JP2011525492A - 修飾サイトカインの精製 - Google Patents
修飾サイトカインの精製 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011525492A JP2011525492A JP2011514894A JP2011514894A JP2011525492A JP 2011525492 A JP2011525492 A JP 2011525492A JP 2011514894 A JP2011514894 A JP 2011514894A JP 2011514894 A JP2011514894 A JP 2011514894A JP 2011525492 A JP2011525492 A JP 2011525492A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chromatography step
- exchange chromatography
- cation exchange
- mixed mode
- flow
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
本発明は、修飾サイトカインの効率的な精製方法を提供する。そのプロセスは、望ましいサイトカインの精製のためにクロマトグラフィー技術を使用することを含む。その精製サイトカインを、治療組成物として使用し得る。本発明の局面は、ダルベポエチンのアイソフォームを単離するためのプロセスを提供する。実施態様において、そのプロセスを、ダルベポエチンの低pIアイソフォームの単離のために使用する。特定の実施態様において、そのプロセスを、約4.5またはそれより低いpIのアイソフォームの単離のために使用する。
Description
本発明の局面は、アイソフォームの混合物から、ダルベポエチンの低pIアイソフォームを分離するためのプロセスに関連する。
エリスロポエチンまたはEPOは、肝臓細胞および腎臓細胞によって産生される、糖鎖付加サイトカインであり、そして赤血球の産生を調節する。精製組換えヒトEPOを、不適切な赤血球の供給に関連する医学的問題、例えば貧血および慢性腎不全の治療のために、ヒト患者に投与し得る。
ヒトEPO分子のポリペプチド主鎖は、不変のアミノ酸配列を有する;しかし、炭水化物の側鎖は、糖含有量および構造において微小不均一性を示す(非特許文献1、非特許文献2および非特許文献3)。負に荷電したシアル酸分子が、典型的には炭水化物鎖の各アームの末端にキャップをする。結果として、一般的な炭水化物鎖の可変性の性質および特にシアル酸含有量が、電荷に差を有するEPOアイソフォームを生じる(非特許文献4)。Egrieおよび同僚ら(非特許文献5および非特許文献6)は、rHuEPOの炭水化物部分におけるシアル酸基の数とその血清半減期および生物学的活性両方との間の直接的な関連を発見した。シアル酸残基は、インビボで迅速なクリアランスを防止するので、より多くのシアル酸残基を有するエリスロポエチンアイソフォームは、より高い生物学的活性を発揮する。
ダルベポエチンは、新規の赤血球生成刺激タンパク質または5本のN結合型炭水化物鎖および22個までのシアル酸を有するEPOアナログである。対照的に、組換えヒトEPOは、3本のN結合型炭水化物鎖および最大14個のシアル酸を有する(非特許文献7および非特許文献8)。さらなる糖鎖付加の結果として、ダルベポエチンは、組換えヒトEPOに関して、3倍長い血清半減期および増加したインビボ活性を示す。ダルベポエチンアイソフォームは、主に種々の数の負に荷電した末端シアル酸残基を有する、種々の糖鎖含有量に起因して生じる。より高いシアル酸含有量を有するアイソフォームは、低いpIを有する。ダルベポエチンのこれらの低pIアイソフォーム、例えばAmgen CorporationによってARANESP(登録商標)として販売される製品は、より高い治療的価値を有することが証明された。
文献は、単独、または疎水性相互作用またはサイズ排除クロマトグラフィー技術と組み合わせた、陰イオン交換クロマトグラフィーによるEPOおよびそのアナログの精製を開示する。
特許文献1は、一連の疎水性相互作用、陰イオン交換、陽イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー工程から成るエリスロポエチンの精製のためのプロセスを開示する。特許文献2は、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによる、組換えヒトエリスロポエチンのクロマトグラフィー精製を開示する。Gokanaら、Journal of Chromatography、第701巻、1997、109−118頁は、DEAE−Sephacelクロマトグラフィーによる、組換えヒトエリスロポエチンアイソフォームのクロマトグラフィーによる分離の方法を記載する。
従って、その開示は、エリスロポエチンおよびそのアナログの精製のために複雑な一連のクロマトグラフィー工程を有する。しかし、アイソフォームの混合物からダルベポエチンの低pIアイソフォームを分離するために、効率的および単純なプロセスが望ましい。
Sasaki Hら、J.Biol.Chem.、1987;262:12059−76
Rush RSら、Anal.Chem.、1995;67:1442−52
Rush RSら、Anal.Chem.、1993;65:1834−42
Rush RSら、Anal.Chem.、1995;67:1442−52
Egrie JC、およびBrowne JK、Br.J.Cancer、2001;84、3−10
Egrieら、Glycoconj.J.、1993;10:263−269
Egrie JC、およびBrowne JK、Br.J.Cancer、2001;84、3−10
Elliot Sら、Blood、2000;96:82a
本発明の局面は、ダルベポエチンのアイソフォームを単離するためのプロセスを提供する。実施態様において、そのプロセスを、ダルベポエチンの低pIアイソフォームの単離のために使用する。特定の実施態様において、そのプロセスを、約4.5またはそれより低いpIのアイソフォームの単離のために使用する。
アイソフォームの単離または精製を、少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて行う。そのプロセスは、ダルベポエチンのアイソフォームの混合物から低pIアイソフォームを単離するために、ある範囲のpHおよび塩濃度を使用する。
