CN110038163B - 一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学组织工程技术领域，本发明公开了一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法。该制备方法以猪真皮去细胞外基质粉末与明胶作为生物材料，通过使用模具浇注和酶促交联成形的工艺制备出复合的水凝胶生物补片。本发明使用生物材料猪真皮去细胞外基质粉末与明胶混合制备补片，不仅水凝胶补片表现出优异的生物相容性，而且增强了水凝胶补片的生物力学特性，解决了现有单一材料补片的不足。同时，其制备过程简单且所需材料容易获得。本发明制备的复合生物补片支架含有预血管化通道，有助于氧气，营养物质交换以及代谢废物排出，加快组织的血管化速度；此外，贯通的通道结构有助于细胞和组织在支架中的长入，可加快腹壁组织重建，有助于解决生物补片现存技术瓶颈，有效改善腹壁缺损修复的治疗效果。

Description

一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学组织工程技术领域,特别涉及一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法。

背景技术

在当今临床外科手术中，腹壁缺损是一种常见的疾病，腹壁疝气、腹壁严重战创伤、意外事故、腹壁肿瘤扩大切除等均可造成腹壁缺损的形成。传统的手术治疗主要是将腹壁缺损周围的肌肉或韧带强行缝合, 术后病人疼痛明显, 恢复时间长, 复发率高。人工补片的出现使腹壁治疗有了突破性进展。通过腹腔内补片植入术将腹壁缺损处进行缝补，减轻腹壁张力，加快患者伤口修复。

人造网状补片是目前常见的人工补片之一，可分为不可吸收或可吸收型两种类型。常见的制备材料为聚酯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙内酯、聚羟基乙酸等。其中合成不吸收材料具有良好的力学性能，但不可吸收降解在体内为终身异物,可能引起肠痪、肠梗阻、感染等并发症,对于已感染或污染的创伤不能适用；对于可吸收聚合物材料，其亲水性差，细胞黏附能力小，而且肠道粘连现象严重及炎症反应，不能满足腹壁缺损的治疗需求。随着近些年的发展，生物补片的研发和应用成为当前腹壁缺损研究的一个重要方向。生物补片是指取自同种、异种的组织,经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质的三维框架结构并能用于修复人体软组织的材料。其来源于猪、牛、人等哺乳动物的富含胶原的组织，常见的例如皮肤、小肠粘膜下层、膀胱及包心等。经过脱细胞技术处理之后就直接用于腹壁缺损的重建与修复。然而发现依然存在以下的问题：1.单一脱细胞组织进行腹壁修复时，其机械性能差难以支撑细胞与组织的生长；2.脱细胞组织植入体内之后，其降解速度过快，新生组织没有重建完整，导致损伤处容易疝气复发。3.直接使用脱细胞组织进行手术修复时，其材料过于致密，难以血管化和氧气、营养物质交换及代谢物排出。此外，宿主细胞及新生组织难以长入材料内部，不利于缺损修复。因此，研究开发一种具有良好机械性能，生物相容性好，能够促进血管化，有助于细胞和组织长入，粘连性小及不易引起排斥反应的可降解复合生物补片是临床上极大的需求。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有补片支架存在的不足，提供一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，该水凝胶复合生物补片是通过使用猪的真皮去细胞外基质粉末与明胶材料通过模具浇注和酶促交联的方法制备而成。具有良好的生物力学性能和生物相容性，并且该生物补片具有预血管化通道结构，有助于宿主细胞和组织的长入，为细胞和组织生长提供氧气、营养物质交换和废物排泄，促进组织血管化，加快组织重建及腹壁修复；有助于解决生物补片现存瓶颈，进一步改善腹壁缺损修复的治疗效果。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，使用猪真皮去细胞基质粉末和明胶作为材料，通过模具浇注和酶促交联成形的方法复合制备含有预血管化通道的复合生物补片，制备步骤如下：

a.浇注模具的设计：浇注模具包括两部分结构，包含圆柱结构的模具底座和模具外套，二者之间通过嵌套的方式组合在一起。在设计模具成形底座时，底座圆柱之间的距离设计为500-800微米，由于营养传输渗透距离为200-400微米之间，底座设计圆柱的目的在于后续成形水凝胶补片时形成预血管通道网络。圆柱的直径设计为500微米。其模具结构及大小可按照所需补片的大小及形状进行设计，然后通过3D打印成形浇注模具。

