KR102256858B1 - 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크 - Google Patents

신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계, 계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계, 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계 및 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석을 포함하는 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통해 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 프린트용 바이오 잉크에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크는 신장의 집합관, 세뇨관과 같은 신장치료에 특화된 성분의 함량을 극대화시켜 신장 치료 효과를 극대화 시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크{THE METHOD FOR DECELLULARIZATION OF KIDNEY TISSUES, THE DECELLULARIZATED MATTER BY THE METHOD AND THE BIO INK COMPRISING DECELLUARIZATED MATTER BY THE METHOD}
본 발명은 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크에 관한 것이며, 보다 상세하게는 신장질환 치료에 효과가 있는 탈세포화 물질에 관한 것이다.
만성 신부전은 노폐물을 제거하는 신기능이 감소되어 정상으로 회복될 수 없는 단계에 있는 질환을 지칭한다. 이는 신기능의 저하가 장기간 지속되면서 발생하는 증상으로써, 결국은 신 대체요법이 필요한 말기 신장질환으로 진행된다. 현재는 증상에 따라 근본적 원인에 대한 합병증 치료, 신기능 소실을 지연하는 치료, 약물기반 치료, 투석이나 이식 등의 신장대체요법 등의 치료법들이 이루어지고 있지만, 손상된 신장에 대한 직접적인 치료는 아직 이루어지지 않고 있다. 또한 손상된 신장 조직을 직접 재생하여 치료 할 수 있는 치료제도 없는 상태이다. 만성 및 말기 신장 부전 발생 시 특히 직접적인 신장 기능에 중요한 역할을 하는 신장 사구체 조직의 손상 및 신장 조직의 섬유화 (fibrosis) 현상은 신장 질환의 주요한 병리형태이며 이러한 발병진행기전을 지연시키는 것은 신장 조직의 재생에 중요한 역할을 한다.
현재 탈세포화된 콩팥의 세포외기질 유래 생체재료에 관한 대부분의 연구는, 적정 탈세포화 방법을 찾기 위한 기초연구이거나, 단순하게 콩팥을 탈세포화한 이후 세포를 다시 파종하는 등 실제 콩팥의 다양한 세포 구성 및 미세구조를 반영한 신장 구조체 제작에 한계가 있는 일차원적인 연구들이다. 이러한 종래기술과 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2016-0025502 호가 개시되어 있다.
이러한 종래기술은 개발된 조직 유래 재료 관련으로도 단순한 탈세포화 공정에만 초점이 맞춰져 있다. 그러나, 장기 내부에도 수많은 조직들이 구성이 되어있으며, 각 조직마다 조직을 유지하는 세포외기질이 다르고 그의 기능도 다르다. 또한 신장질환 치료제의 효능을 평가하기 위한 동물 질환모델링도 잘 정립되어 있지 않다. 신장조직의 직접적인 재생 및 기능의 향상을 위해선 새로운 형태의 치료제 개발 및 이를 검증 할 수 있는 신뢰성 있는 동물 질환 모델링이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0025502 호(2016.03.08. 공개)
본 발명은 종래의 신장질환 치료제의 한계를 극복하기 위한 탈세포화 방법, 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크를 제공하는 것에 그 복적이 있다.
상기 과제의 해결 수단으로서, 본 발명에 따라, 탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계, 계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계, 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계 및 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석을 포함하는 신장조직의 탈세포화 방법이 제공될 수 있다.
한편, 중성화 및 희석에서 분해되는 당단백질은, 데코린(decorin) 및 글리칸(biglycan) 중 적어도 하나일 수 있다.
또한, 중성화 및 희석에서 사용되는 효소는 MMP-13가 될 수 있다.
나아가, 중성화 및 희석은, MMP-13을 2μM 내지 1 M 의 농도로 수행될 수 있다.
또한, 중성화 및 희석는 3시간 내지 5시간 수행될 수 있다.
한편, 계면활성제는 신장 조직에 포함된 단백질의 손상을 최소화 할 수 있는 비이온 계면활성제일 수 있다.
또한, 계면활성제는 트리톤 X-100일 수 있다.