ある局面において、本発明は、ダルベポエチンアイソフォームの混合物からダルベポエチンの低pIアイソフォームを単離するためのプロセスを提供し、当該プロセスは少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
ある局面において、本発明は、ダルベポエチンアイソフォームの混合物からダルベポエチンの低pIアイソフォームを単離するためのプロセスを提供し、当該プロセスは少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、そしてさらに少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
ある局面において、本発明は、ダルベポエチンアイソフォームの混合物からダルベポエチンの低pIアイソフォームを単離するためのプロセスを提供し、当該プロセスは少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、そしてさらに少なくとも1つの混合方式交換クロマトグラフィー工程を含む。
本発明の局面は、フロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィーによって、ダルベポエチンの低pIアイソフォームを単離するためのプロセスに関連する。
本発明は、少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、低pIアイソフォームを、アイソフォームの混合物から分離する方法を含む。望ましいアイソフォームを得るための工程において使用する、低いpH範囲の緩衝液のために、これは同時にウイルス不活性化工程として作用する。
本明細書中で使用される「アイソフォーム」という用語は、同一のアミノ酸配列を有するが、糖鎖付加、アシル化、脱アミド、または硫酸化における差異の結果として、荷電および従って等電点に関して異なるタンパク質を指す。
「等電点」または「pI」は、特定の分子または表面が、正味の電荷を有さないpHである。ポリペプチドの「pI」は、ポリペプチドの正電荷が、その負電荷と釣り合うpHを指す。pIを、様々な公知の方法を用いて、例えばポリペプチドのアミノ酸残基および/またはシアル酸残基の正味の電荷から、または等電点電気泳動、クロマトフォーカシング等を用いることによって推定し得る。
低pIアイソフォームは、約4.5またはそれより低いpIを有するアイソフォームである。
1つの実施態様において、低pIアイソフォームを、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、または少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む混合方式クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって単離する。
別の実施態様において、低pIアイソフォームを、陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程、およびフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、アイソフォームの混合物から単離し、それに続いて任意で別の陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程を行い得る。
さらに別の実施態様において、低pIアイソフォームを、陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程、第1のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程、および第2のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、アイソフォームの混合物から単離する。
さらに別の実施態様において、低pIアイソフォームを、陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー、第1のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー、および第2のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー、続いて別の陰イオン交換または混合方式クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、他のアイソフォームの混合物から分離または精製する。
さらに別の実施態様において、低pIアイソフォームを、陰イオン交換クロマトグラフィー、第1のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー、および第2のフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィーの工程、続いて混合方式クロマトグラフィー工程を含むプロセスによって、他のアイソフォームの混合物から分離または精製する。
本明細書中で述べられた実施態様は、クロマトグラフィー工程の間に、任意でタンジェンシャルフローろ過(Tangential Flow Filtration:TFF)、濃縮、ダイアフィルトレーション、または限外ろ過工程のいずれかを含み得る。
ここで述べられた実施態様は、1つまたはそれ以上のウイルス不活性化工程または滅菌ろ過またはナノろ過工程を含み得る。
上記実施態様において述べられた陰イオン交換クロマトグラフィーを、あらゆる弱いもしくは強い陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、または弱いもしくは強い陰イオン交換体として機能し得る膜を用いて行い得る。陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂または膜の例は、Q−Sepharoseクロマトグラフィー樹脂または膜である。
上記実施態様において述べられた陽イオン交換クロマトグラフィーを、あらゆる弱いもしくは強い陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、または弱いもしくは強い陽イオン交換体として機能し得る膜を用いて行い得る。弱い陽イオン交換樹脂の例は、カルボキシメチル−セファロース(CM−セファロース)または同様のカルボキシメチルリガンドを有する樹脂である。
