CN110638684A - 一种可注射的胶原组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可注射的胶原组合物及制备方法。该可注射胶原组合物包括去端肽胶原凝胶和分散于所述去端肽胶原凝胶中的n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，所述n为3～18中的整数。本发明的可注射胶原组合物采用具有不同粒径的n种脱细胞胶原颗粒，使得在机体内的降解吸收过程循序渐进地发生，更容易被人体耐受，维持周期显著延长，填充效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种可注射胶原组合物及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们越来越注重对于外在美的追求，注射美容术因为手术危险性低、并发症少、恢复时间短而备受推崇。注射美容术是将可注射材料直接注射于人体特定部位，使人体的容貌或体型有所改观，起到增进容貌美或同时改善功能的方法。
目前，可注射型软组织填充产品的类型有合成高分子材料、透明质酸和异体脱细胞真皮产品。合成高分子材料的主要缺点是不可降解，长期存留于人体内会影响皮肤的正常生理活动，有致癌风险。透明质酸的作用效果较短，持续时间仅为六个月到一年。异体脱细胞真皮产品的主要缺点是材料来源有限，且在脱细胞方法中使用如十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠等的化学药品，不仅难以完全去除，还会对机体产生毒害。
可见，目前的可注射型软组织填充产品存在生物安全性低，容易对机体产生危害，降解周期短等缺陷。
发明内容
基于此，有必要提供一种安全有效且在机体内保持时间长的可注射胶原组合物。
一种可注射胶原组合物，包括去端肽胶原凝胶和分散于所述去端肽胶原凝胶中的n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，所述n为3～18中的整数。
在其中一个实施例中，所述n种脱细胞胶原颗粒的粒径范围在30μm～300μm。
在其中一个实施例中，n种所述脱细胞胶原颗粒在所述可注射胶原组合物中的浓度随粒径的大小呈正相关变化；n种所述脱细胞胶原颗粒中的最小粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不超过10mg/mL，最大粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不低于80mg/mL。
在其中一个实施例中，所述n种脱细胞胶原颗粒记为颗粒A1至颗粒An，所述颗粒A1至颗粒An的粒径分别记为B1至Bn，浓度分别记为C1至Cn，满足S1≤B1＜S2，S2≤B2＜S3，……，Sn≤Bn≤Sn+1，N1＜C1≤N2，N2≤C2≤N3，……，Nn≤Cn≤Nn+1，S2-S1＝S3-S2＝……＝Sn+1-Sn，N3-N2＝……＝Nn+1-Nn。
在其中一个实施例中，所述n为3、6、9、12、15或18。
一种可注射胶原组合物的制备方法，该方法包括：
将生物组织进行脱细胞处理，得到细胞外基质；
将所述细胞外基质进行粉碎处理和除杂处理，收集胶原基质；
将第一部分所述胶原基质进行去端肽处理，得到去端肽胶原凝胶；
将第二部分所述胶原基质研磨为n种粒径不同的颗粒，得到n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，所述n为3～18中的整数；
将n种所述脱细胞胶原颗粒与所述去端肽胶原凝胶混合，得到可注射胶原组合物。
在其中一个实施例中，将所述生物组织进行脱细胞处理前，先进行消毒处理，然后用纯水清洗。