b.浇注溶液的制备：称取一定量的明胶溶入去离子水中，在60摄氏度水域中进行搅拌溶解，配成15%浓度的明胶溶液，搅拌至溶质完全溶解后将明胶溶液进行静置于常温环境中。然后称取一定量的明胶的生物交联剂微生物谷氨酰胺转移酶，其与明胶的质量比为1:10。等明胶预制液温度降到30℃时，加入交联剂生物谷氨酰胺转移酶，然后用磁力搅拌机迅速搅拌，使其混合均匀得到预制液。然后称取一定量的猪真皮去细胞基质粉末，以预制液为溶剂，猪真皮去细胞基质粉末为溶质，将一定量的猪真皮去细胞基质粉末加入预制液中，迅速搅拌混合均匀，配置得到10%浓度（猪真皮去细胞基质粉末在溶液中的浓度）的复合浇注液。

c.浇注成形：将得到的复合浇注液浇注到设计的模具中，其支架的厚度可以通过控制浇注于模具中的复合浇注液的体积进行控制，浇注均匀之后，将模具整体置于零下75摄氏度左右的低温环境中迅速交联3-5分钟。然后将模具置于常温环境放置1分钟左右，将其模具的外套拿下，将预交联成形的水凝胶补片从模具底座上取下来；再使用手术剪刀对其四周边多余的部分进行修剪，然后将其水凝胶补片结构置于培养皿中，放置在37℃的真空干燥箱中进行进一步交联成形，交联至少6小时。最终得到复合水凝胶生物补片支架。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤c中，在进行复合浇注液浇注之前，在模具的内表面喷涂一层脱模剂，然后再进行浇注成形，其方便成形的水凝胶补片支架从模具中取下来，不易破坏预交的水凝胶结构。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明使用猪真皮去细胞基质粉末和明胶再重建生物补片支架，与现有聚合物网状结构补片相比，具有非常好的生物相容性，有助于细胞和组织生长。

2.本发明使用猪真皮去细胞基质粉末和明胶再重建生物补片支架，与现有单一去细胞外基质结构补片相比，猪真皮去细胞基质粉末和明胶可以实现个性化成形，而且具有更好的生物力学性能及生物相容性；其次相比于现有致密的补片结构，其有助于细胞和组织的长入。

3.本发明制备的水凝胶生物补片支架含有预制的血管化通道结构，其有助于营养物质、氧气的内外交换以及代谢废物的排出，有助于组织结构的长入，促进腹壁组织新生及血管化。

4.本发明制备的水凝胶生物补片支架采用猪真皮外基质粉末进行再重建，相比于现有直接使用去细胞外基质支架，实现按需制备，促进材料的充分使用。与明胶进行混合通过酶促交联成形，生物相容性更好，且机械强度与降解速度可控。

5.本发明制备水凝胶生物补片支架，模具结构简单而廉价，便于制备。而且明胶材料的价格相较于现有去细胞外基质补片便宜且易得。本发明提供了一种操作简单、高效、便捷的水凝胶生物补片制备工艺，易于推广应用，对腹壁缺损的修复与治疗具有重大意义。

附图说明

图1为本发明实施例浇注模具设计结构示意图。

图2为本发明实施例制备水凝胶复合生物补片的过程示意图。

图3为本发明实施例制备的水凝胶复合生物补片的实物图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施案例一：

参见图1至图3，本用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，具体制备步骤如下：

a．模具结构的设计：该模具包括模具底座和外套两部分结构，其底座上面有均匀分布的竖直圆柱，相邻圆柱之间的距离为500-800微米，圆柱的直径500±5微米，模具形状和大小可按照需求设计；

b. 浇注溶液的制备：称取设定量的明胶于烧杯，加入去离子水，在60摄氏度水域中进行搅拌溶解，配成15±1%浓度的明胶溶液；再称取生物交联剂微生物谷氨酰胺转移酶，与明胶的质量比为1:10±0.1；等明胶溶液温度降到室温，加入交联剂用磁力搅拌机迅速搅拌，使其溶液混合均匀得到预制液；然后称取设定量的猪真皮去细胞基质粉末，作为溶质，以预制液为溶剂，加入猪真皮去细胞基质粉末配置得到浓度为10±0.1% 的混合浇注液；

c．浇注和交联成形：将混合的浇注液浇注在模具中，其成形补片的厚度可根据浇注液的体积来控制，浇注后稍微震荡使均匀，将其置于零下75℃环境中迅速交联3-5分钟；然后将整体置于常温环境中1分钟左右，再将其模具外套取下来，将预交联的水凝胶从模具上取下来，使用手术剪刀对其周边多余部分进行修剪，然后放入培养皿放置在37±2℃的真空干燥箱中再交联至少6小时，得到复合的水凝胶生物补片支架。