한편, 신장 조직 준비단계, 세포 제거 단계 및 살균 소독 단계 이후 잔존용액 및 불순물을 세척하는 세척단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 세척단계는 신장조직 또는 탈세포화 물질을 세척액과 함께 교반시켜 수행될 수 있다.
한편, 세포 제거 단계 이후 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 살균 소독액과 탈세포화 물질을 교반하는 살균 소독 단계를 더 포함할 수 있다.여기서, 살균 소독액은 과초산(peracetic acid)을 포함하는 용액일 수 있다.
또한, 살균 소독액은 PBS(Phosphate buffered saline)을 더 포함할 수 있다.
한편, 중성화 및 희석의 수행 전과 수행 후 중 적어도 한 번 수행되는 동결건조단계를 더 포함할 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 따라, 탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계, 계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계, 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계 및 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석이 수행되어 생성되는 신장조직의 탈세포화 물질이 제공될 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 따라, 탈세포화 물질과 함께 3D 프린팅 될 수 있도록 구성된 하이드로 젤을 포함하며, 탈세포화 물질은, 탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계, 계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계, 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계 및 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석이 수행되어 생성되는 것을 신장조직의 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크가 제공될 수 있다.
한편, 하이드로 젤은 젤라틴 및 콜라겐 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
또한, 하이드로젤은 소정온도 이하에서 액화되도록 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크는 신장의 집합관, 세뇨관과 같은 신장치료에 특화된 성분의 함량을 극대화시켜 신장 치료 효과를 극대화 시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 방법의 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 방법의 개념이 나타난 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 물질이 나타난 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크가 나타난 도면이다.
도 5는 신장조직 탈세포화 물질의 세포외기질함유량 정량평가 그래프이다.
도 6은 탈세포화 조직의 신장조직 치료에 특화된 유효성분을 도시한 도면이다.
도 7은 탈세포화 물질 내에서 신장세포의 생존률을 나타낸 도면이다.
도 8은 탈세포화 물질을 이용하여 프린팅하였을 때 신장 조직의 재생효과를 도시한 도면이다.
도 9은 탈세포화 물질에 대한 동물실험 과정을 도시한 도면이다.
도 10은 탈세포화 물질에 대한 동물실험 결과를 도시한 도면이다.
도 11는 일 실시예에 따른 탈세포화 물질이 신장 조직의 항섬유화 및 재생능력에 미치는 영향을 도시한 도면이다.
도 12은 만성 신부전 질환에서 신장 조직 항섬유화 수치를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 예에 따른 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크에 대하여, 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그리고 이하의 실시예의 설명에서 각각의 구성요소의 명칭은 당업계에서 다른 명칭으로 호칭될 수 있다. 그러나 이들의 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 변형된 실시예를 채용하더라도 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 각각의 구성요소에 부가된 부호는 설명의 편의를 위하여 기재된다. 그러나 이들 부호가 기재된 도면상의 도시 내용이 각각의 구성요소를 도면내의 범위로 한정하지 않는다. 마찬가지로 도면상의 구성을 일부 변형한 실시예가 채용되더라도 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 당해 기술 분야의 일반적인 기술자 수준에 비추어 보아, 당연히 포함되어야 할 구성요소로 인정되는 경우, 이에 대하여는 설명을 생략한다.
도 1은 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 방법의 순서도이며, 도 2는 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 방법의 개념이 나타난 도면이다. 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 일 실시예인 신장조직의 탈세포화 방법은 신장 치료에 특화된 물질을 극대화할 수 있도록 특정한 단계를 포함하여 수행된다. 여기서 신장 치료에 특화된 물질의 일 예는 신장의 집합관, 세뇨관의 치료에 효과가 있는 것으로 알려진 laminin일 수 있다.
본 실시예에서 신장조직의 탈세포화 방법은 신장 조직을 탈세포화 시키며, 탈세포화 시킨 물질을 신장 바이오 잉크의 재료로 이용하기 적합한 기준의 살균도 및 세포 잔존량을 달성할 수 있다. 이를 이하여 본 발명에서 신장조직의 탈세포화 방법은 탈세포화 공정(S100 내지 S600)과 바이오 잉크 원료 생산 공정(S700 내지 S1000)을 포함할 수 있다.