在其中一个实施例中，所述生物组织包括筋膜组织、皮肤组织、小肠粘膜下层组织、羊膜组织、肌腱组织、血管组织和神经组织中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述脱细胞处理包括：将所述生物组织依次置于低渗溶液和高渗溶液中进行处理，然后清洗。
在其中一个实施例中，将所述细胞外基质进行粉碎处理和除杂处理，收集胶原基质的步骤包括：
将所述细胞外基质进行第一粉碎处理和第一除杂处理，得到第一除杂处理后的物料；所述第一除杂处理包括：将第一粉碎处理后的物料置于第一碱溶液中进行处理，然后进行冻融，最后用纯水进行清洗，所述第一碱溶液为氢氧化钠溶液；
将第一除杂处理后的物料进行第二粉碎处理和第二除杂处理，得到第二除杂处理后的物料；所述第二除杂处理包括：将第二粉碎处理后的物料置于非离子洗涤剂中进行处理，最后用纯水进行清洗；
将第二除杂处理后的物料进行第三粉碎处理和第三除杂处理，收集胶原基质；所述第三除杂处理包括：将第三粉碎处理后的物料置于第二碱溶液中进行处理，最后用纯水进行清洗，所述第二碱溶液为碳酸氢钠溶液或碳酸钠溶液。
在其中一个实施例中，所述去端肽处理包括：将第一部分所述胶原基质与蛋白酶混合进行酶解反应，然后进行盐析和透析。
在其中一个实施例中，所述n种脱细胞胶原颗粒的粒径范围在30μm～300μm。
在其中一个实施例中，将所述n种脱细胞胶原颗粒与所述去端肽胶原凝胶混合之前，先将所述n种脱细胞胶原颗粒进行灭菌处理。
在其中一个实施例中，在将n种所述脱细胞胶原颗粒与所述去端肽胶原凝胶混合的步骤中，n种所述脱细胞胶原颗粒在所述可注射胶原组合物中的浓度随粒径的大小呈正相关变化；n种所述脱细胞胶原颗粒中的最小粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不超过10mg/mL，最大粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不低于80mg/mL。
本发明的可注射胶原组合物采用去端肽胶原凝胶作为分散介质，其更容易被机体吸收，并进而组合成自身胶原，有利于机体组织的修复和功能重建；采用具有不同粒径的n种脱细胞胶原颗粒作为分散相，使得降解吸收过程循序渐进地发生，更容易被人体耐受，且能不断刺激胶原增生，维持周期显著延长，填充效果更好。
相比于现有技术中的合成高分子材料类软组织填充产品，本发明的可注射胶原组合物为可吸收降解材料，生物相容性好，安全性更高。与透明质酸类产品相比，本发明的可注射胶原组合物的机械性能和降解性能更优，能够避免因材料降解过于集中而产生的免疫或组织反应问题。相比于异体脱细胞真皮产品，本发明的可注射胶原组合物的原材料易获得，还克服了有机试剂残留、细胞毒性高等缺陷，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为一实施方式的可注射胶原组合物的制备方法的流程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的可注射胶原组合物，包括去端肽胶原凝胶和分散于所述去端肽胶原凝胶中的n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，所述n为3～18中的整数。
上述可注射胶原组合物中，采用去端肽胶原凝胶作为分散介质，去端肽胶原比未去端肽的胶原更容易吸收，能够刺激机体产生新的自体胶原，形成正常的结缔组织，促进机体组织的修复和功能重建。以具有不同粒径的n种脱细胞胶原颗粒为分散相，不同大小的微粒化的脱细胞胶原基质材料的降解周期不同，因而可陆续被机体吸收，使降解吸收过程循序渐进地发生，有效延长了降解时间，更容易被人体耐受，且在降解过程中能够陆续产生新的结缔组织，直到达到稳定的机体组织状态，实现良好的修复和维持效果。去端肽胶原和脱细胞胶原均为生物相容性高的材料，可被自身降解吸收，使得本发明的可注射胶原组合物安全可靠。
