CN105658250A

CN105658250A - 包含颗粒状脱细胞组织的混合凝胶

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Publication number: CN105658250A
Application number: CN201480038295.XA
Authority: CN
Inventors: 松田纯; 松田纯一; 宫柱澄香; 原野里美; 岸田晶夫; 木村刚; 根岸淳; 樋上哲哉; 舩本诚; 舩本诚一; 日渡谦郎; 日渡谦一郎; 田崎晃子
Original assignee: Common financial group legal person chemical and serum therapy research institute; Tokyo Medical and Dental University NUC; Sapporo Medical University; Asahi Denka Kogyo KK
Current assignee: Adeka Corp; Tokyo Medical and Dental University NUC; Sapporo Medical University
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2034-05-02
Also published as: JPWO2014181886A1; EP2995326A4; EP2995326B1; EP2995326A1; HK1222137A1; CN105658250B; JP6553507B2; KR102339700B1; WO2014181886A1; KR20160025502A; CA2911592A1; US20160051731A1; CA2911592C

Abstract

本发明提供：一种混合凝胶，其中包含颗粒状脱细胞组织(将来自动物的生物组织进行脱细胞处理所得的脱细胞生物组织粉碎而获得)、纤维蛋白原和凝血酶；包含该混合凝胶的细胞培养基材；该混合凝胶的制作方法；以及包含颗粒状脱细胞组织和生物组织粘合剂的试剂盒。本发明的混合凝胶具有促进干细胞的分化和功能获取的效果、以及对各种疾病的治疗效果。

Description

包含颗粒状脱细胞组织的混合凝胶

技术领域

本发明涉及再生医疗技术领域，具体而言，涉及包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的混合凝胶及其利用方法。

背景技术

将来自他人的生物组织的移植片进行移植时，接受移植者侧组织对移植片的排斥反应成为问题。作为这种问题的解决方法，期待着开发人工组织。作为原材料，尝试了各种高分子，但由于这些原材料与生物组织的相容性低，因此有时会发生移植片与生物组织的接合部位的脱落或发生感染。

因此，为了提高与生物组织的相容性，开发了如下技术：使用从生物组织中除去细胞而残留的支持组织即脱细胞生物组织作为移植片的技术；使用将这样的脱细胞生物组织粉碎而获得的组织(颗粒状脱细胞组织)的技术。

其中，CryoLife公司开发了可最初商业利用的进行了脱细胞的来自人的心瓣膜，AutoTissue公司为了治疗人的心脏疾病开发了进行了脱细胞的来自猪的心瓣膜。

关于脱细胞组织、颗粒状脱细胞组织有以下的报道。非专利文献1 (Sasaki S.等人, Mol. Vis., 2009, 15, 2022-2028)、非专利文献2 (Hashimoto Y等人, Biomaterials, 2010, 31, 3941-3948)报道了：将通过高静水压处理进行了脱细胞的猪角膜移植到兔眼中时发挥功能。专利文献1 (日本特开2013-42677号公报)公开了一种适合角膜的脱细胞处理的处理液。非专利文献3 (Funamoto S.等人, Biomaterials, 2010, 31, 3590-3595)报道了：通过高静水压处理将来自猪的大动脉脱细胞，对所得的脱细胞组织的力学特性或体内能力进行评价的结果，力学特性没有受到高静水压处理的不良影响，炎症反应得到抑制，该组织可以耐受动脉血压，而且在管腔表面没有形成血栓，还报道了：在移植该血管后4周发生细胞浸润到血管壁的现象。非专利文献4 (Negishi J.等人, J. Artif. Organs, 2011, 14, 223-231)报道了：在胶原蛋白变性得到了抑制的条件下将来自大鼠的颈动脉脱细胞，再将该脱细胞的颈动脉移植到大鼠体内时，动脉闭塞得到抑制。

非专利文献5 (Singelyn J. M.等人, Biomaterials, 2009, 30, 5409-5416)报道了：利用表面活性剂将猪的心肌脱细胞，之后经过冷冻干燥、粉碎和胃蛋白酶消化，所得的心肌基质自身缔合，形成多孔性纤维状水凝胶；以及内皮细胞、平滑肌细胞渗入到该水凝胶中，使小血管的形成增加。非专利文献6 (Seif-Naraghi S.等人, J. Vis. Exp., 2010, 46, e2109)是将该水凝胶应用于左室自由壁后研究宿主反应。非专利文献7 (Singelyn J. M.等人, J. Am. Coll. Cardiol., 2012, 59, 751-763)报道了：将该水凝胶应用于心肌梗塞模型大鼠时，使内源性的心肌细胞增加，保持了心脏功能，而没有引起心律不齐。非专利文献8 (Sonya B.等人, Sci. Transl. Med., 2013, 5, 173ra25)报道了：将该水凝胶应用于猪的心肌梗塞模型时，心脏功能、心室容积、心脏壁的整体运动有所改善，另外，该水凝胶与大鼠具有生物相容性。非专利文献9 (Wolf M. T.等人, Biomaterials, 2012, 33, 7028-7038)公开了：将来自猪的真皮或来自猪的膀胱经过脱细胞处理、冷冻干燥和胃蛋白酶处理而得到的细胞外基质水凝胶应用于大鼠腹壁缺损部位时，与来自真皮的凝胶相比，来自膀胱的凝胶被更快地分解，肌肉形成量更多。

但是，该水凝胶在临床上并没有充分应用于靶部位的方法，因此设想其从应用部位剥落或者添加的基质流失而从目标部位消失。颗粒状脱细胞组织根据其种类期待着其通过自凝胶化而留置在应用部位，但凝胶化无法瞬间完成，而且与靶部位的亲和性也不充分。特别是在心脏这样的动态组织中，该水凝胶难以留置在应用部位，其结果，暗示无法获得充分的效果。

专利文献2 (日本特表2002-518319号公报)报道了：将对人皮肤的脱细胞组织基质AlloDerm (LifeCell公司制造)进行低温破坏而获得的粒状无细胞组织基质应用于大鼠或猪时，没有发现严重的急性炎症性应答的征兆。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-42677号公报；