탈세포화 공정은 신장조직 준비 단계(S100), 1차 세척 단계(S200), 세포 제거 단계(S300), 2차 세척 단계(S400), 살균 소독 단계(S500) 및 3차 세척 단계(S600)를 포함하여 구성될 수 있다.
신장조직 준비 단계(S100)는 먼저 포유류로부터 적출된 신장조직을 준비하는 단계에 해당한다. 신장조직은 먼저 포유로부터 적출하고, 그 다음으로 적절한 크기로 세절하여 준비한다. 일 예로 후술할 탈세포화 공정에서 수율 및 효율을 높일 수 있도록 신장조직을 두께 2mm 이하로 잘라서 준비할 수 있다. 나아가 분쇄 등으로 세절하여 준비할 수 있다.
1차 세척 단계(S200)는 준비된 신장조직에 포함되어 있는 불순물 또는 잔존 용액을 제거할 수 있도록 구성된다. 1차 세척단계(S200)는 세척액을 이용하여 수행될 수 있다. 세척액은 일 예로 증류수가 될 수 있으며, 이 경우 1차 세척 단계(S200)는 세척액과 증류수를 함께 섞고 교반시켜 수행될 수 있다. 1차 세척 단계(S200)에서 조직은 세척됨에 따라 불필요한 물질, 예를 들어 조직내에 포함되어 있는 혈액 등이 조직에서 제거되며, 육안으로 확인했을 때 색이 연해지는 것을 확인할 수 있다. 1차 세척 단계(S200)는 일 예로서 증류수의 질량이 조직 질량 대비 10 배 이상인 상태에서 수행될 수 있다. 또한, 1차 세척 단계(S200)는 일 예로 상온에서 1회에 15분 내지 30분씩 수행될 수 있으며, 세척액을 교환하여 3회 수행될 수 있다. 이 경우 총 1차 세척 단계(S200)의 수행시간은 1 시간 내지 1시간 30분이 될 수 있다. 다만, 이러한 제1 세척 단계(S200)의 수행 시간은 일 예일 뿐 충분한 세척이 이루어지는 시간으로 적절하게 선택되어 수행될 수 있다.
세포 제거 단계(S300)는 신장조직의 탈세포화 공정에 해당한다. 세포 제거 단계(S300)는 세포 및 세포외 기질에 포함되어 있는 다양한 단백질, 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화하면서 신장조직에 포함된 세포의 DNA를 파괴할 수 있도록 수행된다.
세포 제거 단계(S300)는 계면활성제 및 고장용액이 포함된 탈세포화 용액을 이용하여 수행될 수 있다. 계면활성제는 일 예로 비이온 계면활성제일 수 있으며, 구체적으로 1% 이내의 트리톤 X-100(triton x-100)이 포함될 수 있다. 고장용액은 탈세포화 효율을 향상시킬 수 있도록 계면활성제와 함께 사용되며, 일반적인 식염수보다 높은 농도로 구성될 수 있다. 고장용액의 일 예로서 0.3M 내지 1.0M의 NaCl 용액이 이용될 수 있다.
세포 제거 단계(S300)는 신장 조직과 탈세포화 용액의 비율이 1/10 이하의 조건에서 수행될 수 있다. 즉, 신장 조직의 질량이 용액의 10% 이내에서 세포 제거 단계(S300)가 수행될 수 있으며, 이와 관련하여 신장 조직의 부피가 용액의 10%를 경계로 하여 10% 이내인 경우에 효율적으로 진행됨을 실험적으로 확인하였다.
세포 제거 단계(S300)는 신장 조직과 탈세포화 용액을 함께 섞고 교반하여 수행되며, 지속적으로 신장 조직의 탈세포화 이루어질 수 있도록 주기적으로 탈세포화 용액을 교체하여 수행될 수 있다. 일 예로 탈세포화 용액의 교체주기는 3시간마다 교체가 이루어질 수 있도록 결정될 수 있다. 다만 이는 일 예일 뿐 탈세포화 용액이 충분한 탈세포화 효과를 발휘할 수 있는 농도로 유지될 수 있도록 적절한 시기 및 회수로 교체주기가 결정될 수 있다.
