CN114163518A - 一种从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白提取技术领域，具体涉及一种从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法。包括如下步骤：将猪小肠粘膜下层组织分离；后进行预处理、除杂；再在酸性条件下进行研磨，将组织粗破碎；加入酶溶液磨浆，制得细破碎匀浆；再使用盐析法进行胶原蛋白提取物的分离；对分离后的胶原蛋白提取物进行洗涤、真空冷冻干燥，即得高活性的胶原蛋白提取物。本发明提出的方法操作简单、成本低，提取率高，所获得的胶原蛋白具备稳定的三螺旋结构，活性好，纯度高，适合推广应用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白提取技术领域，具体涉及一种从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是一种纤维状的蛋白质，具有3条分子量相近的肽链相互缠绕形成的三螺旋结构，该结构依靠氢键维持稳定，分子量大约为300KD，是一种高分子细胞外蛋白。胶原蛋白具有丰富的氨基酸，如甘氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸，其中，必需氨基酸占胶原蛋白总氨基酸含量的大约16%。生理条件下，胶原蛋白广泛存在于动物体的皮肤，血管，韧带，骨骼，肌腱和软骨组织中，可以发挥支撑器官，保护机体，维持血管壁，维持皮肤弹性、提高毛发亮度和软骨润滑度等重要的生理功能。另外，胶原蛋白具有免疫原性低、可降解、生物活性高和生物相容性好等优点，于是，其相关的胶原蛋白制品被广泛应用于食品、保健品、化妆品和医药领域。
由于胶原蛋白制品已经被广泛应用于多个领域，导致市场需求迅速增加，因此胶原蛋白的来源、制备和提取工艺越来越受到重视。现如今，胶原蛋白制品的来源主要是从牛、猪等动物的组织中获取。近年来，从海洋生物的组织，如鱼皮，提取胶原蛋白也有越来越多的报道。但是，猪小肠粘膜下层组织是一种新型的细胞外基质框架，含有丰富的胶原蛋白，适合作为一种良好的胶原蛋白制品的来源，材料获取容易。
胶原蛋白的提取工艺主要分为2个步骤，首先是对原料进行处理以去除杂质，如脂肪组织，杂蛋白，色素；其次，应用物理、化学、生物的方法，破坏胶原纤维组织，从而提取胶原蛋白。常见的物理提取方法有热水抽提、热压浸提等；常见的化学提取方法有：酸提取法、碱提取法等；常见的生物学方法有：酶法、中性盐析，微生物发酵法，重组DNA提取法等。其中，酸和碱的使用是胶原蛋白提取中最常见的手段，且处理时间长。这可能会导致胶原蛋白结构失活，蛋白降解等问题，进而导致最终提取效率不高。为了提高胶原蛋白的提取效率，缩短提取周期，提高产品质量，通过加入辅助方法去优化胶原蛋白的提取工艺已经被证明是一种有效的手段。已被发现和证实方法有撞击流法辅助酸和酶提取牛跟腱中的胶原蛋白（中国专利，CN106866815A），低剂量辐射辅助酶提取鱼皮中的胶原蛋白（中国专利，CN107022592A）和超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白（CN110272485A）。但是总体来说辅助提取胶原蛋白的方法还是较少，市场上急需更多的时间短且提取效率高的胶原蛋白提取方法。珠磨法是一种物理破碎细胞的方式，基本原理是通过机械转动使磨腔内的细小磨介高速运动以产生各种机械应力作用，比如碰撞、挤压和剪切，以此来使细胞破碎从而达到从细胞中释放有价值物质的目的。珠磨法和胶体磨都是基于机械设备的方法，通过物理粉碎达到使原料分散的目的，常常用于材料的微粒化和乳化。操作简单，成本低，条件温和，适合用于胶原蛋白的提取工艺中。
本发明旨在提供一种从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法，有效解决了以上问题，大大缩短了提取时间提取率高，所获得的胶原蛋白具备稳定的三螺旋结构，活性好，纯度高，适合推广应用。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种高效地从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法，操作简单，成本低；本发明提出的方法提取率高，所获得的胶原蛋白具备稳定的三螺旋结构，活性好，纯度高，适合推广应用。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种提取活性胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
（1）将猪小肠粘膜下层组织分离；
（2）将猪小肠粘膜下层组织进行预处理、除杂；
（3）将组织与酸液混合后，进行研磨，将组织粗破碎；
（4）将粗破碎的组织中加入酶溶液并进行磨浆，制得细破碎匀浆；
（5）盐析法进行胶原蛋白提取物的分离；对分离后的胶原蛋白提取物进行洗涤、真空冷冻干燥，即得高活性的胶原蛋白提取物。