上記実施態様において述べられた混合方式クロマトグラフィーは、1つより多くのクロマトグラフィー分離原理、典型的にはイオン性および疎水性が作用するクロマトグラフィー樹脂を指す。従って、混合方式樹脂は、陽イオンまたは陰イオン、疎水性部分またはリガンドを有する固相を指す。「固相」という用語は、あらゆる非水性マトリックスを意味して使用する。混合方式クロマトグラフィーリガンドは、疎水性相互作用もしくは荷電相互作用のいずれかまたは両方を示す。混合方式樹脂の例は、Captoadhere樹脂または同様の方法で機能するあらゆる混合方式樹脂である。
陽イオン交換工程における「フロースルー方式」は、望ましいタンパク質が、カラムに結合せず、そして注入または注入後の洗浄工程の間に、フロースルー溶液において得られるプロセスを指す。フロースルーにおける望ましいタンパク質を、様々な画分として回収し、そして一緒にプールし得る、または単一の画分として回収し得る。
陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、タンパク質を注入するために本明細書中で使用する緩衝液は、約2から約5、または2.8から約4.8、または約3から約3.5のpH値を有する。洗浄工程の間にタンパク質を得るために本明細書中で使用する緩衝液は、約2から約5、または約2.8から約4、または約3から約3.5のpH値を有する。
第1の陽イオン交換工程において使用する緩衝液のpHは、第2の陽イオン交換工程において使用するpHと異なり得る。
緩衝溶液を作製するために使用する緩衝剤は、酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムまたはリン酸緩衝液、およびその塩または誘導体を含み得る。実施態様において、その緩衝剤は、約10mMから約100mM、または約40から約90mM、または約75から約85mMの濃度を有する。
本発明のある特定の局面および実施態様を、説明の目的のためにのみ提供される、以下の実施例を参照することによってより完全に記載する。これらの実施例は、いかなる様式においても本発明の範囲を制限するとは解釈されない。
実施例1
タンパク質の発現および回収(harvest)
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)産生細胞系を、ダルベポエチンアルファ発現ベクター(pCS−ダルベポエチン−WPE(new ori))由来のレトロベクターによる、CHO−S親細胞系の形質導入によって作製する。形質導入後、プールした細胞の集団は、Tフラスコにおいて10−14日後、36μg/mlまでのダルベポエチンアルファを発現する。プールした細胞の集団を、非常に低い細胞濃度(1〜3生細胞/200μl培地)まで希釈し、そして96穴マイクロタイタープレートにまいて、単一の細胞由来のクローン細胞系を確立する。ダルベポエチンアルファの産生に関してクローンをスクリーニングし、そして高い生産性を有するクローンを発現のために選択する。
タンパク質の発現および回収(harvest)
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)産生細胞系を、ダルベポエチンアルファ発現ベクター(pCS−ダルベポエチン−WPE(new ori))由来のレトロベクターによる、CHO−S親細胞系の形質導入によって作製する。形質導入後、プールした細胞の集団は、Tフラスコにおいて10−14日後、36μg/mlまでのダルベポエチンアルファを発現する。プールした細胞の集団を、非常に低い細胞濃度(1〜3生細胞/200μl培地)まで希釈し、そして96穴マイクロタイタープレートにまいて、単一の細胞由来のクローン細胞系を確立する。ダルベポエチンアルファの産生に関してクローンをスクリーニングし、そして高い生産性を有するクローンを発現のために選択する。
ダルベポエチンアルファを発現する細胞を、生産反応器に播種する前に、3段階のスピナーおよび1段階のシード反応器において、マスター細胞バンクから増殖させる(expand)。
良好な細胞の増殖および高い生存能を得るために、スピナー中で細胞を培養するためにPF CHO培地を使用する。PF−CHO培地は、培地1リットル当たり以下のものを含む:PF−CHO主粉末6.0g、PF−CHO基本粉末10.4g、L−グルタミン0.58g、Pluronic F−68 1.0g、炭酸水素ナトリウム2.0g。培地のpHを播種前に7に設定した。マスター細胞バンク由来の細胞を、PF−CHO培地を含むスピナーボトルに、20万細胞/mLの最初の細胞数で播種する。そのスピナーボトルを、37℃に維持した5%CO2インキュベーターでインキュベートする。細胞密度が100万細胞/mLに達する72時間のインキュベーション後に、細胞を回収し、そして別の段階に移す。スピナーボトルにおける3段階の移動の後、細胞を、4LのSFM−6(1)培地を含む6.5Lのシード反応器に、20万細胞/mLの最初の細胞濃度で播種する。SFM−6(1)培地は、「DMEM/F−12」基本培地、アミノ酸、インスリン、ビタミン、微量元素、植物ペプトン、炭酸水素塩およびフルクトース糖を含む。シード反応器において、pHを7.0に維持し、そして培養の温度を37.0℃に調節する。撹拌および通気を調節することによって、溶解酸素を40%に維持する。細胞密度が100万細胞/mLに達する72時間後、培養を無菌的に回収し、そして細胞を、10LのSFM−6(2)培地を含む11Lの生産反応器へ、20万細胞/mLの最初の細胞密度で移す。12日後に培養を回収して、望ましい産物を含む上清を回収する。
実施例2
陰イオン交換クロマトグラフィーまたはCaptoadhereクロマトグラフィーによる捕捉
未精製の抽出物の浄化後、浄化した細胞培養液を濃縮し、そしてpH7.1の25mMのTris、60mMのNaCl緩衝液を用いて、ダイアフィルトレーション(30kDaの分子量カットオフによるタンジェンシャルフローろ過(TFF)を用いて)によって伝導率を減少させる。次いで濃縮した細胞培養液を、5カラム容量(CV)の25mMのTris、60mMのNaCl、pH7.1緩衝液で前平衡化した、Q−Sepharoseカラムに注入する。次いでカラムを5CVの平衡化緩衝液(25mMのTris、60mMのNaCl、pH7.1)で洗浄した。続いてpH4.0の80mMの酢酸ナトリウム、40−120mMのNaCl緩衝液で、低pH洗浄を行った。平衡化緩衝液による洗浄をもう1度行った。カラムに注入された望ましいタンパク質を、pH7.1の25mMのTris、140−300mMのNaCl緩衝液で溶出した。