세포 제거 단계(S300)는 상온에서 수행될 수 있으며, 전체 탈세포화 공정 대비 75%를 초과하지 않는 시간 동안 수행될 수 있다. 일 예로서, 전체 탈세포화 공정(S100 내지 S600)의 소요시간이 40시간인 경우 세포 제거 단계(S300)는 15시간 내지 16시간 동안 수행될 수 있다. 세포 제거 단계(S300)의 수행시간이 너무 짧은 경우 신장 조직의 충분한 탈세포화를 기대하기 어려우며, 수행시간이 너무 긴 경우에는 신장 조직의 치료에 필요한 유효성분의 손실이 커질 우려가 있으므로 적절한 시간으로 수행되는 것이 바람직하다. 한편, 전술한 탈세포화 용액이 교체와 관련하여, 세포 제거 단계(S300)가 15시간 내지 16시간 동안 수행되는 경우 탈세포화 용액의 교체는 4회 내지 6회 수행될 수 있다.
2차 세척 단계(S400)는 세포 제거 단계(S300) 이후 탈세포화 용액 및 불순물을 제거할 수 있도록 구성된다. 본 단계(S400)에서는 전술한 1차 세척 단계(S200)와 유사하게 수행될 수 있으며, 일 예로 증류수를 이용하여 상온에서 1회에 15 내지 30분씩 수행될 수 있으며, 3회에 걸쳐 수행될 수 있으며, 전체 소요시간은 45분 내지 1시간 30분이 될 수 있다.
살균 소독 단계(S500)는 세포 제거 단계(S300)가 수행된 이후 생성된 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물 등을 사멸시키기 위하여 살균하는 단계에 해당한다. 살균 소독 단계(S500)는 살균 소독액을 이용하여 진행되며, 살균 소독액은 미생물의 세포막을 파괴하는 효과가 있는 과초산(peracetic acid)을 포함할 수 있다. 또한, 살균 소독액은 PBS(phosphate buffered saline)을 포함할 수 있다. 일 예로서 살균 소독액은 전술한 PBS와 1% 과초산이 포함될 수 있다. 살균 소독 단계(S500)는 탈세포화 물질과 살균 소독액을 혼합하고 교반기를 이용하여 적절하게 교반시킴으로써 수행될 수 있다. 살균 소독 단계(S500)는 상온에서 수행될 수 있으며, 1시간 이상의 시간동안 수행될 수 있다.
3차 세척 단계(S600)는 살균 소독 단계(S500) 이후 불순물과 살균 소독액을 제거할 수 있도록 수행된다. 3차 세척단계(S600) 또한 일 예로서 전술한 1차 세척단계(S200) 및 2차 세척단계(S400)와 마찬가지로 상온에서 증류수를 이용하여 수행될 수 있다. 3차 세척 단계(S600)는 살균 소독액의 완전한 제거를 위해 전술한 1차 세척단계(S200) 및 2차 세척단계(S400)와 유사하게 1회 수행에 15분 내지 30분 동안 수행될 수 있으며, 3회에 걸쳐 수행될 수 있고, 전체 소요시간은 45분 내지 1시간 30분이 될 수 있다.
신장 바이오 잉크 원료 생산 공정은 전술한 바와 같이 탈세포화 된 물질을 신장 바이오 잉크의 재료료 이용하기 적합한 상태로 처리하는 과정을 포함할 수 있다. 신장 바이오 잉크 원료 생산 공정은 1차 동결 건조 단계(S700), 조직 용해 단계(S800), 중성화 및 희석 단계(S900) 및 2차 동결 건조 단계(S1000)를 포함할 수 있다.
1차 동결 건조 단계(S700)는 살균 소독이 이루어진 탈세포화 물질에서 수분을 제거하여 단백질 변형을 최소화할 수 있도록 수행된다. 탈세포화 물질이 건조되면 차후 설명할 용해 단계(S800)가 용이하게 수행될 수 있다.
조직 용해 단계(S800)는 차후 설명할 중성화 및 희석 단계(S900)의 준비단계에 해당한다. 조직 용해 단계(S800)는 아세트산(acetic acid)을 포함한 용액에 용해시켜 수행될 수 있다. 일 예로 아세트산은 0.5M 내외, 물질 농도는 0.5% 미만으로 용해시킬 수 있다. 조직 용해 단계(S800)는 24시간 내외로 수행될 수 있다.