专利文献2：日本特表2002-518319号公报；

专利文献3：日本专利第4092397号公报；

专利文献4：日本再公表2008-111530号公报；

专利文献5：日本特开2009-50297号公报；

专利文献6：日本特开2010-227246号公报；

专利文献7：日本专利第4189484号公报；

非专利文献

非专利文献1：Sasaki S.等人, Mol. Vis., 2009, 15, 2022-2028；

非专利文献2：Hashimoto Y.等人, Biomaterials, 2010, 31, 3941-3948；

非专利文献3：Funamoto S.等人, Biomaterials, 2010, 31, 3590-3595；

非专利文献4：Negishi J.等人, J. Artif. Organs, 2011, 14, 223-231；

非专利文献5：Singelyn J. M.等人, Biomaterials, 2009, 30, 5409-5416；

非专利文献6：Seif-Naraghi S.等人, J. Vis. Exp., 2010, 46, e2109；

非专利文献7：Singelyn J. M.等人, J. Am. Coll. Cardiol., 2012, 59, 751-763；

非专利文献8：Sonya B.等人, Sci. Transl. Med., 2013, 5, 173ra25；

非专利文献9：Wolf M. T.等人, Biomaterials, 2012, 33, 7028-7038；

非专利文献10：Ott H. C.等人, Nature Medicine, 2008, 14, 213-221；

非专利文献11：Barakat O.等人, J. Surg. Res., 2012, 173, e11-e25；

非专利文献12：Park K. M.等人, Transplant. Proc., 2012, 44, 1151-1154；

非专利文献13：Ott H. C.等人, Nature Medicine, 2010, 16, 927-933；

非专利文献14：Yang B.等人, Tissue Eng. Part C Methods, 2010, 16, 1201-1211；

非专利文献15：DeQuach J. A.等人, Tissue Eng. Part A, 2011, 17, 2583-2592。

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，显示出颗粒状脱细胞组织没有对移植片的排斥反应，且对疾病部位的再生、治愈有效，但更理想的颗粒状脱细胞组织希望具备以下几点。即，一种支架，在该支架处参与再生、治愈的来自患者的细胞或导入的细胞在靶部位聚集，或者靶部位的成熟细胞脱分化，这些细胞的增殖、分化、再分化的进程快速地进行；或者由颗粒状脱细胞组织重构的组织、器官迅速地适应于宿主并发挥功能；容易应用于靶部位并在该部位迅速地凝胶化，确实地留置在该部位；此外，可早期诱导用于对聚集的细胞供应营养的微细血管，促进上述效果进而更有效地促进组织再生。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究的结果，在将来自脱细胞生物组织的颗粒和纤维蛋白胶(纤维蛋白糊)组合应用于细胞或疾病模型动物时，(1)在来自心脏的细胞中，发现了分化成心肌细胞和获得搏动等功能；(2)在心肌梗塞模型中，确认到了抑制心脏壁厚度变薄的效果或新生血管的效果；(3)在神经前体细胞中，发现了诱导树突的形成/神经突延长作用；(4)在皮肤冻伤模型中，确认到了在抑制冻伤部位挛缩的同时促进组织再生的效果，从而完成了本发明。即，本发明包含以下的发明。

・混合凝胶，其包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶；

・疾病治疗药、细胞移植辅剂、或细胞培养基材，其特征在于，包含该混合凝胶；

・混合凝胶的制作方法，该方法包括下述步骤：将来自动物的生物组织脱细胞以获得脱细胞生物组织的步骤；粉碎该脱细胞生物组织以获得颗粒状脱细胞组织的步骤；以及混合该颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的步骤；

・组织再生疗法，该疗法包括：将该颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织；

・组织再生疗法，该疗法包括：将该混合凝胶应用于动物组织；

・细胞移植方法，该方法包括：将该颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞应用于动物组织；

・细胞移植方法，该方法包括：将该混合凝胶和细胞一起应用于动物组织；

・细胞培养方法，该方法包括：将该混合凝胶和细胞一起进行培养；

・试剂盒，其包含将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。

更具体而言，本发明包含以下的发明。

[1] 混合凝胶，其包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶。

[2] [1]所述的混合凝胶，其中，动物为人以外的动物。

[3] [1]或[2]所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

[4] [1]～[3]中任一项所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

[5] [1]～[4]中任一项所述的混合凝胶，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。

[6] [1]～[5]中任一项所述的混合凝胶，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。

[7] 疾病治疗药，其包含[1]～[6]中任一项所述的混合凝胶。

[8] [7]所述的治疗药，其中，疾病治疗药选自心肌梗塞治疗药、神经损伤疾病治疗药和皮肤冻伤治疗药的治疗药。

[9] 细胞移植辅剂，其包含[1]～[6]中任一项所述的混合凝胶。

[10] [9]所述的细胞移植辅剂，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

[11] 细胞培养基材，其包含[1]～[6]中任一项所述的混合凝胶。

[12] [11]所述的细胞培养基材，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

[13] 混合凝胶的制作方法，该方法包括下述步骤：将来自动物的生物组织脱细胞以获得脱细胞生物组织的步骤；粉碎所述脱细胞生物组织以获得颗粒状脱细胞组织的步骤；以及混合所述颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的步骤。

[14] [13]所述的制作方法，其中，动物为人以外的动物。

[15] [13]或[14]所述的制作方法，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

[16] [13]～[15]中任一项所述的制作方法，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

[17] [13]～[16]中任一项所述的制作方法，其中，获得脱细胞生物组织的步骤包括：将来自动物的生物组织脱细胞的步骤、以及微波照射并清洗的步骤。

[18] [13]～[17]中任一项所述的制作方法，其中，脱细胞为对生物组织进行高静水压处理来进行的。

[19] [13]～[18]中任一项所述的制作方法，其中，粉碎脱细胞生物组织的步骤包括下述步骤：切碎脱细胞生物组织的步骤；将切碎了的脱细胞生物组织冷冻干燥或冻结的步骤；以及将冷冻干燥或冻结了的脱细胞生物组织粉碎的步骤。

[20] [19]所述的制作方法，该方法还包括：将粉碎了的脱细胞生物组织根据颗粒大小进行筛分的步骤。

[21] [13]～[20]中任一项所述的制作方法，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。

[22] 组织再生疗法，该疗法包括：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、和纤维蛋白胶应用于动物组织。

[23] [22]所述的组织再生疗法，其中，成为脱细胞生物组织来源的动物为人以外的动物。

[24] [22]或[23]所述的组织再生疗法，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

[25] [22]～[24]中任一项所述的组织再生疗法，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

[26] [22]～[25]中任一项所述的组织再生疗法，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。

[27] [22]～[26]中任一项所述的组织再生疗法，其中，待应用的动物为人以外的动物。

[28] [22]～[27]中任一项所述的组织再生疗法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。

[29] 组织再生疗法，该疗法包括：将[1]～[6]所述的混合凝胶应用于动物组织。

[30] [29]所述的组织再生疗法，其中，待应用的动物为人以外的动物。

[31] [29]或[30]所述的组织再生疗法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。

[32] 细胞移植方法，该方法包括：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞应用于动物组织。

[33] 细胞移植方法，该方法包括：将[1]～[6]所述的混合凝胶和细胞一起应用于动物组织。

[34] [32]或[33]所述的细胞移植方法，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

[35] [32]～[34]中任一项所述的细胞移植方法，其中，待应用的动物为人以外的动物。

[36] [32]～[35]中任一项所述的细胞移植方法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。