n种脱细胞胶原颗粒仅在粒径上存在差异。进一步地，n种脱细胞胶原颗粒的粒径范围在30μm～300μm。其中，该粒径范围是指，n种脱细胞胶原颗粒的粒径均落在上述范围内，即最小的脱细胞胶原颗粒的粒径不低于30μm，而最大的脱细胞胶原颗粒的粒径不高于300μm。上述粒径范围内的脱细胞胶原颗粒的机械性能和抗降解性能较强，可使该可注射胶原组合物保持较长的降解时间。
n种脱细胞胶原颗粒的粒径可以呈梯度变化，其中呈梯度变化是指，当按一定的粒径区间对全部脱细胞胶原颗粒进行划分时，可以分为粒径分布在n个范围内的n种颗粒，该n种颗粒的粒径呈逐渐增大或逐渐减小的变化趋势。其中，作为划分依据的粒径区间(某种颗粒的最大粒径与最小粒径的差值)可以在很大范围内调整，例如10μm～100μm，n种颗粒可以具有相同的粒径区间，也可以具有不同的粒径区间。举例来说，当本发明的可注射胶原组合物具有3种脱细胞胶原颗粒时，其粒径依次可以在50μm～70μm、80μm～100μm、120～150μm(粒径区间均为20μm)；或者，其粒径也可以在50μm～65μm、70μm～100μm、105～150μm(粒径区间依次为15μm、30μm和45μm)。n种颗粒的粒径可以是连续的，也可以是非连续的，以上举例的两种实施方式均为粒径非连续的情况，即后一种颗粒的最小粒径与前一种颗粒的最大粒径之间存在粒径差。
通过调整n种脱细胞胶原颗粒在去端肽胶原凝胶中的浓度，可以调节可注射胶原组合物的降解时间，使得降解吸收过程可控地进行。具体地，n种脱细胞胶原颗粒的浓度随粒径的大小呈正相关变化。换言之，当n种脱细胞胶原颗粒的粒径逐渐增大时，其各自的浓度也逐渐增大；相反，当n种脱细胞胶原颗粒的粒径逐渐减小时，其各自的浓度也逐渐减小。更简单地说，具有较小粒径的颗粒在去端肽胶原凝胶中的浓度较低，而具有较大粒径的颗粒的浓度则较高。进一步地，n种脱细胞胶原颗粒中，具有最小粒径的那一种脱细胞胶原颗粒的浓度不超过10mg/mL，具有最大粒径的那一种脱细胞胶原颗粒的浓度不低于80mg/mL。n种脱细胞胶原颗粒的粒径在上述范围内变化时，能够使得本发明的可注射胶原组合物具有较好的抗降解效果，在机体内的维持时间更长，并且不会产生显着的免疫或组织反应问题。
在一个实施例中，n种脱细胞胶原颗粒记为颗粒A1至颗粒An，颗粒A1至颗粒An的粒径分别记为B1至Bn，浓度分别记为C1至Cn。本领域技术人员可以理解的是，颗粒A1为一集合概念，颗粒A1的粒径B1代表颗粒A1中任意颗粒的粒径。该颗粒A1至颗粒An的粒径满足S1≤B1＜S2，S2≤B2＜S3，……，Sn≤Bn≤Sn+1，其中S2-S1＝S3-S2＝……＝Sn+1-Sn，进一步地S1为30μm，Sn+1为300μm，S2-S1＝S3-S2＝……＝Sn+1-Sn＝270/n。该颗粒A1至颗粒An的浓度满足N1＜C1≤N2，N2≤C2≤N3，……，Nn≤Cn≤Nn+1，N3-N2＝……＝Nn+1-Nn，进一步地N1＝0，N2＝10mg/mL。这时，n种脱细胞胶原颗粒具有均匀变化的粒径和浓度，能够使可注射胶原组合物在注射后实现持续可控的降解吸收，对机体组织的修复和功能重建具有更为有利的作用。
进一步地，n可以为3、6、9、12、15或18，优选为6、9或12。
一实施方式的上述可注射胶原组合物的制备方法，参考图1，该方法包括：
S1：将生物组织进行消毒处理，得到消毒处理后的生物组织。
其中，生物组织包括筋膜组织、皮肤组织、小肠粘膜下层组织、羊膜组织、肌腱组织、血管组织和神经组织中的至少一种。上述生物组织具有较高的胶原含量，且是容易获得的可降解材料，采用上述生物组织制备的可注射胶原组合物具有良好的生物相容性。
消毒处理可以为常规的任意方法。在一个实施例中，消毒处理包括：采用乙醇溶液对生物组织进行处理，乙醇溶液的浓度可以为75重量％，处理的时间可以为1h～3h，最后用纯水进行清洗。