중성화 및 희석 단계(S900)는 신장 치료에 도움이 되는 단백질을 분해하며, 용해된 탈세포화 물질의 산도를 조절할 수 있도록 수행된다. 중성화 및 희석 단계(S900)는 조직 용해 단계(S800)를 거친 용해된 탈세포화 물질 중 신장의 세뇨관과 혈관에만 포함되어 있는 당단백질의 일종인 데코린(decorin)과 비글리칸(biglycan)을 분해하기 위하여 수행될 수 있다. 중성화 및 희석 단계(S900)는 효소를 이용하여 데코린과 비글리칸을 분해할 수 있으며, 일 예로 효소는 MMP-13이 선택될 수 있다. 중성화 및 희석 단계(S900)는 일 예로 MMP-13을 2μM 이상의 농도로 생성하고 용해된 탈세포화 물질을 함께 교반하여 수행될 수 있다. 중성화 및 희석 단계(S900)는 전체 탈세포화 공정이 40시간인 경우 일 예로 5시간 내외로 수행될 수 있다.
2차 동결 건조 단계(S1000)는 용해된 물질에서 수분을 제거할 수 있도록 수행된다. 탈세포화 공정을 거친 물질은 물질내에 포함되어 있는 수분을 제거하여야 차후 바이오 잉크로 사용하기에 적합한 상태가 될 수 있다. 동결 건조시에는 소정 용기에 담긴 탈세포화 물질을 동결건조기에 적재하여 수행될 수 있다. 일 예로 50ml 튜브에 수용된 탈세포화 물질을 냉각시키며, 반응 표면적을 넓힐 수 있도록 튜브를 눕힌 상태에서 수행될 수 있다. 일 예로, 2차 동결건조는 15Pa 미만의 압력과 ??60ㅀC 미만의 온도에서 수행될 수 있으며, 수분 함량을 최소화할 수 있도록 3 일 내외로 수행될 수 있다.
2차 동결 건조 단계(S1000)가 수행된 이후에는 바이오 잉크로 용해시키는 2차 용해 단계가 수행될 수 있다. 2차 용해 단계는 2차 동결 건조 단계(S1000)에서 건조된 탈세포화 물질을 용해할 수 있도록 구성된다. 2차 용해 단계는 탈세포화 물질을 아세트산에 교반하여 용해시키며, 물질 농도는 1% 내외로 생성하여 건조되었던 모든 탈세포화 물질을 용해시킬 수 있도록 수행된다. 일 예로 2차 용해 단계는 물질 농도가 1% 내외인 경우 48시간 내외로 수행될 수 있다.
2차 용해 단계를 거친 탈세포화 물질은 직접 체내에 주입되거나, 하이드로젤을 혼합하여 체내에 주입될 수 있으며, 3D 프린팅을 통해 특정 수조를 형성한 뒤 임플란트로 사용되는 등 다양한 방법으로 체내로 공급될 수 있다.
도 3은 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 물질이 나타난 도면이다.
본 도면에서는 전술한 신장조직의 탈세포화 방법 중 확보된 신장 조직을 준비하는 단계(도 3(a), 도 3(b)), 1차 세척단계(도 3(c)), 세포 제거 단계(도 3(d)), 살균 소독 단계(도 3(d) 및 동결건조 단계(도 3(e))에서 탈세포화 물질을 촬영하여 나타나 있다.
도 4는 일 실시예에 따른 신장조직의 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크가 나타난 도면이다. 도시된 바와 같이 전술한 탈세포화 물질을 용해시킨 뒤 하이드로젤과 함께 교반하여 바이오 잉크를 생성할 수 있다. 하이드로젤은 젤라틴 및 콜라겐 중 적어도 하나를 포함하여 구성될 수 있다. 하이드로젤은 특정온도 또는 특정 pH에서 액체와 젤 상태로 변화될 수 있다. 하이드로젤은 프린팅하여 장기 칩 등을 제작하는 경우 제작 과정에서 탈세포화 물질이 프린팅 되기에 적절한 물성치를 갖도록 부가되며, 제작 이후에는 불필요한 성분이 된다. 따라서 제거되는 것이 바람직하므로 프린팅이 완료된 뒤 적절한 온도변화를 주어 액체로 상변화를 시킨 뒤 하이드로젤 만을 3D 구조물에서 제거할 수 있게 된다. 이때 하이드로젤은 소정 온도 이하에서는 액화되며, 소정온도 이상에서는 고체화될 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 탈세포화 물질의 효과 및 검증에 대하여 도 5 내지 도 12를 참조하여 설명하도록 한다.
