行分析，并且确定它们的结构和/或组成。
实例5：使用同时以及顺序的外切糖苷酶消化来鉴定在一种N-聚糖中的岩藻糖基连接
[00149]同时的外切糖苷酶消化的实验计划可以用来获得有关在一种聚糖制品中的N-聚糖的结构和/或组成的信息。例如，用外切糖苷酶的不同组合进行消化可以用于区分臂(触角)的α-1/3，4岩藻糖基化作用与一种先前的去唾液酸化的N-聚糖的核心α-1，6岩藻糖基化作用。在表6中所示的每种处理的影响在以下示例性的聚糖结构的情况下进行阐述：
表6.岩藻糖基连接的确定
  酶   Rx01   Rx02   Rx03   Rx04   Rx05   Rx06   Rx07
  β-1/3，4，6-半乳糖苷酶   ---   X   X --- X   X   X
  α-1/3，4，6-岩藻糖苷酶 --- X ---   --- --- X   ---
α-1/3，4-岩藻糖苷酶 --- --- X --- --- ---   X
  β-1，4-己糖   ---   X   X   X   X   ---   ---
Figure A20088001180600671
[00150]如在表6中所示，用不同组合的酶进行外切糖苷酶消化产生了独特的消化产物。在这里所呈现的实例中，仅基于质量进行的分析表明了两个岩藻糖残基的存在。然而，通过使用以上的方法，可以确定两个岩藻糖残基的位置(即，一个岩藻糖位于核心并且另一个岩藻糖位于支链，对比这两个岩藻糖残基出现在支链上)。这个实例证实了一种方式，其中将通过由同时的消化所产生的消化产物进行对比可以提供有关聚糖的结构和/或组成的信息。
实例6：含聚乳糖胺的聚糖的快速鉴定
[00151]使用肽将N-连接的聚糖从一种模型糖蛋白中释放出来：N-糖苷酶F(PNGase-F)产生了一个聚糖样品。PNGase-F是一种酰胺酶，它可以在最里面的GlcNAc与来自N-连接的糖蛋白的高甘露糖、杂合以及复合的寡糖的天冬酰胺残基之间进行切割(Maley et al.，1989，Anal.Biochem.，180：195；通过引用结合在此)。PNGase F可以水解来自糖肽和/或糖蛋白的几乎所有类型的N-聚糖链。使用活化的石墨化的碳固相萃取柱柱体将产生的聚糖样品纯化。然后，用2-苯甲酰胺对该聚糖混合物进行荧光标记。将该聚糖样品分成两个相等的部分，并且每个部分与一组外切糖苷酶(即，唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及N-乙酰己糖胺酶)以同时或顺序的方式分别进行反应。随后通过正相荧光HPLC使用一种酰胺柱或MALDI-MS对反应产物进行分析。分析的结果呈现在图8(色谱图)以及图9(MALDI-MS)中。
等效物和范围
[00152]本领域的普通技术人员应认识到、或通过使用不超出使用常规实验即能够确定与在此说明的本披露的特定的实施方案一致的很多等效物。本披露的范围并非旨在限制于以上的说明，而是如所附的权利要求书中所给出。
[00153]本领域的普通技术人员应当认识到、或通过使用不超出使用常规实验即能够确定与在此说明的具体实施方案一致的很多等效物。本披露的范围并非旨在限制以上说明，而是如所附的权利要求书中所给出。
[00154]在权利要书中，冠词例如“一个(种)”以及“该”可以表示一个或多于一个，除非指明与此相反或另外从上下文中是明确的。因此，例如，提及“一种纳米颗粒”包括多个此类纳米微粒，并且提及“该细胞”包括提及一个或多个本领域技术人员所知的细胞，等等。包括一组的一个或多个成员“或”在其之间的权利要求书或说明书被认为是满足以下条件：该组成员中的一个、多于一个或所有是否存在于，被用于、或者另外涉及了一个给定的产物或方法，除非指明与此相反或另外从上下文中是明确的。本披露包括多个实施方案，其中该组的一个成员准确地存在于，被用于、或者另外涉及了一种给定的产物或方法。本披露包括多个实施方案，其中该组成员的多于一个或所有成员准确地存在于，被用于、或者另外涉及了一种给定的产物或方法。此外，应该理解的是本披露涵盖了多种变体、组合以及排列，其中一个或多个限制、要素、条款、描述性术语、等等，从一个或多个所列出的权利要求中引入到另一个权利要求。例如，可以对从属于另一个权利要求的任何一项权利要求进行修改以便包括在从属于同一基础权利要求的任何一项其他的权利要求中发现的一个或多个限制。此外，在权利要求提及一种组合时，应理解的是包括针对在此所披露的目中任何一种目的的组合的方法，并且包括根据形成在此所披露的多种方法中的任何一种而形成组合的方法或在本领域已知的其他方法，除非另有说明或者除非对于本领域的普通技术人员而言明显会产生一种矛盾或不一致性。
[00155]当多种要素作为列表(例如以Markush组的格式)来呈现时，应理解的是这些要素中的每个亚组也已被披露并且任何一个或多个要素可以从该组中被移出。应当理解的是，总体而言，当提及本披露或根据本披露的多个方面包括具体的要素、特征、等等时，根据本披露的一些实施方案或根据本披露的多个方面包括，或基本上包括此类要素、特征，等等。出于简单的目的，那些实施方案没有在此处的这些词语中确切地给出。注意到了术语“包括”旨在是开放性的并且允许附加的要素或步骤的包含物。
[00156]当给出这些范围时，包括端点。此外，应该理解的是，除非另有指明或另外从上下文中以及本领域的普通技术人员的理解中是明确的，表达成范围的这些值可以采取在根据本披露的不同实施方案中所指出的范围内的任何一种特定的值或亚范围，到该范围的下限单位的十分之一(除非上下文呢另有清楚地指出)。
[00157]此外，应当理解的是，落入现有技术的本披露的任何一个具体实施方案可以明确地从这些权利要求中的任何一项或多项中排除。因为此类实施方案被认为是本领域的普通技术人员所已知的，即使没有在此明确地提出这种排除，它们也可以被排除。根据本披露的这些组合中的任何一个具体的实施方案(例如，任何外切糖苷酶、任何糖苷连接、任何反应条件、任何提纯的方法、产物分析的任何方法、等等)可以从任何一项或更多项权利要求以任何原因而被排除，不论是否涉及现有技术的存在。
[00158]提供以上以及贯穿本文所讨论的的公开文件仅仅是因为它们的披露是早已本申请的提交日。在此的任何内容都不能被解释为承认诸位发明人没有资格由于在先披露而在这种披露之前。