实施案例二：

在本实施例中，参考图1、图2、图3，本用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，使用猪真皮去细胞基质粉末和明胶，通过模具浇注和酶促交联成形的方法，制备出含有预血管化通道的水凝胶复合生物补片支架，具体制备步骤如下：

a.浇注溶液的制备：将烧杯置于电子称上，先调零再称取设定量的明胶于烧杯中，再向烧杯中加入去离子水，使其明胶的浓度为15%，然后将其烧杯置于60℃的水浴中进行充分搅拌，使其明胶全部溶解；然后再称取设定量的明胶的生物交联剂微生物谷氨酰胺转移酶，其量与明胶的重量比是1:10，将明胶溶液置于室温环境，等明胶溶液为30摄氏度左右，将称取的交联剂微生物谷氨酰胺转移酶加入到明胶溶液中，然后将其放入磁力搅拌机，进行充分的搅拌，且保持温度于30℃左右。将微生物谷氨酰胺转移酶全部溶解之后，得到混合均匀的预制液。然后再称取一定重量的猪真皮去细胞外基质粉末，其作为溶质；之前制备的预制液作为溶剂，再将称取的猪真皮去细胞外基质粉末加入到预制液中，配置成10%浓度（其指猪真皮去细胞外基质粉末加入到预制液的浓度）的混合浇注液，然后放置在磁力搅拌机迅速搅拌1小时，恒温于30摄氏度左右，使其充分混合得到浇注溶液。

b.将按需设计打印的模具底座和外套安装在一起，然后按照模具的容积，计算出模具底面的有效面积，根据体积设计出需要厚度的模具支架，按照计算的体积量，使用注射器抽取定量的浇注液，均匀的浇注于模具中，对模具进行轻微的震动，使得溶液均质；再将模具整体放入零下75摄氏度左右的低温环境中预交联3-5分钟。预交联之后将模具拿出置于常温环境等待一分钟，再将模具的外套取下来，然后再把水凝胶补片从模具中取下来。

c.再将取下来水凝胶补片的四周多余的浇注残留物用医用剪刀进行裁剪，修剪之后将补片支架放置在培养皿中，置于37℃的真空干燥箱中进行进一步交联成形，交联至少6小时，使得水凝胶结构充分交联，以保证支架结构的机械特性；最终得到复合水凝胶生物补片支架。

Claims (3)

1.一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，其特征在于，采用猪真皮去细胞外基质粉末和明胶作为材料，通过模具浇注和酶促交联的方法制备；

具体制备步骤如下：

a.模具结构的设计：该模具包括模具底座和外套两部分结构，其底座上面有均匀分布的竖直圆柱，相邻圆柱之间的距离为500-800微米，圆柱的直径500±5微米，模具形状和大小可按照需求设计；

b. 浇注溶液的制备：称取设定量的明胶于烧杯，加入去离子水，在60摄氏度水浴 中进行搅拌溶解，配成15±1%浓度的明胶溶液；再称取生物交联剂微生物谷氨酰胺转移酶，与明胶的质量比为1:10±0.1；等明胶溶液温度降到室温，加入交联剂用磁力搅拌机迅速搅拌，使其溶液混合均匀得到预制液；然后称取设定量的猪真皮去细胞基质粉末，作为溶质，以预制液为溶剂，加入猪真皮去细胞基质粉末配置得到浓度为10±0.1% 的混合浇注液；

c．浇注和交联成形：将混合的浇注液浇注在模具中，其成形补片的厚度可根据浇注液的体积来控制，浇注后稍微震荡使均匀，将其置于零下75℃环境中迅速交联3-5分钟；然后将整体置于常温环境中1分钟左右，再将其模具外套取下来，将预交联的水凝胶从模具上取下来，使用手术剪刀对其周边多余部分进行修剪，然后放入培养皿放置在37±2℃的真空干燥箱中再交联至少6小时，得到复合的水凝胶生物补片支架。

2.根据权利要求1所述的用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，其特征在于：所述水凝胶复合生物补片含有预血管化通道。

3.根据权利要求2所述的用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法，其特征在于：所述的水凝胶补片含有预血管化通道，所述预血管化通道的直径为500±5微米。

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