[37] 细胞培养方法，该方法包括：将[1]～[6]所述的混合凝胶和细胞一起进行培养。

[38] [37]所述的细胞培养方法，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

[39] 试剂盒，其包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。

[40] [39]所述的试剂盒，其中，成为脱细胞生物组织来源的动物为人以外的动物。

[41] [39]或[40]所述的试剂盒，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

[42] [39]～[41]中任一项所述的试剂盒，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

[43] [39]～[42]中任一项所述的试剂盒，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。

[44] [39]～[43]中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为疾病治疗用试剂盒。

[45] [44]所述的试剂盒，其中，疾病治疗用试剂盒为选自心肌梗塞治疗用试剂盒、神经损伤疾病治疗用试剂盒和皮肤冻伤治疗用试剂盒的试剂盒。

[46] [39]～[43]中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为细胞移植用试剂盒。

[47] [46]所述的试剂盒，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

[48] [39]～[43]中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为细胞培养用试剂盒。

[49] [48]所述的试剂盒，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

发明效果

本发明的混合凝胶具有促进干细胞的分化和功能获取的效果、以及对各种疾病的治疗效果。更具体而言可以示例下述的效果：(1)来自心脏的细胞分化成心肌细胞和获得搏动等功能的效果、(2)在心肌梗塞后抑制心脏壁变薄的效果和新生血管的效果、(3)神经前体细胞获得树突形成能力或神经突延长能力的效果、(4)在皮肤冻伤后抑制冻伤部位的挛缩并促进组织再生的效果。

附图说明

图1显示心肌梗塞模型大鼠的未处理的结果。

图2显示将纤维蛋白胶应用于心肌梗塞模型大鼠的结果。

图3显示将纤维蛋白胶应用于心肌梗塞模型大鼠的结果。

图4显示将混合凝胶应用于心肌梗塞模型大鼠的结果。

图5显示将混合凝胶应用于心肌梗塞模型大鼠的结果。

图6显示梗塞部的新生血管数的计测结果。

图7显示对神经前体细胞的树突形成诱导作用的评价结果。

图8显示神经前体细胞分化成神经细胞的评价结果。

图9显示皮下的新生血管诱导能力的评价结果。

图10显示冻伤部位的皮肤组织再生的评价结果。

具体实施方式

1. 混合凝胶的制作方法

本发明包括混合凝胶的制作方法，该方法包括下述步骤：将来自动物的生物组织脱细胞以获得脱细胞生物组织的步骤；粉碎该脱细胞生物组织以获得颗粒状脱细胞组织的步骤；以及混合该颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的步骤。

根据本发明的制作方法，最初从动物中回收生物组织。将该生物组织进行脱细胞处理以除去来自动物的细胞、病毒和细菌。因此，即使将生物组织移植到不同于作为其来源动物的种类的动物中时，也可抑制异种免疫反应。因此，对回收生物组织的动物的种类没有特别限定。另一方面，由于生物组织优选可容易获取，因此优选为人以外的动物，特别优选哺乳类的家畜或鸟类的家畜。作为哺乳类的家畜可以举出：牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、黄鼠狼、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。作为鸟类的家畜可以举出：长尾小鹦鹉、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、野鸡、鸵鸟、鹌鹑等。其中，从获取的稳定性方面考虑，优选猪或兔。

生物组织可以示例：具有细胞外基质结构并可进行脱细胞处理的组织。这样的组织为选自肝脏、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃体、食道、胃、小肠、大肠、肛门、胰脏、心脏、血管、脾脏、肺、脑、骨、脊髓、软骨、精囊、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腱、神经、皮肤等的组织。特别优选为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑、脊髓、精囊、脾脏、膀胱、血管、皮肤等的组织。作为生物组织，特别优选为心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓。由动物回收生物组织的方法对本领域技术人员而言是已知的。

接下来，在本发明的制作方法中，对于来自动物的生物组织进行脱细胞处理。对脱细胞处理没有特别限定，只要能除去来自动物的细胞、病毒和细菌即可。作为这样的方法，可以示例：表面活性剂处理(非专利文献5、非专利文献7、非专利文献8)、酶处理、渗透压处理、冻结融化处理、高静水压处理(非专利文献1、2、3、4、专利文献3：日本专利第4092397号公报、专利文献4：日本再公表2008-111530号公报、专利文献5：日本特开2009-50297号公报)，可以根据动物、生物组织的种类适当选择。高静水压处理由于不使用表面活性剂等有可能对人体产生不良影响的药剂，因此特别优选。静水压处理中所施加的压力为2～1500MPa、优选为10～1000MPa、进一步优选为80～500MPa。

脱细胞处理的条件可以根据动物、生物组织的种类适当选择。脱细胞处理的条件对本领域技术人员而言是已知的，心脏公开在非专利文献10 (Ott H.C.等人, Nature Medicine, 2008, 14, 213-221)中，肝脏公开在非专利文献11 (Barakat O.等人, J. Surg. Res., 2012, 173, e11-e25)中，胃、肠、脾脏、肾脏公开在非专利文献12 (Park K. M.等人, Transplant. Proc., 2012, 44, 1151-1154)中，肺公开在非专利文献13 (Ott H. C.等人, Nature Medicine, 2010, 16, 927-933)中，膀胱公开在非专利文献14 (Yang B.等人, Tissue Eng. Part C Methods, 2010, 16, 1201-1211)中，血管公开在非专利文献3和非专利文献4中，脑公开在非专利文献15 (DeQuach J. A.等人, Tissue Eng. Part A, 2011, 17, 2583-2592)中，皮肤公开在非专利文献9中。

脱细胞处理可包括清洗脱细胞生物组织的步骤。清洗脱细胞生物组织的方法可以根据脱细胞处理的种类适当选择。作为清洗方法可以示例：浸在清洗液中的方法(专利文献6：日本特开2010-227246号公报)、照射微波的方法(专利文献7：专利第4189484号公报)。

接下来，在本发明的制作方法中，对于脱细胞处理后的生物组织进行粉碎处理。粉碎步骤可以包括：切碎脱细胞生物组织的步骤、将切碎了的脱细胞生物组织冷冻干燥或冻结的步骤、以及将冷冻干燥或冻结了的脱细胞生物组织粉碎的步骤。制作颗粒状脱细胞组织的方法公开在非专利文献5、6、7、8和专利文献2中。

对粉碎组织的方法没有特别限定，可以示例：在常温下粉碎生物组织的方法、将生物组织冷冻并在冻结状态下进行粉碎的方法等。当为在常温下难以粉碎的生物组织、例如肾脏等时，优选在冻结状态下进行粉碎。在冻结状态下进行粉碎时，由于在0℃附近的温度下冰晶体的生长，有时会导致组织受损。因此，在冻结状态下粉碎时的粉碎条件为−80℃～−5℃、优选为−50℃～−10℃、更优选为−40℃～−15℃。

作为粉碎方法可以示例：球磨机、珠磨机、胶体磨、锥形球磨机、盘磨机、轮辗机、铣磨机、锤磨机、制粒机、剪切磨(cutting mill)、滚磨机、气流粉碎机等。优选剪切磨。

另外，还可以包括：将已粉碎的脱细胞生物组织根据颗粒大小进行筛分的步骤。

对颗粒状脱细胞组织的粒径没有特别限定，当粒径太小时，组织再生的效果低，而当粒径太大时，难以将该组织用作移植和治疗的基材，因此粒径为0.1～1000μm、优选为0.5～500μm、更优选为1～100μm。