为了提高处理效果，还可以将消毒处理后的生物组织进行切片。
S2：将消毒处理后的生物组织进行脱细胞处理，得到细胞外基质。
其中，脱细胞处理可以为本领域常规的各种方法，例如物理法、化学法和酶学法等。在一个实施例中，脱细胞处理包括：将生物组织依次置于低渗溶液和高渗溶液中进行处理，然后清洗。低渗溶液可以有效地溶解生物组织细胞，高渗溶液可将DNA与蛋白分离，清洗去除DNA及试剂残留后得到细胞外基质。其中，低渗溶液和高渗溶液均为本领域技术人员熟知的试剂，生物组织与低渗溶液和高渗溶液接触的时间可以分别为10h～20h。
S3：将细胞外基质进行第一粉碎处理和第一除杂处理，得到第一除杂处理后的物料。
第一粉碎处理可以为本领域常规的对细胞外基质进行粉碎的方法，本发明没有特殊的限制。将细胞外基质进行第一粉碎处理后，得到第一粉碎处理后的物料，然后进行第一除杂处理。第一除杂处理包括：将第一粉碎处理后的物料置于第一碱溶液中进行处理，然后进行冻融。其中，第一碱溶液为氢氧化钠溶液，其溶液浓度可以为0.4重量～2重量％，第一粉碎处理后的物料与第一碱溶液的重量比可以为(10～20)：100。将第一粉碎处理后的物料置于第一碱溶液中进行处理的温度可以为2℃～10℃，时间可以为6h～24h。冻融的条件包括：温度为-60℃至-40℃，时间为2h～4h。冻融可以反复进行3～6次，即进行一次冻融后将物料自然解冻，然后再进行下一次冻融。第一除杂处理后，可以采用纯水洗去杂质，得到第一除杂处理后的物料。
S4：将第一除杂处理后的物料进行第二粉碎处理和第二除杂处理，得到第二除杂处理后的物料。
第二粉碎处理同样可以为常规的粉碎方法。将第一除杂处理后的物料进行第二粉碎处理后，得到第二粉碎处理后的物料，然后进行第二除杂处理。第二除杂处理包括：将第二粉碎处理后的物料置于非离子洗涤剂中进行处理。其中，非离子洗涤剂例如可以为Triton-100等，第二粉碎处理后的物料与非离子洗涤剂的重量比可以为(10～20)：100，非离子洗涤剂可以为水溶液的形式，其溶液浓度可以为0.1重量～5重量％。将第二粉碎处理后的物料置于非离子洗涤剂中进行处理的温度可以为2℃～10℃，时间可以为12h～24h。第二除杂处理后，可以采用纯水洗去杂质，得到第二除杂处理后的物料。
S5：将第二除杂处理后的物料进行第三粉碎处理和第三除杂处理，收集胶原基质。
第三粉碎处理为常规的粉碎方法。将第二除杂处理后的物料进行第三粉碎处理，得到第三粉碎处理后的物料，然后进行第三除杂处理。第三除杂处理包括：将第三粉碎处理后的物料置于第二碱溶液中进行处理。其中，第二碱溶液为碳酸氢钠溶液或碳酸钠溶液，其溶液浓度可以为1重量～5重量％，第三粉碎处理后的物料与第二碱溶液的重量比可以为(10～20)：100。将第三粉碎处理后的物料置于第二碱溶液中进行处理的温度可以为2℃～10℃，时间可以为6h～24h。将第三粉碎处理后的物料置于第二碱溶液中进行处理后，可以采用纯水洗去杂质。为了进一步提高除杂效果，可以将此步骤反复进行多次。
通过步骤S3～S5的共3次粉碎处理和除杂处理，能够有效地将细胞外基质碎片化，使胶原基质微粒大小更为均匀，并最大程度地除去脂质、细胞核等杂质，降低材料的免疫原性。
S6：将第一部分胶原基质进行去端肽处理，得到去端肽胶原凝胶。
将步骤S5得到的胶原基质分为两部分，第一部分胶原基质进行去端肽处理。进一步地，去端肽处理包括：将第一部分胶原基质与蛋白酶混合进行酶解反应，然后进行盐析和透析。其中，蛋白酶可以为胃蛋白酶，酶解反应的条件可以包括：温度为2℃～10℃，时间为48h～96h；盐析和透析是本领域常规的用于纯化蛋白的步骤，此处不再赘述。
S7：将第二部分胶原基质研磨为n种粒径不同的颗粒，得到n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，n为3～18中的整数。
