CN104677971A - 一种epo突变体的毛细管电泳检测方法 - Google Patents

一种epo突变体的毛细管电泳检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种达依泊汀α精细结构的毛细管电泳分析方法，毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长范围在70～200cm之间，柱内径可以用25～75μm；所用的毛细管电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3.3-5.5的任一种缓冲液、1-10mM的腐胺和1-9M的尿素；毛细管电泳的电极电压为10～50kv；电泳时采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s；柱温范围为10～40℃，检测波长为紫外210-232nm。利用本发明所述的毛细管电泳方法可以实现达依泊汀α完全的基线分离，共产生6个糖组分峰，本方法可以用于达依泊汀α药物在生产过程中的质量控制。

Description

一种EPO突变体的毛细管电泳检测方法
技术领域
本发明涉及化学分析和药物分析领域，具体地说，涉及一种毛细管电泳方法用于测定达依泊汀α精细结构，即确定构成达依泊汀α糖组分的种类和含量。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是一种调节红细胞生成的糖蛋白激素，由肾脏细胞分泌。由于慢性肾衰竭(CRF)发展过程中肾脏组织逐渐被破坏，EPO分泌不足是肾性贫血的主要原因。自从上世纪80年代重组人促红细胞生成素(rHuEPO)问世以来，就成为肾性贫血的主要治疗手段，临床上取得良好的治疗效果。但其半衰期相对较短，通常需要每周给药2一3次，给患者和医护人员带来不便，甚至有些患者因为恐惧注射而放弃治疗。
达依泊汀α(darbepoetin alfa)是rHuEPO高糖基化的类似物，是通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内合成的(参见CN94109128.7)，已由美国Amgen公司开发上市，商品名Aranesp。达依泊汀α由5个N连接的糖基侧链及22个唾液酸残基组成,比rHuEPO多2个N连接糖基侧链和8个唾液酸残基（图1）。rHuEPO是一种单链的酸性糖蛋白，含有165个氨基酸。EPO的糖基化修饰包括3个N末端糖链(分别位于天冬氨酸残基Asp24、Asp38和Asp83)和1个丝氨酸氧末端糖链(位于Ser126)，其主要成分是甘露糖、岩藻糖和唾液酸等。而达依泊汀α通过定点突变的方式，改变了rHuEPO原有的5个氨基酸位点（Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn和Pro90Thr），在第30和第88位氨基酸位置引入了两个新的N-糖基化位点，但新位点的产生并不影响蛋白质3级结构和其与受体的结合。达依泊汀α的分子量为37KD，比rHuEPO(30.4KD)大，其糖基含量也由40％增加到52％。由于唾液酸残基带负电荷，因此本品所带负电荷比rHuEPO多。
达依泊汀α的生物作用机制与rHuEPO和天然EPO相似，与前体红细胞膜上的EPO受体结合，启动细胞内信号转导系统，促使前体红细胞增殖、分化、生存期延长，从而使循环中的红细胞数量和容量增加。静脉注射达依泊汀α的半衰期是rHuEPO的3倍(分别为25.3和8.5小时)，清除率显著低于rHuEPO
达依泊汀α的糖基化状况直接影响其生物活性。糖蛋白中的寡糖存在微不均一性,达依泊汀α的质量控制关键在于寡糖分析。由于达依泊汀α所含的唾液酸较易脱落,而唾液酸能降低达依泊汀α在体内的代谢速度,因此需要能密切控制唾液酸组分即糖组分的分析方法。
理论上达依泊汀α具有22个唾液酸残基，但是由于达依泊汀α所含的唾液酸较易脱落，因此实际上在通过细胞表达得到的达依泊汀α是糖组分存在微不均一性的混合蛋白，在质量控制中一般需要控制具有18-22个唾液酸残基的达依泊汀α达到总组分的80%以上。
等电聚焦法是分析达依泊汀α糖组成成份的一种常用分离分析方法，这也是中国药典规定的分析EPO的方法。但是用等电聚焦法只能做到定性分析，无法做到定量分析。
清华大学周国华等利用毛细管电泳技术测定rHuEPO的唾液酸微多相性。毛细管电泳分离是基于分子的体积/电荷比，其分离效率高于高效液相色谱。rHuEPO的糖基是唾液酸化的,并且唾液酸化的程度差异较大,例如N-连接糖链可能带四个唾液酸,也可能带三个、两个或一个唾液酸。rHuEPO的等电点在4.0左右,当介质的p H值大于等电点后,唾液酸带负电,故可根据唾液酸的多少,通过电泳加以分离。毛细管电泳将rHuEPO分离成7个峰,这是由糖蛋白的唾液酸微多相性引起的,而在体积排阻H P L C中仅有一个rHuEPO峰,因唾液酸与rHuEPO的体内活性有关,所以毛细管电泳比H P LC更能反映rHuEPO的纯度微多相性及生物学活性。
目前还没有毛细管电泳技术测定达依泊汀α糖组成成份的报道。由于达依泊汀α的等电点在3.3左右，分离该酸性蛋白需要在较低的pH条件下进行，而这种低pH环境对于酸性蛋白的分离有较大负面影响，采用清华大学周国华等报道的毛细管电泳条件分离达依泊汀α无法取得良好的分离效果。本申请发明人经过多次摸索，建立了具有良好分离效果的达依泊汀α毛细管电泳技术，实现完全的基线分离。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的基于毛细管电泳技术的达依泊汀α精细结构的分析方法，可用于达依泊汀α药物生产过程的质量控制。
本发明涉及的毛细管电泳方法包括以下步骤：
（l）、通过毛细管电泳对含有达依泊汀α的样品进行分离；
（2）、根据色谱峰面积对具有不同糖组分达依泊汀α进行定量测定。
本发明所使用石英毛细管总长范围在70～200cm之间(柱有效长度为柱总长减去10cm)，柱内径可以用25～75μm。优选石英毛细管内径40～60μm，总长90～140cm；
本发明所用的毛细管电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3.3-5.5的任一种缓冲液、1-10mM的腐胺和1-9M的尿素。发明人意外发现，在缓冲液中加入腐胺和尿素能够影响达依泊汀α在毛细管电泳过程中的迁移速度，从而可以提高不同糖组分的达依泊汀α的分离度。
优选的，所使用的缓冲溶液可选自醋酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH范围为3.6～4.5，缓冲溶液中可加入1-10mM腐胺和1-9M尿素。更优选的，所述的缓冲溶液包含1～100mM氯化钠，1～100mM甘氨酸，1～100mM乙酸钠，4～9M尿素，1-10mM腐胺，pH范围为3.6～4.5。更优选的，所述的缓冲溶液包括5～20mM氯化钠，5～20mM甘氨酸，5-20mM乙酸钠，5～8M尿素，2-5mM腐胺，pH范围为3.6～4.5。