在本发明的颗粒状脱细胞组织的制作方法中，在采取生物组织、将生物组织进行脱细胞处理、清洗除去已破坏的细胞、直至获得颗粒状脱细胞组织之间的任意阶段，可以将脱细胞组织(或生物组织)粉碎成颗粒状。即，无论粉碎步骤是在脱细胞处理之前或之后进行，所得的颗粒状脱细胞组织均未显示出差异，可同等地用于之后的混合凝胶制作中。

在本发明的混合凝胶的制作方法中，将颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶混合来制作混合凝胶。混合方法可以示例：将纤维蛋白原溶液和颗粒状脱细胞组织混合，再向所得混合物中混合凝血酶溶液(或凝血酶粉末)的方法；或者，将凝血酶溶液和颗粒状脱细胞组织混合，再向所得混合物中混合纤维蛋白原溶液(或纤维蛋白原粉末)的方法。

混合凝胶中所含的纤维蛋白原浓度只要是可形成凝胶的浓度即可，没有特别限定，可以根据混合凝胶的应用部位、用途而适当变更。例如可以示例30mg/mL～40mg/mL。

混合凝胶中所含的凝血酶浓度只要是可形成凝胶的浓度即可，没有特别限定，可以根据混合凝胶的应用部位、用途而适当变更。凝血酶浓度为0.8U/mL以上时，容易形成混合凝胶。因此，凝血酶浓度可以示例0.8U/mL～250U/mL。另外，当凝胶中的凝血酶浓度低时，细胞粘附性优异。因此，作为优选的凝血酶浓度，可以示例0.8U/mL～125U/mL，更优选0.8U/mL～12.5U/mL。但是，被认为即使是不足0.8U/mL的浓度，通过调整凝胶的凝固时间、温度也可以制作混合凝胶，因此还可以使用不足0.8U/mL的浓度。

混合凝胶中所含的颗粒状脱细胞组织的浓度可以根据颗粒的种类、混合凝胶的应用部位、用途而适当变更。例如可以示例16μg/mL～64μg/mL。

2. 混合凝胶

本发明包括混合凝胶，所述混合凝胶包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶。

如上所述，关于本发明的混合凝胶，对回收生物组织的动物种类没有特别限定。优选为人以外的动物，优选哺乳类的家畜、鸟类的家畜。作为哺乳类的家畜可以举出：牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、黄鼠狼、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。作为鸟类的家畜可以举出：长尾小鹦鹉、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、野鸡、鸵鸟、鹌鹑等。其中，从获取的稳定性方面考虑，优选猪或兔。

生物组织可以示例：具有细胞外基质结构且可进行脱细胞处理的组织。这样的组织为选自肝脏、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃体、食道、胃、小肠、大肠、肛门、胰脏、心脏、血管、脾脏、肺、脑、骨、脊髓、软骨、精囊、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腱、神经、皮肤等的组织。特别优选为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑、脊髓、精囊、脾脏、膀胱、血管和皮肤等的组织。生物组织特别优选为心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓。

如上所述，关于本发明的混合凝胶，对脱细胞处理方法没有特别限定。优选为高静水压处理。

如上所述，对混合凝胶中的纤维蛋白原浓度没有特别限定，只要是可形成凝胶的浓度即可。可以示例30mg/mL～40mg/mL。

如上所述，对混合凝胶中的凝血酶浓度没有特别限定，只要是可形成凝胶的浓度即可。可以示例0.8U/mL～250U/mL。作为优选的浓度可以示例0.8U/mL～125U/mL，更优选0.8U/mL～12.5U/mL。另一方面，也可以使用不足0.8U/mL的浓度。

如上所述，对混合凝胶中的颗粒浓度没有特别限定，可以示例16μg/mL～64μg/mL。对颗粒状脱细胞组织的粒径没有特别限定，为0.1～1000μm、优选为0.5～500μm、更优选为1～100μm。

3. 疾病治疗药

根据本发明，在上述混合凝胶中确认到了：分化诱导来自心脏的细胞的效果、改善心肌梗塞预后的效果、分化诱导神经前体细胞的效果、以及在皮肤冻伤部位抑制挛缩的发生以治愈患处的效果。因此，本发明包括疾病治疗药，所述疾病治疗药包含上述混合凝胶。混合凝胶可以是凝胶状态、冻结状态、冷冻干燥状态的任一种状态。当为冻结状态时，应用前可以将其融化。当为冷冻干燥状态时，应用前可以进行水合。混合凝胶可直接应用于患处。本发明的疾病治疗药可以示例：心肌梗塞治疗药、神经损伤疾病治疗药和皮肤冻伤治疗药。

4. 细胞移植辅剂、细胞培养基材

本发明的混合凝胶确认到了以下效果：对于来自心脏的细胞的分化诱导效果和获得搏动功能的效果、以及对于神经前体细胞的分化诱导效果。因此，本发明包括含有上述混合凝胶的细胞移植辅剂和细胞培养基材。细胞移植辅剂可以示例：主要由混合凝胶和移植细胞构成的情形和主要由混合凝胶构成的情形。在前一种情形下，可以以使移植细胞存在于混合凝胶内或表面上的状态应用于动物组织。在后一种情形下，可以在将混合凝胶应用于动物组织的前后，组合移植细胞来进行应用。

细胞培养基材可以主要由混合凝胶构成，在培养基中可以与细胞共存使用。与细胞共存时，可以将细胞直接接种在混合凝胶上进行使用，也可以在混合凝胶和细胞之间设置细胞培养插件进行使用。

对细胞移植辅剂、细胞培养基材中使用的细胞没有特别限定。优选为来自心脏的细胞、神经前体细胞或来自组织干细胞的细胞。

5. 组织再生疗法

本发明包含组织再生疗法，该疗法包括：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织。在上述的组织再生疗法中，通过将颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶应用于动物组织，在动物组织上形成混合凝胶。此时，对应用颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶的顺序没有特别限定。本发明还包含组织再生疗法，该疗法包括：将上述的混合凝胶应用于动物组织。

如上所述，在本发明的组织再生疗法中，对回收生物组织的动物种类没有特别限定。优选为人以外的动物，优选哺乳类的家畜、鸟类的家畜。作为哺乳类的家畜，可以举出：牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、黄鼠狼、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。作为鸟类的家畜可以举出：长尾小鹦鹉、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、野鸡、鸵鸟、鹌鹑等。其中，从获取的稳定性方面考虑，优选猪或兔。

生物组织可以示例：具有细胞外基质结构且可进行脱细胞处理的组织。这样的组织为选自肝脏、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃体、食道、胃、小肠、大肠、肛门、胰脏、心脏、血管、脾脏、肺、脑、骨、脊髓、软骨、精囊、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腱、神经、皮肤等的组织。特别优选为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑、脊髓、精囊、脾脏、膀胱、血管和皮肤等的组织。作为生物组织特别优选为心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓。