第二部分胶原基质的粒径一般仍然较大，通过研磨并进行筛分，可得到符合前文所述的粒径分布的n种脱细胞胶原颗粒。研磨可以在本领域的常规设备中进行。
S8：将n种脱细胞胶原颗粒进行灭菌处理。
在一个实施例中，灭菌处理包括：将n种脱细胞胶原颗粒进行辐照灭菌，进一步地，辐照的条件包括：采用钴-60为放射源，剂量为15kGy～25kGy。
S9：将灭菌处理后的n种脱细胞胶原颗粒与去端肽胶原凝胶混合，得到可注射胶原组合物。
将粒径不同的n种脱细胞胶原颗粒与步骤S6得到的去端肽胶原凝胶混合，使n种脱细胞胶原颗粒均匀地分散悬浮在去端肽胶原凝胶中，即可得到本发明的可注射胶原组合物。
进一步地，在将n种脱细胞胶原颗粒与去端肽胶原凝胶混合时，通过控制n种脱细胞胶原颗粒各自的加入量，能够使所得到的可注射胶原组合物中，n种脱细胞胶原颗粒的浓度符合前文所述的与粒径大小呈正相关变化的要求。
上述方法采用同种生物组织进行脱细胞处理，经粉碎除杂步骤去除杂质，获得低免疫的胶原基质，其中一部分胶原基质制成脱细胞胶原颗粒，另一部分去端肽获得胶原凝胶，二者混合后即可得到本发明的可注射胶原组合物，制备工艺简单，适合工业化生产。
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不用于现在本发明。
实施例1
(1)将筋膜组织浸泡在75重量％酒精溶液中2h进行消毒处理，然后用纯水多次清洗后，切成2mm见方的片状组织。
(2)将上述片状组织用低渗溶液(10mM Tris-HCl，50mM EDTA)处理11h后，再用高渗溶液(50mM Tris-HCl，1M NaCl，10mM EDTA)处理11h。
(3)将步骤(2)中得到的物料用10℃纯水清洗4遍后在组织搅碎机(Waring公司生产，型号为8011ES)中进行第一粉碎处理，然后将粉碎后的物料用10倍的0.4重量％氢氧化钠溶液在4℃下浸泡6h，在-60℃下冻融2h，取出后自然解冻，反复冻融3次，随后用纯水清洗，得到第一除杂处理后的物料。
(4)将步骤(3)得到的第一除杂处理后的物料用纯水清洗4遍后进行第二粉碎处理，然后将粉碎后的物料用10倍的0.1重量％非离子洗涤剂Triton-100溶液在4℃下浸泡12h，随后用纯水清洗，得到第二除杂处理后的物料。
(5)将步骤(4)得到的第二除杂处理后的物料用纯水清洗4遍后进行第三粉碎处理，然后将粉碎后的物料用10倍的1重量％碳酸钠溶液在4℃下浸泡6h，随后用纯水清洗，该步骤重复2次，收集胶原基质。
(6)将步骤(5)得到的胶原基质中一部分用胃蛋白酶在8℃下进行酶解96h，然用氯化钠溶液进行盐析，最后透析纯化，获得去端肽胶原凝胶。
(7)将步骤(5)得到的胶原基质中另一部分进行研磨，过筛，去除粒径为30μm以下及300μm以上的颗粒，然后多次研磨筛分，获得粒径在30μm～＜60μm、60μm～＜90μm、90μm～＜120μm、120μm～＜150μm、150μm～＜180μm、180μm～＜210μm、210μm～＜240μm、240μm～＜270μm、270μm～＜300μm的9种脱细胞胶原颗粒，分装后进行钴-60辐照(剂量为25kgy)，常温保存。
(8)将步骤(7)得到的九种脱细胞胶原颗粒按粒径从小到大依次浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL混入步骤(6)得到的去端肽胶原凝胶中，得到可注射胶原组合物。
实施例2
本实施例的可注射胶原组合物制备步骤与实施例1大致相同，区别在于：步骤(7)中研磨筛分得到粒径在30μm～＜120μm、120μm～＜210μm、210μm～＜300μm的3种脱细胞胶原颗粒，其在步骤(8)中的浓度依次为10mg/mL、50mg/mL、90mg/mL。
实施例3