本发明毛细管电泳的电极电压为10～50kv，优选可为20～40KV。
本发明所述方法的毛细管电泳采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s。优选进样压力范围为40～50mbar，时间范围为10～20s；
本发明所使用的柱温范围为10～40℃，优选为25～35℃；
本发明所使用检测波长为紫外210-232nm，优选为214nm。
作为优选，毛细管电泳分离的条件范围为：
本发明所使用石英毛细管总长范围在70～200cm之间，柱内径可以用25～75μm；所用的毛细管电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3.3-5.5的任一种缓冲液、1-10mM的腐胺和1-9M的尿素；毛细管电泳的电极电压为10～50kv；电泳时采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s；柱温范围为10～40℃，检测波长为紫外210-232nm；
更优选的，本发明的毛细管电泳分离的条件范围为：
本发明所使用石英毛细管总长范围在90～140cm之间，柱内径可以用40～60μm；毛细管电泳缓冲溶液可选自醋酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH范围为3.6～4.5，缓冲溶液中可加入1-10mM腐胺和1-9M尿素；毛细管电泳的电极电压为10～50kv；电泳时采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s；柱温范围为10～40℃，检测波长为紫外210-232nm；
更优选的，本发明的毛细管电泳分离的条件范围为：
本发明所使用石英毛细管总长范围在90～140cm之间，柱内径可以用40～60μm；毛细管电泳缓冲溶液包含1～100mM氯化钠，1～100mM甘氨酸，1～100mM乙酸钠，4～9M尿素，1-10mM腐胺，pH范围为3.6～4.5；毛细管电泳的电极电压为20～40kv；电泳时采用压力进样，压力范围为40～50mbar，时间范围为10～20s；柱温范围为25～35℃，检测波长为紫外214nm。
更优选的，本发明的毛细管电泳分离的条件范围为：
本发明所使用石英毛细管总长范围在90～140cm之间，柱内径可以用40～60μm；毛细管电泳缓冲溶液包括5～20mM氯化钠，5～20mM甘氨酸，5-20mM乙酸钠，5～8M尿素，2-5mM腐胺，pH范围为3.6～4.5；毛细管电泳的电极电压为20～40kv；电泳时采用压力进样，压力范围为40～50mbar，时间范围为10～20s；柱温范围为25～35℃，检测波长为紫外214nm。
作为实例，在下面给出毛细管电泳分离的一个优选条件：
石英毛细管内径50μm，总长120cm；缓冲溶液为10mM氯化钠，10mM甘氨酸，10mM乙酸钠，7M尿素，2.5mM腐胺，pH为3.8；电泳时采用压力进样，压力为50mbar，时间15s；分离电压30kv；柱温35℃；检测波长紫外214nm。
从图1中可以看出，利用本发明所述的毛细管电泳方法可以实现达依泊汀α完全的基线分离。不同来源的达依泊汀α样品可能产生不同的目标分离峰。本发明实施例2中共产生6个糖组分峰，其中48.042（峰2）,49.700（峰3）,51.429（峰4）以及53.121（峰5）的峰为主要的目标峰。通过荷质比和电泳淌度的关系以及质谱分析表明，这些目标峰对应唾液酸残基量分别为18,19,20和21的达依泊汀α糖蛋白，峰6为22个唾液酸残基的达依泊汀α。各组分的定量检测依据为，通过计算分离的目标峰面积占所有分离峰面积的百分比，得到该组分在含有达依泊汀α样品中微不均一性的混合蛋白中的百分含量。从表1中可以看出，峰2-6的比例在95%以上。即利用该方法可以检测出达依泊汀α样品中具有18-22个唾液酸残基的达依泊汀α组分的含量，从而可以用于产品生产中的质量控制。
附图说明
图1EPO和达依泊汀α的糖基化示意图，其中的小圆圈代表唾液酸残基。
图2达依泊汀α的毛细管电泳分离图。
具体实施方式
实施例1样品溶液配制
（1）CZE缓冲母液：0.1M氯化钠，0.1M甘氨酸，0.1M乙酸钠
精密称取氯化钠0.584g，甘氨酸1.792g，乙酸钠0.820g，置于100ml的烧杯中，加适量的超纯水使之溶解，转移至100ml容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，备用。
（2）1M腐胺溶液
精密称取腐胺0.882g，置于10ml的烧杯中，加适量的超纯水使之溶解，转移至10ml容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，再分成0.5ml每等份，备用。
（3）CZE缓冲液：0.01M氯化钠，0.01M甘氨酸，0.01M乙酸钠，7M尿素，2.5mM腐胺
称取尿素21.0g置于50ml烧杯中，加入25ml水中，30℃使其溶解，加入5ml的CZE母液和125μl的1M腐胺，使之溶解，用冰乙酸调节pH至3.8，转移至50ml容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，用0.45μm的膜过滤后备用。
实施例2毛细管电泳条件
所用仪器为贝克曼P/ACE MDQ毛细管电泳仪。毛细管柱：未涂层毛细管，毛细管长度为120厘米，内径50微米；电泳缓冲溶液为10mM氯化钠，10mM甘氨酸，10mM乙酸钠，7M尿素，2.5mM腐胺，pH为3.8；电泳时采用压力进样，压力为50mbar，时间15s；分离电压30kv；柱温35℃；检测波长紫外为设定214nm。
达依泊汀α样品购自美国Amgen公司，利用上述的条件进行毛细管电泳，电泳分离图如图1所示
实施例3样品分析
从图1中可以看出，达依泊汀α实现了完全的基线分离，共产生6个糖组分峰，其中48.042（峰2）,49.700（峰3）,51.429（峰4）以及53.121（峰5）的峰为主要的目标峰。收集这些分离峰组分进行质谱分析，表明这些目标峰对应唾液酸残基量分别为18,19,20和21的达依泊汀α糖蛋白，峰6为22个唾液酸残基的达依泊汀α。从表1中可以看出，18-22个唾液酸糖基的达依泊汀α的比例在95%以上。即利用该方法可以检测出达依泊汀α样品中具有18-22个唾液酸残基的达依泊汀α组分的含量，从而可以用于产品生产中的质量检测及控制。
表1达依泊汀α各糖组分峰面积及百分含量