如上所述，在发明的组织再生疗法中，对脱细胞处理的方法没有特别限定。优选为高静水压处理的方法。

对应用本发明的组织再生疗法的组织没有特别限定。优选为心脏、神经或皮肤。

对本发明的纤维蛋白胶的种类没有特别限定。优选示例Bolheal (一般财团法人化学及血清疗法研究所制造)。

如上所述，对混合凝胶中的凝血酶浓度没有特别限定，只要是可形成凝胶的浓度即可。可以示例是0.8U/mL～250U/mL。作为优选的浓度可以示例0.8U/mL～125U/mL，更优选0.8U/mL～12.5U/mL。另一方面，还可以使用不足0.8U/mL的浓度。

如上所述，对混合凝胶中的颗粒浓度没有特别限定，可以示例16μg/mL～64μg/mL。对颗粒状脱细胞组织的粒径没有特别限定，为0.1～1000μm，优选为0.5～500μm，进一步优选为1～100μm。

6. 细胞移植方法

本发明包含细胞移植方法，该方法包括：将该颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞应用于动物组织。在该细胞移植方法中，由颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶形成混合凝胶，细胞存在于混合凝胶内和表面上。对将颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞的应用于动物组织的顺序没有特别限定。各种成分可以分开应用，也可以同时应用。

本发明还包含细胞移植方法，该方法包括：将上述的混合凝胶和细胞一起应用于动物组织。细胞可以存在于混合凝胶内或表面上。可以以使细胞存在于混合凝胶内或表面上的状态应用于动物组织，也可以将混合凝胶或细胞应用于动物组织后再应用另一者。在后一种情形下，对应用混合凝胶和细胞的顺序没有特别限定。

对细胞移植中使用的细胞没有特别限定。可以示例来自心脏的细胞、神经前体细胞或来自组织干细胞的细胞。对应用细胞移植方法的组织没有特别限定。可以示例心脏、神经或皮肤。

7. 细胞培养方法

本发明包含细胞培养方法，该方法包括：将上述混合凝胶和细胞一同进行培养。在本发明的细胞培养方法中，在使混合凝胶和细胞共存于培养基中的情形下，可以将细胞直接接种在混合凝胶上进行培养，或者可以在混合凝胶和细胞之间设置细胞培养插件进行培养。对待培养的细胞没有特别限定。可以示例来自心脏的细胞、神经前体细胞或来自组织干细胞的细胞。

8. 试剂盒

本发明包含试剂盒，该试剂盒包含：通过将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。该试剂盒，当将颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织时，在应用部位形成混合凝胶。

如上所述，关于本发明的试剂盒，对回收生物组织的动物种类没有特别限定。优选为人以外的动物，优选哺乳类的家畜、鸟类的家畜。作为哺乳类的家畜可以举出：牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、黄鼠狼、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。作为鸟类的家畜可以举出：长尾小鹦鹉、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、野鸡、鸵鸟、鹌鹑等。其中，从获取的稳定性方面考虑，优选猪或兔。

如上所述，关于本发明的混合凝胶，对脱细胞处理的方法没有特别限定。优选为高静水压处理。对脱细胞颗粒的粒径没有特别限定，可以为0.1～1000μm、优选为0.5～500μm、进一步优选为1～100μm。

在本发明中，上述的混合凝胶对于疾病模型(心肌梗塞模型、皮肤冻伤模型)、细胞(来自心脏的细胞、神经前体细胞)发挥了优异的效果，因此本发明的试剂盒包括疾病治疗用试剂盒。作为这样的疾病治疗用试剂盒可以示例：心肌梗塞治疗用试剂盒、神经损伤治疗用试剂盒、皮肤冻伤治疗用试剂盒。另外，作为本发明的试剂盒可以示例：细胞移植用试剂盒、细胞培养用试剂盒。对细胞的种类没有特别限定，可以示例：来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

实施例

下面，伴随实施例，来更详细地说明本申请发明，但不限于下述的实施例。

实施例 1

研究来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织对来自胎兔心脏的细胞的培养效果

1. 来自胎兔心脏细胞的调制

对于约6月龄的日本白色种雌兔(Oriental Yeast)，按0.5U/个体以12小时的间隔皮下给予6次FSH(前叶性卵泡刺激素：Antolin R・10、共立制药)，在最终给予FSH后约5小时以50U/个体静脉内给予hCG(胎盘性性腺刺激素(绒膜促性腺激素)：Puberogen、Vovartis)，使其与雄兔交配，制作了妊娠兔。在交配后第16.5~18.5天向妊娠兔的静脉内给予约200mg的戊巴比妥注射液(Somnopentyl、共立制药)，实施安乐死。剖腹后从子宫中取出胎儿，悬浮在生理盐水(大塚生食注、大塚制药)中。由胎儿采取心脏，分散在约1.25%的胰蛋白酶溶液(Difco)中，调制了细胞。

2. 颗粒状脱细胞组织的调制

由约6~12月龄的日本白色种兔(Oriental Yeast)采取心脏，用生理盐水清洗。清洗后，将该组织和生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含核酸水解酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等进行粉碎。通过筛分颗粒状脱细胞组织进行处理，制作了直径为500μm以下的颗粒状脱细胞组织。该颗粒状脱细胞组织在使用前于4℃下保存，用盐水调整成2mg/mL后使用。

3. 培养

在用0.1%明胶溶液(Sigma)包被的TERASAKI板(Sumiron)的每孔中添加10μL添加有约10⁵个来自胎兔心脏的细胞和来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织的Bolheal A液(按照附属文件来调制，所含的G-CSF(Diaclone)的最终浓度(Bolheal中)为100ng/mL、bFGF(PROGEN)为10ng/mL和硒蛋白P片段(自家调制)为7μg/mL)，然后以10μL/孔添加Bolheal B液(按照附属文件进行调制，用生理盐水稀释至1/10)使其凝固(纤维蛋白化)。凝固后，将培养基(含10% FBS (Funakoshi)的DMEM (Sigma))重叠，在CO₂培养箱(5%、37℃)内培养。

4. 组构成和观察

对于成体兔心脏16 (以16μg/mL的最终浓度添加来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织)、成体兔心脏64 (以64μg/mL的最终浓度添加来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织)和未添加(没有添加颗粒状脱细胞组织(0μg/mL))的3组，在培养后第6天就增殖[按标准进行定性判断：死亡或未增殖：−、增殖1~2倍左右：±、增殖2~5倍左右：+、增殖5倍以上：++]、分化[以从接种时的形状(球形)开始的形状变化为指标进行评价(细胞的变化是指分化的细胞的成熟或成熟过程)、无：−、至少从球形开始观察到形状变化：±、观察到明显的形状变化(棒状化、扁平化、细胞突起形成等)：+、观察到明显的分化(推测分化成心肌、成纤维细胞、细胞突起的复杂化等特定细胞种类的水平)：++]和搏动[没有观察到心跳：−、至少1例可以观察到心跳：±、3例以上可以观察到心跳：+、多数(6例~)可以观察到心跳：++]进行了评价。

5. 结果

结果见表1。在未添加颗粒状脱细胞组织的组中，虽然观察到了所培养的来自胎兔心脏的细胞的增殖，但没太观察到分化；同样也几乎没有看到搏动的细胞。当添加了颗粒状脱细胞组织时，确认到了增殖和分化，还确认到了细胞的搏动。而且，当以64μg/mL的浓度添加颗粒状脱细胞组织时，分化和搏动均显著。根据以上的结果明确了：来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织有助于来自胎兔心脏的细胞分化成心肌细胞以及获得搏动等功能。