陰イオン交換クロマトグラフィーまたはCaptoadhereクロマトグラフィーによる捕捉
未精製の抽出物の浄化後、浄化した細胞培養液を濃縮し、そしてpH7.1の25mMのTris、60mMのNaCl緩衝液を用いて、ダイアフィルトレーション(30kDaの分子量カットオフによるタンジェンシャルフローろ過(TFF)を用いて)によって伝導率を減少させる。次いで濃縮した細胞培養液を、5カラム容量(CV)の25mMのTris、60mMのNaCl、pH7.1緩衝液で前平衡化した、Q−Sepharoseカラムに注入する。次いでカラムを5CVの平衡化緩衝液(25mMのTris、60mMのNaCl、pH7.1)で洗浄した。続いてpH4.0の80mMの酢酸ナトリウム、40−120mMのNaCl緩衝液で、低pH洗浄を行った。平衡化緩衝液による洗浄をもう1度行った。カラムに注入された望ましいタンパク質を、pH7.1の25mMのTris、140−300mMのNaCl緩衝液で溶出した。
あるいは、CaptoAdhere(混合方式クロマトグラフィーカラム)を、Q−Sepharoseカラムの代わりに使用し得る。Captoadhereカラムを、5CVの20mMのリン酸塩、60mMのNaCl、pH7.1±0.2緩衝液で前平衡化する。次いでそのカラムを5CVの平衡化緩衝液(20mMのリン酸塩、60mMのNaCl、pH7.1±0.2)で洗浄する。続いてpH4.0の80mMの酢酸ナトリウム、40−120mMのNaCl緩衝液で、低pH洗浄を行う。平衡化緩衝液による洗浄をもう1度行う。カラムに注入された望ましいタンパク質を、pH7.1±0.2で平衡化した20mMのリン酸塩、140−300mMのNaClで溶出する。
実施例3
第1の陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例2からの溶出液の画分をプールおよび濃縮し、そしてpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いたTFF工程によるダイアフィルトレーションによって伝導率を減少させる。この工程は、緩衝液交換工程として作用し、ここでQ−Sepharoseカラムのプールした溶出液を、pH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液中にする。次いで緩衝液を交換したサンプルを、5CVのpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液で前平衡化したCM−Sepharoseカラムへ注入する。サンプルを注入する間に、望ましい産物をフロースルー中に得て、一方不純物はカラムに結合する。注入後、カラムを3CVのpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。望ましい産物を、洗浄工程においてもフロースルーとして得る。続いてカラムに結合した不純物を、pH7.1の25mMのTris、500mMのNaCl緩衝液で溶出する。
第1の陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例2からの溶出液の画分をプールおよび濃縮し、そしてpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いたTFF工程によるダイアフィルトレーションによって伝導率を減少させる。この工程は、緩衝液交換工程として作用し、ここでQ−Sepharoseカラムのプールした溶出液を、pH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液中にする。次いで緩衝液を交換したサンプルを、5CVのpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液で前平衡化したCM−Sepharoseカラムへ注入する。サンプルを注入する間に、望ましい産物をフロースルー中に得て、一方不純物はカラムに結合する。注入後、カラムを3CVのpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。望ましい産物を、洗浄工程においてもフロースルーとして得る。続いてカラムに結合した不純物を、pH7.1の25mMのTris、500mMのNaCl緩衝液で溶出する。
実施例4
第2の陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例3からのフロースルー画分、または実施例2からの溶出液の画分をプールし、濃縮し、そしてTFFを用いて83mMの酢酸ナトリウム(または80−85mMの酢酸ナトリウム)を含む緩衝液、pH3.3(またはpH3.0−3.5)で交換する。TFF由来のサンプルを、5CVのpH3.3の83mMの酢酸ナトリウム緩衝液で前平衡化したCM−Sepharoseカラムに注入する。望ましい産物を、サンプルを注入中にフロースルーにおいて得る。この工程において使用する緩衝液のpHが、フロースルー中に必要なアイソフォームを得るために重要であることが見出された。また上記のプロセスを、30分より長く続け、従って同時にそれはウイルス不活性化工程として作用する。注入後、カラムを9CVのpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。望ましい産物を、洗浄工程のフロースルーにおいて同様に得る。続いてカラムに結合した不純物を、pH7.1の25mMのTris、500mMのNaCl緩衝液で溶出する。
第2の陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例3からのフロースルー画分、または実施例2からの溶出液の画分をプールし、濃縮し、そしてTFFを用いて83mMの酢酸ナトリウム(または80−85mMの酢酸ナトリウム)を含む緩衝液、pH3.3(またはpH3.0−3.5)で交換する。TFF由来のサンプルを、5CVのpH3.3の83mMの酢酸ナトリウム緩衝液で前平衡化したCM−Sepharoseカラムに注入する。望ましい産物を、サンプルを注入中にフロースルーにおいて得る。この工程において使用する緩衝液のpHが、フロースルー中に必要なアイソフォームを得るために重要であることが見出された。また上記のプロセスを、30分より長く続け、従って同時にそれはウイルス不活性化工程として作用する。注入後、カラムを9CVのpH4.8の73mMの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。望ましい産物を、洗浄工程のフロースルーにおいて同様に得る。続いてカラムに結合した不純物を、pH7.1の25mMのTris、500mMのNaCl緩衝液で溶出する。