优选地，（2）中，所述预处理为将分离出的猪小肠粘膜下层组织放在30-40℃，优选为37℃，的碱液中处理15-25 min后，放入酸液中浸泡处理5-15 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干。
优选地，所述酸液1-3%乳酸；所述碱液为1-3%NaOH溶液。
优选地，（3）中，所述酸液为复合酸，所述复合酸中包括：1-3%柠檬酸，1-3%乳酸，1-3%盐酸。
优选地，（3）中，所述研磨过程中，加入2-3颗钢珠，转移至球磨罐中，并于珠磨机上进行组织破碎。
优选地，所述研磨过程中设置珠磨机转速为300-400 rpm，时间为4-10s停3s，循环研磨6-8次，重复3-5次。
优选地，所述钢珠在-20℃预冷5-15 min处理，优选为10 min。
优选地，（4）中，所述酶溶液为复合酶溶液，所述复合酶溶液中包括：1000-1500U/L脂肪酶，500-1000U/L磷脂酶，0.01-0.05w%水杨酸，1-3w%柠檬酸钠，1000-2000U/L无花果蛋白酶，1400-2000U/L木瓜蛋白酶，胃蛋白酶1500-4500U/L。
所述组织与复合酶溶液的用量比为1g：50-100mL；优选为1g：50mL。
优选地，所述复合酶溶液的pH值为4.5-5.5，优选为pH值为5.0，所述pH值使用1-3%的NaOH溶液调节，优选为1%的NaOH溶液。
优选地，（4）中，所述磨浆过程中加入保护剂，所述保护剂包括柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液；
优选地，所述柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液中：盐酸的质量浓度为0.45%-1.6%，氢氧化钠浓度为8.4g/L-18.6g/L，柠檬酸浓度为21g/L-26.6g/L，可调节pH范围为2.2-6.5。
优选地，所述柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液的用量为5mL/g组织。优选地，所述保护剂中还包括冰块。
优选地，所述冰块的用量为组织体积的1/5-1/10。
优选地，（5）中，所述分离为：将细破碎匀浆离心除掉沉淀物，取上层清液用碱液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为1-5 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后离心。
优选地，所述离心的条件为5000-8000 g离心10 -30 min；优选为8000 g离心20min。
优选地，所述碱液为1-3% NaOH溶液。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
（1）本发明方法采用珠磨法和胶体磨联合酸酶法进行胶原蛋白的提取，操作简单，成本低；本发明从组织处理开始到最终获得胶原蛋白，不需要常规方法酶缓慢处理过夜，只需1.5-6h左右即可获得胶原蛋白，能够大大缩短提取时间。
（2）本发明提出的方法提取率高，所获得的胶原蛋白具备稳定的三螺旋结构，活性好，纯度高，适合推广应用。
（3）本发明中细破碎匀浆过程中使用了复合酶溶液和保护剂，取得了较好的匀浆的效果，同时能够有效保护胶原蛋白肽，有利于提高胶原蛋白提取物的提取效率，同时提高了胶原蛋白肽的生物活性。
附图说明
图1：本发明方法提取的胶原蛋白的SDS-PAGE胶图；
图2：本发明方法提取的胶原蛋白的圆二色谱分析图；
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；且不同来源对产品性能不具有显著性影响。
实施例1
（1）猪小肠粘膜下层分离：取下一段长约10 cm的猪空肠，沿纵向剪开，用生理盐水冲洗3遍；用玻片轻轻刮去表面杂物并剪去肠系膜；随后使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外。相同的方法刮去黏膜上皮和固有层，再用生理盐水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下的约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为猪小肠粘膜下层，浸泡于100 μg/ml硫酸庆大霉素溶液并在4℃ 储存。
（2）预处理和去除杂蛋白：将步骤（1）中得到的组织放在37℃的2%NaOH溶液中处理15 min后随后放入1%乳酸中浸泡处理5 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干。
（3）粗破碎匀浆：使用珠磨法进行组织的粗破碎；组织与复合酸溶液混合后，加入2-3颗钢珠，转移至球磨罐中并于珠磨机上进行组织破碎；设置转速为300 rpm，时间为4 s停3s，循环研磨6次，重复3次；其中，所述复合酸溶液组成为：1%柠檬酸，1%乳酸，1%盐酸。