[表1]

实施例 2

研究各种颗粒状脱细胞组织对培养来自胎兔心脏的细胞的效果

1. 来自胎兔心脏的细胞的调制

利用与实施例1相同的方法来获得。

2. 颗粒状脱细胞组织的调制

对于利用与实施例1相同的方法采取的胎兔心脏和由约6~12月龄的日本白色种兔(Oriental Yeast)采取的心脏、肾脏、肺、肝脏和由猪采取的肝脏，将组织与生理盐水一起装入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。将该冷冻干燥了的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎。通过筛分颗粒状脱细胞组织进行处理，制作了直径为500μm以下的颗粒状脱细胞组织。颗粒状脱细胞组织在使用前于4℃下保存，用生理盐水调整成2mg/mL后使用。

3. 培养

在用0.1%明胶溶液(Sigma)包被的多盘4孔(Nunc)的每孔中添加10μL分别添加有约4×10⁵个的来自胎兔心脏的细胞和上述的颗粒状脱细胞组织的Bolheal A液(按照附属文件来调制，用生理盐水稀释至1/2)，然后以10μL/孔添加Bolheal B液(按照附属文件来调制，用生理盐水稀释至1/10)，使其凝固(纤维蛋白化)。凝固后，将培养基(含10% FBS(Funakoshi)的DMEM (Sigma))重叠，在CO₂培养箱(5%、37℃)内培养。

4. 组构成和观察

对于分别以500μg/mL的浓度添加有来自胎兔心脏、成体兔心脏、成体兔肾脏、成体兔肺、成体兔肝脏、成体猪肝脏的颗粒状脱细胞组织的试验组、未添加(未添加颗粒状脱细胞组织(0μg/mL))和对照(未添加颗粒状脱细胞组织(0μg/mL)/未添加Bolheal (包括含有物))的试验组进行了研究。与实施例1同样，分别在培养第7天对增殖、分化和搏动实施了评价。

5. 结果

结果见表2。在对照中没太确认到增殖，但确认到了分化成膨化的细胞的趋势。没有确认到搏动的细胞。未添加组虽然确认到了增殖/分化，但没太确认到搏动的细胞。相对于此，添加有颗粒状脱细胞组织的组确认到了增殖/分化、还确认到了搏动的细胞，而与动物种类、脏器的来源无关。根据以上的结果明确了：颗粒状脱细胞组织有助于来自胎兔心脏的细胞分化成心肌细胞和获得搏动等功能，而与其来源无关。

[表2]

实施例 3

研究颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在大鼠心肌梗塞模型中的效果

1. 颗粒状脱细胞组织的调制

由Wistar大鼠采取肝脏组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎。通过筛分颗粒状脱细胞组织进行处理，将直径500μm以下者用作颗粒状脱细胞组织。

2. 移植实验

对Wistar大鼠(雌、10-12周龄)肌肉注射0.1mL戊巴比妥进行麻醉处理。剃去侧胸部的毛，用聚烯吡酮碘(Isodine)消毒。在麻醉下对大鼠进行气管插管并与呼吸器连接。让大鼠呈侧卧位，从侧胸部切开，除去肌肉层和心膜，趋近心脏。用缝合线将左冠动脉结扎，制作梗塞部。向所制作的梗塞部滴加100μL含10%来自肝脏的颗粒状脱细胞组织的纤维蛋白原溶液(×1；80mg/mL)，之后滴加100μL凝血酶溶液(×1；250U/mL、×1/150；1.6U/mL)。使用仅滴加了Bolheal的组、未处置组作为对照。缝合进行了梗塞制作、各处置的大鼠的切开部，自主呼吸稳定后拔管。

3. 组构成和观察

混合凝胶中的纤维蛋白原浓度设为40mg/mL，混合凝胶中的凝血酶浓度设为0.8U/mL和125U/mL，对于各浓度添加颗粒状脱细胞组织使凝胶达到10%浓度。还设定未添加颗粒状脱细胞组织的组作为比较对象，4周后对大鼠实施安乐死，观察心脏梗塞部位，采取样品。所采取的样品通过HE染色进行组织学评价，对各试验组进行了研究。

4. 结果

结果见图1～图5。即使在未添加颗粒状脱细胞组织的纤维蛋白凝胶中也通过肉眼确认到了新生血管的浸润。另外，当凝血酶浓度为125U/mL时，新生血管趋于减少。另一方面，根据肉眼所见，添加了颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在其周围确认到丰富的新生血管，在梗塞心肌内确认到了大量的新生血管。此外，新生血管的程度根据凝血酶浓度而变化，当凝血酶浓度为0.8U/mL时，确认到更多的新生血管。

实施例 4

1. 来自胎兔心脏的细胞的调制

利用与实施例1相同的方法来获得。

2. 颗粒状脱细胞组织的调制

由食用猪采取心脏、脾脏、脑、脊髓、肾脏和膀胱的组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将该袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含有核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎成粉末状。通过筛分脱细胞粉末进行处理，将直径500μm以下者用作颗粒状脱细胞组织。颗粒状脱细胞组织在使用前于4℃下保存，用生理盐水调整至2mg/mL后使用。

3. 培养

利用与实施例1相同的方法进行实施。

4. 组构成和观察

对于分别以100μg/mL的浓度添加了各种颗粒状脱细胞组织的试验组、未添加组(未添加颗粒状脱细胞组织(0μg/mL))、阳性对照组(添加了来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织(100μg/mL))、和对照(未添加颗粒状脱细胞组织(0μg/mL)/未添加Bolheal (包括含有物))的试验组进行了研究。与实施例1同样，分别在培养第7天对搏动实施了评价。

5. 结果

结果见表3。在对照中没有观察到搏动。在未添加组中没太观察到搏动的细胞。在添加了来自兔心脏的颗粒状脱细胞组织的组中，在多数细胞中观察到了搏动。相对于此，在添加了来自猪的各种颗粒状脱细胞组织的群中观察到了搏动的细胞，而与脏器的来源无特别关联。根据以上的结果明确了：即使颗粒状脱细胞组织的来源种类不同，也有助于来自胎儿心脏的细胞分化成心肌细胞和获得搏动等功能。

[表3]

实施例 5

研究颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在兔心肌梗塞模型中的效果

1. 颗粒状脱细胞组织的调制

利用与实施例2相同的方法来获得。

2. 移植实验

将日本白色种兔(雄、购入时14-15周龄、Biotek)在人工呼吸管理下在氯胺酮和异氟醚的全身麻醉下开胸，用缝合线将左冠动脉前降支结扎，制作了梗塞部。在混合凝胶组中，将约40μL的纤维蛋白原溶液擦入所制作的梗塞部，滴加将来自胎兔心脏的0.01mg颗粒状脱细胞组织粉末悬浮在生理盐水中而获得的5μL溶液和5μL纤维蛋白原溶液的混合溶液，之后滴加10μL凝血酶溶液(×1/10：25U/mL)，放置1分钟后进行100μL纤维蛋白原溶液和100μL凝血酶溶液的混合喷雾，进一步静置1分钟。设定仅实施了梗塞制作的非移植组作为对照。进行所有的移植操作后闭胸。