実施例5
陰イオン交換クロマトグラフィー工程またはCaptoadhereクロマトグラフィー工程
実施例4由来のフロースルー画分を、25mMのTris、60mMのNaClを含むpH7.1の緩衝液で前平衡化したQ−Sepharoseカラムに注入する。そのカラムを、同じ緩衝液で洗浄する。望ましい産物がカラムに結合し、そしてpH6.0で緩衝化した40mMのリン酸塩、280mMのNaClで溶出する。
陰イオン交換クロマトグラフィー工程またはCaptoadhereクロマトグラフィー工程
実施例4由来のフロースルー画分を、25mMのTris、60mMのNaClを含むpH7.1の緩衝液で前平衡化したQ−Sepharoseカラムに注入する。そのカラムを、同じ緩衝液で洗浄する。望ましい産物がカラムに結合し、そしてpH6.0で緩衝化した40mMのリン酸塩、280mMのNaClで溶出する。
あるいは、CaptoAdhere(混合方式クロマトグラフィーカラム)を、Q−Sepharoseカラムの代わりに使用し得る。この場合、カラムを5CVのpH6.0の20mMのリン酸緩衝液で前平衡化し、そして同じ緩衝液(5CV)で再び洗浄する。次いでカラムに結合した望ましいタンパク質を、4CVの40mMのリン酸塩および280mMのNaClを含むpH6.0の緩衝液で溶出する。
この工程(実施例5)は、濃縮および緩衝液交換工程として作用し、従って別のTFFの必要性を排除する。これはまた通常のTFFよりもコントロールされた環境を提供する。
実施例6
等電点電気泳動
実施例4のフロースルー画分および実施例5由来の溶出液を、等電点電気泳動(IEF)によって分析する。IEFゲルを、水、尿素、30%アクリルアミド、および両性電解質(pH範囲2−4および3−10)を用いて調製する。上記の成分を静かに混合し、そして10%w/vの過硫酸アンモニウムおよびTEMEDを混合物に加え、そしてその混合物をゲルサンドイッチ装置(BIORAD Mini Protean Cell)中に入れ、そしてコームをはめる。ゲルを室温で45分間ポリマー化させる。少量のタンパク質溶液を、同じ容積のサンプル緩衝液(グリセロール、両性電解質およびMilli Q水)と混合し、そしてゲルに添加する。次いでゲルをBIORAD Mini Protean Cellアセンブリーに置き、そして別の区画においてアノード緩衝液(25mMの水酸化ナトリウム)およびカソード緩衝液(25mMのオルトリン酸)を満たす。実施例4由来のフロースルー画分または実施例5由来の溶出液を、室温において両性電解質の前電気泳動(pre−focusing)のために200Vの定電圧で1.5時間流し、そして次いで電圧を400Vに上げて、そして室温で次の1.5時間流す。流した後、当該分野で開示されるように、ゲルを注意深く除去し、そしてクーマシーまたは銀染色のいずれかを用いて染色する。
等電点電気泳動
実施例4のフロースルー画分および実施例5由来の溶出液を、等電点電気泳動(IEF)によって分析する。IEFゲルを、水、尿素、30%アクリルアミド、および両性電解質(pH範囲2−4および3−10)を用いて調製する。上記の成分を静かに混合し、そして10%w/vの過硫酸アンモニウムおよびTEMEDを混合物に加え、そしてその混合物をゲルサンドイッチ装置(BIORAD Mini Protean Cell)中に入れ、そしてコームをはめる。ゲルを室温で45分間ポリマー化させる。少量のタンパク質溶液を、同じ容積のサンプル緩衝液(グリセロール、両性電解質およびMilli Q水)と混合し、そしてゲルに添加する。次いでゲルをBIORAD Mini Protean Cellアセンブリーに置き、そして別の区画においてアノード緩衝液(25mMの水酸化ナトリウム)およびカソード緩衝液(25mMのオルトリン酸)を満たす。実施例4由来のフロースルー画分または実施例5由来の溶出液を、室温において両性電解質の前電気泳動(pre−focusing)のために200Vの定電圧で1.5時間流し、そして次いで電圧を400Vに上げて、そして室温で次の1.5時間流す。流した後、当該分野で開示されるように、ゲルを注意深く除去し、そしてクーマシーまたは銀染色のいずれかを用いて染色する。
図1は、上記で記載したように行った実験からの等電点電気泳動ゲルを示し、実施例5で記載したQ−Sepharose工程の溶出液において得られた低pIアイソフォームを示す。レーンAからFは、本発明によって行った異なる精製バッチである;すなわち、ダルベポエチンアルファを発現する細胞培養の回収物を、実施例2で記載したように陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて実施例4で記載したように、フロースルー方式で陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、続いて実施例5で記載したように、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。
図2は、上記で記載したように行った実験からの等電点電気泳動ゲルを示し、実施例4で記載したように行ったCM−Sepharose工程のフロースルーにおいて得られた低pIアイソフォームを示す。図のレーンAからCおよびFからIは、本発明によって行った異なる精製バッチである;すなわち、ダルベポエチンアルファを発現する細胞培養の回収物を、実施例2で記載したように陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて実施例4で記載したように、フロースルー方式で陽イオン交換クロマトグラフィーを行う。レーンDおよびEは、ダルベポエチン(darbepoietin)アルファARANESP(登録商標)(pI2.8〜3.3)の市販で入手可能なサンプルにおいて観察されたアイソフォームであり、そして比較のための標準として使用する。
Claims (32)
