CN112852878A - 一种转基因家蚕生产重组人源ⅲ型胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种转基因家蚕生产重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，以家蚕作为载体，利用粒子枪将家蚕转基因质粒注射到家蚕卵的前胚层胚胎中，在25℃的温度下孵育成转基因家蚕，并获得蚕茧。将蚕茧放置于胰蛋白酶中，混合、震荡、离心，去除丝胶后，用硫氰酸胍和β‑巯基乙醇溶解形成混合溶液；利用透析袋对混合溶液透析，将透析后混合溶液中倒入(NH4)2SO4水溶液，离心，得可溶性蛋白，再经过AKTA层析系统和Superdex200分析柱纯化，得目标物。该工艺简单，蛋白表达水平高，生长速度快，蛋白折叠有效，广泛的翻译后修饰，糖基化与哺乳动物细胞类似，无内毒素；产量高、收率高、纯度高，能达到完全脱色目的，获得单一的、纯的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，适用于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种转基因家蚕生产重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是人体中最主要的结构性蛋白，占人体蛋白质总量的30％以上、占细胞外基质的70％-80％，在人体中发挥着支撑、信号调控、维系细胞生存的微环境等多种功能。人体目前已发现28种不同型别的胶原蛋白，分别分布于皮肤、粘膜、血管、骨骼、肌腱、内脏器官等人体的各个部位，发挥着各自不同的生理功能。人体皮肤及粘膜中，胶原蛋白占干重的70％至80％，I型和III型胶原蛋白是关系人体皮肤损伤后修复和修复质量的关键因素，在人体中分布广泛。I型胶原蛋白主要存在与成人的皮肤、肌腱及骨组织上，III型胶原蛋白主要存在与婴儿的皮肤或血管内膜、肠道上及成人软骨、玻璃体、椎间盘等上。其中，III型胶原蛋白的合成能力很强，能够在创伤修复中将来源于骨髓的干细胞分化成帮助修复的纤维细胞。但III型人源胶原蛋白会随着年龄的增长而逐渐流失，在婴幼儿时期，存在于皮肤或血管内膜、肠道的III型人源胶原蛋白大概比I型人源胶原蛋白高出80％，当婴幼儿发生软组织挫伤时，骨髓处的干细胞会分化成纤维细胞，合成III型人源胶原蛋白，并利用其修复和弹性功能帮助挫伤组织修复，一般情况下不会留下疤痕。而成人体内的III型人源胶原蛋白明显少于I型人源胶原蛋白，I型占比80％，III型占比20％，在合成细胞外基质(ECM)时，组织的修复质量就明显弱于婴幼儿，会留下疤痕。随着人年龄的增加，III型人源胶原蛋白流失愈来愈多，在25岁以后，皮肤中III型胶原蛋白的合成赶不上流失，皮肤渐渐松弛，出现敏感、皱纹等各种衰老现象。因此，补充III型胶原蛋白可延缓皮肤衰老，增加皮肤弹性，修复各种问题性皮肤。
目前，市场上主流胶原蛋白为猪皮、鱼皮、牛皮、驴皮、鱼鳞等中提取的动物源胶原蛋白，其基因序列与人源胶原蛋白有着根本性差异，属于非同源物质。在提取过程中，动物源胶原蛋白的结构和活性可能被破坏，最终提炼出的产品主要以胶原蛋白短肽的形式呈现，不能行使其生物学功能。同时，动物源胶原蛋白进入人体后受到皮肤免疫层阻隔，无法深入肌底层、真皮层，且在使用过程中存在活性低甚至无活性、有动物源病毒污染、过敏风险等诸多弊端。动物组织提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性及结构的弱加工赋型性等缺点，限制了许多潜在用途的开发。随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原已取得巨大成果，与天然胶原蛋白相比，利用该技术生产的胶原蛋白解决了传统提取法存在的病毒隐患缺陷，同时又显著提高了胶原蛋白的稳定性、亲水性和生物相容性。微生物发酵所用宿主菌目前主要采用大肠杆菌，但采用大肠杆菌表达获得的重组胶原蛋白存在纯化困难的问题及内毒素含量高的风险。
发明内容
为解决背景技术中存在的问题，本发明提供一种转基因家蚕生产重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法。
本发明的技术方案如下：
一种转基因家蚕生产重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤S1：载体的筛选
以家蚕卵作为载体；
步骤S2：转基因载体的制备