Claims (132)

1.一种方法，包括以下步骤：
提供一种聚糖制品；
将该聚糖制品的一个第一样品经受一个第一外切糖苷酶操作；
使该聚糖制品的一个第二样品经受一个第二外切糖苷酶操作，其中该第二外切糖苷酶操作不同于该第一外切糖苷酶操作并且进一步地其中该第一以及第二外切糖苷酶操作选自下组，其构成为：
没有进行处理；
顺序地进行处理；以及
同时地进行处理；
对该第一以及第二外切糖苷酶操作的切割产物进行表征；以及
将该第一外切糖苷酶操作的这些切割产物的表征结果与该第二外切糖苷酶操作的切割产物的表征结果进行比较，从而确定该聚糖制品的至少一个糖基化作用的特征。
2.如权利要求1所述的方法，其中该比较步骤包括将该第一或第二外切糖苷酶操作的切割产物的表征结果与一个参比样品的切割产物进行比较。
3.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用一种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用至少两种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
5.如权利要求4所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
6.如权利要求4所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶不是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
7.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用两种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
8.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用三种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
9.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用四种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
10.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用五种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
11.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用六种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
12.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括用至少七种选自下组的外切糖苷酶来处理该聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
13.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括使用至少一种外切糖苷酶顺序地处理该聚糖制品。
14.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括使用至少一种外切糖苷酶同时地处理该聚糖制品。
15.如权利要求1所述的方法，其中该第一或第二外切糖苷酶操作包括未用外切糖苷酶处理该聚糖制品。
16.如权利要求1所述的方法，其中至少一种切割产物包括含有三个甘露糖以及2个N-乙酰葡糖胺残基的一个戊糖核心。
17.如权利要求1所述的方法，其中该至少一种切割产物包括一种触角的岩藻糖基化物。
18.如权利要求1所述的方法，其中该至少一种切割产物包括一种乳糖胺扩展物。
19.如权利要求1所述的方法，其中该至少一种切割产物包括一种硫酸化的聚糖，一种磷酸化的聚糖，连接到N-乙酰葡糖胺上的一种唾液酸，或一种乙酰化的聚糖。
20.如权利要求1所述的方法，其中提供一种聚糖制品的步骤包括：
a)提供了多种糖蛋白，每种糖蛋白包括至少一个N-聚糖，
该N-聚糖被连接至这些糖蛋白之一上；
b)从至少一种糖蛋白中移出至少一个N-聚糖；
c)可任选地，将所移出的N-聚糖分离出来。
21.如权利要求20所述的方法，其中该移出步骤包括将一种糖蛋白或多种糖蛋白经受一个聚糖酶的处理。
22.如权利要求21所述的方法，其中该聚糖酶包括N-聚糖酶F。
23.如权利要求20所述的方法，其中该移出步骤包括将一种糖蛋白或多种糖蛋白经受化学切割处理。
24.如权利要求20所述的方法，其中该移出步骤包括将一种糖蛋白或多种糖蛋白经受肼处理。
25.如权利要求20所述的方法，进一步包括在分离步骤之前使用一种荧光标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
26.如权利要求20所述的方法，进一步包括在分离步骤之后使用一种荧光标记物将所移出的N-聚糖进行标记的步骤。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中该荧光标记物包括2-氨基苯甲酰胺，2-氨基嘌呤，或苯胺。
28.如权利要求20所述的方法，进一步包括在分离步骤之前使用一种放射性标记物以及一种同位素标记的试剂中的一种或两种将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
29.如权利要求20所述的方法，进一步包括在分离步骤之后使用一种放射性标记物将所移出的N-聚糖进行标记的步骤。