- ダルボポエチンアイソフォームの混合物から、ダルボポエチンの低pIアイソフォームを単離するためのプロセスであって、該プロセスは、少なくとも1つのフロースルー方式での陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、プロセス。
- 前記アイソフォームが、約4.5未満のpI値を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項3に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項3に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項3に記載のプロセス。
- 2つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項7に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項7に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項7に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項11に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項11に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項11に記載のプロセス。
- 2つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項11に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項15に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項15に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項15に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項3に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、前記陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項19に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、前記陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項19に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項19に記載のプロセス。
- 少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして少なくとも1つの混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項19に記載のプロセス。
- 2つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項19に記載のプロセス。
- 前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こる、請求項24に記載のプロセス。
- 前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項24に記載のプロセス。
- 前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項24に記載のプロセス。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程より先に起こり、そして前記混合方式クロマトグラフィー工程が、少なくとも1つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に起こる、請求項24に記載のプロセス。
- 前記フロースルーが、約2〜5.5のpH値において得られる、請求項1〜28のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記フロースルーが、約3〜5のpH値において得られる、請求項29に記載のプロセス。
- 前記フロースルーが、約3.3のpH値において得られる、請求項30に記載のプロセス。
- 前記フロースルーが、約4.8のpH値において得られる、請求項31に記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN1536CH2008 | 2008-06-24 | ||
IN1536/CHE/2008 | 2008-06-24 | ||
PCT/US2009/048239 WO2010008823A2 (en) | 2008-06-24 | 2009-06-23 | Purification of modified cytokines |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011525492A true JP2011525492A (ja) | 2011-09-22 |
Family
ID=41550949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011514894A Withdrawn JP2011525492A (ja) | 2008-06-24 | 2009-06-23 | 修飾サイトカインの精製 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8779110B2 (ja) |
EP (1) | EP2307442A4 (ja) |
JP (1) | JP2011525492A (ja) |
CN (1) | CN102076705A (ja) |
BR (1) | BRPI0915394A2 (ja) |
MX (1) | MX2010014180A (ja) |
RU (1) | RU2011102447A (ja) |
WO (1) | WO2010008823A2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014532080A (ja) * | 2011-10-18 | 2014-12-04 | チョン クン ダン ファーマシューティカル コーポレーション | 低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法 |