（4）细破碎匀浆：使用胶体磨进行组织的细破碎；在上述步骤（3）中加入pH值为5.0的复合酶溶液后，5mL/g组织的柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液（其中，盐酸的质量浓度为0.45%，氢氧化钠浓度为8.4g/L，柠檬酸浓度为21g/L）和1/10组织体积的冰块，并通过胶体磨磨浆8 min，循环研磨2次，胶体磨间隙为0.5 mm，用300目滤布过滤除杂。
（5）胶原蛋白提取物的分离：将步骤（4）得到的提取液固液分离，离心除掉沉淀物，取上层清液用1%NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为1 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后8000g离心20 min；收集沉淀物，洗涤、真空冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
其中，步骤（3）中钢珠，提前在-20℃预冷10 min处理。
步骤（4）中的复合酶溶液组成为 1000U/L脂肪酶，500U/L磷脂酶，0.01w%水杨酸，1w%柠檬酸钠，1000U/L无花果蛋白酶，1400U/L木瓜蛋白酶，胃蛋白酶1500U/L。所述组织与复合酶溶液的用量比为1g:10mL。
实施例2
（1）猪小肠粘膜下层分离：取下一段长约10 cm的猪空肠，沿纵向剪开，用生理盐水冲洗3遍。用玻片轻轻刮去表面杂物并剪去肠系膜。随后使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外；相同的方法刮去黏膜上皮和固有层，再用生理盐水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下的约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为猪小肠粘膜下层，浸泡于150 μg/ml硫酸庆大霉素溶液并在4℃储存；
（2）预处理和去除杂蛋白：将步骤（1）中得到的组织放在37℃的2%NaOH溶液中处理20 min后随后放入2%乳酸中浸泡处理10 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干；
（3）粗破碎匀浆：使用珠磨法进行组织的粗破碎。组织与复合酸溶液混合后，加入2-3颗钢珠，转移至球磨罐中并于珠磨机上进行组织破碎。设置转速为350 rpm，时间为7s停3s，循环研磨7次，重复3次；其中，复合酸溶液组成为：1%柠檬酸，1%乳酸，3%盐酸
（4）细破碎匀浆：使用胶体磨进行组织的细破碎；在上述步骤（3）中加入pH值为5.0的复合酶溶液后，5mL/g组织的柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液（其中，盐酸的质量浓度为0.45%，氢氧化钠浓度为8.4g/L，柠檬酸浓度为21g/L）和1/8组织体积的冰块，并通过胶体磨磨浆9 min，循环研磨2次，胶体磨间隙为0.5 mm，用400目滤布过滤除杂；
（5）胶原蛋白提取物的分离：将步骤（4）得到的提取液固液分离，离心除掉沉淀物，取上层清液用1%NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为3 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后8000g离心20 min。收集沉淀物，洗涤、真空冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
其中，步骤（3）中钢珠，提前在-20℃预冷10 min处理。
步骤（4）中的复合酶溶液组成为 1300U/L脂肪酶，800U/L磷脂酶，0.03w%水杨酸，2w%柠檬酸钠，1500U/L无花果蛋白酶，1700U/L木瓜蛋白酶，胃蛋白酶3000U/L。所述组织与复合酶溶液的用量比为1g:30mL。
实施例3
（1）猪小肠粘膜下层分离：取下一段长约10 cm的猪空肠，沿纵向剪开，用生理盐水冲洗3遍。用玻片轻轻刮去表面杂物并剪去肠系膜。随后使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外。相同的方法刮去黏膜上皮和固有层，再用生理盐水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下的约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为猪小肠粘膜下层，浸泡于200 μg/ml硫酸庆大霉素溶液并在4℃储存；
（2）预处理和去除杂蛋白：将步骤（1）中得到的组织放在37℃的3%NaOH溶液中处理25 min后随后放入3%乳酸中浸泡处理15 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干；