도 5는 신장조직 탈세포화 물질의 세포외기질함유량 정량평가 그래프이다.
도시된 바와 같이, 탈세포화 물질에는 자연적인 세포보다 GAG 함량은 약 2배, 콜라겐(collagen) 양은 약 3배 이상이 포함되어 있음을 확인할 수 있음을 확인할 수 있다. 여기서, 'Relative ECM composition %' 는 조직내 상대적 ECM, 즉 세포 외기질 구성 요소 비율을 뜻하며, GAG(Glycosaminoglycans)는 세포외 주요 기질 성분인 다당류를 뜻하며, Collagen은 '교원질'(膠原質)이라고도 불리는 경단백질로서 조직내 결합 조직의 주성분을 뜻한다.
도 6은 탈세포화 조직의 신장조직 치료에 특화된 유효성분을 도시한 도면이다.
도시된 바와 같이, 신장조직 치료에 특화된 유효성분의 일 예로서, Hematoxylin & Eosin (H&E), Masson's Trichrome (MT), Alcian Blue, laminin, fibronectin 이 나타나 있다.
본 발명에 따른 탈세포화 방법을 통해 생성된 탈세포화 물질에 잔여하는 세포량을 H&E staining을 통해, 신장 조직의 세포외기질의 주요 성분이 잔존해있음을 MT, Alcian Blue, staining 등을 통해 확인하였다. 또한, 면역조직화학법을 통해 laminin, fibronectin 등의 신장 치료에 유효한 성분들이 잔존해있음을 확인할 수 있다.
도 7은 탈세포화 물질 내에서 신장세포의 생존률을 나타낸 도면이다. 도시된 바와 같이, 콜라겐에 신장에서 유래된 세포를 배양한 경우와 신장조직 탈세포화 물질에 신장에서 유래된 세포를 배양한 경우를 비교할 수 있다. 배양을 시작한 이후 3 일 및 7 일의 영상이며, 이를 비교해보면 신장조직 탈세포화 물질에 배양한 신장 유래 세포의 생존률이 월등하게 높은 것을 확인하였다.
도 8은 탈세포화 물질의 신장 조직에 대한 재생효과를 도시한 도면이다. 본 도면에서는 신장조직의 손상(damage or wound)이 있는 경우 콜라겐또는 탈세포화 물질을 손상 부위에 도포 하였을 때 재생되는 효과를 확인할 수 있다. 전술한 두 경우에 대하여 동일한 조건에서 신장조직 탈세포화 물질을 도포하였을 때 두 배 이상의 재생효과가 있는 것을 확인하였다.
도 9는 탈세포화 물질에 대한 동물실험 과정을 도시한 도면이며, 도 10은 탈세포화 물질에 대한 동물실험 결과를 도시한 도면이다.
도시된 바와 같이 먼저 쥐의 좌측 요관(Left kidney ureteral)을 임시적으로 폐쇄(obstruction)시켜 인위적으로 좌측 신장에 손상을 발생시킨다. 본 실험에서는 7일간 좌측 요관을 폐쇄시 혈액요소질소(blood urea nitrogen)의 수치가 급격하게 상승되었으며, 크레아티닌(creatinine) 수치 또한 급격하게 증가되어 좌측 신장에 손상이 발생된 것으로 확인되었다. 이후 우측 신장을 절제(kidney nephrectomy)하고 폐쇄시킨 좌측 요관을 개방하여 손상된 좌측 신장만이 기능할 수 있는 상태를 만들었다.
