KR100374306B1

KR100374306B1 - 재조합효모로부터과립구-콜로니자극인자를정제하는방법

Info

Publication number: KR100374306B1
Application number: KR1019950020734A
Authority: KR
Inventors: 장호진; 김정호; 조중명
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 2003-07-12
Also published as: KR970006501A

Abstract

본 발명은 재조합 효모로부터 G-CSF를 정제하는 방법에 관한 것으로, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 유전자를 포함하는 형질전환된 효모세포를 배양하고, 배양된 효모세포를 파쇄한 후 가용성 단백질을 제거하고, 불용성 침전물을 우레아 용액으로 세척하고, 우레아에 불용성인 침전물을 도데실황산나트륨(SDS) 용액에 용해시키고, 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 및 S-세파로즈 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피하는 것을 포함하는 정제 방법에 의하면 G-CSF를 고순도로 얻을 수 있다.

Description

재조합 효모로부터 과립구-콜로니자극인자(G-CSF)를 정제하는 방법{PURIFICATION METHOD OF G-CSF FROM RECOMBINANT YEAST}

본 발명은 유전자 조작에 의해 재조합된 효모로부터 대량 발현된 과립구-클로니 자극 인자(G-CSF; granulocyte-colony stimulating factor)를 정제하는 방법에 관한 것이다.

인간의 조혈체계는 다양한 백혈구 세포-호중구. 대식구, 호염구, 비만 세포, 호산구, T세포, B세포-와 적혈구 세포, 그리고 혈액 응고와 관련된 혈병을 형성하는 세포들(clot-forming cells)-거핵구, 혈소판-로 이루어진다. 조혈작용은 다양하고 상당히 분화된 세포들을 만드는 일련의 복잡한 과정으로, 근간 세포(stem cells)가 다양한 선구 혈구 세포(progenitor)로 분화하고 분화된 선구 혈구세포는 활발하게 증식한 후 성숙한 혈구세포로 분화한다. 이 과정에 관련된 기작은 (1) 체액 활성화, (2) 다능성 근간세포 인자(pluripotent stem cell factor)의 자기재생과 분화 및 (3) 기질 성분(stromal component)과 근간 및 선구 혈구 세포 사이의 작용에 의해 피드백됨으로써 이루어진다[Tabbara 등.Anticancer Res.11, 81 ((1991)].

화학요법, 방사선 또는 자연적으로 발생한 골수 형성 이상 장애 등에 의해서 조혈 재생조직이 영향을 받으면 혈소판 감소증, 백혈구 감소증, 빈혈 등이 발생된다. 조혈성장인자(hematopoietic growth factor)는 이러한 병이 발생하는 동안 골수의 재생을 가속화한다. 후천성 면역 결핍증과 같이 몇가지 바이러스에 의한 발병으로 T 세포와 같은 혈구세포가 파괴될 경우에는 T 세포의 생산을 증가시키는 것이 치료의 한 방법이 될 수 있다.

조혈성장인자는 일반적으로 19-90kD 사이의 당단백질로서 매우 낮은 농도에서도 생물학적 활성을 나타내며[Schrader 등,PNAS, 83, 2458 (1986)] 어떤 조혈 성장인자들, 예를 들면 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 대식구-콜로니 자극 인자(Granulocyte Macrophage-colony stimulating factor), 콜로니 자극 인자-1, 인터루킨-3(interleukin-3)또는 다중-콜로니 자극 인자(multi-colony stimulating factor)및 적혈구 성장촉진 인자(erythropoietin)는 반도체 배양시 골수 유래의 콜로니 성장을 촉진시킨다[Metcalf 등,Science, 229, 16 (1985) 및 Clark 등,Science, 236, 1229 (1987)].

조혈성장인자는 매우 적은 양으로 존재하므로 이를 검출, 확인하기가 쉽지 않고 또한 특성 규명도 별로 이루어지지 않았으나 최근에 재조합 유전자 조작 기술의 발달로 시퀀싱과 클로닝 부분에서 조혈성장인자에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다[Lin 등 미합중국특허 제4703008 호: Souza 등, 미합중국특허 제 4810643 호: Lee 등PNAS. 82, 4360 (1985): Wong 등,Science, 228, 810 (1985): Yokota 등.PNAS, 81. 1070 (1984): 및 Fung 등,Nature, 307, 233 (1984): Gough 등,Nature, 309,763 (1984); 및 Kawasaki 등,Science, 230.291 (1985)].