JP6258536B1 (ja) * | 2017-03-03 | 2018-01-10 | 協和発酵キリン株式会社 | ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 |
US10604779B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-03-31 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of mutant-type human erythropoietin |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8911992B2 (en) * | 2011-04-28 | 2014-12-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | DNA removal in target molecule purification |
US9712207B2 (en) | 2011-05-11 | 2017-07-18 | Reinhart Rudershausen | Method and decoder for despreading data signals spread using walsh sequences |
WO2013153497A1 (en) | 2012-04-10 | 2013-10-17 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Single step fractionation method |
WO2014204023A1 (ko) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | 씨제이헬스케어 주식회사 | 신규한 다베포에틴 알파의 정제 방법 |
JP6415198B2 (ja) | 2013-09-12 | 2018-10-31 | キヤノン株式会社 | カートリッジ |
KR101414897B1 (ko) | 2013-11-29 | 2014-07-04 | 씨제이헬스케어 주식회사 | 다베포에틴 알파의 정제 방법 |
KR20230136616A (ko) * | 2014-02-04 | 2023-09-26 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온교환 크로마토그래피의 용도 |
CN118215671A (zh) * | 2021-09-14 | 2024-06-18 | 杰科(天津)生物医药有限公司 | 一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR9917606A (pt) | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
BR0214568A (pt) | 2001-11-28 | 2004-11-03 | Sandoz Ag | Purificação cromatográfica de eritropoietina humana recombinante |
EP1548031A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-06-29 | Dubai Genetics FZ-LLC | Nature-identical erythropoietin |
US20060246544A1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-11-02 | Neose Technologies,Inc. | Manufacturing process for the production of peptides grown in insect cell lines |
RU2007147422A (ru) * | 2005-05-24 | 2009-06-27 | Эйвестаджен Лимитед,In (In) | Способ рекомбинантного получения стимулирующего эритропоэз белка |
KR101443257B1 (ko) * | 2011-10-18 | 2014-09-19 | 주식회사 종근당 | 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법 |
-
2009
- 2009-06-23 RU RU2011102447/10A patent/RU2011102447A/ru unknown
- 2009-06-23 WO PCT/US2009/048239 patent/WO2010008823A2/en active Application Filing
- 2009-06-23 BR BRPI0915394A patent/BRPI0915394A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-06-23 US US12/997,292 patent/US8779110B2/en active Active
- 2009-06-23 JP JP2011514894A patent/JP2011525492A/ja not_active Withdrawn
- 2009-06-23 MX MX2010014180A patent/MX2010014180A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-06-23 CN CN2009801241182A patent/CN102076705A/zh active Pending
- 2009-06-23 EP EP09798480A patent/EP2307442A4/en not_active Ceased
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014532080A (ja) * | 2011-10-18 | 2014-12-04 | チョン クン ダン ファーマシューティカル コーポレーション | 低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法 |