在家蚕卵被产出后的2～8小时内，利用粒子枪取20nL的家蚕转基因质粒溶液，注射到家蚕卵的前胚层胚胎中，注射后的家产卵即为转基因载体；
步骤S3：转基因载体的培育
转基因载体在25℃的温度条件下孵育成转基因家蚕，并获得转基因蚕茧；
步骤S4：转基因蚕茧丝胶的去除
取50mg的转基因蚕茧，放置于5mL 1mg/mL的胰蛋白酶中，混合、以100rpm的转速进行震荡、以10000rpm的转速进行离心，去除转基因蚕茧中的丝胶；
步骤S5：重组人源Ⅲ型胶原蛋白的提取
步骤S51：混合溶液的制备
将去除丝胶后的转基因蚕茧，用2mL 6moL/L硫氰酸胍和2mL 5％β-巯基乙醇溶解形成混合溶液；
步骤S52：混合溶液的透析
取10～15cm的透析袋，将其一端用棉绳扎死，由开口端倒入上述混合溶液，开口端用棉绳扎死，将盛装有混合溶液的透析袋放入30mL 10mM的磷酸盐缓冲液中，上述放置透析袋的磷酸盐缓冲液在500rpm的磁力搅拌器内搅拌8h后，取出透析袋，透析袋内的混合溶液即为透析后混合溶液；
步骤S53：透析后混合溶液的分离
将透析后混合溶液中倒入2mL 19％(NH4)2SO4水溶液，以10000rpm的转速进行离心，去除离心后的上清液，离心后的下层沉淀物即为可溶性蛋白；
步骤S54：重组人源Ⅲ型胶原蛋白的纯化
将上述可溶性蛋白用AKTA层析系统和Superdex200分析柱纯化后得到重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种利用家蚕做重组蛋白表达载体的简单工艺，该工艺具有蛋白的表达水平高，生长速度快，蛋白折叠有效，广泛的翻译后修饰，糖基化与哺乳动物细胞类似，无内毒素的优点重组人源Ⅲ型胶原蛋白的产量高、收率高、纯度高，且能达到完全脱色的目的，以获得单一的、纯的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，适合于工业化大规模生产的家蚕表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白的生产方法。
附图说明
通过参考以下结合附图的说明，并且随着对本发明的更全面理解，本发明的其它目的及结果将更加明白及易于理解。在附图中：
图1为实施例1中可溶性蛋白的免疫印迹电泳实验
图2为实施例1中可溶性蛋白和重组人源Ⅲ型胶原蛋白的电泳图。
图3为实施例1中可溶性蛋白的色谱图。
图4为实施例1中重组人源Ⅲ型胶原蛋白的色谱图。
具体实施方式
为使本领域技术人员能够更好的理解本发明的技术方案及其优点，下面结合附图对本申请进行详细描述，但并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
一种转基因家蚕生产重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法：
以家蚕卵作为载体，在家蚕卵被产出后的2～8小时内，利用粒子枪取20nL的家蚕转基因质粒(购买于云舟生物科技(广州)有限公司)溶液，注射到家蚕卵的前胚层胚胎中，注射后的家产卵即为转基因载体；转基因载体在25℃的温度条件下孵育成转基因家蚕，并获得转基因蚕茧；取50mg的转基因蚕茧，放置于5mL 1mg/mL的胰蛋白酶中，混合、以100rpm的转速进行震荡、以10000rpm的转速进行离心，去除转基因蚕茧中的丝胶；
蛋白质的粗提过程：将去除丝胶后的转基因蚕茧，用2mL 6moL/L硫氰酸胍和2mL5％β-巯基乙醇溶解形成混合溶液；取10～15cm的透析袋，将其一端用棉绳扎死，由开口端倒入上述混合溶液，开口端用棉绳扎死，将盛装有混合溶液的透析袋放入30mL 10mM的磷酸盐缓冲液中，上述放置透析袋的磷酸盐缓冲液在500rpm的磁力搅拌器内搅拌8h后，取出透析袋，透析袋内的混合溶液即为透析后混合溶液；将透析后混合溶液中倒入2mL 19％(NH4)2SO4水溶液，以10000rpm的转速进行离心，去除离心后的上清液，离心后的下层沉淀物即为可溶性蛋白；
重组人源Ⅲ型胶原蛋白的纯化过程：将上述可溶性蛋白用AKTA层析系统和Superdex200分析柱纯化后得到纯化后蛋白即重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
实验例1免疫印迹电泳实验
(1)实验对象：实施例1中的可溶性蛋白
(2)实验过程如下：
1.取上述实验对象样品，上样量为10uL；
2.上样完毕后，用0.1％SDS-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；