本实施例的可注射胶原组合物制备步骤与实施例1大致相同，区别在于：步骤(7)中研磨筛分得到粒径在30μm～＜45μm、45μm～＜60μm、60μm～＜75μm、75μm～＜90μm、90μm～＜105μm、105μm～＜120μm、120μm～＜135μm、135μm～＜150μm、150μm～＜165μm、165μm～＜180μm、180μm～＜195μm、195μm～＜210μm、210μm～＜225μm、225μm～＜240μm、240μm～＜255μm、255μm～＜270μm、270μm～＜285μm、285μm～＜300μm的18种脱细胞胶原颗粒，其在步骤(8)中的浓度依次为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、85mg/mL、85mg/mL、90mg/mL。
实施例4
本实施例的可注射胶原组合物制备步骤与实施例1大致相同，区别在于：9种脱细胞胶原颗粒在步骤(8)中的浓度均为50mg/mL。
实施例5
本实施例的可注射胶原组合物制备步骤与实施例1大致相同，区别在于：步骤(7)中研磨筛分得到粒径在30μm～＜60μm、80μm～＜120μm、130μm～＜180μm、190μm～＜250μm的4种脱细胞胶原颗粒，其在步骤(8)中的浓度依次为10mg/mL、20mg/mL、35mg/mL、55mg/mL、80mg/mL。
对比例1
(1)将筋膜组织浸泡在75重量％酒精溶液中2h进行消毒处理，然后用纯水多次清洗后，切成2mm见方的片状组织。
(2)将上述片状组织用低渗溶液(10mM Tris-HCl，50mM EDTA)处理11h后，再用高渗溶液(50mM Tris-HCl，1M NaCl，10mM EDTA)处理11h。
(3)将步骤(2)中得到的物料用纯水清洗4遍后在组织搅碎机(Waring公司生产，型号为8011ES)中进行粉碎处理，然后将粉碎后的物料用10倍的0.4重量％氢氧化钠溶液在4℃下浸泡6h，在-60℃下冻融2h，取出后自然解冻，反复冻融3次，随后用纯水清洗，收集胶原基质。
(4)将步骤(3)得到的胶原基质中一部分用胃蛋白酶在8℃下进行酶解96h，然用氯化钠溶液进行盐析，最后透析纯化，获得去端肽胶原凝胶。
(5)将步骤(3)得到的胶原基质中另一部分研磨为粒径为300μm的脱细胞胶原颗粒，然后进行钴-60辐照(剂量为25kgy)，常温保存。
(6)将步骤(5)得到的脱细胞胶原颗粒按浓度为90mg/mL混入步骤(4)得到的去端肽胶原凝胶中，得到可注射胶原组合物。
测试例1
将实施例1～5和对比例1制备的可注射胶原组合物进行皮下注射，试验参考标准为GB/T16886.6-2015。具体试验方法：选用家兔背部进行注射填充，兔麻醉背部去毛后，每侧植入5个点，每个点相隔2cm～3cm，注射量为0.2mL，观察填充剂在动物体内的降解情况。
实施例1～3的可注射胶原组合物进行皮下填充后无明显炎症反应，填充物降解时间为12～18月；实施例4～5降解时间稍低于实施例1～3，但均超过10个月；实施例4的可注射胶原组合物在前期有炎症反应，随后炎症反应逐渐消失。以上结果说明本发明的可注射胶原组合物的填充效果好，在机体内能够长时间维持，且生物相容性良好。而对比例1的可注射胶原组合物有严重且持续的炎症反应，主要是因为产品出现集中降解情况，使机体免疫反应过强。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种可注射胶原组合物，其特征在于，包括去端肽胶原凝胶和分散于所述去端肽胶原凝胶中的n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，所述n为3～18中的整数。
2.根据权利要求1所述的可注射胶原组合物，其特征在于，n种所述脱细胞胶原颗粒的粒径范围在30μm～300μm。