30.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受一个选自下组的操作，该组的构成为：色谱法、液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、薄层色谱法(TLC)、酰胺柱色谱法、质谱法(MS)、串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)、电泳法、毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有蛋白质印迹法(使用识别特定的聚糖结构的抗体)、核磁共振(NMR)：一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相关光谱NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多级量子相干(HMQC-NMR)、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合。
31.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受质谱法(MS)处理。
32.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受串联MS处理。
33.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受MALDI-MS处理。
34.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受核磁共振(NMR)处理。
35.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受色谱法处理。
36.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受毛细管电泳法(CE)处理。
37.如权利要求1所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受CE-MS处理。
38.如权利要求1所述的方法，进一步包括评估在该N-聚糖制品中的不常见的修饰作用的存在。
39.如权利要求38所述的方法，其中该不常见的修饰作用选自下组，其构成为：磷酸化、硫酸化、乙酰化、乳糖胺扩展、以及触角的岩藻糖基化作用。
40.一种表征多种连接蛋白的N-聚糖的方法，包括：
a)提供了多种糖蛋白，每种糖蛋白包括至少一种N-聚糖，该N-聚糖被连接至这些糖蛋白之一上；
其中这些糖蛋白中的至少一个成员的糖基化作用模式是不同于这些糖蛋白中的至少一个其他成员的糖基化作用模式；
b)从至少一种糖蛋白中移出至少一个N-聚糖；
c)可任选地，将所移出的N-聚糖分离出来；
d)通过将至少一种所移出的N-聚糖经受至少一个外切糖苷酶的酶的处理而从该至少一种所移出的N-聚糖的非还原性末端切割掉至少一个末端的糖苷键以生成多种切割产物；并且
e)对这些切割产物进行表征。
41.如权利要求40所述的方法，进一步包括将这些切割产物的表征结果与一种参比样品进行比较的一个步骤。
42.如权利要求40所述的方法，其中该至少一种外切糖苷酶的酶是选自下组，其构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
43.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该分离的N-聚糖经受至少两种选自下组的外切糖苷酶的酶的处理，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
44.如权利要求43所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
45.如权利要求43所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶不是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
46.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该分离的N-聚糖经受两种选自下组的外切糖苷酶的处理，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
47.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该分离的N-聚糖经受三种选自下组的外切糖苷酶的处理，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
48.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该分离的N-聚糖经受四种选自下组的外切糖苷酶的处理，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
49.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该分离的N-聚糖经受五种选自下组的外切糖苷酶的处理，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
50.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该至少一种移出的N-聚糖顺序地经受至少一种外切糖苷酶的处理。
51.如权利要求40所述的方法，其中该切割步骤包括将该至少一种移出的N-聚糖同时地经受至少一种外切糖苷酶的处理。
52.如权利要求40所述的方法，其中至少一种切割产物包括含有三个甘露糖以及2个N-乙酰葡糖胺残基的一个戊糖核心。
53.如权利要求40所述的方法，其中该至少一种切割产物包括一种触角的岩藻糖基化物。
54.如权利要求40所述的方法，其中该至少一种切割产物包括一种乳糖胺扩展物。
55.如权利要求40所述的方法，其中该至少一种切割产物包括一种硫酸化的聚糖，一种磷酸化的聚糖，连接到N-乙酰葡糖胺上的一种唾液酸，或一种乙酰化的聚糖。
56.如权利要求40所述的方法，其中该移出步骤包括将该糖蛋白或多种糖蛋白经受一种聚糖酶的处理。
57.如权利要求56所述的方法，其中该聚糖酶包括N-聚糖酶F。
58.如权利要求40所述的方法，其中该移出步骤包括将该糖蛋白或多种糖蛋白经受化学切割处理。