조혈성장인자증 G-CSF는 생체외 (in vitro)에서 선구 혈구세포에 작용하여 과립구 콜로니 형성을 자극한다[Souza 등,Science, 232, 61(1986): 및 Metcalf 등,J. Cell. Physiol., 116, 198 (1983)]. 일반적으로 G-CSF는 207개의 아미노산 전구체로 합성되는데 이 중, 30 개의 아미노산은 소수성 시그널 펩티드로서 최종적으로 177개의 아미노산으로 이루어지며 아미노산 시퀀스상에 O-글리코실화될 수 있는 부분이 3군데-1, 7 및 8 번째 잔기-존재한다.

정제된 천연 G-CSF 단백질은 SDS-PAGE 상에서 24 kD 크기이며 pl는 5.5 이고 [Metcalf 등.J. Cell. Physiol., 116. 198 (1983)]. 루(Lu) 등의 실험결과에 따르면 E. coli에서 발현 정제된 재조합 인간 G-CSF는 4개의 시스테인 잔기가 각각 디설파이드 이중결합(Cys36-Cys42, Cys64-Cys74)을 형성하고 있으며, CD 스펙트럼 결과 G-CSF의 2차 구조의 상당부분이 알파 헬릭스 구조임이 밝혀졌다[Arch. Biochem.Biophysics., 268, 81 (1989)].

천연 G-CSF는 인간 방광암 세포주 5637[Morioka 등,Res, Exp. Med., 190,229 (1990), 및 Welte 등,PNAS., 82, 1526 (1985)]. 내독소가 주입된 마우스의 폐조직[Metcalf 등,J. Cell. Physiol., 116. 198(1983)], 및 인간 편평상피암 세포주 (CHU-2)[Nomura 등,EMBO J.,5. 871 (1986)] 등에서 유래된 추출물로부터 황산암모늄 분획, 소수성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 역상 고압 액체 크로마토그래피등 복잡한 과정을 통하여 활성 분획이 분리 정제되었다.

최근에는 유전자 재조합 G-CSF를 발현시킨 후 이를 순수하게 분리하여 그의 활성이 보고되었다. 암겐(Amgen)사의 경우 대장균에서 재조합 G-CSF를 발현시키고 라우르산나트륨을 이용하여 용해시킨 후 역상 고압 액체 크로마토그래피로 정제하여 95% 이상의 재조합 G-CSF 단백질을 얻었으며[Souza 등,Science, 232.61 (1986)], 추가리(Chugai)사의 경우 동물세포에서 발현된 재조합 G-CSF를 겔여과크로마토그래피 및 소수성 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. [Tsuchiya 등,EMBO J., 6, 611 (1987): 및 Oheda 등,J. Biochem., 103,544 (1988)] 이중에서 대장균 유래 단백질의 경우에는 대장균 유래의 발열물질을 제거하기가 쉽지 않아 의약품으로 제조하려면 발열물질을 제거하는 과정을 필히 추가해야 한다. 또 동물세포 유래의 재조합 G-CSF를 정제하는 경우에는 정제 초기 단계인 겔 여과 크로마토그래피 과정을 위해서 세포배양액을 농축해야 되는데 이것은 소규모의 정제과정에서는 가능할지 모르나 대량 정제를 위해서는 적합하지 못하다.

따라서 본발명자들은 상기의 문제점들을 해결하고자 부단히 노력한 결과 G-CSF 유전자를 클로닝한 다음 이를 유전공학적인 방법으로 형질전환시킨 재조합 효모에서 발현시키는데 성공하였으며, 이를 정제하는 과정에서 G-CSF 단백질의 특성을 연구한 결과 친수성 및 친유성을 동시에 갖는 시약(chaotrophic reagent)의 용액에서도 잘 용해되지 않는 성질을 발견하여 이 성질을 이용함으로써 대부분의 오염단백질을 제거하는 과정을 포함시킨 새로운 정제방법을 완성할 수 있었다.

즉, 본 발명의 목적은 재조합 효모에서 발현된 G-CSF를 고순도로 정제하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본발명에서는 G-CSF 유전자를 포함하는 형질전환된 효모세포를 배양하고, 배양된 효모세포를 파쇄한후 가용성 단백질을 제거하고, 불용성 침전물을 우레아 용액으로 세척하고, 우레아에 불용성인 침전물을 도데실황산나트륨(SDS) 용액에 용해시키고, 세파크린 S-100 겔 여과 칼럼크로마토그래피 및 S-세파로즈 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피하는 것을 포함하는 재조합 효모로부터 G-CSF를 정제하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