US10604779B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-03-31 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of mutant-type human erythropoietin |
JP6258536B1 (ja) * | 2017-03-03 | 2018-01-10 | 協和発酵キリン株式会社 | ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 |
WO2018159842A1 (ja) * | 2017-03-03 | 2018-09-07 | 協和発酵キリン株式会社 | ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2307442A2 (en) | 2011-04-13 |
US20110098452A1 (en) | 2011-04-28 |
WO2010008823A2 (en) | 2010-01-21 |
EP2307442A4 (en) | 2012-05-30 |
US8779110B2 (en) | 2014-07-15 |
RU2011102447A (ru) | 2012-07-27 |
BRPI0915394A2 (pt) | 2017-06-27 |
WO2010008823A3 (en) | 2010-09-10 |
WO2010008823A8 (en) | 2011-01-27 |
MX2010014180A (es) | 2011-02-15 |
CN102076705A (zh) | 2011-05-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8779110B2 (en) | Purification of low isoelectric point isoforms of darbepoietin | |
US6692931B1 (en) | Recombinant glycoproteins, method for the production thereof, medicaments containing said glycoproteins and use thereof | |
WO2011024025A1 (en) | An erythropoietin analogue and a method thereof | |
JP2017526649A (ja) | rHu−GCSFの精製のための新規プロセス | |
EP0232034B1 (en) | Production of human erythropoietin | |
KR20150133833A (ko) | 단백질 생산 방법 | |
US9994627B2 (en) | Methods for purifying erythropoietin analogs having lower isoelectric point | |
WO2011063195A2 (en) | Purification of modified cytokines | |
CN111499764B (zh) | 一种具有促红细胞生成素活性的长效融合蛋白 | |
WO2011156369A2 (en) | Purification of modified cytokines | |
KR100369788B1 (ko) | 재조합 인간 에리트로포이에틴의 제조방법 | |
WO2011024024A1 (en) | A process for recovering darbepoeitin alfa isoforms | |
US7638296B1 (en) | Method for the massive culture of cells producing recombinant human erythropoietin | |
KR101330033B1 (ko) | 인간 과립구 콜로니 자극 인자(g-csf)의 변이체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학 조성물 | |
KR100344059B1 (ko) | 재조합 인간 에리트로포이에틴의 정제 방법 | |
EP3153522A1 (en) | Process for the purification of erythropoietin and darbepoetin alfa | |
KR20170041384A (ko) | 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 | |
EP3009447B1 (en) | Production of erythropoiesis stimulating protein using metal ions | |
KR100670105B1 (ko) | 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴 | |
KR0184776B1 (ko) | 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법 | |
US20070264710A1 (en) | Process for Purifying Human Thrombopoietin with High Content of Sialic Acid | |
JP2022514728A (ja) | 修飾ヒトエリスロポエチン(modified human erythropoietin) | |
KR100374306B1 (ko) | 재조합효모로부터과립구-콜로니자극인자를정제하는방법 | |
KR20230085400A (ko) | 항바이러스용 수액제 조성물 | |
Shimizu | Ontogeny of chicken hemoglobin II. Chromatographic study of the heterogeneity of hemoglobin in development |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20120904 |