59.如权利要求40所述的方法，其中该移出步骤包括将该糖蛋白或多种糖蛋白经受肼处理。
60.如权利要求40所述的方法，进一步包括在分离步骤之前使用一种荧光标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
61.如权利要求40所述的方法，进一步包括在分离步骤之后使用一种荧光标记物将所移出的N-聚糖进行标记的步骤。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中该荧光标记物包括2-氨基苯甲酰胺。
63.如权利要求40所述的方法，进一步包括在分离步骤之前使用一种放射性标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
64.如权利要求40所述的方法，进一步包括在分离步骤之后使用一种放射性标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
65.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将这些切割产物经受一个选自下组的操作，该组的构成为：色谱法、液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、薄层色谱法(TLC)、酰胺柱色谱法、质谱法(MS)、串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)、电泳法、毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有使用识别特定的多糖结构的抗体的蛋白质印迹法、核磁共振(NMR)：一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相关谱NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多级量子相干NMR(HMQC-NMR)、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)、核欧沃豪斯效应谱NMR(NOESY-NMR)、以及它们的组合。
66.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受质谱法(MS)处理。
67.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受串联MS处理。
68.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受MALDI-MS处理。
69.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受核磁共振(NMR)处理。
70.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受色谱法处理。
71.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受毛细管电泳法(CE)处理。
72.如权利要求40所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受CE-MS处理。
73.一种方法，包括以下步骤：
将一种聚糖制品经受一个外切糖苷酶操作，其中该外切糖苷酶操作包括顺序地给予多种外切糖苷酶，并且其中该外切糖苷酶操作产生了在该聚糖制品中的聚糖的切割；
在该外切糖苷酶操作过程中从该聚糖制品获得了至少一个第一样品；并且
分析在该至少一个所获得的样品中所切割的聚糖类。
74.如权利要求73所述的方法，其中：
该获得步骤包括从该聚糖制品中移出在时间上分离开的多个样品；并且
该分析步骤包括将在一种或多种所移出的样品中的切割的聚糖类进行表征。
75.如权利要求74所述的方法，其中该分析步骤包括将在至少一种所移出的样品中的切割的聚糖类与在至少一种其他的所移出的样品中的切割的聚糖类进行比较。
76.如权利要求74所述的方法，其中该分析步骤包括将在至少一种所移出的样品中的切割的聚糖类与在一种参比样品中的切割的聚糖类进行比较。
77.如权利要求74所述的方法，其中这些样品以规则的间隔移出。
78.如权利要求74所述的方法，其中这些样品以不规则的间隔移出。
79.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约10％时，将这些样品移出。
80.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约25％时，将这些样品移出。
81.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约50％时，将这些样品移出。
82.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约75％时，将这些样品移出。
83.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约90％时，将这些样品移出。
84.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了几乎100％时，将这些样品移出。
85.如权利要求74所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了100％之前，将这些样品移出。
86.如权利要求74所述的方法，其中在这些聚糖被切割了100％之前，将这些样品移出。
87.如权利要求73所述的方法，其中：
该外切糖苷酶处理包括顺序地给予至少一种第一以及第二外切糖苷酶；并且
该获得步骤包括：
在给予该第一外切糖苷酶之后但是在给予该第二外切糖苷酶之前移出至少一个第一样品；并且
在给予该第二外切糖苷酶之后移出至少一个第二样品。
88.用于对一种糖蛋白的多个批次的进行比较一种方法，该方法包括以下步骤：
由该糖蛋白的一个第一批次提供一个第一聚糖制品；
由该糖蛋白的一个第二批次提供一个第二聚糖制品；