먼저 G-CSF 유전자를 포함하는 형질변형된 효모세포를 5% 글루코스가 포함된 Leu-배지에 넣고 진탕배양한 후, 5% YEPD 배지에 옮겨 배양하고 2% YEPD 배지에 옳겨 진탕배양하여 650nm에서 OD값이 20에 도달하면 배양을 끝낸다. 이 배양물을 원심분리하여 효모세포를 침전시킨다. 침전된 세포들을 EDTA, β-머캡토에탄올, 트리스 완충용액에 현탁시키고 PMSF(phenyl methyl sulfonyl fluoride)를 첨가한후 세포를 파쇄한다. 세포 파쇄물을 원심분리하여 침전물을 취하고 이를 우레아 용액으로 세척하여 오염단백질을 제거한다. 상기의 완충용액에 도데실황산나트륨을 첨가한 용액으로, 우레야 용액으로 용해되지 않은 침전물을 용해시키고 이 용액을 원심분리하여 상등액을 취한 다음 농축하였다. 1 % 트리톤을 함유하는 완충용액으로 미리 평형화한 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼에 상기 농축액을 주입한 후 상기의 완충용액으로 용출한다. 용출된 각 부분을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 G-CSF 부분만을 모은 후, 아세트산나트륨 완충용액으로 미리 평형화한 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼에 주입하여 상기의 완충용액으로 용출한다. 용출된 각 부분을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 G-CSF 부분만을 모아서 아세트산나트륨 완충용액에서 투석한 후, 동일 투석 완충용액으로 미리 평형화한 S-세파로즈 양이온 교환 칼럼에 흘려보내 결합시킨 다음, 칼럼내 유리된 상태로 존재하는 물질은 동일 완충용액으로 씻어내고 결합된 단백질은 0 내지 0.8 M 농도 구배의 염화나트륨을 함유하는 완충용액으로 용출하여 용출된 각 부분을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 G-CSF 부분만을 모음으로써 고순도의 G-CSF를 얻을 수 있다. 상기 과정을 제 1 도에 단계적으로 나타내었다.

상기 과정에서 오염 단백질을 제거하는데 사용되는 우레아 용액은 4 내지 9 M 농도로 사용하는 것이 바람직하고 8 M 농도로 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한 우레아 용액으로 용해되지 않은 침전물을 용해시키는데 사용되는 SDS 용액은 0.5 내지 1% 의 농도가 바람직하고 1% 의 농도로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 방법으로 정제한 재조합 G-CSF의 아미노말단의 아미노산 서열은 자동화된 아미노산 분석기 등을 사용하여 분석 확인할수 있다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본발명을 더욱 상세히 설명한다.

단, 본발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 재조합 효모세포의 배양

G-CSF 유전자를 포함하는 형질전환된 효모(기탁번호 KCTC 8672P) 1 ml를 5 % 글루코스가 포함된 10 ml Leu 배지(Leu 보충물 0.25 %, 아미노산이 들어 있지 않는 기본염 0.67 %, 아데닌 0.001 %, Thr 0.02 %)에 넣고 30 ℃에서 12 시간 진탕배양한 후, 50ml 의 5 % YEPD 배지에 옮겨 8 시간 배양하고, 다시 1 ℓ의 2 % YEPD 배지에 옮겨 약 48시간 진탕배양하여, 650 nm에서 OD 값이 20에 도달하면 배양을 종결시켰다. 원심분리기(Beckman, JB6, Rotor: JS 4.2 미국)로 3,500 rpm에서 25 분간 원심분리하여 효모세포를 침전시키고 이 침전된 세포들을 G-CSF의 정제에 사용하였다.

(실시예 2) 세포파쇄 및 오염단백질의 제거

실시예 1에서 얻은 효모세포 5 g을 1 mM EDTA, 5 mM β-머캡토에탄올 및 20 mM Tris 완충용액 (pH 8.0) 30ml 에 현탁시킨 다음 PMSF를 1 mM이 되도록 첨가하고, 4 ℃에서 비이드 비이터(bead beater: Biospec products, 미국)를 이용하여 5 분식 3 회에 걸쳐 세포를 파쇄하였다. 이 파쇄액에 상기 완충용액 10 ml 를 첨가한 후 10 분간 교반시킨 다음 원심분리하였다. 상등액은 버리고 침전물을 8 M 우레아 용액 40 ml 로 세척하여 오염 단백질을 제거하고, 불용성 침전물에 1% SDS 용액이 포함된 상기 완충액 10 ml를 첨가하여 용해시킨 후 원심분리하였다(12,000 rpm, 20 분). 침전물을 버리고 상등액을 취하여 다음 과정에 이용하였다.