3.根据权利要求1所述的可注射胶原组合物，其特征在于，n种所述脱细胞胶原颗粒在所述可注射胶原组合物中的浓度随粒径的大小呈正相关变化；n种所述脱细胞胶原颗粒中的最小粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不超过10mg/mL，最大粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不低于80mg/mL。
4.根据权利要求1所述的可注射胶原组合物，其特征在于，所述n种脱细胞基质颗粒记为颗粒A1至颗粒An，所述颗粒A1至颗粒An的粒径分别记为B1至Bn，浓度分别记为C1至Cn，满足S1≤B1＜S2，S2≤B2＜S3，……，Sn≤Bn≤Sn+1，N1＜C1≤N2，N2≤C2≤N3，……，Nn≤Cn≤Nn+1，S2-S1＝S3-S2＝……＝Sn+1-Sn，N3-N2＝……＝Nn+1-Nn；及/或，
所述n为3、6、9、12、15或18。
5.一种可注射胶原组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括：
将生物组织进行脱细胞处理，得到细胞外基质；
将所述细胞外基质进行粉碎处理和除杂处理，收集胶原基质；
将第一部分所述胶原基质进行去端肽处理，得到去端肽胶原凝胶；
将第二部分所述胶原基质研磨为n种粒径不同的颗粒，得到n种粒径不同的脱细胞胶原颗粒，所述n为3～18中的整数；
将n种所述脱细胞胶原颗粒与所述去端肽胶原凝胶混合，得到可注射胶原组合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物组织包括筋膜组织、皮肤组织、小肠粘膜下层组织、羊膜组织、肌腱组织、血管组织和神经组织中的至少一种；及/或，
所述脱细胞处理包括：将所述生物组织依次置于低渗溶液和高渗溶液中进行处理，然后清洗。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述细胞外基质进行粉碎处理和除杂处理，收集胶原基质的步骤包括：
将所述细胞外基质进行第一粉碎处理和第一除杂处理，得到第一除杂处理后的物料；所述第一除杂处理包括：将第一粉碎处理后的物料置于第一碱溶液中进行处理，然后进行冻融，所述第一碱溶液为氢氧化钠溶液；
将第一除杂处理后的物料进行第二粉碎处理和第二除杂处理，得到第二除杂处理后的物料；所述第二除杂处理包括：将第二粉碎处理后的物料置于非离子洗涤剂中进行处理；
将第二除杂处理后的物料进行第三粉碎处理和第三除杂处理，收集胶原基质；所述第三除杂处理包括：将第三粉碎处理后的物料置于第二碱溶液中进行处理，所述第二碱溶液为碳酸氢钠溶液或碳酸钠溶液。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述去端肽处理包括：将第一部分所述胶原基质与蛋白酶混合进行酶解反应，然后进行盐析和透析。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述n种脱细胞胶原颗粒与所述去端肽胶原凝胶混合之前，先将所述n种脱细胞胶原颗粒进行灭菌处理。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述n种脱细胞胶原颗粒的粒径范围在30μm～300μm；及/或，
在将n种所述脱细胞胶原颗粒与所述去端肽胶原凝胶混合的步骤中，n种所述脱细胞胶原颗粒在所述可注射胶原组合物中的浓度随粒径的大小呈正相关变化；n种所述脱细胞胶原颗粒中的最小粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不超过10mg/mL，最大粒径的所述脱细胞胶原颗粒的浓度不低于80mg/mL。
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