3. 结果

结果见图6。在术后2个月的病理组织评价(苏木精-伊红染色标本)中，与非移植组相比，在本发明的颗粒状脱细胞组织的混合凝胶组中，在梗塞部确认到了许多的新生血管。

实施例 6

研究各种颗粒状脱细胞组织的混合凝胶对神经前体细胞的效果

1. 各种颗粒状脱细胞组织的调制

由Wistar大鼠采取脑、脊髓、肝脏的组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含有核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎成粉末状。通过筛分脱细胞粉末进行处理，将直径为500μm以下者用作颗粒状脱细胞组织。

2. 培养和组构成

在来自脑、脊髓和肝脏的各颗粒状脱细胞组织中，对于含有颗粒状脱细胞组织的Bolheal上培养组(on)和含有颗粒状脱细胞组织的Bolheal插件组(insert；在细胞培养插件上添加含有颗粒状脱细胞组织的Bolheal凝胶)的各组进行了比较研究。

在含有颗粒状脱细胞组织的Bolheal上培养组(on)中，向24孔板盘中滴加150μl含10%颗粒状脱细胞组织的纤维蛋白原溶液，之后滴加150μl各稀释倍率(×1；250U/mL、×1/10；25U/mL、×1/100；2.5U/mL)的凝血酶溶液进行混合。将PC12细胞(来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞)接种在凝胶上(1.0×10⁴细胞/孔、0.1%马血清的RPMI)，培养了24小时。

在含有颗粒状脱细胞组织的Bolheal插件组(insert)中，在用胶原蛋白包被的24孔板盘上接种PC12细胞(1.0×10⁴细胞/孔、10%马血清和5% FBS的RPMI)，培养了24小时。向细胞培养插件(孔径为8μm)中滴加150μl含10%颗粒状脱细胞组织的纤维蛋白原溶液，之后滴加150μl各稀释倍率(×1；250U/mL、×1/10；25U/mL、×1/100；2.5U/mL)的凝血酶溶液，调制了含有颗粒状脱细胞组织的凝胶。将培养液交换成0.1%马血清的RPMI，在各孔中设置调制有凝胶的细胞培养插件，培养了24小时。

在所有的研究中，均设置未添加颗粒状脱细胞组织的阴性对照组和添加了50ng NGF以代替颗粒状脱细胞组织的阳性对照组，以确认评价系统在发挥功能。

3. 结果

结果见图7。与添加了来自肝脏的颗粒状脱细胞组织的组相比，添加了来自脑的颗粒状脱细胞组织的组和添加了来自脊髓的颗粒状脱细胞组织的组诱导树突形成的作用优异，其效果可与NGF相媲美。此外，确认到低浓度的凝血酶显示出更强的树突形成作用。

实施例 7

研究异种颗粒状脱细胞组织的混合凝胶对神经前体细胞的效果

1. 颗粒状脱细胞组织的调制

由食用猪采取脑的组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含有核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎成粉末状。通过筛分脱细胞粉末进行处理，将直径为500μm以下者用作颗粒状脱细胞组织。

2. 培养和组构成

在猪脑的颗粒状脱细胞组织中，对于Bolheal凝胶内粉末封入体添加组和Bolheal凝胶添加组的各组进行了比较研究。将PC12细胞以1×10⁴细胞/100μL (10%马血清−5% FBS−RPMI1640)/孔接种在用胶原蛋白IV包被的96孔板中，24小时后将培养基交换成0.1%马血清−RPMI1640 (100μL/孔)，按照组构成进行颗粒状脱细胞组织、Bolheal和试剂的添加。就Bolheal凝胶内粉末封入体添加组而言，使用TERASAKI板(Sumiron)，向10μL 2.5U/mL的凝血酶溶液中添加0.3mg/5μL的猪脑颗粒状脱细胞组织，再添加5μL纤维蛋白原溶液，通过移液混合后进行凝胶化(37℃2小时以上)，加入到孔中。就Bolheal凝胶添加组而言，使用TERASAKI板，依次添加10μL 2.5U/mL的凝血酶溶液、5μL生理盐水(大塚制药)、5μL纤维蛋白原溶液，通过移液混合后进行凝胶化(37℃2小时以上)，加入到孔中。并且，还加入了作为阳性对照组的添加有50ng/mL NGF的组、以及作为阴性对照组的未处理的组。在处理后第2~3天，以神经突延长和神经细胞特异性抗原的检测为指标，对于神经细胞分化诱导的有无进行了分析。通过进行免疫组织化学染色实施了神经细胞特异性抗原的检测。关于免疫组织化学染色，使用抗βIII微管蛋白(Promega)作为抗原检测用抗体，使用Alexa Fluor 594抗-小鼠(Invitrogen)作为视觉化抗体，关于核染色，使用Hoechst 33342 (DOJINDO)。利用上述的染色条件，将细胞核染成蓝色，将βIII微管蛋白染成红色。

3. 结果

培养后第2天的神经突延长的观察结果见表4。在Bolheal凝胶内粉末封入体添加组和阳性对照组(添加NGF)中确认到了神经突延长。培养后第3天的各组的免疫组织学观察结果见图8和表5。免疫组织化学染色中，在Bolheal凝胶内粉末封入体添加组和阳性对照组(添加NGF)中也确认到了βIII微管蛋白抗原。根据以上的结果显示出：在Bolheal凝胶内粉末封入体添加组中确认到了神经分化，即使是使用异种动物的颗粒状脱细胞组织的混合凝胶也具有诱导神经细胞的能力。

[表4]

[表5]

*阳性率=用βIII微管蛋白染色的细胞数/计数细胞数(计数细胞数＞20个)×100

实施例 8

研究颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在大鼠背部皮下的效果

1. 颗粒状脱细胞组织的调制

由Wistar大鼠采取肝脏，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含有核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎成粉末状。通过筛分脱细胞粉末进行处理，将直径为500μm以下者用作颗粒状脱细胞组织。

2. 移植实验

对Wistar大鼠(雄、8-12周龄)肌肉注射0.1mL戊巴比妥进行麻醉处理。剃去背部的毛，用聚烯吡酮碘消毒。在消毒后的背部制作1cm的切口，由切口层在皮层和肌肉层之间制作插入混合凝胶的口袋。向制作的口袋中移植包含纤维蛋白凝胶的混合凝胶，用5-0缝合线缝合切口层。经过规定的期间后，对大鼠实施安乐死，观察创伤部，回收样品。回收的样品通过HE染色进行了组织学评价。

3. 组构成和观察

将混合凝胶中的纤维蛋白原浓度设为40mg/mL，将混合凝胶中的凝血酶浓度设为0.8U/mL和125U/mL，对于各浓度添加颗粒状脱细胞组织使凝胶达到5%的浓度。还设定未添加颗粒状脱细胞组织的组作为比较对象，对各试验组进行了研究。