将该第一以及第二聚糖制品各自经受一个外切糖苷酶操作，以便特异性地从在该聚糖制品中的N-连接的聚糖的非还原性末端对单糖进行切割；并且
将由该第一聚糖制品所获得的切割产物与由第二制品所获得的切割产物进行比较这样评定两个批次的一致性。
89.如权利要求88所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用一种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
90.如权利要求88所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用至少两种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
91.如权利要求90所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
92.如权利要求90所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶不是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
93.如权利要求88所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用两种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
94.如权利要求88所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用三种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
95.如权利要求88所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括使用四种选自下组的外切糖苷酶进行处理，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
96.如权利要求88所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用五种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二聚糖制品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
97.如权利要求88所述的方法，其中该糖苷酶操作包括使用至少一种外切糖苷酶顺序地处理该第一以及第二聚糖制品。
98.如权利要求88所述的方法，其中该糖苷酶操作包括使用至少一种外切糖苷酶同时地处理该第一以及第二聚糖制品。
99.如权利要求88所述的方法，其中至少一种切割产物包括一种糖形，该糖形选自下组，其构成为
含有三个甘露糖以及2个N-乙酰葡糖胺残基的一个戊糖核心；
一种触角的岩藻糖基化物；
一种乳糖胺扩展物；
一种硫酸化的聚糖；
一种磷酸化的聚糖；
连接到一个N-乙酰葡糖胺上的一种唾液酸；以及
一种乙酰化的聚糖。
100.如权利要求88所述的方法，其中提供一种聚糖制品的步骤包括：
a)从来自该第一或第二批次的至少一种糖蛋白中移出至少一种N-聚糖；
b)可任选地，将所移出的N-聚糖分离出来。
101.如权利要求100所述的方法，其中该移出步骤包括将该糖蛋白批次经受一个聚糖酶或化学切割处理。
102.如权利要求100所述的方法，进一步包括在分离步骤之前或之后使用一种荧光标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
103.如权利要求100所述的方法，进一步包括在分离步骤之前或之后使用一种放射性标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
104.如权利要求88所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受一个选自下组的操作，该组的构成为：色谱法、液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、薄层色谱法(TLC)、酰胺柱色谱法、质谱法(MS)、串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)、电泳法、毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有使用识别特定的多糖结构的抗体的蛋白质印迹法、核磁共振(NMR)：一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相关光谱NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多级量子相干(HMQC-NMR)、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合。
105.用于监测一种糖蛋白的生产的一种方法，该方法包括以下步骤：
在一种糖蛋白的生产过程中，从该生产体系中移出至少第一以及第二含聚糖的样品；
将该第一以及第二含聚糖的样品各自经受一个外切糖苷酶操作，以便特异性地从在该含聚糖样品中的N-连接的聚糖的非还原性末端对单糖进行切割；以及
将从该第一含聚糖的样品中所获得的切割产物与从该第二含聚糖的样品中的那些产物进行比较，从而确定差别并且因此使糖蛋白生产的发展得到监测。
106.如权利要求105所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用一种选自下组外切糖苷酶来处理该第一以及第二含聚糖的样品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
107.如权利要求105所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用至少两种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二含聚糖的样品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