이후 본 발명에 따라 신장 조직으로부터 유래된 탈세포화 물질을 좌측 신장에 투여하여 약 8주간 경과를 파악하였으며, 혈액요소질소와 크레아티닌의 수치가 1주일 이내에 정상수치로 회복됨을 확인하였다. 탈세포화 물질을 신장에 투여하는 방법의 일 예로써, 탈세포화 물질을 시린지(syringe)를 이용하여 병변부위에 주입하여 수행될 수 있다. 본 실험에서는 병변부위가 발생한 신장 동정맥 부위 반대측의 신수질 부분에 200㎕ 내지 5 ml의 탈세포화 물질을 주입하여 수행도었다. 한편, 신장에 주입시는 실험체를 개복하거나, 복부 초음파 가이드를 이용하여 신장에 주입될 수 있으나, 이는 일 예일 뿐 다양한 방식으로 신장의 병변부위에 접근하여 주입이 이루어질 수 있다.
도 11은 일 실시예에 따른 탈세포화 물질이 신장 조직의 항섬유화 및 재생능력에 미치는 영향을 도시한 도면이며, 도 12는 탈세포화 물질이 신장 조직의 항섬유화 및 재생능력의 수치를 나타낸 도면이다.
도 11을 참조하면, 정상 신장 조직, 신장 섬유화가 유발된 조직, 그리고 신장 조직 유래 탈세포화 물질을 주입한 이후 1, 2, 4, 6, 8 주 경과 후의 영상이 도시되어 있으며, 4주 이후 섬유화가 일어났었던 조직의 상당부분이 회복되었음을 확인할 수 있다.
도 12를 참조하면, 신장 병변 부위의 치료여부에 대한 평가요소의 일 예로 섬유화 수치가 될 수 있다. 신장 섬유화 수치는 직접 병변부의 신장조직의 조직병리 검사를 통하여 산정될 수 있다. 신장 섬유화 수치 산정을 위한 조직 병리 검사의 일 예로 신장 중 병변부의 조직을 채취하여 Masson's Trichrome Staining 및 Sirius Red Staining(신장 조직의 interstitial fibrosis 및 interstitial collagen deposition 정도를 알 수 있는 방법)을 실시한 후 신장 조직 단면 면적에서의 염색 정도에 따라 아래의 표 1과 같이 grade 를 나누어 섬유화정도를 수치적으로 나타낼 수 있게 된다.
staining positive염색 범위 Grade
no staining 0
25% staining 1
25 to 50% staining 2
50 to 75% staining 3
75 to 100% staining 4
한편, 도 12에 나타난 native는 정상 신장 조직을 뜻하며, RUUO는 reversible unilateral ureteral obstruction 으로서, 신장 섬유화 유발 방법에 의해 신장의 섬유화가 발생된 상태를 뜻한다.
도 12(a)를 참조하면, 섬유화 수치(Interstitial fibrosis score)에서 탈세포화 물질의 주입 이후 4주 까지 회복이 활발하게 진행되어 섬유화 수치가 급격하게 감소됨을 확인할 수 있었으며, 4주 이후 안정적으로 섬유화 수치가 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 도 12(b)를 참조하면, Sirius Red Staining Area가 RUUO 이후 최대 수치로 증가하였다가 신장조직 유래 탈세포화 물질을 주입한 이후 점차 수치가 낮아져 4주 이후 정상 신장 조직과 유사한 수치로 나타나는 것을 확인하였다.
전술한 바와 같이 본 발명에 따른 일 실시예인 신장조직의 탈세포화 방법은 신장에 유효한 단백질을 분해한 상태의 탈세포화 물질을 생성할 수 있으며, 생성된 탈세포화 물질은 신장의 사구체의 기저막을 구성하는 세포외기질 구성을 모방하여 구성되므로 이를 이용하는 경우 신장치료를 극대화할 수 있다.
또한 본 발명에 따라 생성된 탈세포화 물질로 3D 프린팅에 사용되는 바이오 잉크를 생성하는 경우 전술한 신장 치료 효과를 확보하면서 탈세포화 물질을 원하는 형태의 구조로 프린팅할 수 있게 된다.