（3）粗破碎匀浆：使用珠磨法进行组织的粗破碎。组织与复合酸溶液混合后，加入2-3颗钢珠，转移至球磨罐中并于珠磨机上进行组织破碎。设置转速为400 rpm，时间为10s停3s，循环研磨8次，共研磨1 min，重复3次；其中，复合酸溶液的组成为：3%柠檬酸，3%乳酸，3%盐酸。
（4）细破碎匀浆：使用胶体磨进行组织的细破碎。在上述步骤（3）中加入pH值为5.0的复合酶溶液后，5mL/g组织的柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液（盐酸的质量浓度为1.6%，氢氧化钠浓度为18.6g/L，柠檬酸浓度为26.6g/L）和1/5组织体积的冰块，并通过胶体磨磨浆10 min，循环研磨2次，胶体磨间隙为0.5 mm，用500目滤布过滤除杂；
（5）胶原蛋白提取物的分离：将步骤（4）得到的提取液固液分离，离心除掉沉淀物，取上层清液用1%NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为5 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后8000g离心20 min。收集沉淀物，洗涤、真空冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
其中，步骤（3）中钢珠，提前在-20℃预冷10 min处理。
步骤（4）中的复合酶溶液组成为 1500U/L脂肪酶，1000U/L磷脂酶，0.05w%水杨酸，3w%柠檬酸钠，2000U/L无花果蛋白酶，2000U/L木瓜蛋白酶，胃蛋白酶4500U/L。所述组织与复合酶溶液的用量比为1g:50mL。
对比例1
（1）猪小肠粘膜下层分离：取下一段长约10 cm的猪空肠，沿纵向剪开，用生理盐水冲洗3遍。用玻片轻轻刮去表面杂物并剪去肠系膜。随后使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外。相同的方法刮去黏膜上皮和固有层，再用生理盐水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下的约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为猪小肠粘膜下层，浸泡于200 μg/ml硫酸庆大霉素溶液并在4℃储存；
（2）预处理和去除杂蛋白：将步骤（1）中得到的组织放在37℃的3%NaOH溶液中处理25 min后随后放入3%乳酸中浸泡处理15 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干；
（3）酸化溶胀：将步骤（2）得到的组织浸泡于1%醋酸溶液中2h使之充分溶胀；
（4）破碎匀浆：使用胶体磨进行组织的细破碎。在上述步骤（3）中加入pH值为5.0的复合酶溶液后，5mL/g组织的柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液（其中，盐酸的质量浓度为0.45%，氢氧化钠浓度为8.4g/L，柠檬酸浓度为21g/L）和1/10组织体积的冰块，并通过胶体磨磨浆10 min，循环研磨2次，胶体磨间隙为0.5 mm，用500目滤布过滤除杂；
（5）胶原蛋白提取物的分离：将步骤（4）得到的提取液固液分离，离心除掉沉淀物，取上层清液用1%NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为5 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后8000g离心20 min。收集沉淀物，洗涤、真空冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
其中，步骤（4）中的复合酶溶液组成为 1500U/L脂肪酶，1000U/L磷脂酶，0.05w%水杨酸，3w%柠檬酸钠，2000U/L无花果蛋白酶，2000U/L木瓜蛋白酶，胃蛋白酶4500U/L。所述组织与复合酶溶液的用量比为1g:50mL。
对比例2
（1）猪小肠粘膜下层分离：取下一段长约10 cm的猪空肠，沿纵向剪开，用生理盐水冲洗3遍。用玻片轻轻刮去表面杂物并剪去肠系膜。随后使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外。相同的方法刮去黏膜上皮和固有层，再用生理盐水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下的约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为猪小肠粘膜下层，浸泡于200 μg/ml硫酸庆大霉素溶液并在4℃储存。
（2）预处理和去除杂蛋白：将步骤（1）中得到的组织放在37℃的3%NaOH溶液中处理25 min后随后放入3%乳酸中浸泡处理15 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干。