Claims (10)

1.一种达依泊汀α精细结构的毛细管电泳检测方法，所述方法包括如下的步骤：
（l）、通过毛细管电泳对含有达依泊汀α的样品进行分离；
（2）、根据色谱峰面积对具有不同糖组分达依泊汀α进行定量测定；
其中，所述的毛细管电泳条件中，电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3.3-5.5的任一种缓冲液、1-10mM的腐胺和1-9M的尿素。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，石英毛细管总长范围为70～200cm，柱内径为25～75μm。
3.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳的电极电压为10～50kv。
4.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s。
5.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳的柱温范围为10～40℃。
6.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳时所使用检测波长为紫外210-232nm。
7.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳分离的条件范围为：石英毛细管总长范围在70～200cm之间，柱内径可以用25～75μm；所用的毛细管电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3.3-5.5的任一种缓冲液、1-10mM的腐胺和1-9M的尿素；毛细管电泳的电极电压为10～50kv；电泳时采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s；柱温范围为10～40℃，检测波长为紫外210-232nm。
8.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳分离的条件范围为：石英毛细管总长范围在90～140cm之间，柱内径可以用40～60μm；毛细管电泳缓冲溶液可选自醋酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH范围为3.6～4.5，缓冲溶液中可加入1-10mM腐胺和1-9M尿素；毛细管电泳的电极电压为10～50kv；电泳时采用压力进样，压力范围为30～60mbar，时间范围为5～30s；柱温范围为10～40℃，检测波长为紫外210-232nm。
9.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，毛细管电泳分离的条件范围为：本发明所使用石英毛细管总长范围在90～140cm之间，柱内径可以用40～60μm；毛细管电泳缓冲溶液包含1～100mM氯化钠，1～100mM甘氨酸，1～100mM乙酸钠，4～9M尿素，1-10mM腐胺，pH范围为3.6～4.5；毛细管电泳的电极电压为20～40kv；电泳时采用压力进样，压力范围为40～50mbar，时间范围为10～20s；柱温范围为25～35℃，检测波长为紫外214nm。
10.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，各组分的定量检测依据为，通过计算分离的目标峰面积占所有分离峰面积的百分比，得到该组分在含有达依泊汀α样品中微不均一性的混合糖基化蛋白中的百分含量。
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