(실시예 3) 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼 크로마토그래피

상기 실시예 2에서 얻어진 상등액을 YM 30 한외농축기(Amicon, 미국)를 이용하여 농축한 다음, 20 mM 트리스, 1 % 트리톤 X-100, 5 mM β-머캡토에탄올(pH 8.3) 완충용액으로 미리 평형화한 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼에 주입한 후 동일 완충용액으로 용출하였다. 용출된 각 부분을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 G-CSF 부분만을 수집한 후 25 mM 아세트산나트륨 완충용액(pH- 4.5)을 이용하여 2 회 투석하였다.

(실시예 4) S-세파로즈 양이온 교환 수지 칼럼 크로마토그래피

투석이 끝난 후 원심분리하여 상등액만 모으고 이 상등액을 25mM 아세트산나트륨(pH 4.5) 완충용액으로 미리 평형화한 S-세파로즈(Pharmacia사, 스웨덴) 양이온 교환 수지 칼럼에 통과시켜 결합시키고, 칼럼내에 유리된 상태로 남아있는 물질은 동일한 평형 완충용액으로 씻어내었다. 칼럼에 결합된 단백질은 0-0.8 M 염화나트름 농도구배를 함유하는 상기의 완충용액으로 용출하고, 용출된 각 부분을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 G-CSF 부분만을 수집함으로써 고순도의 G-CSF 단백질을 얻었다.

제 2도는 본발명의 정제 과정 각 단계에서의 전기 영동 결과를 나타낸 것으로, 1 레인은 세포파쇄후의 전체 균질액, 2 레인은 균질액중 원심분리한 침전물, 3 레인은 1 % SDS 용액으로 용해시킨 단백질들, 4 레인은 세파크린 S-100 겔 여과 칼럼 크로마토그래피후 수집한 용액, 5 레인은 S-세파로즈 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 최종 정제된 G-CSF 단백질의 전기 영동 결과이다.

(실시예 5) 정제된 재조합 G-CSF 의 아미노말단의 아미노산 서열분석

상기 실시예에 따라 정제한 G-CSF의 아미노말단의 아미노산 서열을 자동화된 서열분석기(모델 471A, Applied Biosystem사, 미국) 내에서 에드만 분해반응을 이용하여 분석하였다[Geoffray Zubay,Biochemistry, 제 2 판,47-48, (1988)]. 이 반응결과 생성된 페닐티오히단토인(phenythiohydantoin)이 붙은 아미노산을 역상 고압 크로마토그래피 칼럼(220mm x 2.1mm, 모델 PTH-222, Applied Biosystems 사, 미국)으로 분리하였으며 그결과를 제 3 도에 나타내었다. 제 3도에서 (a)는 G-CSF의 N-말단 첫번째 아미노산 잔기, (b)는 G-CSF의 N-말단 두번째 아미노산 잔기, (c)는 G-CSF의 N-말단 세번째 아미노산 잔기의 경우이다. 표준 아미노산의 상기 칼럼에서의 유지 시간과 비교한 결과, 본 발명의 방법으로 정제된 재조합 G-CSF의 아미노말단의 아미노산 서열은 Thr. Pro. Leu 임을 확인하였다. 정재된 G-CSF의 순도는 95% 이었다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본발명의 정제 방법에 의하면 G-SCF 단백질이 발현된 효모세포로부터 G-SCF를 순수하고 용이하게 분리 정제할 수 있다.

제 1 도는 재조합 효모로부터 발현된 G-CSF를 분리정제하는 과정의 흐름도이고;

제 2 도는 G-CSF의 정제과정 단계별로 전기영동 결과를 나타낸 것이고;

제 3 도는 정제된 G-CSF의 아미노 말단을 서열분석기를 통하여 분석한 후 역상 고압 크로마토그래피한 결과로서,

(a), (b) 및 (c)는 각각 G-CSF의 N-말단 첫번째, 두번째 및 세번째 아미노산 잔기를 나타낸다.

Claims

과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 유전자를 포함하는 형질전환된 효모세포를 배양하고, 배양된 효모세포를 파쇄한 후 기용성 단백질을 제거하고, 불용성 침전물을 우레아 용액으로 세척하고, 우레아에 불용성인 침전물을 도데실황산나트륨(SDS) 용액에 용해시키고, 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 및 S-세파로그 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피하는 것을 포함하는 재조합 효모로부터 G-CSF를 정제하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 우레아 용액이 4 내지 9 M 농도인 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 도데실황산나트륨 용액이 0.5 내지 1 % 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 세파크릴 S-100 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에서 1% 트리톤이 함유된 pH 8.3의 완충용액을 사용하는 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 S-세파로즈 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피에서 아세트산 나트륨 완충용액(pH 4.5)을 사용하는 것을 특징으로하는 방법.
제 5 항에 있어서,

0-0.8 M 염화나트륨 농도구배를 이응하여 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.