（3）破碎匀浆：使用珠磨法进行组织的粗破碎。组织与复合酸溶液混合后，加入2-3颗钢珠，转移至球磨罐中并于珠磨机上进行组织破碎。设置转速为400 rpm，时间为10s停3s，循环研磨8次，共研磨1 min，重复3次；其中，所述复合酸的组成为：3%柠檬酸，3%乳酸，3%盐酸；其中，钢珠提前在-20℃预冷10 min处理；
（4）消化：将步骤（3）所得产物中加入胃蛋白酶溶液中消化12h，所述胃蛋白酶溶液含胃蛋白酶10000U/L，1%醋酸，所述组织与胃蛋白酶的用量比为1g:50mL。
（5）胶原蛋白提取物的分离：将步骤（4）得到的提取液固液分离，离心除掉沉淀物，取上层清液用1%NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为5 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后8000g离心20 min。收集沉淀物，洗涤、真空冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
对比例3
（1）猪小肠粘膜下层分离：取下一段长约10 cm的猪空肠，沿纵向剪开，用生理盐水冲洗3遍。用玻片轻轻刮去表面杂物并剪去肠系膜。随后使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外。相同的方法刮去黏膜上皮和固有层，再用生理盐水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下的约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为猪小肠粘膜下层，浸泡于200 μg/ml硫酸庆大霉素溶液并在4℃储存。
（2）预处理和去除杂蛋白：将步骤（1）中得到的组织放在37℃的3%NaOH溶液中处理25 min后随后放入3%乳酸中浸泡处理15 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干。
（3）酸化溶胀：将步骤（2）得到的组织浸泡于1%醋酸溶液中2h使之充分溶胀。
（4）消化：将步骤（3）所得产物中加入胃蛋白酶溶液中消化12h，所述胃蛋白酶溶液含胃蛋白酶10000U/L，1%醋酸，所述组织与胃蛋白酶的用量比为1g:50mL。
（5）胶原蛋白提取物的分离：将步骤（2）得到的提取液固液分离，离心除掉沉淀物，取上层清液用1%NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为5 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后8000g离心20 min。收集沉淀物，洗涤、真空冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
1、胶原蛋白提取效果
计算实施例1-3中，提取的胶原蛋白的得率，计算公式如下：
胶原蛋白得率=胶原蛋白提取物的质量/未经预处理的原料的质量*100%；
表1 实施例1-3及对比例1-3的胶原蛋白得率
本发明方法从猪小肠黏膜下层中提取胶原蛋白的时间大约在1.5-6h，相比于其他方法，本发明方法时间较短。相比于其他组织来说，如鱼皮、牛跟腱等组织，本发明方法的蛋白得率高。如表1所示，在没有使用任何辅助方法的时候，对比例3提取的胶原蛋白的得率为53.9%，在使用其中之一珠磨法或者胶体磨法时，胶原蛋白的提取率略有提升，分别为55.9%、56.4%。当使用本发明方法在猪小肠粘膜下层中提取胶原蛋白时，得率得到显著性的提升，约提升了20%，实施例1-3的得率分别为65.1%，65.5%和64.6%。
2、分析测试例1
将实施例1制得的胶原蛋白提取物作为待测样品，用3%醋酸溶解为约1 mg/mL的溶液，与样品缓冲液（市售蛋白上样缓冲液，购买自碧云天，货号：P0015B）等体积混合，置于90~100℃热水中1 min~2 min取出进行SDS-PAGE电泳，样品上样体积为20 µL，将电压设定为110 V，上样完毕后进行电泳；电泳结束，卸下胶板，剥离胶放入考马斯亮蓝染色液中，室温染色2h。加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上，每20 min更换一次脱色液至完全脱净；经过染色、脱色后胶片，用影像分析系统进行扫描分析，获得本发明提取的胶原蛋白的SDS-PAGE胶图，见图1。
结果显示，未经过提取和纯化处理的样本，在SDS-PAGE图中（其中，Marker是SDS-PAGE电泳实验的分子量标准品），显示了较多的杂带，表明未经处理的样本蛋白种类复杂；胶图结果显示，与标准品对比，经过本发明方法从猪小肠黏膜下层中提取的胶原蛋白条带完整，蛋白质结构完整，无明显杂带，纯度高。
3、分析测试例2
将实施例1制得的胶原蛋白提取物作为待测样品，用圆二色光谱仪（AppliedPhotophysicsChirasican）进行分析；将待测样品用3%醋酸溶解为约1 mg/mL的溶液，测定波长范围：190~250 nm，比色皿光程：1 mm，扫描速度：0.5 nm/s；测定环境：25℃，氮气保护，以3%的醋酸溶液为空白对照；获得本发明提取的胶原蛋白的圆二色谱分析图，见图2。