4. 结果

结果见图9。即使在未添加颗粒状脱细胞组织的纤维蛋白凝胶中，也肉眼确认到了新生血管的浸润。另外，无论凝血酶浓度如何，几乎没有确认到细胞浸润。在移植第3天和第7天没有确认到明显的差别。另一方面，就添加了颗粒状脱细胞组织的混合凝胶而言，在其周围肉眼可见丰富的新生血管，确认到了凝胶内部的细胞浸润和新生血管。此外，其程度根据凝血酶浓度而变化，在凝血酶浓度为0.8U/mL时，确认到了更多的细胞浸润和新生血管。

实施例 9

研究颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在大鼠皮肤冻伤模型中的效果

1. 颗粒状脱细胞组织的调制

由Wistar大鼠采取肝脏组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含有核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎成粉末状。通过筛分脱细胞粉末进行处理，将直径为500μm以下者用作颗粒状脱细胞组织。

2. 移植实验

对Wistar大鼠(雄、8-12周龄)肌肉注射0.1mL戊巴比妥进行麻醉处理。剃去背部的毛，用聚烯吡酮碘消毒。在消毒后的背部制作直至真皮中层的缺失(直径为15mm)。为了制造冻伤，将通过液氮冷却的金属体在创伤部按压60秒。向冻结的创伤处添加颗粒状脱细胞组织(肝脏)，再滴加80mg/mL的纤维蛋白原溶液，滴加250U/mL的凝血酶溶液。设定仅滴加Bolheal的组、未处置组作为对照。之后，用橡皮膏包覆创伤部，再用纱布包覆大鼠整个躯干。

3. 组构成和观察

混合凝胶中的纤维蛋白原浓度设为40mg/mL，混合凝胶中的凝血酶浓度设为125U/mL，对于各浓度添加颗粒状脱细胞组织使凝胶达到10%的浓度。还设定未添加颗粒状脱细胞组织的组作为比较对象，观察了经过规定期间后的损伤部位。

4. 结果

结果见图10。在未处置组中，在冻伤部位看到了皮肤组织治愈过程所特有的皮肤的挛缩。相对于此，在未添加颗粒状脱细胞组织的组中没有看到皮肤的挛缩。但是，尚未达到填补由冻伤引起的皮肤缺失，处于被脆弱组织覆盖的状态。在添加了颗粒状脱细胞组织的组中，也没有看到皮肤的挛缩，此外，肉眼可见皮肤缺失部位的组织再生早期进行。由此认为：脱细胞粉末是促进加速皮肤再生的细胞聚集和支架填补的材料。

产业实用性

本发明是可以在再生医疗领域应用的技术。

Claims

1.混合凝胶，其包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱细胞生物组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶。

2.权利要求1所述的混合凝胶，其中，动物为人以外的动物。

3.权利要求1或2所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

4.权利要求1～3中任一项所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

5.权利要求1～4中任一项所述的混合凝胶，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。

6.权利要求1～5中任一项所述的混合凝胶，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。

7.疾病治疗药，其包含权利要求1～6中任一项所述的混合凝胶。

8.权利要求7所述的治疗药，其中，疾病治疗药为选自心肌梗塞治疗药、神经损伤疾病治疗药和皮肤冻伤治疗药的治疗药。

9.细胞移植辅剂，其包含权利要求1～6中任一项所述的混合凝胶。

10.权利要求9所述的细胞移植辅剂，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

11.细胞培养基材，其包含权利要求1～6中任一项所述的混合凝胶。

12.权利要求11所述的细胞培养基材，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

13.混合凝胶的制作方法，该方法包括下述步骤：将来自动物的生物组织脱细胞以获得脱细胞生物组织的步骤；粉碎所述脱细胞生物组织以获得颗粒状脱细胞组织的步骤；以及混合所述颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的步骤。

14.权利要求13所述的制作方法，其中，动物为人以外的动物。

15.权利要求13或14所述的制作方法，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

16.权利要求13～15中任一项所述的制作方法，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

17.权利要求13～16中任一项所述的制作方法，其中，获得脱细胞生物组织的步骤包括：将来自动物的生物组织脱细胞的步骤；以及微波照射并清洗的步骤。

18.权利要求13～17中任一项所述的制作方法，其中，脱细胞为对生物组织进行高静水压处理来进行的。

19.权利要求13～18中任一项所述的制作方法，其中，粉碎脱细胞生物组织的步骤包括：切碎脱细胞生物组织的步骤；将切碎了的脱细胞生物组织冷冻干燥或冻结的步骤；以及将冷冻干燥或冻结了的脱细胞生物组织粉碎的步骤。

20.权利要求19所述的制作方法，该方法还包括：将粉碎了的脱细胞生物组织根据颗粒大小进行筛分的步骤。

21.权利要求13～20中任一项所述的制作方法，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。

22.组织再生疗法，该疗法包括：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱细胞生物组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织。

23.权利要求22所述的组织再生疗法，其中，成为脱细胞生物组织来源的动物为人以外的动物。

24.权利要求22或23所述的组织再生疗法，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

25.权利要求22～24中任一项所述的组织再生疗法，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

26.权利要求22～25中任一项所述的组织再生疗法，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。

27.权利要求22～26中任一项所述的组织再生疗法，其中，待应用的动物为人以外的动物。

28.权利要求22～27中任一项所述的组织再生疗法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。

29.组织再生疗法，该疗法包括：将权利要求1～6所述的混合凝胶应用于动物组织。

30.权利要求29所述的组织再生疗法，其中，待应用的动物为人以外的动物。

31.权利要求29或30所述的组织再生疗法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。

32.细胞移植方法，该方法包括：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱细胞生物组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞应用于动物组织。

33.细胞移植方法，该方法包括：将权利要求1～6所述的混合凝胶和细胞一起应用于动物组织。

34.权利要求32或33所述的细胞移植方法，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

35.权利要求32～34中任一项所述的细胞移植方法，其中，待应用的动物为人以外的动物。

36.权利要求32～35中任一项所述的细胞移植方法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。

37.细胞培养方法，该方法包括：将权利要求1～6所述的混合凝胶和细胞一起进行培养。

38.权利要求37所述的细胞培养方法，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

39.试剂盒，其包含：将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱细胞生物组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。

40.权利要求39所述的试剂盒，其中，成为脱细胞生物组织来源的动物为人以外的动物。

41.权利要求39或40所述的试剂盒，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生物组织。

42.权利要求39～41中任一项所述的试剂盒，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。

43.权利要求39～42中任一项所述的试剂盒，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。

44.权利要求39～43中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为疾病治疗用试剂盒。

45.权利要求44所述的试剂盒，其中，疾病治疗用试剂盒为选自心肌梗塞治疗用试剂盒、神经损伤疾病治疗用试剂盒和皮肤冻伤治疗用试剂盒的试剂盒。

46.权利要求39～43中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为细胞移植用试剂盒。

47.权利要求46所述的试剂盒，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。

48.权利要求39～43中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为细胞培养用试剂盒。

49.权利要求48所述的试剂盒，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组织干细胞的细胞。