S100: 신장조직 준비 단계
S200: 1차 세척 단계
S300: 세포 제거 단계
S400: 2차 세척 단계
S500: 살균 소독 단계
S600: 3차 세척 단계
S700: 1차 동결 건조 단계
S800: 조직 용해 단계
S900: 중성화 및 희석 단계
S1000: 2차 동결 건조 단계

Claims (17)

  1. 탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계;
    계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 상기 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계;
    상기 세포 제거 단계 이후 상기 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 상기 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계; 및
    상기 살균 소독 단계 이후 상기 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석 단계를 포함하며,
    상기 계면활성제는 1% 이하의 트리톤 X-100(Triton X-100)이며,
    상기 고장용액은 0.3M 내지 1.0M 의 NaCl이며,
    상기 중성화 및 희석단계는 당단백질인 데코린(decorin) 및 글리칸(biglycan) 중 적어도 하나를 분해할 수 있도록 2μM 내지 1 M 의 농도의 MMP-13로 효소 반응을 수행하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 중성화 및 희석 단계는 3시간 내지 5시간 수행되는 것을 특징으로 하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 신장 조직 준비단계, 상기 세포 제거 단계 및 상기 살균 소독 단계 이후 잔존용액 및 불순물을 세척하는 세척단계를 더 포함하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 세척단계는 신장조직 또는 탈세포화 물질을 세척액과 함께 교반시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 세포 제거 단계 이후 상기 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 살균 소독액과 상기 탈세포화 물질을 교반하는 살균 소독 단계를 더 포함하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 살균 소독액은 과초산(peracetic acid)을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 살균 소독액은 PBS(Phosphate buffered saline)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  13. 제1 항에 있어서,
    상기 중성화 및 희석 단계의 수행 전과 수행 후 중 적어도 한 번 수행되는 동결건조단계를 더 포함하는 신장조직의 탈세포화 방법.
  14. 탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계;
    계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 상기 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계;
    상기 세포 제거 단계 이후 상기 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 상기 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계; 및
    상기 살균 소독 단계 이후 상기 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석 단계가 수행되어 생성되며,
    상기 계면활성제는 1% 이하의 트리톤 X-100(Triton X-100)이며,
    상기 고장용액은 0.3M 내지 1.0M 의 NaCl이며,
    상기 중성화 및 희석단계는 당단백질인 데코린(decorin) 및 글리칸(biglycan) 중 적어도 하나를 분해할 수 있도록 2μM 내지 1 M 의 농도의 MMP-13로 효소 반응이 수행되어 생성되는 신장조직의 탈세포화 물질.
  15. 탈세포화 물질과 함께 3D 프린팅 될 수 있도록 구성된 하이드로 젤을 포함하며,
    상기 탈세포화 물질은,
    탈세포의 대상이 되는 포유류로부터 적출된 신장조직을 세절하는 신장 조직 준비 단계;
    계면활성제 및 고장용액을 포함하는 탈세포화 용액으로 상기 신장 조직의 세포를 탈세포화 물질로 변환시키는 세포 제거 단계;
    상기 세포 제거 단계 이후 상기 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물을 사멸시킬 수 있도록 상기 탈세포화 물질과 살균소독액을 교반하는 살균 소독 단계; 및
    상기 살균 소독 단계 이후 상기 탈세포화 물질에서 당단백질이 분해될 수 있도록 효소 반응을 수행하는 중성화 및 희석 단계가 수행되어 생성되며,
    상기 계면활성제는 1% 이하의 트리톤 X-100(Triton X-100)이며,
    상기 고장용액은 0.3M 내지 1.0M 의 NaCl이며,
    상기 중성화 및 희석단계는 당단백질인 데코린(decorin) 및 글리칸(biglycan) 중 적어도 하나를 분해할 수 있도록 2μM 내지 1 M 의 농도의 MMP-13로 효소 반응이 수행되어 생성되는 신장조직의 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크.
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 하이드로 젤은 젤라틴 및 콜라겐 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 신장조직의 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크.
  17. 제16 항에 있어서,
    상기 하이드로 젤은 소정온도 이하에서 액화되는 것을 특징으로 하는 신장 조직의 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크.
KR1020200026003A 2020-03-02 2020-03-02 신장조직의 탈세포화 방법, 이를 통하여 생성된 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크 KR102256858B1 (ko)

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Acta Biomaterialia, vol.33, pp.88~95(2016)* *
Int. J. Mol. Sci., vol.19,4117, pp.1~79(2018)* *

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