3.转模：转膜装置依次按阳极碳板、24层滤纸、纤维膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，接通电源，恒流1mA/cm2，1.5h；
4.将纤维膜与anti-EGFP抗体浸泡在10mL碱性磷酸酶缓冲溶液中(pH7.5)，65℃，2h。
5.用碱性磷酸酶缓冲溶液清洗3次，加入CDP-Star37℃培育15min后显色。
(3)实验结论
参阅图1：①为实施例1中的可溶性蛋白的免疫印迹电泳图；②为蛋白质标准品(北京索莱宝科技有限公司；批号07270101180)。
由于anti-EGFP抗体与重组人源Ⅲ型胶原蛋白有免疫反应，因此在图1中，我们通过与蛋白质标准品的电泳图比对确认分子量在82附近的蛋白条带显色，为目标物即重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
实验例2电泳实验
(1)实验对象：实施例1中的可溶性蛋白和实施例1中的纯化后蛋白
(2)实验过程如下：
1.取上述实验对象样品，上样量为10uL；
2.上样完毕后，用0.1％SDS-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；
3.用碱性磷酸酶缓冲溶液清洗3次，加入CBB R250染色。
(3)实验结论
参阅图2：①实施例1中的重组人源Ⅲ型胶原蛋白；②实施例1中的可溶性蛋白；③蛋白质标准品。
可见②经过电泳分离后出现三个蛋白条带，在实验例1的基础上，与③对比确认分子量在82附近的蛋白条带即为目标物，其余蛋白条带为杂质；①为纯化后的蛋白，图2可见，①中仅出现一个蛋白条带，并且分子量在82附近，说明经过纯化后，我们得到了单一的重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
实验例3色谱实验
(1)实验对象：实施例1中的重组人源Ⅲ型胶原蛋白和可溶性蛋白
(2)实验条件：缓冲溶液为50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，流速0.4mL/min，检测波长为280nm。色谱柱：BEH300 C4 3.5μm，2.1×50mm。
(3)实验结论：图3为可溶性蛋白的色谱图，从中可以看出样品出现三个峰，也就是说，样品中含有两个杂质蛋白，结果与电泳实验相同。图4为纯化后蛋白的色谱图，从中可以看出样品出现单独的一个峰，并且，该峰在图3相同位置也出现过，所以可以判断，可溶性蛋白经过分离纯化后获得了一个纯蛋白。在免疫印迹实验的基础上，可以确定，该位置处的纯蛋白即为重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种转基因家蚕生产重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：载体的筛选
以家蚕作为载体；
步骤S2：转基因载体的制备
在家蚕卵被产出后的2～8小时内，利用粒子枪取20nL的家蚕转基因质粒溶液，注射到家蚕卵的前胚层胚胎中，注射后的家蚕卵即为转基因载体；
步骤S3：转基因载体的培育
转基因载体在25℃的温度条件下孵育成转基因家蚕，并获得转基因蚕茧；
步骤S4：转基因蚕茧丝胶的去除
取50mg的转基因蚕茧，放置于5mL 1mg/mL的胰蛋白酶中，混合、以100rpm的转速进行震荡、以10000rpm的转速进行离心，去除转基因蚕茧中的丝胶；
步骤S5：重组人源Ⅲ型胶原蛋白的提取
步骤S51：混合溶液的制备
将去除丝胶后的转基因蚕茧，用2mL 6moL/L硫氰酸胍和2mL 5％β-巯基乙醇溶解形成混合溶液；
步骤S52：混合溶液的透析
取10～15cm的透析袋，将其一端用棉绳扎死，由开口端倒入上述混合溶液，开口端用棉绳扎死，将盛装有混合溶液的透析袋放入30mL 10mM的磷酸盐缓冲液中，上述放置透析袋的磷酸盐缓冲液在500rpm的磁力搅拌器内搅拌8h后，取出透析袋，透析袋内的混合溶液即为透析后混合溶液；
步骤S53：透析后混合溶液的分离
将透析后混合溶液中倒入2mL 19％(NH4)2SO4水溶液，以10000rpm的转速进行离心，去除离心后的上清液，离心后的下层沉淀物即为可溶性蛋白；
步骤S54：重组人源Ⅲ型胶原蛋白的纯化
将上述可溶性蛋白用AKTA层析系统和Superdex200分析柱纯化后得到重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
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