结果显示，在200 nm附近存在负吸收峰，在220 nm附件存在正吸收峰，是三螺旋结构所特有的，说明提取的胶原蛋白保留了完整的三螺旋结构，具备生物活性。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将猪小肠粘膜下层组织分离；
（2）将猪小肠粘膜下层组织进行预处理、除杂；
（3）将组织与酸液混合后，进行研磨，将组织粗破碎；
（4）将粗破碎的组织中加入酶溶液并进行磨浆，制得细破碎匀浆；
（5）盐析法进行胶原蛋白提取物的分离；对分离后的胶原蛋白提取物进行洗涤、真空冷冻干燥，即得高活性的胶原蛋白提取物。
2.如权利要求1所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，（2）中，所述预处理为将分离出的猪小肠粘膜下层组织放在30-40℃的碱液中处理15-25 min后，放入酸液中浸泡处理5-15 min，再转移至生理盐水中清洗，晾干。
3.如权利要求2所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，所述酸液为：1-3%乳酸；所述碱液为1-3%NaOH溶液。
4.如权利要求1所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，（3）中，所述酸液为复合酸，所述复合酸中包括：1-3%柠檬酸，1-3%乳酸，1-3%盐酸。
5.如权利要求1所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，（3）中，所述研磨过程中，加入2-3颗钢珠，转移至球磨罐中，并于珠磨机上进行组织破碎；所述研磨过程中设置珠磨机转速为300-400 rpm，时间为4-10s停3s，循环研磨6-8次，重复3-5次。
6.如权利要求1所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，（4）中，所述酶溶液为复合酶溶液，所述复合酶溶液中包括：1000-1500U/L脂肪酶，500-1000U/L磷脂酶，0.01-0.05w%水杨酸，1-3w%柠檬酸钠，1000-2000U/L无花果蛋白酶，1400-2000U/L木瓜蛋白酶，胃蛋白酶1500-4500U/L；所述组织与复合酶溶液的用量比为1g：50-100mL。
7.如权利要求6所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，所述复合酶溶液的pH值为4.5-5.5。
8.如权利要求1所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，（4）中，所述磨浆过程中加入保护剂，所述保护剂包括柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液和/或冰块。
9.如权利要求1-8任一所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，（5）中，所述分离为：将细破碎匀浆离心除掉沉淀物，取上层清液用碱液调节pH值至中性，然后加入NaCl使其浓度为1-5 mol/L以进行胶原蛋白盐析，静置，随后离心。
10.如权利要求9所述的提取活性胶原蛋白的方法，其特征在于，所述离心的条件为5000-8000g离心10 -30 min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210131712.1A CN114163518A (zh) | 2022-02-14 | 2022-02-14 | 一种从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202210131712.1A CN114163518A (zh) | 2022-02-14 | 2022-02-14 | 一种从猪小肠粘膜下层中提取活性胶原蛋白的方法 |
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| CN110628857B (zh) * | 2019-10-29 | 2021-07-02 | 南宁学院 | 一种牛皮中胶原蛋白的提取方法 |
| CN113717273A (zh) * | 2021-09-06 | 2021-11-30 | 北京博辉瑞进生物科技有限公司 | 天然胶原材料及天然胶原材料的制备方法、用途 |
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2022
- 2022-02-14 CN CN202210131712.1A patent/CN114163518A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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