108.如权利要求107所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
109.如权利要求107所述的方法，其中该至少两种外切糖苷酶不是以相对于彼此基本上相等的量进行提供。
110.如权利要求105所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用两种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二含聚糖的样品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
111.如权利要求105所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用三种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二含聚糖的样品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
112.如权利要求105所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用四种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二含聚糖的样品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
113.如权利要求105所述的方法，其中该外切糖苷酶操作包括用五种选自下组的外切糖苷酶来处理该第一以及第二含聚糖的样品，该组的构成为：一种唾液酸酶、一种半乳糖苷酶、一种己糖胺酶、一种岩藻糖苷酶、一种甘露糖苷酶、以及它们的组合。
114.如权利要求105所述的方法，其中该糖苷酶操作包括使用至少一种外切糖苷酶顺序地处理该第一以及第二含聚糖的样品。
115.如权利要求105所述的方法，其中该糖苷酶操作包括使用至少一种外切糖苷酶同时地处理该第一以及第二含聚糖的样品。
116.如权利要求105所述的方法，其中至少一种切割产物包括一种糖形，该糖形选自下组，其构成为
含有三个甘露糖以及2个N-乙酰葡糖胺残基的一个戊糖核心；
一种触角的岩藻糖基化物；
一种乳糖胺扩展物；以及
一种硫酸化的聚糖；
一种磷酸化的聚糖；
连接到一个N-乙酰葡糖胺上的一种唾液酸；以及
一种乙酰化的聚糖。
117.如权利要求105所述的方法，其中移出含聚糖样品的步骤进一步包括从该含聚糖的样品中获得至少一种聚糖制品。
118.如权利要求117所述的方法，其中获得至少一种聚糖制品包括：
a)从在该含聚糖的样品中所包含的至少一种结合糖中移出至少一种N-聚糖；并且
b)可任选地，将所移出的N-聚糖分离出来。
119.如权利要求118所述的方法，其中该移出步骤包括将一种糖蛋白或多种糖蛋白经受一个聚糖酶或化学切割处理。
120.如权利要求118所述的方法，进一步包括在分离步骤之前或之后使用一种荧光标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
121.如权利要求118所述的方法，进一步包括在分离步骤之前或之后使用一种放射性标记物将所移出的N-聚糖进行标记的一个步骤。
122.如权利要求105所述的方法，其中该表征步骤包括将该切割产物经受一个选自下组的操作，该组的构成为：色谱法、液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、薄层色谱法(TLC)、酰胺柱色谱法、质谱法(MS)、串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)、电泳法、毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)跟随有使用识别特定的多糖结构的抗体的蛋白质印迹法、核磁共振(NMR)：一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相关光谱NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多级量子相干(HMQC-NMR)、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合。
123.如权利要求105所述的方法，其中这些含聚糖的样品以规则的间隔移出。
124.如权利要求105所述的方法，其中这些含聚糖的样品以不规则的间隔移出。
125.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约10％时，将至少一种含聚糖的样品移出。
126.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约25％时，将至少一种含聚糖的样品移出。
127.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约50％时，将至少一种含聚糖的样品移出。
128.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约75％时，将至少一种含聚糖的样品移出。
129.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了约90％时，将至少一种含聚糖的样品移出。
130.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了几乎100％时，将至少一种含聚糖的样品移出。
131.如权利要求105所述的方法，其中在该外切糖苷酶操作完成了100％之前，将至少一种含聚糖的样品移出。
132.如权利要求105所述的方法，其中在这些聚糖被切割了100％之前，将至少一种含聚糖的样品移出。
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